專利名稱：冠痙攣相關(guān)性疾病的診斷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于診斷特定疾病的技術(shù)，具體地講，涉及冠痙攣相關(guān)性疾病基因的篩選方法。
背景技術(shù)：
生物體內(nèi)的一氧化氮(生物體內(nèi)NO)是近年來在生物體內(nèi)鑒定出的一種物質(zhì)，能作為血管擴(kuò)張物(18-25)、神經(jīng)遞質(zhì)(11，12)或免疫反應(yīng)物(13-17)而起作用。生物體內(nèi)的NO由L-精氨酸合成，其合成至少與三種一氧化氮合成酶(nitric oxide synthasenos)，即神經(jīng)型NOS，血管內(nèi)皮型NOS及巨噬細(xì)胞型NOS中的一種類型相關(guān)。神經(jīng)型NOS和血管內(nèi)皮型均為構(gòu)成型，依賴于細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的升高活性增大。而巨噬細(xì)胞型NOS為鈣非依賴性，炎癥時(shí)活化。最近有些人證明了血管內(nèi)皮型NOS(endothelial cell nitric oxide synthaseeNOS)的基因構(gòu)造，報(bào)道eNOS基因位于第7號(hào)染色體的7q 35-36，有26個(gè)外顯子，長(zhǎng)度為21kb。(18-25)。
發(fā)明公開冠狀動(dòng)脈痙攣(冠痙攣)能引起冠痙攣性心絞痛或變異型心絞痛，對(duì)于其它廣泛的缺血性心臟病，冠痙攣是引起發(fā)病的一主要因素(1-6)。但是冠痙攣的機(jī)制還不十分明確。
如若闡明冠痙攣的機(jī)制，就能早期診斷。治療與冠痙攣相關(guān)的缺血性疾病，考慮到這些，于是進(jìn)行了許多研究。作為冠痙攣的機(jī)制，目前的報(bào)道中，多側(cè)重于平滑肌的過度收縮性(hyper-contractility)而非血管內(nèi)皮損傷(35)。
乙酰膽堿作用到平滑肌能使之收縮，內(nèi)皮正常時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞分泌一氧化氮(NO)，分泌的NO作用于血管平滑肌能使之?dāng)U張。但是，在冠痙攣性心絞痛的病例中，冠狀動(dòng)脈內(nèi)施與乙酰膽堿，血管沒有擴(kuò)張而誘發(fā)了冠痙攣(7，8)，著眼于該事實(shí)，本發(fā)明人已證明了這樣一點(diǎn)，在冠痙攣性心絞痛的病例中，乙酰膽堿誘發(fā)的NO基礎(chǔ)分泌低下(10)。
另外，硝酸甘油和亞硝酸制劑在生物體內(nèi)形成NO，擴(kuò)張血管，預(yù)先抑制了NO合成的血管對(duì)亞硝酸制劑的反應(yīng)過度敏感(9)，冠痙攣性心絞痛的冠動(dòng)脈對(duì)硝酸甘油的反應(yīng)過度敏感(6)，由此認(rèn)為冠痙攣性心絞痛的冠狀動(dòng)脈中NO的基礎(chǔ)分泌低下。由以上結(jié)果我們認(rèn)為冠痙攣與NO，具體講，冠痙攣與分泌NO的內(nèi)皮間有密切關(guān)系。到目前為止，從NO基礎(chǔ)分泌低下這一事實(shí)來探討冠痙攣和分泌NO內(nèi)皮間關(guān)系的報(bào)道尚未見到。
另一方面，日本人冠痙攣的發(fā)病率比歐美人高(26，27)，因此認(rèn)為其發(fā)病因素可能與遺傳背景有關(guān)。
基于以上見解，本發(fā)明人著眼于合成生物體內(nèi)NO的NOS中的血管內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(endothelial cell nitric oxide synthaseeNOS)基因，探討它是否與冠痙攣的發(fā)病相關(guān)，得出結(jié)果完成本發(fā)明。發(fā)明概要本發(fā)明涉及冠痙攣相關(guān)性疾病基因的篩選方法，其特征在于判斷血管內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因的核苷酸變化中有無下面1種或2種以上的變化eNOS基因cDNA的894位的鳥嘌呤(G)變?yōu)樾叵汆奏?T)以及774位的胞嘧啶變?yōu)樾叵汆奏?T)，以及eNOS基因5′側(cè)翼序列的核苷酸變化-786位的胸腺嘧啶(T)變?yōu)榘奏?C)，-922位的腺嘌呤(A)變?yōu)轼B嘌呤(G)及-1468位的胸腺嘧啶(T)變?yōu)橄汆堰?A)，或者其互補(bǔ)鏈上出現(xiàn)相應(yīng)的變化，優(yōu)選的方法是判斷eNOS有無出現(xiàn)這樣2種以上的變化，eNOS基因內(nèi)的變化的任何一種，以及至少一種5′側(cè)翼序列的變化。最更優(yōu)選的是冠痙攣性相關(guān)疾病為心絞痛的方法，最優(yōu)選的是冠痙攣性相關(guān)疾病為冠痙攣性心絞痛的方法。
其它的方案中本發(fā)明涉及利用RFLP。通過判斷有無限制性酶酶切片段篩選上述變化的方法，具體而言涉及這樣的方法用PCR擴(kuò)增編碼eNOS的cDNA上相當(dāng)于外顯子7的部分，用限制性酶Ban II和/或Mbo I處理其擴(kuò)增片段，然后經(jīng)酶處理的片段通過電泳來判斷有無變化，在同樣編碼eNOS的cDNA上，用限制性酶FoK I處理外顯子6上存在的變化、用限制性酶Msp I處理eNOS基因5′側(cè)翼序列中-786位的變化，用限制性酶處理eNOS基因5′側(cè)翼序列中-1468位的變化，判斷是否有變化。
另外，本發(fā)明涉及實(shí)施本發(fā)明方法用的試劑盒，即涉及包含用PCR擴(kuò)增編碼eNOS的cDNA上相當(dāng)于外顯子7部分用的寡核苷酸及限制性酶Ban II和/或Mbo I。用于診斷冠痙攣相關(guān)性疾病的試劑盒；包含用PCR擴(kuò)增編碼eNOS的cDNA上相當(dāng)于外顯子6部分時(shí)應(yīng)用的寡核苷酸和限制性酶FoK I、用于診斷冠痙攣性相關(guān)疾病的試劑盒；包含用PCR擴(kuò)增eNOS基因5′側(cè)翼序列中包括-786位部分時(shí)應(yīng)用的寡核苷酸和限制性酶Msp I、用于診斷冠痙攣性相關(guān)疾病的試劑盒；包含用PCR擴(kuò)增eNOS基因5′側(cè)翼序列中包括-1468位部分時(shí)應(yīng)用的寡核苷酸和限制性酶MboI、用于診斷冠痙攣性相關(guān)疾病的試劑盒。再者，本發(fā)明的試劑盒中所含擴(kuò)增用寡核苷酸除用下面表1中所述的以外可用其它的，可參照eNOS基因組DNA的序列使用哪一種。
另外，本發(fā)明涉及診斷冠痙攣相關(guān)性疾病的方法，其特征在于判斷有無伴隨冠痙攣性相關(guān)疾病在eNOS基因上出現(xiàn)上述核苷酸變化中的1或2種。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是用PCR-SSCP分析含eNOS基因的外顯子7的DNA片段，其電泳結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)閳D面的照片。箭頭表示。
圖2是用含eNOS基因的外顯子7的DNA片段的PCR-SSCP對(duì)變異的病例(變異型)和非變異的病例(正常型)進(jìn)行直接測(cè)序的結(jié)果圖。圖中結(jié)果顯示變異型為雜合體。
圖3表示通過PCR-RFLP篩選含eNOS基因外顯子7的DNA片段的結(jié)果，限制性酶用Ban II和/或Mbo I。圖3A為限制性酶的示意圖。圖3B是將實(shí)際的電泳結(jié)果轉(zhuǎn)化為圖面的照片。
圖4是通過PCR-RFLP篩選含eNOS基因外顯子6的DNA片段，將表示其結(jié)果的電泳結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)閳D面的照片。限制性酶用FoK I。
圖5為分別通過PCR-RFLP篩選含eNOS基因5′側(cè)翼區(qū)中-786位和-1468位的DNA片段，將其電泳結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)閳D面的照片。-786位的變化用限制性酶Msp I，-1468位的變化用Mbo I。
發(fā)明公開如上所述，本發(fā)明人從eNOS基因入手，探討它是否與冠痙攣的發(fā)病相關(guān)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下面的事實(shí)。
A)eNOS基因外顯子內(nèi)的變異1)外顯子7的變異在編碼eNOS的cDNA上，894位的鳥嘌呤(G)轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?T)
用PCR-SSCP(聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)型多樣性)和直接測(cè)序法可以看到冠痙攣性心絞痛患者eNOS基因的外顯子7上有點(diǎn)突變。其變異為GAG變?yōu)镚AT，氨基酸的變異為從谷氨酸變?yōu)樘於彼?Glu298Asp)。該變異是在96個(gè)冠痙攣性心絞痛患者和86對(duì)照中進(jìn)行篩選的，其中冠痙攣性心絞痛患者群中有22人，對(duì)照組中有7人出現(xiàn)這種變異，2)外顯子6的變異eNOS基因的cDNA上，774位的胞嘧啶(C)變?yōu)樾叵汆奏?T)用PCR-SSCP法發(fā)現(xiàn)在10個(gè)冠痙攣性心絞痛患者中有4人出現(xiàn)這種堿基替換。而在對(duì)照組的9人中沒有發(fā)現(xiàn)這種堿基替換(P＝0.03)。并且這種替換沒有造成氨基酸的變化。
B)eNOS基因5′側(cè)翼區(qū)中的變異發(fā)現(xiàn)eNOS基因5′側(cè)翼區(qū)中有幾個(gè)變異，對(duì)這些變異與冠痙攣疾病的相關(guān)性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，得到以下結(jié)果。1)5′側(cè)翼區(qū)(-786)的胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)榘奏?C)用PCR-SSCP法發(fā)現(xiàn)123名冠痙攣性心絞痛患者中有34人(27.6％)出現(xiàn)這種堿基替換。而對(duì)照組的86人中只有4人(4.7％)出現(xiàn)這種堿基替換(P＜0.0001)2)5′側(cè)翼區(qū)(-922)的腺嘌呤(A)變?yōu)轼B嘌呤(G)用PCR-SSCP法發(fā)現(xiàn)104名冠痙攣性心絞痛患者有31人(29.1％)出現(xiàn)這種堿基替換。而在對(duì)照組的83人中只有3人(3.6％)出現(xiàn)這種堿基替換(P＜0.0001)3)5′側(cè)翼區(qū)(-1468)的胸腺嘧啶(T)腺嘌呤變?yōu)榘奏?A)用PCR-SSCP法，在98名冠痙攣性心絞痛患者中發(fā)現(xiàn)有26人(26.5％)出現(xiàn)這種堿基替換。而在對(duì)照組26人中沒有發(fā)現(xiàn)這種堿基替換(0％)。(P＜0.0006)以上所發(fā)現(xiàn)的eNOS基因的變異有利于冠痙攣性相關(guān)疾病的診斷。
本說明書中“冠痙攣性相關(guān)疾病”指心絞痛，尤指冠動(dòng)脈痙攣性心絞痛。變異型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛、勞力型心絞痛、安靜心絞痛、急性心梗或微小血管疾病(microvasculor disease)等。
根據(jù)本發(fā)明所證明的冠痙攣與eNOS基因的相關(guān)性，從懷疑患有冠痙攣相關(guān)性疾病的患者入手，如若確定在eNOS基因及其5′側(cè)翼區(qū)出現(xiàn)上述變異，則可判定該患者存在患冠痙攣相關(guān)性疾病的很大的危險(xiǎn)因素。這些變異中任何一個(gè)均可為冠痙攣相關(guān)疾病的指標(biāo)，但若出現(xiàn)2個(gè)以上的變異，則為更確切的指標(biāo)。此外，發(fā)現(xiàn)若在eNOS基因區(qū)及其5′側(cè)翼區(qū)均出現(xiàn)變異，則可發(fā)生重癥冠痙攣相關(guān)性疾病。
由此，本發(fā)明涉及冠痙攣相關(guān)性疾病基因的篩選方法，其特征在于判斷血管內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因的核苷酸有無出現(xiàn)下面的1種或2種以上的變化其cDNA的894位的鳥嘌呤(G)變?yōu)樾叵汆奏ぃ?74位的胞嘧啶(C)變?yōu)樾叵汆奏?T)，以及eNOS基因5′側(cè)翼區(qū)核苷酸的變化為-786位的胸腺嘧啶(T)變?yōu)榘奏?C)，-922位的腺嘌呤(A)變?yōu)轼B嘌呤(G)，及-1468位胸腺嘧啶(T)變?yōu)橄汆堰?A)，或者其互補(bǔ)鏈出現(xiàn)相應(yīng)的變化。其互補(bǔ)鏈出現(xiàn)相應(yīng)的變化“指，如eNOS基因核苷酸的變化中，其cDNA上894位的鳥嘌呤(G)變?yōu)樾叵汆奏?T)的時(shí)候，第894位鳥嘌呤互補(bǔ)的胞嘧啶(C)變?yōu)橄汆堰?A)。
首先，對(duì)從患者eNOS基因及其5′側(cè)翼序列入手的方法進(jìn)行簡(jiǎn)要說明。
作為獲取基因的樣品，可用所有的活檢樣品，經(jīng)典地用白細(xì)胞、肝組織活檢物。用蛋白酶K-SDS對(duì)樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)分解、變性，之后用酚/氯仿抽提，得到基因組DNA(+RNA)。如果需要，可用RN ase去除RNA。
然后用下面的任一引物通過PCR對(duì)所得基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。然后用以下檢測(cè)核酸變異的方法證實(shí)有無變異。1)RFLP法(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)2)PCR-SSCP(單鏈DNA高級(jí)構(gòu)象多態(tài)性分析)3)ASO雜交法(等位基因特異的寡核苷酸雜交)將PCR產(chǎn)物斑點(diǎn)印跡于尼龍膜等支持物上，與具有待檢測(cè)變異部位堿基序列，18聚體程度的合成寡核苷酸探針(要得到信號(hào)有必要進(jìn)行放射性同位素或生物素標(biāo)記)后，按探針Tm值洗凈后可檢測(cè)出1個(gè)堿基的錯(cuò)配(如若有錯(cuò)配，不發(fā)生雜交)。這是用PCR檢測(cè)特定堿基替代的最典型的方法。4)測(cè)序法5)Southern印跡法這是用限制性酶處理DNA，通過電泳展開，與探針進(jìn)行雜交的普通方法。基因組Southern法，PCR Southern法均可使用。后者與上面(3)的原理相同，但后者能獲得遷移度的情況，因此具有精確度上的優(yōu)點(diǎn)。6)ARMS(擴(kuò)增折射突變系統(tǒng))在PCR中，引物變性后，用DNA聚合酶可從5′- 3′合成模板DNA的互補(bǔ)鏈DNA，但如果引物3′末端堿基有錯(cuò)配，PCR的效率降低，也就是說是利用電泳中不可能觀察到的物質(zhì)的方法，用在引物3′末端堿基希望檢測(cè)出的變異堿基的互補(bǔ)序列進(jìn)行PCR，可以檢測(cè)有無擴(kuò)增產(chǎn)物。7)DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis，變性劑濃度梯度凝膠電泳法)該方法是利用具有PCR產(chǎn)物中錯(cuò)配的雜合子較純合子容易解離而進(jìn)行的。隨著解離的進(jìn)行，凝膠電泳的遷移度降低，所以展開的聚丙烯酰胺凝膠中尿素和甲酰胺的密度呈梯度分配，由此，尤需強(qiáng)調(diào)的是含錯(cuò)配的雙鏈DNA的存在，即變異的存在就可檢測(cè)出來。8)RN aseA切斷法RN aseA(RNA裂解酶)的特性是不能裂解雙鏈RNA或RNA/DNA復(fù)合體，只能裂解單鏈RNA。因此，如32p標(biāo)記的RNA探針與單鏈變性的樣品DNA雜交，RN aseA處理后，如若用電泳展開，由于與變異型雜交的RNA探針在錯(cuò)配部位被切斷，所以能檢測(cè)出2條帶。9)化學(xué)切割法雙鏈DNA的錯(cuò)配部位的“C”“T”分別用羥胺、四氧化修飾后，經(jīng)哌啶處理，切斷糖。利用標(biāo)記的探針可形成雙鏈，本處理后，電泳，若探針的大小變短則可檢測(cè)出變異。在檢測(cè)Glu 298 Asp時(shí)，若探針為正常型反向鏈的序列，錯(cuò)配為C-T，所以哪種修飾均可使用。10)連接酶法原理是用DNA連接酶連接2個(gè)寡核苷酸時(shí)，若在結(jié)合位置與模板DNA間出現(xiàn)錯(cuò)配則不能進(jìn)行結(jié)合。
i)LMGD(連接酶介導(dǎo)的基因檢測(cè))法一邊的寡DNA用如32P標(biāo)記，另一邊的用生物素標(biāo)記，連接后，通過鏈霉抗生物素蛋白吸附進(jìn)行回收，如若進(jìn)行了連接，(即沒有錯(cuò)配)，32P的放射量以高值顯示，由此可檢測(cè)出變異。
ii)LCR(連接酶鏈反應(yīng))用耐熱性連接酶反復(fù)進(jìn)行上述的連接反應(yīng)，由于對(duì)與PCR同樣產(chǎn)生的DNA鏈，寡DNA也發(fā)生變性，所以可高敏感度地檢測(cè)變異。發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案1.外顯子7上的變異外顯子7上的變異，即編碼eNOS的cDNA上，894位的鳥嘌呤(G)變?yōu)樾叵汆奏?T)，能造成從GAG到GAT的變化，形成各種不同的限制性酶部位。因此，用限制性酶也可知道有無變異。具體而言，用限制性酶Ban II、Mbo I的任一個(gè)消化所得擴(kuò)增產(chǎn)物，可知道有無上述變異。詳細(xì)地講，若能用限制性酶Ban II酶切，可判斷不存在變異，或能用限制性酶Mbo I進(jìn)行酶切，可判斷存在變異。
或者eNOS的cDNA上存在這樣的變異，894位的鳥嘌呤(G)變?yōu)樾叵汆奏?T)，氨基酸從谷氨酸變?yōu)榫彼?Glu 298 Asp)。因此，eNOS氨基酸序列的變化，即eNOS氨基酸序列上，298位的谷氨酸變?yōu)榫彼幔部勺鳛橐恢笜?biāo)。
2.外顯子6上的變異外顯子6上的變異，即編碼eNOS的cDNA上，774位的胞嘧啶(C)變?yōu)樾叵汆奏?T)，形成各種不同限制性酶部位。因此，可利用限制性酶判斷有無變異。具體而言，用限制性酶FoK I消化所得的擴(kuò)增片段，可判斷有無上述變異。詳細(xì)地講，若能用FoK I進(jìn)行消化，可判斷存在變異，若不能消化，則知道不存在變異。
3. 5′側(cè)翼區(qū)的-786位的變異eNOS基因5′側(cè)翼區(qū)的核苷酸變化，即-786位的胸腺嘧啶(T)變?yōu)榘奏?C)，也可形成不同限制性酶部位。因此，用限制性酶也可判斷有無變異，具體而言，用限制性酶Msp I消化所得擴(kuò)增產(chǎn)物，可判斷有無上述變異。詳細(xì)地講，用限制性酶Msp I能切割1個(gè)部位，則可知道不存在變異，若Msp I能切割2個(gè)部位，則判斷存在變異。
4. 5′側(cè)翼區(qū)-1486位的變異eNOS基因5′側(cè)翼區(qū)核苷酸的變化，-1486位的胸腺嘧啶(T)變?yōu)橄汆堰?A)，也可形成不同的限制性酶部位。因此，用限制性酶可知道有無變異，具體而言，用限制性酶Mbo I消化所得擴(kuò)增產(chǎn)物，可知道有無上述變異。詳細(xì)地講，若用限制性酶Msp I能切割1個(gè)部位的話，可判斷不存在變異，若Msp I能切割2個(gè)部位，則存在變異。
實(shí)施例實(shí)施例1檢測(cè)eNOS基因外顯子7上的變異試驗(yàn)對(duì)象為96例冠痙攣性心絞痛病例和86名對(duì)照病例。冠痙攣性心絞痛組的病例全部在安靜時(shí)有過自然發(fā)作(男性53人、女性43人，平均61歲、33-86歲)。在所有的病例中進(jìn)行心導(dǎo)管檢查，在冠動(dòng)脈造影上識(shí)別乙酰膽堿和麥角新堿誘發(fā)的冠痙攣，同時(shí)在心電圖上觀察到有意義的ST-T改變(7，8)。另外，在這些病例中未觀察到有意義的冠動(dòng)脈狹窄(＞75％)。
86名對(duì)照病例中，61人有胸痛癥候群，12人有心電圖異常，另外13人有輕微的瓣膜病(男性35人，女性51人，平均年齡61歲，13-83歲)。對(duì)照病例也全部進(jìn)行冠動(dòng)脈造影，結(jié)果，未觀察到冠動(dòng)脈有有意義的狹窄，將乙酰膽堿或麥角新堿冠動(dòng)脈內(nèi)施用給對(duì)照病例中的61名胸痛癥候群和12名心電圖異常者進(jìn)行冠痙攣的誘發(fā)試驗(yàn)，均呈陰性。另外，對(duì)照病例中除外心梗，X綜合癥、心肌病、心功能不全。(1)用PCR-SSCP檢測(cè)eNOS基因的變異(i)DNA的分離從10名典型的冠痙攣性心絞痛病例和9名對(duì)照病例的末梢采靜脈血，從白細(xì)胞抽提DNA(28)。DNA的提取用DNA提取藥盒DNAQUICH[大日本制藥]進(jìn)行。ii)PCR工程參照已報(bào)道的eNOS基因的構(gòu)造(18-25)進(jìn)行PCR-SSCP法(29)，對(duì)eNOS基因所有的外顯子輪流施行PCR-SSCP法。
所有的引物以間夾各個(gè)外顯子的形式制備到內(nèi)合子中。下面表1顯示了應(yīng)用的所有引物。
PCR-SSCP中應(yīng)用的與eNOS基因26個(gè)外顯子對(duì)應(yīng)的引物
1. 5′-CAGCAGAGTGGACGCACAGTAAC 15. 5′-GTGACAACCTTGTCTTTGTCC5′-TTGTTGCCCACCTGCTCCTAGCTG 5′-TCGTCAGTGGAGCTCCCTTT(217)(231)2. 5′-AACCCTTCCTGATGACCCTATCCC 16. 5′-AAAGGGAGCTCCACTGACGA5′-CTTACCCACCCTTTCCCTGGAGAC 5′-AGAATCAGGGCAGAGTGAGG(200)(284)3. 5′-TCCTGACCTTTGCACTCCCTCGA 17. 5′-AGCAAGACGCAGTGAAGCCG5′-ATGGGAAGGTCGTCACGGGGTTTC 5′-TGGCCCCAGAGTGCTTTAGT(250)(275)4. 5′-ACAACTTCCTGCTTGTCCCCTTCC 18. 5′-ACTAAAGCACTCTGGGGCCA5′-ACCCCGCTCCCCTTTTGGTA 5′-AGGGTCAGGGTGTTCAGGACA(259)(203)5. 5′-TCTGGAGCTGATACTCAAGACCCC 19. 5′-TGTCCTGAACACCCTGACCCT5′-CGCATGGGGAAAGAGCTGGTCAGA 5′-GCTGGTGTGCCCTGTTGCTT(246)(322)6. 5′-TCTGACCAGCTCTTTCCCCATGCG 20. 5′-CTCCCTGTGCACTATCCCCA5′-CCACTGGTTTCCTCATTCTCCACC 5′-TCTAGCCCCTGTGCCTCATT(232)(329)7. 5′-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA 21. 5′-TCCAACCCACTGCATCCTGC5′-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA 5′-TGCTCCTGCTTGTTGCCTCA(248)(259)8. 5′-GCTGATCCCACACCCCAACA 22. 5′-TGAGGCAACAAGCAGGAGCA5′-TGCCTTGGACAGGTGCATTC 5′-CACCAAGTCTTCCATCTCAC(250)(202)9. 5′-TGATCACCTCTGTCCCTACCGA 23. 5′-ATGGAGTGTCTCTCCTGCCA5′-ATGCAAACCCTTTGCCTTCCTG 5′-TTCAGGCAGTCCTTTAGTGC(189)(173)10. 5′-AAGAATGGGCGAGGTCTGTGGGT 24. 5′-AGAAGAGCCTTCCCAACCCG5′-CAGGGGCTGCTTAGAATTAGAGC 5′-ATCTTCAGGTTACCATTGCG(311) (219)11. 5′-TCCCTCCCAACCCATCATCTCTCT25. 5′-CAGACCTACGTGCAGGACAT5′-AGTGGTAGGCCCAGAACACTGCT 5′-ACCTTAGCAGGAACCCCGCA(208) (276)12. 5′-CAGGACACCCTCACACCTTCCTCT26-1. 5′-GTTCTGATCCACTGTGCTCT5′-TCTTTCTAGCTCCCTGCTCCC 5′-TCTCCCGGAACTGGAAGGGA(210) (226)13. 5′-ACAGCACCCAGGACATCTGTCTTC26-2. 5′-ACACCAACAGCCCCTGAGAG5′-AGCCCCTTTCCTGGAAGTTCTCA 5′-TGGCAGTAGGCCCTGGGGTA(163) (273)14. 5′-TGATGTCAAACACTCCCCTCG 26-3. 5′-TTAATCTGGAAGGCCCCTCC5′-AAAACGGACTTGAGGCACAG 5′-GAGGGAGACTCCGTTTCAAA(178) (267)注)各引物組中上段為有義引物，下段為反義引物。
括弧內(nèi)為擴(kuò)增片段的堿基長(zhǎng)度。
外顯子26的分析中用3個(gè)引物對(duì)各管中制備5μl這樣的溶液，包含50mmol/L KCl、20mmol/L Tris-鹽酸(pH8.4)、0.75mmol/L MgCl2、0.1mmol/L dNTPs、α-[32P]dCTP(0.2ml)、各種引物(5P mo1)及0.01 U Taq聚合酶(GIBCOBRL，Life Technologies Inc.，MD USA)，然后加入患者的DNA 30ng。
PCR如下進(jìn)行。首先，94℃2′進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，接著94℃30″、55-58℃30″及72℃1′為1循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，在4℃保存PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。外顯子7的擴(kuò)增在57℃進(jìn)行。iii)SSCP步驟電泳在如下3個(gè)條件下進(jìn)行室溫5％的甘油凝膠，4℃5％和10％的甘油凝膠。
甘油凝膠如下制備1)丙烯酰胺和N，N′亞甲基雙丙烯酰胺以49∶1進(jìn)行混和的溶液5％；2)0.5×TBE(10×TBE三(羥甲基)氨基甲烷108g+硼酸55g+0.5M EDTA 40ml+水(總量至500ml)稀釋到20倍)。3)在配制的5％或10％甘油溶液60ml中加入10％APS(過硫酸銨)160μl和60μl TEMED(N，N，N′，N′-四甲基乙二胺)，制成凝膠。iv)結(jié)果擴(kuò)增外顯子7的結(jié)果如圖1所示。根據(jù)該結(jié)果可以看到含外顯子7的片段中，在冠痙攣性心絞痛組的10人中有3人出現(xiàn)帶位移。而在對(duì)照組中完全沒有改變。(2)用直接測(cè)序法檢測(cè)變異基因?qū)⒃诠こ?1)的PCR-SSCP中判斷的變異病例和正常病例的DNA再次在工程(1)的(ii)條件下進(jìn)行擴(kuò)增，用Wizard PCR DNA純化系統(tǒng)(Wizard PCR Preps DNA Purification System，Promega，USA)進(jìn)行純化。用ABI的(USA)自動(dòng)測(cè)序儀，通過直接測(cè)序法確定堿基序列。
對(duì)變異型DNA和正常DNA通過直接測(cè)序法進(jìn)行分析的結(jié)果，在外顯子7上可以看到eNOS cDNA的894位發(fā)生點(diǎn)突變，由鳥嘌呤(G)變?yōu)樾叵汆奏?T)。這在變異的3例中均可證實(shí)。這種變異在eNOS氨基酸的序列上可引起從谷氨酸到精氨酸變化的錯(cuò)配變異(Glu 298Asp)。圖2為直接測(cè)序的結(jié)果。這里顯示沒有變異的正常型為純合體。(3)用PCR-RFLP篩選從G到T的變異如步驟(2)中所示，由于eNOS基因的外顯子T上可發(fā)現(xiàn)引起Glu298 Asp突變的錯(cuò)義突變，所以其篩選均用冠痙攣性心絞痛病例和對(duì)照病例，即對(duì)96名冠痙攣性心絞痛病例和86名對(duì)照病例進(jìn)行。該篩選用PCR-RFLP(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)法。為了防止限制性酶不完全切割的錯(cuò)誤識(shí)別，使用Ban II和Mbo I兩種限制性酶[均購自寶酒造]。
根據(jù)步驟(I)和(ii)中描述的方法，擴(kuò)增所有病例的eNOS基因外顯子7。含外顯子T的PCR擴(kuò)增片段為248bp。然后將所得擴(kuò)增片段按廠家的說明用Ban II和Mbo I中的任一種進(jìn)行消化，將所得消化產(chǎn)物進(jìn)行4％Nusieve GTG瓊脂糖凝膠電泳，判斷泳帶。
結(jié)果如圖3所示，可分為3類帶。圖3A為限制性酶圖，圖3B為實(shí)際電泳的照片。
如圖3B所示，在非突變的野生型中用Ban II酶切形成長(zhǎng)度為163bp和85bp的2個(gè)片段，用Mbo I酶切時(shí)可看到未切割的248bp的帶型。由此可證明，非突變的野生型中有一個(gè)Ban II部位而不存在Mbo I位點(diǎn)。
eNOS的cDNA 894位為T/T純合體的病例中，用Ban II不能使用進(jìn)行切割(248bp)，用Mbo I可形成長(zhǎng)度為158bp和90bp的2個(gè)片段。因此可證明純合體病例中不存在Ban II位點(diǎn)，只存在一個(gè)Mbo I位點(diǎn)。
存在這樣的病例，用Ban II時(shí)可看到形成248bp、163bp和85bp的3個(gè)帶，用Mbo I時(shí)可看到形成248bp、158bp和90bp的3個(gè)帶。這表明無論用Ban II和Mbo I哪個(gè)進(jìn)行消化，分別在一條帶上只存在一個(gè)切割位點(diǎn)，所以是雜合體(G/T)。
以上述3種類型為基礎(chǔ)，對(duì)冠痙攣性心絞痛組和對(duì)照組的所有病例進(jìn)行eNOS基因Glu 298 Asp突變程度的探討。對(duì)每一病例，用上述2種酶分別進(jìn)行消化，其結(jié)果，用這2種酶進(jìn)行消化的結(jié)果在所有的病例中均一致。
可以看到96名冠痙攣性心絞痛病例中有22人(23％)發(fā)生Glu 298Asp突變，其中純合體1人，雜合體21人。而在86例對(duì)照組中，有7人發(fā)生突變(8％)，均為雜合體。(4)統(tǒng)計(jì)分析冠痙攣與Glu 298 Asp突變及其它危險(xiǎn)因素的關(guān)系根據(jù)Fisher′s平方概率(exact probability)，用開平方檢驗(yàn)和非配對(duì)-t檢驗(yàn)比較冠痙攣性心絞痛病例組和對(duì)照組病例間在步驟(3)中所得變異程度、及年齡、性別、高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥、肥胖度和煙草等冠痙攣危險(xiǎn)因素的程度。另外，通過多變量分析(多元對(duì)數(shù)回歸分析)探討哪個(gè)因素與冠痙攣?zhàn)钕嚓P(guān)。用SPSS Advanced Statistics 6.1fbrthe Macintosh(SPSS日本公司，日本)進(jìn)行分析。如下所示單獨(dú)變量用啞(dummy)變量。所有的數(shù)值用均值±SD表示。
性別；0男性， 1女性年齡；0不滿60歲， 160歲以上肥胖度(body mass Index)；0不滿26， 126以上膽固醇血癥；0正常，1高膽固醇血癥(閾值，260mg/dl)煙草； 0不吸煙者， 1吸煙者高血壓；0正常血壓， 1高血壓(閾值160/95mmHg)糖尿病；0無糖尿病， 1有糖尿病(閾值，空腹血糖140mg/dl或OGTT為200mg/dl)開平方檢驗(yàn)結(jié)果如下面表2所示，用fbrward stepwise selection(Wald)的檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示。所有的統(tǒng)計(jì)中P＝0.05為有意義。統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果Glu 298 Asp突變及其它危險(xiǎn)因素年齡、性別、血壓、糖尿病、高膽固醇血癥、肥滿度、吸煙與冠痙攣的關(guān)系亦如表2所示，性別(P＝.035)、吸煙(P＝.00001)及Glu 298 Asp突變(P＝.005)有顯著性差異。表2被檢患者的臨床特性對(duì)照 冠痙攣p值年齡61±12 61±11.97*男性∶女性 35∶51 53∶43.035**肥滿度 23.4±3.723.1±3.0 .48*高血壓 29/8535/94 .39**糖尿病 15/8410/93 .13**高膽固醇血癥31/8231/93 .32**煙草17/8450/95 .00001**Glu 298 Asp突變7/86 22/96 .005***非配對(duì)t-檢驗(yàn)、**Fisher′s平方概率開平方(chi-square)檢驗(yàn)多變量分析(多元對(duì)數(shù)回歸分析)的結(jié)果如下面表3所示。與冠痙攣?zhàn)钕嚓P(guān)的因素為吸煙(P＝.0005)，其次為Glu 298 Asp突變(P＝.0272)。在多元對(duì)數(shù)回歸分析中未看到性別與冠痙攣的關(guān)系。
表3多元對(duì)數(shù)回歸分析的結(jié)果變量 β SE Wald df 顯著性差異 R Exp(β)煙草 1.2342 .3529 12.2316 1 .0005 .2120 3.4355Glu298Asp 1.0746 .4866 4.87711 .0272 .1124 2.9288常數(shù) -.4371 .2139 4.17471 .0410 -- --
實(shí)施例2eNOS檢驗(yàn)外顯子6的變異的檢測(cè)如實(shí)施例1中所描述的，從10名冠痙攣性心絞痛病例和9名對(duì)照病例中分離基因組DNA，用表1中的引物進(jìn)行PCR，通過SSCP方法判斷外顯子6的變異。然后，進(jìn)行外顯子6的直接測(cè)序，可以發(fā)現(xiàn)eNOS基因的cDNA上774位的胞嘧啶(C)替換為胸腺嘧啶(T)。
在10名冠痙攣性心絞痛患者中有4人出現(xiàn)這種堿基替換，而在9名對(duì)照病例中沒有發(fā)現(xiàn)這種堿基替換(P＝0.03)。再者，該堿基替換沒有造成氨基酸的變化。
實(shí)施例3eNOS基因5′側(cè)翼區(qū)變異的檢測(cè)(1)除使用下面的引物外，實(shí)際上可按照實(shí)例1中描述的方法發(fā)現(xiàn)5′側(cè)翼區(qū)(-786)的胸腺嘧啶(T)替換為胞嘧啶(C)。
引物-5′側(cè)5′-ATGCTCCCACCAGGGCATCA-3′引物-3′側(cè)5′-GTCCTTGAGTCTGACATTAGGG-3′可以看到123名冠痙攣性心絞痛患者中有34人(27.6％)發(fā)生這種堿基替換，而在對(duì)照病例中，86人中只發(fā)現(xiàn)4人(4.7％)。(P＜0.0001)。
實(shí)施例4eNOS基因5′側(cè)翼區(qū)變異的檢測(cè)(2)除使用下面的引物外，實(shí)際上可按照實(shí)施例1中描述的方法可發(fā)現(xiàn)5′側(cè)翼區(qū)(-922)的腺嘌呤(A)替換為鳥嘌呤引物-5′側(cè)5′-TCAGTCTCTGAGGTCTCAA-3′引物-3′側(cè)5′-TGATGCCCTGGTGGGAGCAT-3′可看到104名冠痙攣性心絞痛患者中有31人(29.1％)出現(xiàn)兩種堿基替換，而在對(duì)照病例中，83人中只發(fā)現(xiàn)3人(3.6％)。(P＜0.0001)。
實(shí)施例5eNOS基因5′側(cè)翼區(qū)變異的檢測(cè)(3)除使用下面的引物外，實(shí)際上可按照實(shí)施例1中所描述的方法發(fā)現(xiàn)5′側(cè)翼區(qū)(-1468)的胸腺嘧啶(T)替換為腺嘌呤(A)引物-5′側(cè)5′-CCATTAACTGGAACCTAGGAA-3′引物-3′側(cè)5′-AGCCTGGGCTTTGTCCCATGA-3′
可以看到，98名冠痙攣性心絞痛患者中有26人(26.5％)出現(xiàn)這種堿基替換，而在對(duì)照組26名病例中未發(fā)現(xiàn)這種替換(0％)。(P＜0.0006)實(shí)施例6變異的篩選對(duì)上述所得5種變異，如可用ASO雜交法(單位基因特異的寡核苷酸雜交)進(jìn)行大規(guī)模篩選。以下舉例說明大規(guī)模篩選用的ASO雜交法1)與SSCP同樣地進(jìn)行PCR。該情況下最終達(dá)到20μl。反應(yīng)液的組成及循環(huán)條件與實(shí)施例1中外顯子7的情況相同。
2)取10μl PCR反應(yīng)液于0.5M NaOH(1.5M NaCl+25mM EDTA2Na)200μl中，100μl固定于野生型用尼龍膜上，剩余的100μl固定于變異型用尼龍膜上。
3)將固定的尼龍膜分別放置到各自的雜交袋中，加入預(yù)雜交液(3×SSPE，5×Denhart′s試劑，0.5％SDS，1μg/μl鮭魚精DNA)，65℃培養(yǎng)2小時(shí)。
4)加入32P標(biāo)記的正常型探針(5×106dpm/ml)和5倍量的非標(biāo)記異常型探針，或在另一袋中加入32P標(biāo)記的異常型探針(5×106dpm/ml)及5倍量的非標(biāo)記正常型探針。
5)在60℃溫育各袋30′，然后溫度從60℃降低到X℃(實(shí)施例3中53℃、實(shí)施例4中50℃、實(shí)施例5中46℃)。邊降低邊溫育1小時(shí)。
6)從袋中取出尼龍膜，在2×SSPE(0.1％SDS)中室溫下溫育10分鐘，2次，然后在5×SSPE(0.1％SDS)中X℃溫育10分鐘，1次。
7)將尼龍膜包于聚乙烯包裝紙中，覆蓋X光膠片，顯影(放射自顯影)。
實(shí)施例7eNOS基因外顯子6和5′側(cè)翼區(qū)上變異的篩選用實(shí)施例2、3和5中所示的直接測(cè)序法，可以發(fā)現(xiàn)eNOS基因的cDNA上，外顯子6的774位胞嘧啶(C)替換為胸腺嘧啶(T)，或其5′側(cè)翼區(qū)的-786位胸腺嘧啶(T)替換為(C)，同樣5′側(cè)翼區(qū)的-1468位由胸腺嘧啶(T)替換為腺嘌呤(A)。按照下面的條件用PCR-RFLP法篩選這些變異。另外，PCR中應(yīng)用的寡核苷酸和擴(kuò)增條件如下表4、表5所示。表4PCR擴(kuò)增時(shí)應(yīng)用的堿基序列特異的寡核苷酸(a)外顯子65′-TCTGACCAGCTCTTTCCCCATGCG-3′(有義)5′-CCACTGGTTTCCTCATTCTCCACC-3′(有義)(b)側(cè)翼區(qū)(-1468)5′-CTCCAGCCCCTCAGATGA-3′(反義1)5′-TCCAGCCCCTCAGATGG-3′(反義2)5′-GTCCTTGAGTCTGACATTAGGG-3′(有義)(c)5′側(cè)翼區(qū)(-786)5′-AATGAGTCATCCTTGGTCATG-3′(反義)5′-GGGTTTGTAGTTCTGTGT-3′(有義1)5′-GGGTTTGTAGTTCTGTGC-3′(有義2)表5PCR擴(kuò)增條件擴(kuò)增區(qū)域溫度(℃) 時(shí)間(秒) 循環(huán)變性退火延伸 變性退火延伸外顯子6 94 63 72 60 60 60 325′側(cè)翼區(qū) 94 58 72 45 75 60 325′側(cè)翼區(qū) 94 60 72 45 75 60 32PCR緩沖液組成10mM Tris-HCl pH9.0，50mM KCl，1.5mMMgCl2，0.1％Triton X-100，0.5mM各PCR引物，200mM脫氧核苷酸及0.5U Taq聚合酶達(dá)25μl。
用PE公司制造的DNA熱循環(huán)儀480控制溫度。(1)外顯子6上的變異基本上依照實(shí)例(1)中步驟(2)描述的方法應(yīng)用表4中的引物和表5中的擴(kuò)增條件來擴(kuò)增樣品eNOS基因的外顯子6。按照廠家說明用FoK I消化所得擴(kuò)增片段(232bp)、之后，進(jìn)行10％聚丙烯酸胺凝膠電泳。確認(rèn)類型。因?yàn)橹挥凶儺愋突蚩捎肍oK I消化，所以可分別證實(shí)C/C純合體為232bp帶，C/T雜合體為232bp、133bp、99bp的帶，T/T純合體為133bp、99bp的帶。由PCR-RFLP篩選的結(jié)果如圖4所示。
(2)5′側(cè)翼區(qū)域-786位的變異基本上依照實(shí)施例(1)中步驟(2)描述的方法，用表4的引物和表5的擴(kuò)增條件來擴(kuò)增樣品5′側(cè)翼區(qū)含-786位變異的部分。按照廠家的說明用MSPI消化所得擴(kuò)增片段(354bp)，之后，經(jīng)10％聚丙烯酸胺凝膠電泳，確認(rèn)帶型。正常型基因(T)的純合體中Msp I在一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行消化，產(chǎn)生196bp和158bp兩條帶。而變異型基因(G)的純合體中Msp I在2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行消化，所以產(chǎn)生158bp、154bp、44bp三條帶。由PCR-RFLP進(jìn)行篩選的結(jié)果如圖5所示。
(3)5′側(cè)翼區(qū)-1468位的變異基本上按實(shí)施例(1)中步驟(2)描述方法，用表4的引物和表5中的擴(kuò)增條件對(duì)樣品中含5′側(cè)翼區(qū)-1468位變異的部分進(jìn)行擴(kuò)增。按照廠家說明用Mbo I對(duì)所得擴(kuò)增片段進(jìn)行消化，之后，經(jīng)10％聚丙烯酰胺凝膠電泳，確認(rèn)帶型。正常型基因(T)的純合體中，Mbo I在1個(gè)位點(diǎn)消化，產(chǎn)生515bp和112bp 2條帶。而變異型基因(A)的純合體中，Mbo I有兩個(gè)消化位點(diǎn)，產(chǎn)生515bp、61bp、41bp三條帶。由PCR-RFLP進(jìn)行篩選的結(jié)果如圖5所示。
(4)5′側(cè)翼區(qū)-992位的變異該變異的檢測(cè)用PCR-SSP(序列特異的引物)法進(jìn)行。以-922位的A或G作為3′方向延伸的起點(diǎn)，上下游方向各設(shè)計(jì)2種引物(共4種)。該引物與表4中的(b)和(c)相同。使與這些引物配對(duì)的有義或反義引物(2種)分別在擴(kuò)增區(qū)域包含-1468位、-786位的變異部位。這些PCR的時(shí)候，-922位為A/A純合體時(shí)只能用3′側(cè)起點(diǎn)為A或T(互補(bǔ)序列)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，A/G雜合體時(shí)能用所有的引物進(jìn)行擴(kuò)增，G/G的純合體時(shí)只能用3′起點(diǎn)為G或C(互補(bǔ)序列)的引物。
所得擴(kuò)增片段與上面(2)和(3)中所得到擴(kuò)增片段相同。在檢測(cè)所得擴(kuò)增片段時(shí)，在某種檢測(cè)體中可發(fā)現(xiàn)-922位為A(正常型)等位基因(ァレル)來源的上述(2)的擴(kuò)增片段(354bp)，只能是786位的堿基為T的正常型，而-922位為G(異常型)的等位基因來源的上述(2)的擴(kuò)增片段(354bp)，只能是-786位的堿基為G的異常型。同樣，-922位為A(正常型)的等位基因來源的上述(3)的擴(kuò)增片段(627bp)，只能是-1468位堿基為T的正常型，而-922位為G(異常型)的等位基因來源的上述(3)的擴(kuò)增片段(672bp)，只能是-1468位堿基為A的異常型。由此可以證實(shí)，5′側(cè)翼區(qū)內(nèi)的上述變異，以某種形式全部連鎖在同一等位基因上，這表明只要能檢測(cè)出3個(gè)部位中的任一部位的突變，就有可能預(yù)測(cè)出其它兩個(gè)部位有無突變。討論如上所述，本發(fā)明人建立這樣的假設(shè)，eNOS基因變異NOS活性下降，這是否與冠動(dòng)脈痙攣相關(guān)呢？對(duì)此進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。假若這一觀點(diǎn)成立，與冠痙攣大多由一枝發(fā)展到多枝的事實(shí)相符合(8)。另外，雖然Marsden等已報(bào)道了實(shí)例1中發(fā)現(xiàn)的Glu 298 Asp突變(24)，但他們根本沒查明其意義。
實(shí)施例1中可看到，Glu 298 Asp突變?cè)诠诏d攣性心絞痛組中為23％、而對(duì)照組為8％，冠痙攣性心絞痛組與對(duì)照組比較，其程度呈顯著性增高，另外多變量分析的結(jié)果也表明冠痙攣與Glu 298 Asp突變間有顯著性相關(guān)。
但是這種突變率占冠痙攣病例的23％，而對(duì)與冠痙攣病例的剩余77％來說，其它因素可能與其成因密切相關(guān)。實(shí)施例1中是以eNOS外顯子7中的突變?yōu)橹笜?biāo)的，但與該變異不同的、eNOS其它區(qū)域(啟動(dòng)子區(qū)域和內(nèi)含子區(qū)域等)是否也有變異，在這一假設(shè)之下重復(fù)了實(shí)驗(yàn)，查明了這一事實(shí)(實(shí)例2～5)。因此，如果詳細(xì)研究調(diào)查這些變異的相關(guān)性，那么冠痙攣性相關(guān)疾病就能更準(zhǔn)確地診斷。
或者還不僅eNOS基因，還可能有其它的基因?yàn)楣诏d攣的成因，進(jìn)一步講，除基因這一重要因素之外，應(yīng)考慮到環(huán)境因素與冠痙攣的關(guān)系。這是由于家族性冠痙攣病例較少。在實(shí)施例1中也表明吸煙是冠痙攣的危險(xiǎn)因素。該經(jīng)驗(yàn)與其它的報(bào)道一致(30，31)。這次，多元對(duì)數(shù)回歸分析的結(jié)果顯示，在包含突變?cè)趦?nèi)的所有實(shí)驗(yàn)因素中，吸煙是冠痙攣的最重要因素，這表明環(huán)境因素在冠痙攣的成因上是極其重要的。其中的研究者也指出吸煙能引起內(nèi)皮損傷(32，33)。
對(duì)照組中有8％的病例出現(xiàn)Glu 298 Asp突變(786人，實(shí)施例1)。其具體的理由尚不明確，但發(fā)現(xiàn)突變的7人中有6人為非吸煙者，因此這些病例中吸煙不是帶來嚴(yán)重影響的危險(xiǎn)因素。還有一個(gè)理由我們認(rèn)為冠痙攣的診斷有困難?？傊幸恍├碛煽绰┝斯诏d攣，有可能將冠痙攣病例列入對(duì)照組。理由如下1)發(fā)作大多在深夜-早晨發(fā)生，通常在白天不發(fā)生的就容易漏診。
2)即便冠動(dòng)脈內(nèi)施與乙酰膽堿，通常不限于能誘發(fā)冠痙攣，乙酸膽堿誘發(fā)的冠痙攣大多依賴與冠痙攣性心絞痛的“disease activity”(疾病的活動(dòng)性)。
3)2/3以上的冠痙攣發(fā)作為靜止的(無癥狀)4)即便檢查結(jié)果判斷是不是冠痙攣心絞痛，但將來有可能出現(xiàn)冠痙攣。相反，冠痙攣性心絞痛的診斷為通過進(jìn)行冠動(dòng)脈造影，確實(shí)證實(shí)為冠痙攣，達(dá)到確切診斷的病例。
本發(fā)明的初衷是不僅說明環(huán)境因素而且說明遺傳的重要因素與冠痙攣病因的關(guān)系，以提供更好地冠痙攣型相關(guān)疾病的診斷。
以下列出了本發(fā)明說明書中引用的文獻(xiàn)名。參考文獻(xiàn)1)Hillis LD，Braunwald E，冠狀動(dòng)脈痙攣。新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志。1978；299695-7022)Conti CR.冠狀動(dòng)脈痙攣和心肌梗塞。新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志。1983；309238-2393)Yasue H，Omote S，Takizawa A，Nagao M.局部缺血性心臟病中的冠狀動(dòng)脈痙攣及其病理學(xué)。循環(huán)研究綜述。1983；52(Supple 1)147-1524)Maseri A，Davies G，Hackett D，Kaski JC.冠狀動(dòng)脈痙攣和血管收縮。區(qū)別事實(shí)。循環(huán)。1990；811983-19915)Yasue H，Nagao M，Omote S，Takizawa A，Miwa K，Tanaka S.冠狀動(dòng)脈痙攣和由換氣過度及tris緩沖液灌注引起的prinzmetal氏變異型心絞痛。循環(huán)。1978；5856-626)Yasue H，Omote S，Takizawa A，Nagao M，Miwa K，Tanaka S.Prinzmetal氏變異型心絞痛患者鍛煉容量的周期性心臟變化(Circadianvariation)。鍛煉誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈痙攣的作用。循環(huán)。1979；59938-9487)Yasue H，Horio Y，Nakamura N，F(xiàn)ujii H，Imoto N，Sonoda R，Kugiyama K，Obata K，Morikami Y，Kimura T.在變異型心絞痛患者中用乙酸膽堿誘導(dǎo)冠狀動(dòng)脈痙攣副交感神經(jīng)系統(tǒng)在冠狀動(dòng)脈痙攣病理機(jī)制中的可能作用。循環(huán)。1986；74955-9638)Okumura K，Yasue H，Horio Y，Takaoka K，Matsuyama K，Kugiyama K，F(xiàn)ujii H，Morikami Y.變異型心絞痛患者中的多心管冠狀動(dòng)脈痙攣，冠內(nèi)乙酰膽堿注射研究。循環(huán)。1988；77535-5429)Moncada S，Plmer RM，Higgs EA.一氧化氮，生理學(xué)，病理生物學(xué)和藥理學(xué)。藥理學(xué)綜述。1991；43109-14210)Yasue H.冠痙攣的病理學(xué)和臨床特征。JJap Soc InternMed.1995；841407-141511)Bredt DS，Hwang PM，Glatt CE，Lowenstein C，Reed RR，SynderSH.與細(xì)胞色素P-450還原酶結(jié)構(gòu)相似的一氧化氮合成酶的顆粒和表達(dá)。自然。1991；351714-71812)Nakane M，Schmidt HHW，Pollock JS，F(xiàn)orstermann U，Murad F.克隆的人腦一氧化氮合成酶在骨骼肌中的高表達(dá)。FEBS Let。1993；316175-18013)Lyons，CR，Orloff GJ，Cunningham JM.從小鼠巨噬細(xì)胞系分子克隆和功能表達(dá)可誘導(dǎo)的一氧化氮合成酶。1992；2676370-637414)Xie Q，Cho HJ，Calaycay J，Mumford RA，Swiderek KM，Lee TD，Ding A，Troso T，Nathan C.從小鼠巨噬細(xì)胞克隆和特征描述可誘導(dǎo)的一氧化氮合成酶。科學(xué)。1992；25625-22815)Lowenstein CJ，Glatt CS，Bredt DS，Synder SH.與大腦酶相比克隆和表達(dá)的巨噬細(xì)胞一氧化氮合成酶。美國國家科學(xué)院院刊。1992；896711-671516)Geller DA，Lowenstein CJ，Shapiro RA，Nussler AK，Di Silvio M，Wang SC，Nakayama DK，Simmons RL，Snyder SH，Billiar TR.來自人肝細(xì)胞的可誘導(dǎo)的一氧化氮合成酶的分子克隆和表達(dá)。美國國家科學(xué)院院刊。1993；903491-349517)Chartrain N，Geller D，Koty P，Sitrin N，Nussler A，Hoffmann E，Billiar T，Hutchinson N，Mudgett J.人可誘導(dǎo)的一氧化氮合成酶基因的分子克隆，結(jié)構(gòu)，和染色體定位。生物化學(xué)雜志。1994；2696765-677218)Lamas S，Marsden PA，Gordon KL，Tempst P，Michel T.內(nèi)皮一氧化氮合成酶不同的組成型酶異構(gòu)體的分子克隆和特征描述。美國國家科學(xué)院院刊。1992；896348-635219)Sessa，WC，Harrison JK，Barder CM，Zeng D，Durieux ME，DAngelo DD，Lynch KR，Peach MJ.編碼內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶的cDNA的分子克隆和表達(dá)。生物化學(xué)雜志。1992；26715274-1527620)Nishida K，Harrison DG，Navas JP，F(xiàn)isher AA，Docery SP，Uematsu M，Nerem RM，Alexander RW，Murphy TJ.組成型牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶的分子克隆和特征描述。臨床研究雜志。1992；902092-209621)Janssens SP，Shimouchi A，Quetermous T，Bloch DB，Bloch KD編碼人內(nèi)皮來源的松弛因子/一氧化氮合成酶的cDNA的克隆和表達(dá)。生化雜志。1992；26714519-1452222)Marsden PA，Schappert KT，Chen HS，F(xiàn)lowers M，Sundell CL，Wilcox JN，Lamas S，Michel T.人內(nèi)皮一氧化氮合成酶的分子克隆和特征描述。FEBS Letter 1992；307287-293
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1.冠痙攣性相關(guān)疾病基因的篩選方法，其特征在于判斷有無出現(xiàn)選自下組的任一種或二種以上伴隨冠痙攣性相關(guān)疾病的血管內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因核苷酸的變化其cDNA 894位的鳥嘌呤(G)變?yōu)樾叵汆奏?T)，以及774位的胞嘧啶(C)變?yōu)樾叵汆奏?T)，以及eNOS基因5′側(cè)翼區(qū)核苷酸的變化-786位的胸腺嘧啶(T)變?yōu)榘奏?C)，-922位的腺嘌呤(A)變?yōu)轼B嘌呤(G)，及-1468位的胸胞嘧啶(T)變?yōu)橄汆堰?A)，或者其互補(bǔ)鏈上出現(xiàn)相應(yīng)的變化。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于判斷有無eNOS基因內(nèi)的任一種變化及有無其5′側(cè)翼區(qū)的至少一種、二種以上變化。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中冠痙攣性相關(guān)疾病為心絞痛。
4.權(quán)利要求3的方法，其中冠痙攣性相關(guān)疾病指冠痙攣性心絞痛。
5.權(quán)利要求1的方法，其特征在于通過PCR擴(kuò)增編碼eNOS的cDNA上相當(dāng)于外顯子7的部分，用限制性酶Ban II和/或Mbo I處理其擴(kuò)增片段，然后將經(jīng)酶處理的片段進(jìn)行電泳，由此來判斷有無變化。
6.用于診斷冠痙攣相關(guān)疾病的試劑盒，它包括用PCR擴(kuò)增編碼eNOS的cDNA上相當(dāng)于外顯子7部分時(shí)用的寡核苷酸和限制性酶Ban II和/或Mbo I。
7.權(quán)利要求1的方法，其特征在于通過PCR擴(kuò)增編碼eNOS的cDNA上相當(dāng)于外顯子6的部分，用限制性酶FoK I處理擴(kuò)增片斷，然后將經(jīng)酶處理的片段進(jìn)行電泳來判斷有無變化。
8.用于診斷冠痙攣性相關(guān)疾病的試劑盒，它包括用PCR擴(kuò)增編碼eNOS的cDNA上相當(dāng)于外顯子6部分時(shí)應(yīng)用的寡核苷酸和限制性酶FoKI。
9.權(quán)利要求1的方法，其特征在于通過PCR擴(kuò)增eNOS基因5′側(cè)翼區(qū)中包含-786位的部分，用限制性酶Msp I處理擴(kuò)增片段，然后將經(jīng)酶處理的片段進(jìn)行電泳來判斷有無變化。
10.用于診斷冠痙攣相關(guān)疾病的試劑盒，它包括用PCR擴(kuò)增eNOS基因5′側(cè)翼區(qū)中包含-786位部分時(shí)應(yīng)用的寡核苷酸和限制性酶Msp I。
11.權(quán)利要求1的方法，其特征在于通過PCR擴(kuò)增eNOS基因5′側(cè)翼區(qū)中包含-1468位的部分，用限制性酶Mbo I處理其擴(kuò)增片段，然后將經(jīng)酶處理的片段進(jìn)行電泳，以此來判斷有關(guān)變化。
12.用于診斷冠痙攣相關(guān)疾病的試劑盒，它包括用PCR擴(kuò)增eNOS基因5′側(cè)翼區(qū)中包含-1468位部分時(shí)應(yīng)用的寡核苷酸和限制性酶MboI。
13.冠痙攣性相關(guān)疾病的診斷方法，其特征在于判斷有無權(quán)利要求1中伴隨冠痙攣相關(guān)疾病的任一種或二種以上的eNOS基因核苷酸的變化。
全文摘要
一種篩選冠痙攣相關(guān)疾病基因的方法,它包括判斷內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因中特異核苷酸替代的發(fā)生。該方法有利于冠痙攣相關(guān)性疾病,如冠狀動(dòng)脈痙攣性心絞痛的診斷,而這用現(xiàn)有的方法尚不能方便地進(jìn)行診斷。
文檔編號(hào)G01N33/48GK1202205SQ96198281
公開日1998年12月16日 申請(qǐng)日期1996年11月13日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月13日
發(fā)明者泰江弘文, 吉村道博 申請(qǐng)人:鹽野義制藥株式會(huì)社