專利名稱：點免疫結(jié)合測試蘋果潛隱病毒方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及點免疫結(jié)合測試蘋果潛隱病毒方法技術(shù)領(lǐng)域。
用酶聯(lián)免疫技術(shù)測試蘋果潛隱病毒是當(dāng)前廣泛應(yīng)用的檢測技術(shù)，由于該技術(shù)檢測過程需時較長，靈敏度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性還不夠高，數(shù)據(jù)重復(fù)性差、抗原、抗體和試劑藥品用量大，耗資高，檢測標(biāo)本不能保存。
本發(fā)明的目的是發(fā)明一種點免疫結(jié)合測試蘋果潛隱病毒方法，使檢測時間縮短、靈敏度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性高，重復(fù)性好，檢測成本低，標(biāo)本可保存。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的把待檢蘋果葉片放入0.02M磷酸鹽溶液中研磨，然后加入等量氯仿離心10分鐘取上清液為抗原液；取兔抗蘋果褪綠葉斑病毒血清和兔抗蘋果莖溝病毒血清用抗體緩沖液稀釋制成抗血清液，抗體緩沖液由0.02M磷酸鹽溶液，0.05％吐溫20,2％聚乙烯吡咯烷酮和0.2％牛血清白蛋白制成；辣根過氧化物酶標(biāo)記的A蛋白用0.02M磷酸鹽溶解，使用時用抗體緩沖液稀釋制成酶標(biāo)A蛋白液；將硝酸纖維素膜用打孔器打圓孔狀印跡，在圓孔狀印跡上滴入2μl抗原液，然后浸入封閉緩沖液中30分鐘，封閉緩沖液由0.02M磷酸鹽，0.05％吐溫20,2％聚乙烯吡咯烷酮和2％牛血清白蛋白制成；然后取出硝酸纖維素膜吸干，用0.02M磷酸鹽加0.05吐溫20液洗滌，吸干，然后加抗血清液，每圓孔狀印跡上加25μ1,28℃保濕孵育1小時，然后再用0.02M磷酸鹽溶液加0.05％吐溫20液洗滌，吸干；然后浸入抗體緩沖液封閉15分鐘，洗滌、吸干；再加入酶標(biāo)A蛋白液，每圓孔狀印跡上加25μl,28℃保濕孵育1小時，洗滌、吸干；每圓孔狀印跡上加25μl底物溶液，保濕避光孵育10-30分鐘，帶病毒樣點顯色；底物溶液由二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽加咪唑制成，用時加過氧化氫；將顯色的硝酸纖維素膜用水沖洗，再用蒸餾水洗滌，吸干，如圓孔狀印跡上的斑點與硝酸纖維素膜顏色相同為無蘋果潛隱病毒，如斑點顏色為黃褐色或褐色為有蘋果潛隱病毒。
本發(fā)明的優(yōu)點是檢測過程需時較短，靈敏度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性高，重復(fù)性好、抗原、抗體和試劑藥品用量小，成本低，檢測樣本可保存。
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明做進一步說明采蘋果葉片時間以春秋二季為宜，每個待檢樣品采1-2片葉，裝入樣品袋，再裝入塑料袋，保濕存放待檢；取待檢蘋果葉片0.5克加2倍體積的0.02M磷酸鹽緩沖液研磨，加等量氯仿離心10分鐘取上清液為抗原液；取兔抗蘋果褪綠葉斑病毒血清和兔抗蘋果莖溝病毒血清用抗體緩沖液稀釋制成抗血清液，抗體緩沖液由0.02M磷酸鹽溶液，0.05％吐溫20,2％聚乙烯吡咯烷酮和0.2％牛血清白蛋白制成；辣根過氧化物酶標(biāo)記的A蛋白用0.02M磷酸鹽溶解，使用時用抗體緩沖液稀釋制成酶標(biāo)A蛋白液；每種病毒抗血清應(yīng)單獨用1張硝酸纖維素膜，每個重復(fù)也可單用1張，硝酸纖維素膜的大小根據(jù)等檢樣品數(shù)確定，按每個斑點占1cm2剪裁，用直徑0.5cm2的打孔器在該膜上打圓孔狀印跡，按設(shè)計要求繪制排列圖，在圓孔狀印跡上滴入2μl抗原液，然后浸入封閉緩沖液中30分鐘，封閉緩沖液由0.02M磷酸鹽，0.05％吐溫20,2％聚乙烯吡咯烷酮和2％牛血清白蛋白制成；然后取出硝酸纖維素膜吸干，用0.02M磷酸鹽加0.05％吐溫20液洗滌3次，每次5分鐘，吸干；然后加抗血清液，每圓孔狀印跡上加25μl,28℃保濕孵育1小時，然后再用0.02M磷酸鹽溶液加0.05％吐溫20洗滌3次，每次5分鐘，吸干；然后浸入抗體緩沖液封閉15分鐘，洗滌3次，每次5分鐘，吸干；再加入酶標(biāo)A蛋白液,每圓孔狀印跡上加25μl,28℃保濕孵育1小時，洗滌3次，每次5分鐘，吸干；每圓孔狀印跡上加25μl底物溶液，保濕避光孵育10-30分鐘，帶病毒樣點顯色，底物溶液由二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽加咪唑制成，用時加0.1％過氧化氫；將顯色的硝酸纖維素膜用水沖洗，再用蒸餾水洗滌，吸干，反應(yīng)中止，根據(jù)樣品斑點顯色程度判斷如下陰性- 樣品斑點與白色硝酸纖維素膜顏色相同+ 樣品斑點隱約可見淡黃褐色印跡陽性 + 樣品斑點為淡黃褐色印跡或僅周邊顯黃褐色圓環(huán)、半圓環(huán)、中間不顯色++樣品斑點黃褐色+++樣品斑點深黃褐色或褐色將檢測結(jié)果記入排列圖，寫出檢測報告，連以硝酸纖維素膜一并歸檔保存。
權(quán)利要求
1.點免疫結(jié)合測試蘋果潛隱病毒方法，其特征是把待檢蘋果葉片放入0.02M磷酸鹽溶液中研磨，然后加入等量氯仿離心10分鐘取上清液為抗原液；取兔抗蘋果褪綠葉斑病毒血清和兔抗蘋果莖溝病毒血清用抗體緩沖液稀釋制成抗血清液，抗體緩沖液由0.02M磷酸鹽溶液，0.05％吐溫20,2％聚乙烯吡咯烷酮和0.2％牛血清白蛋白制成；辣根過氧化物酶標(biāo)記的A蛋白用0.02M磷酸鹽溶解，使用時用抗體緩沖液稀釋制成酶標(biāo)A蛋白液；將硝酸纖維素膜用打孔器打圓孔狀印跡，在圓孔狀印跡上滴入2μl抗原液，然后浸入封閉緩沖液中30分鐘，封閉緩沖液由0.02M磷酸鹽，0.05％吐溫20,2％聚乙烯吡咯烷酮和2％牛血清白蛋白制成；然后取出硝酸纖維素膜吸干，用0.02M磷酸鹽加0.05％吐溫20液洗滌，吸干；然后加抗血清液，每圓孔狀印跡上加25μl,28℃保濕孵育1小時，然后再用0.02M磷酸鹽溶液加0.05％吐溫20液洗滌，吸干；然后浸入抗體緩沖液封閉15分鐘，洗滌、吸干；再加入酶標(biāo)A蛋白液，每圓孔狀印跡上加25μl,28℃保濕孵育1小時，洗滌、吸干；每圓孔狀印跡上加25μl底物溶液，保濕避光孵育10-30分鐘，帶病毒樣點顯色；底物溶液由二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽加咪唑制成，用時加過氧化氫；將顯色的硝酸纖維素膜用水沖洗，再用蒸餾水洗滌，吸干，如圓孔狀印跡上的斑點與硝酸纖維素膜顏色相同為無蘋果潛隱病毒，如斑點顏色為黃褐色或褐色為有蘋果潛隱病毒。
全文摘要
點免疫結(jié)合測試蘋果潛隱病毒方法,把蘋果葉片放入0.02M磷酸鹽緩沖液中進行研磨,然后加入等量氯仿離心提取抗原液,取兔抗蘋果褪綠葉斑病毒血清和兔抗蘋果莖溝病毒血清用抗體緩沖液稀釋制成抗血清液,辣根過氧化物酶標(biāo)A蛋白用0.02M磷酸鹽溶解,使用時用抗體緩沖液稀釋,將硝酸纖維素膜打上圓孔狀印跡,在其上滴入2μl抗原液,然后再加上抗血清酶標(biāo)A蛋白液和底物溶液,根據(jù)其斑點顯色情況判斷被檢蘋果是否帶有潛隱病毒。
文檔編號G01N33/50GK1210266SQ9710607
公開日1999年3月10日 申請日期1997年9月3日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月3日
發(fā)明者石蔭萍, 王強生, 楊建明, 孫清榮, 隋從義 申請人:山東省果樹研究所