專利名稱：：C型肝炎病毒感染病的診斷試劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及利用免疫凝集反應檢測C型肝炎病毒(HCV)感染病的診斷試劑。1988年美國的ChironCorporation的研究組首先于病毒中發(fā)現(xiàn)了HCV基因。為了檢測該HCV的抗體，進行了各種重組抗原和合成多肽的研究，開發(fā)了檢測與HCV相關的抗體的試劑盒。而作為檢測方法主要有瓊脂凝膠擴散法、對流免疫電泳法、放射免疫測定法、酶免疫測定法、被動紅細胞凝集法、膠乳凝集法等方法。為了檢測與HCV相關的抗體所用的HCV抗原蛋白質，其中作為結構域蛋白有人們已知的核心和被膜蛋白，而作為非結構域蛋白質有NS1～NS5蛋白質。若只用一種HCV抗原蛋白質，檢測靈敏度不是特別高，特異性上也有問題，所以要將結構域和非結構域的蛋白質適當組合起來使用(Proc.Natl.Acad.Soi.USA8910011-10015，1992)。并且也進行了為進一步提高檢測靈敏度的試驗。例如，在粒子凝集法中有時要使致敏的HCV抗原數(shù)進一步增加，有時對有HCV抗原活性的多肽進行加熱處理(特開平6-1002273號)，或者是使HCV抗原蛋白質和載體蛋白質的融合蛋白質用親水性粒子致敏后再用于試驗(特開平7～198723號)。雖然也曾嘗試用合成多肽作抗原，但一般來說使用合成多肽時檢測靈敏度降低。因此，需要能高靈敏度且迅速測定多個檢測樣品的HCV感染病的診斷試劑以及診斷方法。為達到上述目的，進行了深入的研究，結果發(fā)現(xiàn)，利用戊二醛法將載體蛋白質和各種C型肝炎病毒的核心抗原、NS3抗原、NS4抗原以及NS5抗原通過化學結合調制成復合抗原，然后用載體粒子使復合抗原致敏，這樣可以提高靈敏度，同時通過使用復合抗原也可大幅度地改善粒子的穩(wěn)定性。本發(fā)明提供了用固相使HCV抗原、HCV抗原與載體蛋白質通過化學結合調制的復合抗原致敏后得到的C型肝炎病毒感染病的診斷試劑。作為載體蛋白質，只要是水溶性蛋白質，沒有特別的限制。理想的載體蛋白質的分子量是10,000～1,000,000，更理想的是30,000～150,000之間的蛋白質，具體講，最合適的是牛血清清蛋白(BSA)、卵清清蛋白、血藍蛋白等。另外，還可以使用水溶性的合成高分子，如聚乙二醇、葡聚糖等。作為固相可使用載體粒子、微型血凝反應盤、試管等。最好是用載體粒子。作為載體粒子，可使用通常粒子凝集法的診斷試劑中用的公知的粒子。例如，可以使用象聚苯乙烯膠乳那樣的疏水性粒子，以及粒子表面含有氨基、羧基等親水基團的共聚合粒子、紅細胞、明膠粒子等。最理想的是用聚苯乙烯膠乳。在本發(fā)明的診斷試劑中使用的HCV抗原蛋白質是眾所周知的結構域蛋白質和非結構域蛋白質。作為結構域蛋白質可以使用核心蛋白質，作為非結構域蛋白質可使用NS3蛋白質、NS4蛋白質和NS5蛋白質。有關這些抗原蛋白質的氨基酸和核苷酸序列在文獻(特表平5-508219號)中已有記載。至于抗原蛋白質的來源，只要它有HCV抗原活性，并不受特別限制。即可以使用從天然分離的蛋白，也可使用化學合成的，以及通過基因重組制造出來的蛋白質。作為抗原蛋白質可以使用上述范圍內(nèi)的蛋白質中的各種長度的多肽。最好是用含有至少一個抗原決定簇的由8個以上氨基酸組成的多肽。最理想的是用分子量為1,000～5,000的合成多肽。多肽的合成可利用本專業(yè)中眾所周知的方法，例如固相合成法、片段縮合法、或是用經(jīng)典的溶液合成法進行。理想的方法是文獻(Merrifield.J.Am.Chem.Soc.852149，1963)記載的固相多肽合成法。而本發(fā)明中，核心、NS3、NS4、NS5合種抗原蛋白質，通過組合，這種組合是至少含有一個以上的不同抗原決定簇的1種以上的抗原蛋白質的組合，組合的抗原蛋白可直接地用載體粒子致敏，或是與載體蛋白結合，以復合抗原的形式用載體粒子致敏。后面敘述的實施例中作為核心抗原使用的是包含特表平5-508219號記載的核心區(qū)內(nèi)氨基酸序列中49-68的多肽，作為NS4多肽使用的是含有特表平5-508219號記載的NS4區(qū)內(nèi)氨基酸序列中1706～1725、1718～1739以及1724～1743的多肽，而作為NS5多肽使用的是含有特表平5-508219號記載的NS5區(qū)內(nèi)氨基酸序列中的2287-2306、2299～2318，以及2311～2330的多肽，而作為NS3抗原使用的是含有特表平5～508219號記載的NS3區(qū)內(nèi)氨基酸序列中的1192～1457的多肽，但本發(fā)明并不受此限制。將上述各種抗原蛋白質與載體蛋白通過化學鍵結合后制成復合抗原。發(fā)現(xiàn)用載體粒子使復合抗原致敏后其檢測靈敏度比直接用載體粒子使抗原蛋白質致敏后的檢測靈敏度高。但是，本發(fā)明中使用的象NS3那樣的分子量在10,000以上的抗原沒有觀察到顯著的差別。因此，可以直接用載體粒子使象NS3那樣的抗原蛋白質致敏，也可以與其它抗原蛋白質結合以復合抗原形式用載體粒子致敏。載體蛋白與抗原蛋白質的結合可以采用眾所周知的方法，例如可以使用碳二亞胺法、過碘酸法、馬來酰亞胺法、戊二醛法等方法。通過戊二醛搭橋可增大反應性，所以最理想的是用戊二醛法。調制復合抗原時，載體蛋白與抗原蛋白質的分子數(shù)比大約是1∶3～1∶20，理想的是大約1∶4～1∶9，最理想的比例大約是1∶6～1∶8。利用眾所周知的方法，將這樣調制的復合抗原與載體粒子結合(致敏)。例如可通過物理吸附、或化學吸附結合。如上所述，NS3抗原不只是與載體蛋白質形成復合抗原后用載體粒子致敏，也可以直接用載體粒子致敏，這可以用同樣的方法致敏。致敏是在有緩沖作用的緩沖液中進行的，例如可使用磷酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、Tris緩沖液、醋酸緩沖液，理想的pH是3-8，最理想的pH是pH4-5。本發(fā)明還提供C型肝炎病毒感染病的診斷方法，其特征是將上述的C型肝炎病毒感染病診斷試劑加到檢測樣品中，用流式細胞儀測定載體粒子的凝集程度。本發(fā)明的C型肝炎病毒感染病診斷試劑，在檢測樣品中若存在HCV抗體就可與它反應引起凝集。產(chǎn)生的凝集可以目視，或通過濁度、吸光度等進行測定。若使用應用了流式細胞儀原理的全自動免疫凝集測定裝置(例如東亞醫(yī)用電子社制的PAMIA-30TM)通過光學手段測定凝集粒子的大小，其測定迅速，而且靈敏度和精度都高。即通過鞘流機構將樣品導入流動室，排成一列通過，用激光照射，通過測定散射光的強度就可知道凝集的程度，給出凝集的粒子數(shù)(PPolymer)和未凝集的粒子數(shù)(MMonomer)，由P和M推算出P/T(T＝P+M)，根據(jù)予先得到的臨界值判斷有無HCV抗體。利用這一方法可使HCV抗體的檢測靈敏度更高。而如果使粒徑變成合適的粒徑，通過采用了電阻法的血液分析裝置或粒度分析裝置進行測定也是有可能的。但若考慮到檢測器的堵塞等問題，最好還是用光學方法測定。若使用本發(fā)明的C型肝炎病毒感染病診斷試劑，則不僅診斷靈敏度高，而且可以比市售的診斷試劑更早期地診斷出有無感染。就是說，在使用下列一組血清作試驗時，這組血清是同一個人的HCV抗體陽性化過程中隨時間的推移采集的數(shù)個樣品(例如產(chǎn)生HCV抗體的系列血清，進口商協(xié)和醫(yī)學、制造商BOSTONBIOMEDICA.INC)。試驗的結果表明本發(fā)明的C型肝炎病毒感染病診斷試劑與以往采用的使用紅細包的被動血球凝集法(PHA)、酶免疫檢測法(EIA)以及酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)相比，可以更早地、即在感染初期就可檢測出受HCV的感染。將本發(fā)明的診斷試劑與使用相同的抗原(但并不是與載體蛋白質調制成復合抗原)直接致敏制成的診斷試劑相比，結果表明，還是本發(fā)明的診斷試劑的檢測靈敏度高。另外，本發(fā)明的診斷試劑在長期保存后其檢測靈敏度也不下降，可以說是個穩(wěn)定的診斷試劑。本發(fā)明的診斷方法與以往的ELISA等方法相比，省去了繁瑣的清洗工序，只是簡單地將本發(fā)明的HCV感染病診斷試劑(最好是將HCV抗原致敏的膠乳粒子)與檢測樣品(最好是被驗者血液)混合就可實施。還有本發(fā)明的診斷方法也可以通過能全自動地進行上述混合操作和測定操作的測定儀器實施，適用于多個檢測樣品的測定。實施例在以下的實施例中進一步詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍不受此限制。實施例1HCV復合抗原的調制作為HCV抗原，使用的NS3抗原是根據(jù)特表平5-508219號的實施例1記載通過基因重組制造的。采用的NS3多肽是HCV蛋白質中的1192～1457氨基酸序列。使用的核心抗原、NS4抗原、NS5抗原是分別含有特表平5-508219號記載的49～68、1706～1725、2287～2306氨基酸序列的多肽、這些多肽是使用PERKINELMER社的多肽合成儀(Model431A)合成的。首先將BSA(市售品、分子量66,000)溶于10mMPBS、pH7.0緩沖液中配成0.1％(w/v)濃度的BSA溶液，然后再將核心抗原(49～68氨基酸序列的多肽)溶于10mMPBS、pH7.0緩沖液中配成0.1％(w/v)濃度的核心抗原溶液。將7體積的核心抗原溶液加到1體積的BSA溶液中，最后加10mMPBS、pH7.0緩沖液配成9體積的混合溶液。然后加入1％的戊二醛水溶液，使反應開始，反應溫度是30℃，30分鐘后加1體積20％甘氨酸水溶液終止反應。對于NS3、NS4、NS5抗原也進行同樣的操作，用10mMPBS、pH6-8的緩沖液，對于1體積的1％(w/v)BSA溶液用1～8體積的0.1％(w/v)HCV抗原溶液與其反應，調制HCV復合抗原。實施例2HCV抗原致敏的膠乳的制造將粒徑0.78μm的聚苯乙烯膠乳粒子(積水化學工業(yè)株式會社制)于10mMPBS、pH4.0的緩沖液中配成5％(w/v)濃度膠乳分散液，然后向里邊加入實施例1中調制的NS3復合抗原、NS4復合抗原、NS5復合抗原，添加的比例是每1ml膠乳分散液加50μg上述抗原，于4℃下反應24小時。然后離心(12000rpm，10分鐘)，再加入與起始同量的含有1mg/mlBSA的0.1MPBS、pH7.0的緩沖液，使粒子分散，再次離心，于同樣的緩沖液中使粒子分散即制成HCV抗原致敏的膠乳。實施例3凝集反應向10μl檢測樣品(被驗者血液)中加10上l實施例2調制的HCV抗原致敏的膠乳(5％)，再加入80μl含1mg/mlBSA的0.1M磷酸緩沖液，于45℃反應15分鐘后，測定膠乳粒子的凝集度。該反應及測定可利用全自動免疫測定儀器PAMIA-30(東亞醫(yī)用電子株式會社制)進行，測定前向角散射光。凝集度以凝集的粒子數(shù)占總粒子數(shù)的百分數(shù)(P/T％)表示。測定結果如表1所示。如表1表明的那樣，在HCV抗體陽性檢測樣品中有很高的凝集度。而在HCV抗體陰性的檢測樣品中膠乳不凝集。因為在含有HCV抗體的檢測樣品中看到了凝集，由此可知HCV抗原致敏的膠乳粒子是通過與HCV抗體反應形成凝集的。表1HCV抗體陽性檢測樣品HCV抗體陰性檢測樣品凝集度72.5254.5644.8943.0273.000.950.900.820.820.92(P/T％)臨界值2.79％實施例4早期檢測靈敏度利用市售的HCV抗體的系列血清PHV901，PHV902和PHV903(進口商協(xié)和醫(yī)學，制造商BostonBiomedica.Inc)進行HCV抗體陽性化的早期檢測靈敏度試驗，這組血清，是從同一個人HCV抗體陽性化過程中不同時間間隔采集的血組成的數(shù)個檢測樣品。將使用了實施例2中調制的診斷試劑的本發(fā)明的計數(shù)免疫測定法(CIA)與使用以下方法的其他商社的制品比較A社利用紅細胞的被動血球凝集法(PHA)使用HCV抗原核心、NS3、NS4B社酶免疫檢測法(EIA)使用HCV抗原核心、NS3、NS4C社酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)使用HCV抗原核心、NS3、NS4得到的結果如以下表2、表3和表4所示。(表中B社和C社的數(shù)據(jù)給出了附帶值)。若使用本發(fā)明的診斷試劑和診斷方法，與其他任一商社的診斷試劑相比，可以更早地檢測出PHV902和PHV903(這些被驗者系列血清，從采血的第一天開始，利用PCR檢查抗體，就是陽性的)中HCV感染。表2會有HCV抗體的系列血清PHV901表3含有HCV抗體的系列血清PHV902表4含有HCV抗體的系列血清PHV903實施例5與將HCV抗原直接致敏的診斷試劑的比較使用本發(fā)明的診斷試劑以及使用同一抗原直接致敏后制成的診斷試劑，進行HCV抗體檢測靈敏度的比較試驗。將NS3抗原(通過基因重組法制得的)、核心抗原(通過合成法得到的多肽)、NS4(通過合成法得到的多肽)和NS5抗原(通過合成法得到的多肽)分別與BSA作成復合抗原后，通過實施例2的方法致敏，制成HCV復合抗原致敏的膠乳。作為對照，使用同一抗原和同樣的致敏條件，通過直接致敏，調制HCV抗原直接致敏的膠乳。使用這些膠乳，利用實施例3的方法測定HCV抗體陽性的檢測樣品(A-E)以及HCV抗體陰性的樣品(F～J)的凝集度(P/T％)。考慮到臨界值(對于復合抗原致敏的乳膠是1.95％；對于抗原直接致敏的乳膠是1.01％)后進行了各個檢測樣品的HCV抗體陽性或陰性的判斷。結果如表5所示。表5</tables>對于HCV抗體陽性檢測樣品A和E，若使用抗原直接致敏的診斷試劑不能檢測出HCV抗體，但使用本發(fā)明的復合抗原致敏的診斷試劑卻可以檢測出HCV抗體。實施例6長期保存的穩(wěn)定性試驗將實施例5的5％(w/v)的HCV抗原致敏的膠乳、0.1MPBS、pH7.0的懸濁液冷藏保存，進行試劑保存穩(wěn)定性試驗。所得結果如以下表6所示。表66個月2.55％1.82％9個月2.25％2.10％12個月2.33％2.32％13個月2.44％2.57％</table></tables>以上結果清楚表明，復合抗原致敏的膠乳既使保存了13個月其凝集度仍很穩(wěn)定。另外，使用直接致敏的膠乳在HCV抗體陰性的混合血清的試驗中，其凝集度隨保存期的延長逐漸地上升，而在用HCV抗體陽性的混合血清的試驗中，其凝集度漸漸地下降，同時還可觀察到臨界值漸漸地上升。實施例7HCV抗原致敏膠乳的調制(2)使用與實施例1相同的HCV抗原，除了不將NS3抗原作成復合抗原，而是直接致敏之外，其它操作與實施例2一樣，調制HCV抗原致敏的膠乳。實施例8HCV抗原致敏膠乳的調制(3)使用與實施例1一樣的NS3抗原，核心抗原是上述公報(特表平5-508219號)記載的氨基酸序列49-68的多肽，NS4抗原是同一氨基酸序列中的1706-1725、1718-1737的多肽，用的NS5抗原是同一氨基酸序列中的2287-2306、2299-2318的多肽，與實施例1操作一樣，使1～8體積的0.1％(w/v)HCV抗原溶液與1體積的1％(w/v)的BSA溶液反應來調制HCV復合抗原。而調制HCV抗原致敏膠乳的操作與實施例2一樣。實施例9HCV抗原致敏膠乳的調制(4)使用的NS3抗原與實施例1用的一樣，而核心抗原是上述公報記載的氨基酸序列中的49～68一段多肽，NS4抗原是同一氨基酸序列中的1706～1725、1718～1737、1724～1743多肽，用的NS5抗原是同一氨基酸序列中的2287-2306、2299-2318、2311-2330多肽，與實施例1一樣使1～8體積的0.1％(w/v)HCV抗原溶液與1個體積的1％(w/v)BSA溶液反應，調制HCV復合抗原，然后與實施例2同樣操作調制HCV抗原致敏膠乳。權利要求1.一種C型肝炎病毒感染病診斷試劑，是用固相使HCV抗原、HCV抗原與載體蛋白通過化學結合調制的復合抗原致敏得到的。2.權利要求1中記載的C型肝炎病毒感染病診斷試劑，其中HCV抗原是從核心抗原、NS3抗原、NS4抗原和NS5抗原中選擇的抗原。3.權利要求1或權利要求2中記載的C型肝炎病毒感染病診斷試劑，是用固相使從以下抗原和復合抗原中選出的3種以上的HCV抗原致敏后得到的，a.核心抗原與載體蛋白質通過化學結合調制的復合抗原；b.NS3抗原或NS3抗原與載體蛋白質經(jīng)化學結合調制的復合抗原；c.NS4抗原與載體蛋白質經(jīng)化學結合調制的復合抗原；d.NS5抗原與載體蛋白質經(jīng)化學結合調制的復合抗原。4.根據(jù)權利要求1-3中的任一項記載的C型肝炎病毒感染病診斷試劑，其中HCV抗原是一種以上的抗原，其中含有至少一種具有HCV抗原活性的不同的抗原決定簇。5.權利要求1～4中任一項記載的C型肝炎病毒感染病的診斷試劑，其中載體蛋白質是從BSA、卵清清蛋白或血藍蛋白中選擇的。6.權利要求1～5中任一項記載的C型肝炎病毒感染病的診斷試劑，其中固相是載體粒子。7.權利要求6中記載的C型肝炎病毒感染病診斷試劑，其中載體粒子是疏水性粒子。8.權利要求7中記載的C型肝炎病毒感染病診斷試劑，其中疏水性粒子是聚苯乙烯膠乳。9.C型肝炎病毒感染病的診斷方法，是將權利要求6記載的C型肝炎病毒感染病診斷試劑加到檢測樣品中，測定載體粒子的凝集度。10.權利要求9中記載的C型肝炎病毒感染病的診斷方法，其中凝集度是通過流式細胞儀測定的。11.權利要求10中記載的C型肝炎病毒感染病的診斷方法，其中通過流式細胞儀測定的是前向角散射光。全文摘要本發(fā)明提供能夠高靈敏度且迅速測定多個檢測樣品的HCV感染病診斷試劑及其診斷方法。其中C型肝炎病毒感染病診斷試劑是通過用固相使HCV抗原或HCV抗原與載體蛋白通過化學結合調制成的復合抗原致敏后得到的。其診斷方法是將該診斷試劑添加到檢測樣品中,測定載體粒子的凝集度。文檔編號G01N33/576GK1170875SQ97109798公開日1998年1月21日申請日期1997年5月6日優(yōu)先權日1996年5月7日發(fā)明者高浜洋一,白石順一申請人:東亞醫(yī)用電子株式會社