專利名稱：網(wǎng)織紅細胞測定用試劑和測定方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及網(wǎng)織紅細胞測定用試劑和測定方法，更詳細地是涉及在臨床檢驗方面為了測定血液中網(wǎng)織紅細胞以及網(wǎng)織紅細胞成熟指數(shù)而采用的試劑和測定方法。
網(wǎng)織紅細胞是骨髓中的幼紅細胞脫核后剛剛被釋放到外周血液中的未成熟紅細胞。網(wǎng)織紅細胞作為細胞成熟過程中的遺跡具有以下特征即細胞內(nèi)含有少量的成熟紅細胞中不含的RNA或核糖體、線粒體等細胞亞器官。
在臨床檢驗方面，對網(wǎng)織紅細胞進行分類計數(shù)在掌握患者骨髓內(nèi)造血狀態(tài)方面非常重要。骨髓造血正常的健康人其網(wǎng)織紅細胞占紅細胞總量的0.5～3.0％，可是當骨髓造血處于異常狀態(tài)例如在骨髓造血被抑制的狀態(tài)下，網(wǎng)織紅細胞數(shù)量減少，而在骨髓造血亢進的狀態(tài)下，網(wǎng)織紅細胞數(shù)量增加。具體講就是網(wǎng)織紅細胞數(shù)量在再生不良性貧血、惡性腫瘤化療時減少，而在溶血性貧血時增加。
以前的網(wǎng)織紅細胞計數(shù)方法是通過將血液樣品與含有新美藍(NMB)、或煌焦油藍(BCB)等堿性色素的染色液混合，使網(wǎng)織紅細胞中含有的上述殘存物質(zhì)析出，染色，在顯微鏡下觀察每個細胞，辨別成熟的紅細胞和網(wǎng)織紅細胞。這是一個手工操作方法。
然而，手工操作法的問題在于樣品制作繁瑣，而且檢驗技師間會產(chǎn)生細胞辨別的個人誤差和細胞計數(shù)數(shù)量少等原因造成的統(tǒng)計學上的誤差增大。
為了解決上述問題，可按下面方法(流式細胞儀法)進行，用熒光堿性色素代替上面的堿性色素對網(wǎng)織紅細胞進行熒光染色，用流式細胞儀測定細胞的前方散射光強度和熒光強度，主要用熒光強度的差別辨別成熟紅細胞和網(wǎng)織紅細胞并進行分類計數(shù)。用于這一方法的色素有人們熟知的吖啶橙、噻唑橙、金(色)胺O等色素。
這個方法是根據(jù)網(wǎng)織紅細胞的熒光強度，按其成熟程度對網(wǎng)織紅細胞分類計數(shù)，有可能算出網(wǎng)織紅細胞的成熟指數(shù)，人們已經(jīng)知道，熒光強度高的網(wǎng)織紅細胞的比率，即，新生網(wǎng)織紅細胞的比率作為骨髓造血功能的恢復指標是有用的，人們期待著這一方法的利用。
但另有一問題作為激發(fā)熒光色素的光源需要價格高而且體積大的氬激光器，所以裝置本身價格高且體積大。另外，除了在流式細胞儀法可使用的金(色)胺O以外的上述色素對網(wǎng)織紅細胞染色需5分多鐘時間。特別是噻唑橙需60分鐘以上的染色時間，這已在Lee.L.G.etalCytometry；7508-517(1986)報告了，所以使樣品制備全自動化是困難的，從省力的觀點看是有問題的。由于通過人工進行樣品制備，所以因其手工技術(shù)或操作者不同而使數(shù)據(jù)有偏差，尤其是在網(wǎng)織紅細胞成熟指數(shù)上存在著很大的數(shù)據(jù)偏差這一缺點。
美國第5360739號專利公布了一種流式細胞儀測定方法，即采用比較便宜的He/Ne激光源，噁嗪750作為色素，通過測定散射光強度和吸光度或熒光強度測定網(wǎng)織紅細胞。但該專利未涉及下面講的異常淋巴細胞的問題。
本申請人也專心致力于研究用于正確而迅速測定網(wǎng)織紅細胞以及網(wǎng)織紅細胞成熟指數(shù)的試劑和測定方法，該試劑和測定方法可在配置了便宜的小型光源的流式細胞儀法中使用。但由于在出現(xiàn)異常淋巴細胞的特殊患者的樣品中，淋巴細胞熒光強度與網(wǎng)織紅細胞的熒光強度差不多，所以它們的分辨變得困難了。因此，就白細胞和網(wǎng)織紅細胞的辨別困難問題，目前還未確立正確而迅速地測定的試劑以及測定方法。這一情況也在目前市售的以氬激光為光源的流式細胞儀用網(wǎng)織紅細胞測定用試劑盒(Retic-COUNTTM)的使用說明書中給了提示即在測定白細胞數(shù)異常增加的患者的樣品時需要通過另外的方法確認。
根據(jù)本發(fā)明可以提供由至少一種可使網(wǎng)織紅細胞特異染色的色素和至少一種可使白細胞特異染色的色素組成的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑。
同時可提供使用上述試劑測定網(wǎng)織紅細胞的方法。
本發(fā)明的試劑和測定方法對于象上述那樣患者的檢測樣品，即對于出現(xiàn)很多異常淋巴細胞的患者樣品也可正確而迅速地測定網(wǎng)織紅細胞。本發(fā)明的試劑尤其適合于流式細胞儀法中使用。就是說，對于出現(xiàn)很多異常淋巴細胞的患者樣品，通過使用本發(fā)明的試劑，可以不讓成熟的紅細胞和網(wǎng)織紅細胞的熒光強度變化，而只使白細胞的熒光強度增大，所以可以精度更高地分類計數(shù)網(wǎng)織紅細胞。
本發(fā)明的試劑是由使網(wǎng)織紅細胞特異染色的色素和使白細胞特異染色的色素組成的。所謂使網(wǎng)織紅細胞特異染色的色素是指用這種色素染色可使網(wǎng)織紅細胞與其它血細胞區(qū)別開來。例如式(I)化合物
式中，R1為氫原子或低級烷基；R2和R3可相同或不同，為氫原子、低級烷基或低級烷氧基；R4為氫原子、?；虻图壨榛?；R5為氫原子，可被取代的低級烷基；Z為硫原子、氧原子或被低級烷基取代的碳原子；n為1或2；X-是陰離子。
式(I)的R1中的低級烷基是指碳數(shù)為1～6的直鏈或支鏈的烷基，如甲基、乙基、丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基或己基。其中理想的是甲基和乙基。
R2和R3中的低級烷基與上述相同，而作為低級烷氧基是指碳數(shù)為1～6的烷氧基，如甲氧基、乙氧基、或丙氧基，其中理想的是甲氧基和乙氧基，而R2和R3是氫原子時更理想。
R4中的?；硐氲氖菑闹咀弭人嵫苌孽；?，例如乙?；捅；?，其中理想的是乙酰基。而低級烷基與上述的一樣。
R5中的低級烷基與上述的一樣，所謂可被取代的低級烷基是指可以被1～3個羥基或鹵原子(如氟、氯、溴、磺)等取代的低級烷基，其中，理想的是羥甲基和羥乙基。
Z中的低級烷基與上述的一樣，作為Z理想的是硫原子。
X-中的陰離子有鹵素離子(氟、氧、溴或碘離子、鹵化硼離子(BF4-、BCl4-、BBr4-等)、磷化合物離子、鹵氧酸離子、氟硫酸離子、甲硫酸離子、苯環(huán)上有鹵原子或鹵代烷基取代基的四苯基硼化合物離子等，其中，理想的是溴離子和BF4-。
下面給出了式(I)的具體化合物。
上面式(I)中n＝1的化合物，可經(jīng)過下面途徑合成。例如用下式表示的化合物與N，N-二取代甲脒反應，
其生成物再與以下式表示的喹啉衍生物反應，然后經(jīng)氟硼酸鈉處理，即可合成。
而式(I)中n＝2的化合物，是在上述反應中用丙二醛雙(苯亞氨)鹽代替N，N-二取代甲脒進行反應合成的。
其它可能使用的色素的例子，其結(jié)構(gòu)式如下
和 例如(1)1，1’，3，3，3’，3’-六甲基吲哚二喹啉藍色素碘化物(HIDCI，可從LAMBDA PHYSIK社購買到)
(2)1，1’-二乙基-2，4’-醌喹啉藍色素碘化物(NK-138，可從日本感光色素研究所買到)
(3)頻哪氰醇氯化物
(4)1，3’-二乙基-2，2’-醌硫雜喹啉藍色素碘化物。
用作網(wǎng)織紅細胞檢測用的色素也可使用眾所周知的噁嗪750。為使網(wǎng)織紅細胞染色，本發(fā)明試劑中的上述色素用量要充足，可根據(jù)色素的種類、試劑組成進行適當調(diào)整。例如，大約為0.1～100mg/升，更理想的量大約是0.3～30mg/升，最理想的是0.3～3mg/升。
而作為使白細胞特異染色的色素例如有式(II)和式(III)代表的色素
式中R6和R7可相同也可不同，表示氫原子、低級烷基、低級烷氧基或苯基；R8～R11可相同或不同，表示氫原子或低級烷基；X-是陰離子。
式中R12和R13可相同也可不同，表示氫原子、低級烷基，低級烷氧基或用低級烷基取代的氨基，R14和R15相同或不同，表示氫原子或低級烷基；X-是陰離子。
而上述式(II)和式(III)中的低級烷基以及低級烷氧基與前面所述一樣。
為使白細胞染色，本發(fā)明試劑中色素的濃度要充足而且這一濃度不妨礙網(wǎng)織紅細胞測定用色素對網(wǎng)織紅細胞的染色。濃度可以根據(jù)色素的種類以及試劑組成進行適當調(diào)整。例如為0.001～200mg/升，更理想的大約是0.003～3mg/升，最理想的是0.003～0.03mg/升。
在本發(fā)明試劑組成中使網(wǎng)織紅細胞特異染色的色素可以迅速地向紅細胞內(nèi)滲透，將細胞內(nèi)的RNA染色。因此，即使只使用使網(wǎng)織紅細胞特異染色的色素，對網(wǎng)織紅細胞進行分類計數(shù)也是可能的。然而，在因急性淋巴性白血病等使淋巴細胞系的異常細胞增多等特別的情況下，淋巴細胞和未成熟的網(wǎng)織紅細胞的熒光強度變得大致相等，所以辨別這兩種細胞就變得困難了。
另一方面，本發(fā)明的試劑中含有能使白細胞特異染色的色素，用上述濃度只使白細胞染色是可能的。使白細胞特異染色的色素因色素的種類不同染色也不一樣，大概都可以使白細胞中的不包含在網(wǎng)織紅細胞中的顆粒成分或核等特異染色，我們認為由此會使白細胞的熒光強度增強。其結(jié)果，網(wǎng)織紅細胞和白細胞的熒光強度會產(chǎn)生明顯的差別，即，白細胞的熒光強度比網(wǎng)織紅細胞的熒光強度強，由于網(wǎng)織紅細胞的熒光強度沒有變化，所以即使在上述那樣的情況下辨別這兩種細胞也是可能的。
這里雖然例舉了用紅色波長的光可激發(fā)的色素，但本發(fā)明中不限于這些色素，也可將被藍色波長光那樣的其它波長的光激發(fā)的色素組合使用，即使在這種情況下，也可提高網(wǎng)織紅細胞和白細胞的辨別率。
另外還可使本發(fā)明試劑中含有抑制紅細胞的非特異染色的多價陰離子、緩沖液、滲透壓補償液和/或促染液。
本發(fā)明人在研究試劑組成時發(fā)現(xiàn)，當通常使用的染液中的滲透壓補償液的主要成分是NaCl(主要是Cl-)時，紅細胞的非特異熒光變大，而網(wǎng)織紅細胞的特異熒光變小，其結(jié)果使得紅細胞和網(wǎng)織紅細胞的辨別變得困難了。另外也發(fā)現(xiàn)將染色液中的Cl-換成多價陰離子時，成熟紅細胞的非特異熒光顯著地被抑制，紅細胞和網(wǎng)織紅細胞的辨別也變得容易了。因此理想的是使本發(fā)明試劑中含有多價陰離子。作為多價陰離子，硫酸根離子、磷酸根離子、碳酸根離子以及多價羧酸根離子特別適合。供給這些離子的化合物例如有檸檬酸、硫酸、磷酸、EDTA及它們的堿金屬鹽等。多價陰離子的濃度為在試劑的總離子成分中所占比例在50％以上，理想的是占70％以上。
另外，本發(fā)明的試劑中可含有使pH保持一定的緩沖液。使用緩沖液使pH保持一定由此可保持穩(wěn)定的網(wǎng)織紅細胞的染色結(jié)果，使用的濃度是數(shù)mM～100mM左右。緩沖液的種類，只要是通常使用的，并不特別限定，例如按所希望的pH適當使用羧酸鹽類、磷酸鹽類、古德緩沖液、牛磺酸、三乙醇胺等。本發(fā)明中試劑的合適pH因所用色素不同而有所不同，但一般是在6.0～11.0范圍，理想的pH是處于7.0～10.0范圍，更理想的是在8.0～9.5范圍內(nèi)。若pH比上述范圍過低時，由于紅細胞易脆化，變得易溶血，所以使得網(wǎng)織紅細胞的正確測定變得困難了。若pH過高，由于紅細胞膜上的酸性官能團解離，使它易與陽離子色素結(jié)合，增加紅細胞的非特異熒光。由于這一原因有使成熟紅細胞與網(wǎng)織紅細胞的辨別變得困難的傾向，這是不希望的。若上述多價陰離子具有將pH調(diào)節(jié)到合適的pH范圍內(nèi)的緩沖能力，也可兼用作緩沖劑。
本發(fā)明的試劑中也含有滲透壓補償液，為了防止紅細胞的低滲溶血，希望將滲透壓調(diào)整到生理學上的滲透壓。通常調(diào)整到150～600mOsm/kg的范圍內(nèi)。滲透壓補償液并不被特別限定。例如，合適的有丙酸等酸的堿金屬鹽、葡萄糖、甘露糖等糖類。若未達到所占試劑中總陰離子的比例的50％，也可使用象NaCl那樣的堿金屬鹵化物、堿土金屬鹵化物等。若是用上述的多價陰離子以及緩沖液可以將滲透壓調(diào)節(jié)到適當?shù)姆秶鷥?nèi)時，就不需含有滲透壓補償液了。
本發(fā)明的試劑中還可含有作為促染液的以式(IV)表示的陽離子表面活性劑。
式中，R16為碳數(shù)是8-12的烷基；R17、R18、R19相同或不同，表示低級烷基；Y-為鹵素離子。
其中，碳數(shù)8-12的烷基包括直鏈或支鏈的烷基，例如辛基、癸基或十二烷基，基中理想的是辛基和癸基。
而低級烷基與上述的相同。
作為陽離子表面活性劑的具體例子有溴化辛基三甲基銨(OTAB)、溴化癸基三甲基銨(DTAB)或氯化十二烷基三甲基銨(LTAC)。
作為促染液的陽離子表面活性劑的濃度，總碳數(shù)愈增加，少量即可有效。例如OTAB為300～20000mg/升，DTAB為500～300mg/升，而LTAC為50～250mg/升即可。陽離子表面活性劑的作用機制雖然不明確，但由于它會引起與紅細胞膜的某些相互作用，人們認為它可促進色素的通透性。因此樣品中若促染液量多就會傷害紅細胞，有時會引起溶血，這是所不希望的。
另外由于陽離子表面活性劑有使紅細胞球狀化的作用，所以使紅細胞團的前方散射光強度分布聚束。其結(jié)果，使血小板和紅細胞系細胞的辨別變得容易了。還有在小球紅細胞病、例如在缺鐵性貧血等病的治療中，血液中因疾病而產(chǎn)生的小球形紅細胞和正球形紅細胞混在一起，但若用本發(fā)明的試劑通過前方散射光強度辨別這兩種細胞也成了可能。同時也可同樣辨別少量出現(xiàn)的橢圓形紅細胞。這樣一來利用陽離子表面活性劑的紅細胞球形化作用在測定網(wǎng)織紅細胞的同時也可檢測小球形紅細胞和橢圓形紅細胞等紅細胞的異常形態(tài)。
本發(fā)明的試劑中除含有上述組成成分之外，也可含有例如2-吡啶基硫代-1-氧化鈉或β-苯乙醇等防腐劑。
還有在本發(fā)明的試劑中使用的色素在水溶液中不穩(wěn)定時可將色素溶解在適當?shù)目膳c水互溶的非水溶劑中保存，如乙醇、二甲基亞砜、乙二醇等。使用時與含有別的成分的水溶液混合后就可使用。各個色素溶解在同一非水溶劑中也是可能的，而也可能溶解在別的非水溶劑中。
本發(fā)明的試劑在使用流式細胞儀測定網(wǎng)織紅細胞時特別有效。
工序(1)，將本發(fā)明的網(wǎng)織紅細胞測定試劑與血液學樣品混合后制備測定用樣品。所謂血液學樣品是指含有成為測定對象的血液成分的任何樣品。例如，進行過抗凝劑處理的外周血液或骨髓液。測定樣品的制備理想的是將網(wǎng)織紅細胞測定用試劑與血液學樣品按100∶1～1000∶1的比例混合后使其反應，此時的反應溫度在25～50℃范圍內(nèi)合適，更優(yōu)選在35～45℃。而合適的反應時間因試劑中所含色素而不同，但理想的是10秒～5分鐘左右，更理想的是20秒～2分鐘左右，最理想的是20～60秒左右。
工序(2)，將在工序(1)中得到的測定用樣品導入裝有紅色波長光源的流式細胞儀的流動系統(tǒng)中。作為紅色波長光源，只要是可產(chǎn)生使用色素(熒光色素)的激發(fā)波長附近的光，例如600～680nm左右的波長的光的光源即可，并不被特別限定。例如He/Ne激光器、紅色波長范圍的半導體激光器等光源。

圖1給出了使用的含有紅色波長光源的流式細胞儀的光學部分。在半導體激光器1的前方通過會聚透鏡組2裝了一個流動池3，在流動池的前方通過光束限制器4裝了前方散射光用受光透鏡5和光電二極管6。而在流動池3的側(cè)面通過側(cè)面熒光用的受光透鏡7裝了帶通濾波器8和光電倍增管9。而流動部分、數(shù)據(jù)處理部分等其它構(gòu)件，將眾所周知的結(jié)構(gòu)等改進后即可使用。
工序(3)，用上述的紅色波長的光照射流過鞘流(Sheath-flow)中的細胞。
工序(4)是測定由細胞發(fā)出的散射光和熒光。此時的散射光無論是前方散射光或側(cè)面散射光都可以。作為前方散射光無論是前方低角散射光(1～5°)或是前方高角散射光(6～20°)都可以。散射光是反映細胞大小信息的參數(shù)，其它測定細胞大小信息的方法還有電阻法等。根據(jù)情況不同可利用電阻法代替散射光的測定來測定電阻信號。
工序(5)，根據(jù)散射光強度或散射光強度和熒光強度的散射圖辨別血小板和其它的細胞。
工序(6)，根據(jù)熒光強度或者熒光強度和散射光強度的散射圖辨別紅細胞、網(wǎng)織紅細胞以及白細胞。
工序(7)，對紅細胞和網(wǎng)織紅細胞分類計數(shù)，算出它們的細胞數(shù)和細胞比率。
將網(wǎng)織紅細胞按其成熟程度的差別分類計數(shù)，具體講是根據(jù)熒光強度的不同進行的，可以算出它們占總網(wǎng)織紅細胞的比例。
實施例1首先按下列組成配制網(wǎng)織紅細胞測定用試劑。
使紅細胞特異染色的色素A 3mg使白細胞特異染色的色素B 0.03mg麥黃酮(緩沖劑) 1.79g檸檬酸3鈉二水和物(多價陰離子)29.4gLTAC(陽離子表面活性劑、促染劑) 150mg精制水 1升(用氫氧化鈉將pH調(diào)到9.0)
噁嗪170將經(jīng)過抗凝劑處理的健康人血液10μl加到2ml的試劑中，40℃溫育120秒后，將得到的測定用樣品用圖1所示的光學部分測定前方散射光強度和熒光強度。在圖2所示的散射圖中，網(wǎng)織紅細胞比率是2.0％。而作為對照方法用東亞醫(yī)用電子制R-2000測定的也是2.0％。
同樣測定淋巴系統(tǒng)的異常細胞出現(xiàn)的血液時得到圖3的散射圖。根據(jù)這個散射圖可以清楚地辨別網(wǎng)織紅細胞團和白細胞團。
實施例2首先按下列組成配制網(wǎng)織紅細胞測定用試劑。
使網(wǎng)織紅細胞特異染色的色素A3mg使白細胞特異染色的色素C30mg麥黃酮 1.79g檸檬酸3鈉二水和物 29.4gLTAC 150mg精制水 1升
(用氫氧化鈉將pH調(diào)到9.0)
將10μl經(jīng)抗凝劑處理的健康人血加到2ml的試劑中，40℃溫育120秒后，將得到的測定用樣品用圖1所示的光學部分測定前方散射光強度和熒光強度。圖4給出的散射圖中網(wǎng)織紅細胞比率是1.8％，而作為對照方法用東亞醫(yī)用電子制R-2000測定時是1.7％。
比較例1首先按下列組成配制網(wǎng)織紅細胞測定用試劑。
使網(wǎng)織紅細胞特異染色的色素A3mg麥黃酮 1.79g檸檬酸3鈉二水和物 29.4gLTAC 150mg精制水 1升(用氫氧化鈉將pH調(diào)到9.0)將10μl進行過抗凝劑處理的健康人血加到2ml試劑中，40℃溫育120秒后，將得到的測定用樣品用圖1所示的光學部分測定前方散射光強度和熒光強度。圖5給出的散射圖中網(wǎng)織紅細胞的比率為2.1％，而作為對照方法用東亞醫(yī)用電子制R-2000測定時是2.0％。
同樣測定出現(xiàn)淋巴系統(tǒng)的異常淋巴細胞的血液時得到圖6的散射圖。根據(jù)這個散射圖不能清楚地辨別網(wǎng)織紅細胞團和白細胞團。
采用本發(fā)明的試劑和測定方法，使用配置了便宜、小型的光源的流式細胞儀法，既使在異常淋巴細胞出現(xiàn)的特殊檢測樣品中也可正確、迅速地測定網(wǎng)織紅細胞。即，利用本發(fā)明的試劑和測定方法對于出現(xiàn)異常淋巴細胞的患者樣品，可以不使成熟紅細胞和網(wǎng)織紅細胞的熒光強度變化，而只使白細胞的熒光強度變大，因此可以更精確地對網(wǎng)織紅細胞分類計數(shù)。
附圖的簡單說明圖1在本發(fā)明的測定方法中使用的帶有紅色波長光源的流式細胞儀的光學部分的簡圖。
圖2使用含有本發(fā)明的使網(wǎng)織紅細胞特異染色的色素A和使白細胞特異染色的色素B的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑，測定健康人外周血液樣品的前方散射光強度以及熒光強度時得到的散射圖。
圖3使用含有本發(fā)明的使網(wǎng)織紅細胞特異染色的色素A和使白細胞特異染色的色素B的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑，測定出現(xiàn)異常淋巴細胞的患者的外周血液樣品的前方散射光強度以及熒光強度時得到的散射圖。
圖4使用含有本發(fā)明的使網(wǎng)織紅細胞特異染色的色素A和使白細胞特異染色的色素C的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑，測定健康人的外周血液樣品的前方散射光強度以及熒光強度時得到的散射圖。
圖5使用本發(fā)明的只含有使網(wǎng)織紅細胞特異染色的色素A的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑，測定健康人外周血液樣品的前方散射光強度以及熒光強度時得到的散射圖。
圖6使用只含有使網(wǎng)織紅細胞特異染色的色素A的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑，測定有異常淋巴細胞出現(xiàn)的患者的外周血液樣品的前方散射光強度以及熒光強度時得到的散射圖。
符號說明1.半導體激光器2.會聚透鏡組3.流動池4.光束限制器5.前方散射光用受光透鏡6.光電二極管7.側(cè)面熒光用受光透鏡8.帶通濾波片9.光電倍增管
權(quán)利要求
1.網(wǎng)織紅細胞測定用試劑，由至少一種能使網(wǎng)織紅細胞特異染色的色素和至少一種能使白細胞特異染色的色素組成。
2.權(quán)利要求1中記載的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑，其中使網(wǎng)織紅細胞特異染色的色素如式(I)所示，
(式中，R1為氫原子或低級烷基；R2和R3相同或不同，表示氫原子、低級烷基或低級烷氧基；R4為氫原子、?；虻图壨榛籖5為氫原子、可以被取代的低級烷基；Z為硫原子、氧原子或被低級烷基取代的碳原子；n為1或2，X-為陰離子)。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中任一項記載的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑，其中使白細胞特異染色的色素如式(II)或式(III)所示，
(式中，R6以及R7相同或不同，表示氫原子、低級烷基、低級烷氧基或苯基；R8～R11相同或不同，表示氫原子或低級烷基；X-為陰離子)
(式中，R12及R13相同或不同，表示氫原子、低級烷基、烷氧基以及可被低級烷基取代的氨基；R14和R15相同或不同，表示氫原子或低級烷基；X-是陰離子)。
4.權(quán)利要求1～3中任一項記載的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑，其中含有抑制紅細胞的非特異熒光的多價陰離子。
5.權(quán)利要求1～4中任一項記載的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑，其中含有使pH保持一定的緩沖液。
6.權(quán)利要求1～5中任一項記載的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑，其中含有使?jié)B透壓維持在生理學滲透壓的滲透壓補償液。
7.權(quán)利要求1～6中任一項記載的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑，其中含有促染液。
8.權(quán)利要求7中記載的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑，其中的促染液是陽離子表面活性劑。
9.權(quán)利要求8中記載的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑，其中的陽離子表面活性劑如式(IV)所示，
(式中，R16為碳數(shù)8～12的烷基；R17、R18、R19相同或不同，表示低級烷基；Y-為鹵素離子)。
10.權(quán)利要求9中記載的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑，其中的陽離子表面活性劑是下列的至少一種氯化十二烷基三甲基銨、溴化癸基三甲基銨、溴化辛基三甲基銨。
11.使用權(quán)利要求1～10中任一項記載的試劑測定網(wǎng)織紅細胞的方法。
12.權(quán)利要求11中記載的方法，該方法使用流式細胞儀。
全文摘要
本發(fā)明提供由至少一種能使網(wǎng)織紅細胞特異染色的色素和至少一種能使白細胞特異染色的色素組成的網(wǎng)織紅細胞測定用試劑和測定方法。利用該試劑,使用配備便宜且小型的光源的流式細胞儀對既使有異常淋巴細胞等出現(xiàn)的特殊檢測樣品也可正確而迅速地測定網(wǎng)織紅細胞。
文檔編號G01N33/50GK1172953SQ9711072
公開日1998年2月11日 申請日期1997年4月11日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月12日
發(fā)明者赤井保正, 系瀨祐司, 田中加代, 坂田孝 申請人:東亞醫(yī)用電子株式會社