專利名稱：對(duì)蝦白斑桿狀病毒快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及我國對(duì)蝦爆發(fā)性流行病原—白斑桿狀病毒(C型桿狀病毒)的快速檢測方法，該方法適用于對(duì)蝦(包括蝦苗及蝦各組織)和蝦養(yǎng)殖環(huán)境中水生生物等的檢疫，檢測或診斷。
本發(fā)明是根據(jù)所測得的部分對(duì)蝦白斑桿狀病毒DNA的序列，利用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)檢測對(duì)蝦白斑桿狀病毒。關(guān)于對(duì)蝦白斑桿狀病毒的PCR檢測，臺(tái)灣大學(xué)的羅初芳等在《水產(chǎn)生物疾病》(DIS·AQUAT·ORG，Vo1.25,1996)雜志上發(fā)表了PCR法檢測該病毒，所用引物對(duì)PCR擴(kuò)增后的帶為1447bP(堿基對(duì))大小，擴(kuò)增帶大，靈敏度低。另外，上海生化所周國瑛和黃海水產(chǎn)所郭福生等在《1996年第二屆全國人工養(yǎng)殖對(duì)蝦疾病綜合防治和環(huán)境管理學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集》上分別發(fā)表相關(guān)文章周國瑛等提出的方法所用樣品量大(5g)，提取方法繁雜，操作不便，此外引物對(duì)的序列未公開；郭福生等的論文中所用引物對(duì)是參照草蝦包含體桿狀病毒(A型桿狀病毒)的多角體基因序列設(shè)計(jì)，因而特異性差。
對(duì)蝦白斑桿狀病毒，至今沒有建立細(xì)胞系，所以材料受限制。其屬于C型桿狀病毒，無包含體，分離過程中病毒易降解，所以其基因組的DNA序列在國內(nèi)外未見報(bào)導(dǎo)，也未有相關(guān)專利。本發(fā)明是在獲得完整病毒基因組，將部分酶切片段克隆并經(jīng)地高辛標(biāo)記作為探針進(jìn)行DNA斑點(diǎn)雜交，選擇蝦病毒DNA雜交信號(hào)強(qiáng)，而正常蝦染色體無雜交信號(hào)的克隆片段進(jìn)行序列測定。依據(jù)所得的序列設(shè)計(jì)并尋找特異性強(qiáng)、靈敏度高的引物對(duì)用于PCR，達(dá)到快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測。
PCR方法常受模板DNA樣品的純凈影響，本發(fā)明利用鹽酸胍的強(qiáng)變性作用，并輔以TritonX-100一類的溫和去污劑來解聚組織細(xì)胞的蛋白，最后用玻璃粉Sillca(2.1mm)吸附一定大小的DNA片斷，去除PCR的抑制因子，使PCR反應(yīng)很好地進(jìn)行。
酶切克隆片斷的DNA序列測得如下LOCUSPWSBV1 1421 bp DNA1 GAATTCAGCA GAATTGTTTC CTTCTTAACC ATTCTTCGTA AGAACATTAC ACCCGCATTA61 GTCGACCCTA AAGGCGCGTT ACACGAGAAA GTAGCCATCT ATTTGACCCT TCTTTCAACC121 AAATCAAAAC TAGAAAACTT TTTCCAATAC GGTCTCAGTA ATTCGTCCTC AGTTGATCTT181 AGCCATCTAA AACCCATTAA TTGTAGCAAC AATCTCAAGA ATATTGAAGA CACATTCATG241 TACAGAAAGT CCACCCTATT CTTATTATGG CCCTCCCAGA AAATTTCACA GCTCTCTTGC301 AACAGGAACA AATGGACCCC GATACTGCCA TTGAAAGCAG ACGCTCCCTT ACCACCTTCC361 TTATCATTCC AACACTGCTT CAATGGCGAA CGGTGCAAGA GCCGCTGTGG GTGCAGGAGG421 AGGAAACCCA ATGGGCTTGT ATCTTTTTTC CCACATTCTT CACGAGTCTA CCGTCACAAC481 ATCAAACCCC GTCACAGACA CCACAGAAAA CGTCAACTAT ATTCCTCTGT TACCAGATCC541 TGTTATGGTA GTGAACCCCT TCAAGGATTC TGCTAGGTTG ATCGTTAACA ACAACAATTC601 TGGAATTGAT GTCTTGAATG ATAAGTCGTG CAACTACTTG CAAGTATCCA TGCCATCTGA661 ATCATCTGGC CTCGTCACCA ATACTGGATG CTCTTCTTCT TCTTCCTCAT CTTCGTCTGA721 TACCTTCAAG TACGTCAGGA GAGACAATAC GCCTGTGAAT CTTCCCCGTG TCACACCAGC781 CGTTCTCTGT TCTGATGCTT CCTCTAATCT CTTGGACGTG TTCTCCAGGG CAGATATTGT841 CCTCGAAAAC ATGAACGTGA GATTTGGTTT CATGCCCGAG ATTATTGCTG CCGTCTCCAA901 ATTCAAGGGG CTGACCAAGG AAGAGGTTAT TAAGCAAATG GTTTCTCAGA ACAACATCAA961 CAACAACAGC AACAACAACA ACGGAAATGG GAAGAAAACA ACCGTCGATC CAGTCACTGG1021 GGATATTGTT ATCACCAATG CCACATTCCC CGACACTCGT CCTCTATACA CTGCAGCAAA1081 TGGAGGAACA TCATCATTCA AATGGGGAGA TATCAACGAC AGAAAAATGC ACGCCAAGGC1141 TTTCCCCACC TTCTTTATTG GTAACCCAAC CGCCGCCGCA ACAGCTAACG GAGTGCCTCT1201 TACATCTGAG GGAATTTCCC TCACTGAAGA AAAACGCAAG AAAATCGCAG GCATCTCTGA1261 AGGATCAATT GGCACGGGGG CTCTGCGTGC AGCGGCCAAC ACCCGCCTCT CATCCGACAT1321 GGAACCTGTC ATGAAGGGAT GGAACAACAT TGTTCAGCTT CAACAAACAT TCAAGAAAGC1381 TTCAGATAAA CTCACTCATC TTTTGAGATC GGGAGGAATT C
PCR引物對(duì)序列如下N端引物tac tgc cat tga aag cag acg ctcC端引物tta ata acc tct tcc ttg gtc agcPCR的模板DNA樣品制備方法如下鹽酸胍裂解液(配方見后)裂解勻漿組織，低速離心去除雜質(zhì)，Silica純化。
以下對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行詳細(xì)描述實(shí)驗(yàn)對(duì)象懷疑帶有該病毒的新鮮對(duì)蝦或其冷凍品；實(shí)驗(yàn)材料所用試劑為普通試劑，可向生物試劑公司購買。
裂解液6M鹽酸胍溶于TE緩沖液中，含1％TritonX-100，調(diào)PH7.4；TE緩沖液10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH 8.3；洗滌液等體積混合乙醇和TEM緩沖液TEN緩沖液20mM Tris-HCl，1mM EDTA，100mM NaCl，PH7.4；實(shí)驗(yàn)步驟1.從實(shí)驗(yàn)對(duì)象摘取內(nèi)臟(諸如肝胰腺、腸、或腮等)。
2.取上述樣品(如是蝦苗或肌肉，則取0.3g)于裝有500ul裂解液的1.5ml小離心管中，用合適的玻棒勻漿器勻漿15min，10,000rpm離心5min；3.轉(zhuǎn)移上清液，加入3ul Silica(2.1mm)，冰水浴中放置30min，不時(shí)的振蕩；14,000rpm離心15sec，棄上清，沉淀用洗滌液洗，反復(fù)2次；最后加入15ulTE緩沖液，充分混勻，55℃熱水浴5min，高速離心30sec，取上清得到模板DNA樣品。
4.按標(biāo)準(zhǔn)50ulPCR反應(yīng)體系加入DNA樣品5ul，95℃變性5min后，照下列文件94℃，45sec；60℃，45sec；72℃，1min擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。
5.取PCR產(chǎn)物10ul，在1.5％瓊脂糖膠電泳，EB(溴乙錠)染色，紫外檢測，擴(kuò)增片斷大小為611bp(堿基對(duì))。
本發(fā)明公開的DNA序列經(jīng)過DNA斑點(diǎn)雜交證明與對(duì)蝦染色體無同源性，根據(jù)序列設(shè)計(jì)的PCR引物對(duì)具有很強(qiáng)的特異性，結(jié)合PCR技術(shù)的快速、靈敏，近3～4小時(shí)即可完成全過程，使對(duì)蝦桿狀病毒的檢測準(zhǔn)確、快速。本發(fā)明將為對(duì)蝦白斑桿狀病毒的檢疫、快速診斷、流行病學(xué)等方面提供強(qiáng)有力的技術(shù)手段。
權(quán)利要求
1.一種檢測對(duì)蝦白斑桿狀病毒的方法，其特征在于所用PCR引物依據(jù)純化后的病毒DNA酶切片斷克隆的序列設(shè)計(jì)。
2.一種如權(quán)利要求1所述的檢測對(duì)蝦白斑桿狀病毒的方法，其特征在于病毒DNA酶切片斷克隆的序列為LOCUSPWSBV1 1421 bp DNA1 GAATTCAGCA GAATTGTTTC CTTCTTAACC ATTCTTCGTA AGAACATTAC ACCCGCATTA61 GTCGACCCTA AAGGCGCGTT ACACGAGAAA GTAGCCATCT ATTTGACCCT TCTTTCAACC121 AAATCAAAAC TAGAAAACTT TTTCCAATAC GGTCTCAGTA ATTCGTCCTC AGTTGATCTT181 AGCCATCTAA AACCCATTAA TTGTAGCAAC AATGTCAAGA ATATTGAAGA CACATTCATG241 TACAGAAAGT CCACCCTATT CTTATTATGG CCCTCCCAGA AAATTTCACA GCTCTCTTGC301 AACAGGAACA AATGGACCCC GATACTGCCA TTGAAAGCAG ACGCTCCCTT ACCACCTTCC361 TTATCATTCC AACACTGCTT CAATGGCGAA CGGTGCAAGA GCCGCTGTGG GTGCAGGAGG421 AGGAAACCCA ATGGGCTTGT ATCTTTTTTC CCACATTCTT CACGAGTCTA CCGTCACAAC481 ATCAAACCCC GTCACAGACA CCACAGAAAA CGTCAACTAT ATTCCTCTGT TACCAGATCC541 TGTTATGGTA GTGAACCCCT TCAAGGATTC TGCTAGGTTG ATCGTTAACA ACAACAATTC601 TGGAATTGAT GTCTTGAATG ATAAGTCGTG CAACTACTTG CAAGTATCCA TGCCATCTGA661 ATCATCTGGC CTCGTCACCA ATACTGGATG CTCTTCTTCT TCTTCCTCAT CTTCGTCTGA721 TACCTTCAAG TACGTCAGGA GAGACAATAC GCCTGTGAAT CTTCCCCGTG TCACACCAGC781 CGTTCTCTGT TCTGATGCTT CCTCTAATCT CTTGGACGTG TTCTCCAGGG CAGATATTGT841 CCTCGAAAAC ATGAACGTGA GATTTGGTTT CATGCCCGAG ATTATTGCTG CCGTCTCCAA901 ATTCAAGGGG CTGACCAAGG AAGAGGTTAT TAAGCAAATG GTTTCTCAGA ACAACATCAA961 CAACAACAGC AACAACAACA ACGGAAATGG GAAGAAAACA ACCGTCGATC CAGTCACTGG1021 GGATATTGTT ATCACCAATG CCACATTCCC CGACACTCGT CCTCTATACA CTGCAGCAAA1081 TGGAGGAACA TCATCATTCA AATGGGGAGA TATCAACGAC AGAAAAATGC ACGCCAAGGC1141 TTTCCCCACC TTCTTTATTG GTAACCCAAC CGCCGCCGCA ACAGCTAACG GAGTGCCTCT1201 TACATCTGAC GGAATTTCCC TCACTGAAGA AAAACGCAAG AAAATCGCAG GCATCTCTGA1261 AGGATCAATT GGCACGGGGG CTCTGCGTGC AGCCGCCAAC ACCCGCCTCT CATCCGACAT1321 GGAACCTGTC ATGAAGGGAT GGAACAACAT TGTTCAGCTT CAACAAACAT TCAAGAAAGC1381 TTCAGATAAA CTCACTCATC TTTTGAGATC GGGAGGAATT C
3.一種如權(quán)利要求1所述的檢測對(duì)蝦白斑桿狀病毒的方法，其特征在于PCR引對(duì)序列為N端引物tac tgc cat tga aag cag acg ctcC端引物tta ata acc tct tcc ttg gtc agc
4.一種如權(quán)利要求1所述的檢測對(duì)蝦白斑桿狀病毒的方法，其特征在于對(duì)模板DNA樣品的提取方法是將鹽酸胍強(qiáng)變性劑與溫和去污劑、Silica一類純化物有效地結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明是在獲得純化的對(duì)蝦白斑桿狀病毒DNA的基礎(chǔ)上,酶切片斷克隆測序?yàn)橐罁?jù),設(shè)計(jì)PCR引物對(duì),應(yīng)用PCR技術(shù)來檢測對(duì)蝦是否罹患該病毒,從而達(dá)到早診斷,早預(yù)防,早治療;并且可對(duì)該病的流行病學(xué)進(jìn)行研究。用快速方法從對(duì)蝦組織中提取模板DNA樣品,去除PCR抑制因子,使得PCR方法得以實(shí)行,真正做到快速、靈敏、特異。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1199859SQ97112049
公開日1998年11月25日 申請(qǐng)日期1997年5月20日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月20日
發(fā)明者王瑋, 楊豐, 陳榮忠, 徐洵 申請(qǐng)人:國家海洋局第三海洋研究所