專利名稱：鴉片樣受體功能的調(diào)節(jié)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種篩選方法，它包括在用于神經(jīng)病和/或精神病的篩選檢查中測試一種LC132受體拮抗劑。更確切地說，該篩選方法基于將LC132受體與推測為LC132受體功能的拮抗劑的藥劑接觸，接著測試該化合物的結合性和/或拮抗劑活性，然后測試有LC132拮抗劑活性的藥劑在抗癲癇、抗驚厥和/或抗焦慮的篩選中的應用情況，以證明其對這些疾病的相應治療活性。
現(xiàn)在，苯并二氮雜類受體拮抗劑(如阿普唑侖、地西泮、勞拉西泮)仍然是治療焦慮疾病、尤其是急性焦慮病的主要臨床藥物。由于苯并二氮雜受體拮抗劑具有抗驚厥性能，所以其中的某些也用作鎮(zhèn)癲癇藥。最近，業(yè)已發(fā)現(xiàn)其它藥物在治療焦慮疾病中的臨床應用，例如選擇性5-羥基胺重攝取抑制劑(如氟西汀)和丁螺環(huán)酮。治療癲癇的主要藥物有卡馬西平、苯妥英、丙戊酸鹽、乙琥胺和苯巴比妥。如下所述，在藥理治療焦慮、癲癇和驚厥方面可得到的藥物都不是最佳藥物。
焦慮是一種生理現(xiàn)象，它表現(xiàn)為對真實的或潛在的危險的警告信號。當不存在真實的危險或當情緒的強度被夸大時，焦慮就成為病理現(xiàn)象。如果患器官疾病者產(chǎn)生生理和病理焦慮就有可能危及生命，并且會導致或延長各種生理機能障礙。各種焦慮病屬于較為常見的精神病，據(jù)估計大約4～8％的人患有這類病。有大量文獻記載表明用苯并二氮雜受體拮抗劑治療焦慮病后，病情會立即緩解。盡管這類藥物的功效會維持一段較長的時間，但實施治療數(shù)周以上就會出現(xiàn)一系列問題。雖然對于不同的病人可通過優(yōu)化苯并二氮雜受體拮抗劑的劑量而大大避免不希望的副作用，但對于嚴重的焦慮和癲癇病例以及對于減輕病理性肌肉緊張所需的劑量對不眠癥的抑制往往會達到如此程度，即擾亂智力機能并降低從事各種技術性工作(操作機器、開汽車)時的注意力和精確性。個人對這種超鎮(zhèn)靜作用(oversedation)的敏感性大不一樣。肌肉松弛會導致言語不清和步法紊亂、尤其是老年病人。在高劑量時、對中樞活性藥物體驗極少的病人甚至在正常劑量時都可能出現(xiàn)行為的抑制解除。長期接觸苯并二氮雜受體拮抗劑也會出現(xiàn)問題，問題之一就是形成對療效的耐受性。相當一部分病人會喪失抗癲癇效驗(表現(xiàn)為脫逸現(xiàn)象(escape phenomena))。物質(zhì)依賴性表現(xiàn)為突然停止服藥后的藥物中止癥狀，它的影響因素有接觸藥物的持續(xù)時間、劑量、藥物作用的持續(xù)時間、以及病人的個性。重氮螺癸二酮(azaspirodecanedione)丁螺環(huán)酮只表現(xiàn)抗焦慮活性，它與通過苯并二氮雜受體拮抗作用起作用(它顯示抗驚厥、肌肉松弛、和鎮(zhèn)靜/催眠效果)的抗焦慮劑形成鮮明的對照。據(jù)假設，丁螺環(huán)酮的作用機理包括5-羥色胺1A受體的部分拮抗性。與苯并二氮雜受體完全拮抗劑相比，丁螺環(huán)酮的優(yōu)點在于更小的鎮(zhèn)靜作用、更少的精神運動性損傷連同耗酒精量、物質(zhì)依賴性更低、和大為減少的濫用傾向。然而，抗焦慮活性起始時的長潛伏期顯著不同于典型的苯并二氮雜類安定藥，后者迅速起作用。此外，有可能出現(xiàn)丁螺環(huán)酮的治療順序性問題，有關先用苯并二氮雜受體拮抗劑治療過的或顯示嚴重焦慮的病人的療效問題。丁螺環(huán)酮不但是對醫(yī)療設備的有價值的輔助物(其地位已逐漸變得更為明確)；而且從理論方面來看它也相當重要，因為它是滿足強烈的臨床功效與當今的安全標準的最重要的抗焦慮藥?？紤]到選擇性5-羥色胺重攝取抑制劑(SSRIs)的作用機理，這類藥物的藥理效果似乎歸因于突觸間隙中導致神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺可得性的增加。但是，SSRIs開始時的治療作用緩慢，一般至少需要幾周。盡管SSRIs是早期開發(fā)的且優(yōu)先用作抗抑郁藥，但它在治療恐慌癥方面的應用日益增多，例如氟西汀或強迫觀念與行為的疾病，如氟伏沙明。人們對SSRIs的耐受性良好，但是，這類藥物的副作用有神經(jīng)質(zhì)、震顫、頭昏、頭痛、失眠癥、性機能障礙、惡心和腹瀉。此外，三環(huán)抗抑郁藥氯米帕明是一種有效的非選擇性5-羥色胺重攝取抑制劑，已被證實可用于治療強迫觀念與行為的疾病[例如參見，Martin and Haefely，in“Principles of Pharmacology，Eds.(Munson)et al.，Chapman & Hall，N.Y.，1995，pp.243-277]。
癲癇是一種神經(jīng)病，大約有1％的人患有此病。該慢性病的特征在于復發(fā)的自發(fā)性癲癇發(fā)作不是由活性腦疾病引起的。癲癇發(fā)作突然，是無意的、受時間限制的交替行為，它與腦神經(jīng)元的過量沖動釋放有關?，F(xiàn)在癲癇病一般是根據(jù)病人表現(xiàn)的主要癲癇發(fā)作類別而分類的(一位給定的病人可能有多種癲癇發(fā)作，但其中的一種比其它種更頻繁而被用作分類的根據(jù))。按癲癇發(fā)作的類別分類的一個實在的優(yōu)點是，在某種程度上可預測對可選擇的療法的應答性。一般地，只有大約一半的病人利用抗癲癇藥而使其癲癇發(fā)作受到很好的控制；另一半病人則可分為兩類偶然發(fā)作癲癇的患者和不能由抗癲癇藥物控制癲癇發(fā)作和/或因藥物而招致不可接受的不利效果的病人。而且，現(xiàn)在常用的藥物會引起副作用。癲癇發(fā)作的病因較多，而其起因通常不明，所以具有抗驚厥效果的鎮(zhèn)癲藥與其它藥物在治療上很重要。(例如參見Lloyd and Gillenwater，in“Principles ofPharmacology，Eds. Munson et al.，Chapman & Hall，N. Y.，1995，pp.363-398)。
以前，被稱為“orphanin FQ”或“nociceptin”的長度為17個氨基酸的肽(F-G-G-F-T-G-A-R-K-S-A-R-K-L-A-N-Q)已被從大鼠腦(Meunier et al.，Nature 377532-535，1995)和從豬的下丘腦(Reinscheid et al.，Science 270792-794，1995)中分離出。該orphanin FQ的氨基酸序列與nociceptin的完全相同，下面將稱之為OFQ。Julius(Nature 377476，1995)在對該OFQ發(fā)現(xiàn)的注釋中提到這個肽的序列與強啡肽A最相似，而強啡肽A是5種確定的鴉片樣受體的內(nèi)源性配體之一。OFQ抑制培養(yǎng)物中CHO(LC 132+)細胞中的腺苷酸環(huán)化酶；并且如果將OFQ給藥到鼠的大腦內(nèi)室，就會引起痛覺過敏(Meunier et al.，loc.cit)。結果的型式表明該十七肽是LC132受體的內(nèi)源性拮抗劑，并且似乎具有前-感受傷害的(pro-nociceptive)性能。Reinscheid et al.(loc.cit.)指出如果將OFQ注入鼠的大腦內(nèi)室，則會在尾巴-輕拍試驗(tail-flick test)(但不是加熱板試驗(hot-plate test))中降低運動活性并引起痛覺過敏。于是總結出OFQ可作為大腦的神經(jīng)遞質(zhì)以調(diào)節(jié)感受傷害的和運動的行為。Vaughan和Christie(Br.J.Pharmacol.1771609-1611，1996)應用腦切片中的整個細胞膜片箝記錄研究了OFQ對大鼠的背側(cè)縫核神經(jīng)元的膜性質(zhì)的作用，它符合下列報道在背側(cè)縫神經(jīng)元中存在LC132受體mRNA(Lachowicz et al.，J.Neurochem.6434-40，1995)和G-蛋白質(zhì)介導的將克隆化LC132受體偶聯(lián)到活化K通道上(Zhang and Yu，J.Biol.Chem. 27022772-22776，1995)，業(yè)已發(fā)現(xiàn)LC132受體配體nociceptin有力且有效地增強背側(cè)縫神經(jīng)元中的內(nèi)部矯正K傳導。
申請人出乎意外地證實LC132受體的拮抗劑如OFQ尤其對精神病和神經(jīng)病的動物模型有療效(預示對病人的療效)，但不局限于焦慮病、癲癇和驚厥的治療。這就使申請人開發(fā)鑒定有用物質(zhì)的方法和方案從而提出治療上有用的化合物和/或?qū)е聦⒒衔镉糜诎l(fā)現(xiàn)治療上有用的化合物。因此，本發(fā)明涉及篩選治療上有用的化合物的方法，該方法包括在用于精神病和/或神經(jīng)病的篩選檢查中，尤其是用于抗癲癇、抗驚厥或抗焦慮篩選檢查中測試一種LC132受體拮抗劑。
在一個優(yōu)選的實施方案中，治療上有用的化合物的篩選方法包括在用于精神病和/或神經(jīng)病的篩選檢查中測試一種LC132受體拮抗劑。該方法最好包括將一種LC132受體與推測有LC132受體拮抗劑活性的藥劑接觸，測試該LC132受體-藥劑的結合性和/或測定LC132受體拮抗劑活性，然后測試有拮抗劑活性的藥劑在精神病和/或神經(jīng)病篩選檢查、即抗癲癇、抗驚厥或抗焦慮的篩選檢查中的應用情況。
術語“LC132受體”或“LC132受體蛋白”表示天然的受體蛋白及其衍生物。得自不同的動物種的該受體或其衍生物在文獻中有數(shù)個名稱，最常用的是ORL1。LC132受體是一種孤獨受體，其人體和鼠的互補DNAs近來已得到鑒定，它在結構上類似于鴉片樣物質(zhì)受體(Mollereau et al.，F(xiàn)EBS Lett. 34133-38，1994；Fukuda et al.，F(xiàn)EBS Lett. 34342-46，1994；Chen et al.，F(xiàn)EBS Lett. 347279-283，1994；Bunzow et al.，F(xiàn)EBSLett 347284-288，1994；Wang et al.，F(xiàn)EBS Lett. 34875-79，1994；Lachowicz et al.，loc. cit.；Nishi et al.，Biochem. Biophys.Res. Commun. 2051353-1357，1994和Wick et al.，Molec.Brain Res.2737-44，1995)。LC132受體生物活性的特點在于它對OFQ的強親和力結合和不能與腺苷酸環(huán)化酶偶聯(lián)(Meunier et al.，loc.cit.；Reinscheidet al.，1995，loc. cit.)。
通常地，優(yōu)選的LC132受體衍生物其氨基酸序列中至少有80％的氨基酸序列與相應的人LC132受體氨基酸序列相同，優(yōu)選是至少有90％且最優(yōu)選是至少有95％相同；其特征在于它們對OFQ有高的親和力結合。該檢查方法的一個特別有利的實施方案包括天然人LC132受體蛋白的應用。
“LC132受體蛋白”這一術語也包括天然或非天然生成的受體蛋白和有關的蛋白質(zhì)的衍生物，其中至少有部分蛋白質(zhì)序列可與OFQ肽接合，即天然的LC132受體的一個或多個氨基酸或其片段被取代或者缺失而不失去結合活性。這類衍生物可用已知的肽化學方法或重組DNA技術來制備。“LC132受體蛋白”這一術語還包括這樣的衍生物，它可通過該領域中的已知方法從作為殘基上的側(cè)鏈的功能基或者N-或C-端基來制備。這類衍生物可以包括羧基的脂族酯、羧基與氨或與伯胺或仲胺反應而得的酰胺、氨基酸殘基的游離氨基與酰基(例如鏈烷?；蛱辑h(huán)芳?；?作用而得的N-?；苌锘蛘哂坞x羥基(例如絲氨?；蛱K氨酰殘基)與?；饔枚玫腛-?；苌铩?br> LC132(鴉片樣)孤獨受體近年來已被鑒定，這是基于與預計的鴉片樣受體氨基酸序列的嚴格的同源性(Mollereau et al.，loc.cit.；Bunzowet al.，loc. cit.；Lachowicz et al.，loc. cit.)。如果在異源體系例如CHO細胞系中表達LC132受體，埃托啡和強啡肽A較弱地抑制環(huán)狀AMP的形成，但其它的鴉片樣物質(zhì)是惰性的。十七肽OFQ被鑒定為LC132受體的有效的內(nèi)源性拮抗劑(Meunier et al.，loc. cit.，Reinscheid et al.(1995)，loc. cit.)。LC132轉(zhuǎn)錄物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的數(shù)個區(qū)內(nèi)被表達，已知這些區(qū)域涉及疼痛調(diào)節(jié)，它包括下丘腦、腦干和脊髓背側(cè)角(Julius，loc. cit.)。
LC132受體蛋白及其衍生物的表達可通過常見的重組DNA技術來完成。這種技術在文獻中有描述(參見例如Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，“Molecular Cloning.A Laboratory Manual”，Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.，1989和Ausubel et al.，“Current Protocols inMolecular Biology”，Green Publishers Association & Wiley Interscience，1987)。而且，DNA分子或其編碼整個或部分的LC132蛋白質(zhì)的片斷可通過聚合酶鏈反應(PCR)技術而獲得。編碼LC132受體的核酸序列可利用大量的宿主/載體組合來表達。有用的表達載體可由染色體、非染色體和合成核酸序列的片段構成。這種載體的實例有病毒載體如各種已知的SV40的衍生物，細菌載體如得自大腸桿菌(E.coli)的質(zhì)粒，噬菌體DNAs如λ噬菌體衍生物、M13和其它絲狀單鏈DNA噬菌體，還有在酵母中有用的載體如2μ質(zhì)粒的衍生物，在真核細胞中有用的載體；更優(yōu)選是在動物細胞中有用的載體如那些含SV40、腺病毒和/或逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的DNA序列的載體。
用于表達核酸序列所編碼的LC132受體的宿主細胞可以是選自各種已知宿主的細胞，大量宿主得自例如The American Type CultureCollection(ATCC)。用于LC132表達的優(yōu)選的宿主是哺乳動物細胞如CHO細胞。LC132受體表達細胞系的制備可按該技術中的已知方法例如Reinscheid et al.描述的方法(1995，loc.cit.)。
“LC132受體拮抗劑”這一術語是指可結合到LC132受體上從而調(diào)節(jié)LC132受體功能的化合物，即在細胞內(nèi)抑制毛喉素(forskolin)-刺激的腺苷酰環(huán)化酶活性，該細胞用可表達LC132受體的載體轉(zhuǎn)化過。典型的拮抗劑是高親和性配體，優(yōu)選其IC50值低于1μM，例如OFQ或其衍生物。
“將LC受體與推測有LC132受體拮抗劑活性的藥劑接觸”這一術語可包括下列特點將一種優(yōu)選為人LC132受體蛋白的LC132受體蛋白、在適當?shù)木彌_液中連接到固相中；該固相通常是聚氯乙烯，但也可以是其它聚合物如纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯或聚丙烯。固體支持體的存在形式可以是管狀、珠狀、圓盤狀或微量滴定板狀、或者是適于實施試驗的任何其它表面，其上被動地結合LC132受體，露出高親和性的受體結合位點。洗滌后，可以在適當?shù)木彌_溶液中加入推測能結合到LC132受體上和/或具有LC132受體拮抗劑活性的藥劑。
制備LC132受體的優(yōu)選的方法其特征在于用含編碼LC132受體的核酸序列的載體轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞系例如CHO細胞系，接著表達該受體蛋白。然后就可以將含該受體蛋白的純化了的膜結合到上述固體表面，再與被推測為LC132受體拮抗劑的藥劑一起培養(yǎng)。這些方法都是該技術中已知的，例如Reinscheid et al.，loc. cit.闡述了這類方法。此時本發(fā)明的方法包括(a)提供含LC132受體的細胞膜，(b)將該膜與被推測為LC132受體拮抗劑的化合物接觸，與(c)測定該化合物是否結合到LC132受體上和是否產(chǎn)生拮抗劑專一活性，接著進行精神病和/或神經(jīng)病篩選檢查。
測定推測為一種拮抗劑的藥劑與LC132受體的結合情況可通過對該藥劑的直接標記或?qū)δ掣偁幮运巹┤鏞FQ的標記來實施。例如可以利用放射性標記物來標記該藥劑或該競爭性藥劑。Reinscheid et al.(1995，loc.cit.)描述了一個優(yōu)選的實施方案，也可參見實施例1。
LC132受體拮抗劑活性的藥理鑒定，可通過對毛喉素刺激的cAMP在宿主細胞(例如CHO細胞)中積累的抑制程度來確定，而該宿主細胞是用可表達LC132受體的載體轉(zhuǎn)染的?？衫肦einscheid et al.(1995，loc.cit.)所述方法或利用本技術中的其它方法來測定cAMP的濃度。實施例1中敘述了本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案，它包括LC132受體拮抗劑活性的測定。
于是LC132受體拮抗劑可通過精神病和/或神經(jīng)病篩選而得以進一步表征。術語“精神病和/或神經(jīng)病篩選檢查”是指，但不局限于抗焦慮的、抗癲癇的和/或抗驚厥的篩選檢查。本技術中已知的這些檢查方法如下述所示抗焦慮試驗(Martin & Haefely，cit. loc.)建立了大量動物模型，試圖借以預測新的化合物在人體內(nèi)的抗焦慮活性。這些范例中有許多以所謂的“抵觸”情形估測動物的行為，也就是同時在兩種對立的動機狀態(tài)如接近和疏遠趨向的影響下行為的響應。也許人們最熟悉的模型是有條件的懲罰抵觸范例，其中將動物訓練成能為接受獎勵(例如對饑餓的動物獎勵食物)而自發(fā)地表現(xiàn)出一定的響應(例如壓杠桿)。一旦動物表現(xiàn)出恒定水平的壓杠桿響應，就引入短暫的非常時期(通常發(fā)出視覺或聽覺信號)，其間對壓杠桿行為同時實施食物獎勵和輕度的足電擊懲罰。在這些抵觸期間，動物表現(xiàn)出顯著遲鈍的響應速度，還發(fā)出各種明顯的情緒信號。苯并二氮雜受體拮抗劑例如抗焦慮的地西泮的獨特效果在于在不破壞未受懲罰的響應的劑量時，對受懲罰行為的脫抑制現(xiàn)象(導致受懲罰下響應速度的提高)。此外，在不存在實際懲罰時，即當壓杠桿速度因害怕受懲罰而減慢時，這些相同活性的藥物會產(chǎn)生類似抗焦慮的效果。抵觸試驗不需有條件的行為響應對首次受試驗的口渴的動物可以提供飲水的機會，但在其飲水時通過與電噴管接觸而進行懲罰。這種懲罰抑制的飲水因苯并二氮雜受體拮抗劑(如地西泮)引起的劑量依賴性而解除。初步的活性可同樣因意外的懲罰而降低，且可通過已知的抗焦慮藥的治療而消失掉。無懲罰的抵觸模型都基于自然對抗的促動狀態(tài)的存在，一方面有好奇的趨向，而另一方面又害怕新環(huán)境(例如暗-亮室試驗、增加的正迷宮、在生疏環(huán)境中消耗不熟悉的食物或普通食物、彼此不熟悉的動物之間的合群作用)。顯然，可將這些試驗場合中苯并二氮雜受體拮抗劑引起的行為抑制解除效果歸于類似抗焦慮作用；這些效果也可被解釋為轉(zhuǎn)移性因素的影響作用的普遍減弱或甚至降低抑制先天的或有條件的響應的能力。可將苯并二氮雜拮抗劑引起的抗挫折效果歸因于響應的增強，該響應因試驗場合中響應意外情況的獎勵而得以維持，其中的獎勵被減輕或省去。通過在動物體內(nèi)長久植入的電極對中腦水管周圍的神經(jīng)灰質(zhì)區(qū)實施的電刺激是轉(zhuǎn)移性的，并可誘發(fā)一系列情緒反應，苯并二氮雜受體拮抗劑能擴大轉(zhuǎn)移閾(aversive threshold)。特點在于行為和生理癥狀(心血管的、內(nèi)分泌的)的急性焦慮病態(tài)可由下列因素而引起已知的能在人體內(nèi)產(chǎn)生焦慮的化學藥品例如驚厥藥如戊二烯亞戊基四唑，服用不夠驚厥劑量的針對苯并二氮雜受體拮抗劑的反拮抗劑，或者甚至是長期用高劑量的鎮(zhèn)靜藥治療后突然停止用藥。將幼鼠迅速從其母體身邊分開而引起的超聲痛苦喊叫可被苯并二氮雜受體拮抗劑減輕。上述范例中苯并二氮雜受體拮抗劑的藥理專一性是使人難忘的，而抗抑郁藥、止痛藥和精神抑制藥相對地效果較差些。
抗癲癇/抗驚厥試驗(Martin & Haefely loc. cit.)。在人們熟知的用于預防或治愈動物急性癲癇發(fā)作的藥物中，苯并二氮雜受體拮抗劑是最有效的；引起急性癲癇發(fā)作的原因全身服用化學品(如戊二烯亞戊基四唑、吡枯枯靈堿、印防己毒素、GABA生物合成的抑制劑、青霉素、局部麻醉劑、乙酰膽堿酯酶的抑制劑)，在皮層表面上或向室系統(tǒng)中給藥(強心苷、谷氨酸鹽受體興奮劑NMDA)，或者長期用于皮層的藥物(病灶性鋁或鈷鎮(zhèn)癲癇藥)。它們還是有效的保護劑，被用于預防高壓性癲癇發(fā)作和因下列情況而導致的癲癇發(fā)作(激動性癲癇發(fā)作)在邊緣系統(tǒng)中從閾下的強度開始進行長久的間歇性電刺激后而引起的癲癇發(fā)作。電驚厥性癲癇也可用多數(shù)(但不是全部)苯并二氮雜受體拮抗劑來預防，不過劑量要比防止化學藥物引發(fā)的癲癇所用的劑量高得多。癲癇的各種遺傳模型(大鼠中的癲癇小發(fā)作狀表現(xiàn)型、易發(fā)生遺傳的小鼠種中因聲覺刺激而引發(fā)的癲癇或者在易發(fā)生遺傳的狒狒中因光刺激而引發(fā)的肌陣攣性癲癇)對苯并二氮雜受體拮抗劑有響應。因此，苯并二氯雜受體拮抗劑對目前所有的動物癲癇模型都有療效，可以預測它對多數(shù)人癲癇形式或驚厥病態(tài)有療效。與其寬泛的癲癇樣抗驚厥活性相一致，苯并二氮雜受體拮抗劑可預防或抑制下列癲癇樣電活性即由體外保存的腦切片、尤其是海馬切片中的各種操作(驚厥劑、離子型組合物)引起。它們還可減輕在各個腦區(qū)內(nèi)由電刺激引起的神經(jīng)元的后釋放。還發(fā)現(xiàn)苯并二氮雜受體拮抗劑可減輕病灶內(nèi)的癲癇樣活性，還可抑制泛化。
將如前所述的一種LC132受體拮抗劑即OFQ注射入小鼠的腦內(nèi)室，并在測試抗焦慮效果的試驗(自發(fā)反應抵觸試驗、亮-暗試驗，實施例2和3)中觀測動物。已證實在兩個試驗范例中OFQ表現(xiàn)出抗焦慮效果。此外，證實腦內(nèi)室注射的OFQ在小鼠的癲癇模型(聽原性癲癇模型，實施例4)中有活性，它預示的普遍抗驚厥效果和對患者的抗癲癇作用。文獻中未報道過OFQ的這類有效的治療效果。
下述的實施例1、2、3和4中描述了優(yōu)選的試驗對LC132受體拮抗劑活性的測定和對毛喉素刺激的cAMP積累的抑制(實施例1)，表明OFQ可抑制在用LC132轉(zhuǎn)染的CHO細胞內(nèi)由毛喉素刺激的cAMP積累，這與未轉(zhuǎn)染的CHO細胞形成對照。在用LC132受體轉(zhuǎn)染的CHO細胞內(nèi)，OFQ抑制毛喉素刺激的cAMP積累其半數(shù)效應濃度(EC50)為1.05±0.21nM，而達到大約80％抑制的極大效果是在100nM。它對未轉(zhuǎn)染的細胞無效果。為了測定OFQ對其受體的結合動力學，研制出并鑒定了放射性配體[125I]Tyr14-orphanin(Reinscheid et al.，J. Biol. Chem.27114163-14168，1996)。將[125I]Tyr14-orphanin結合到從CHO細胞制得的膜上，所述細胞以可飽和的和不可取代的方式表達LC132受體，其中Kd為56.2±7.3pM，而Bmax大約為200fmol/mg蛋白質(zhì)。OFQ抑制[125I]Tyr14-orphanin對LC132受體的結合，其抑制常數(shù)(Ki)為0.19±0.02nM(Reinscheid et al.(1996)，loc.cit.)。
抗焦慮效果的白發(fā)反應抵觸試驗(實施例2)表明與載體注射(平均值)±標準平均誤差＝36.3±7.4)相比，OFQ(平均值±標準平均誤差＝24.6±3.6)不明顯地減弱未受懲罰的響應，它預示極小的運動損傷；反之，與載體注射(平均值±標準平均誤差＝4.3±1.6)相比，OFQ(平均值±標準平均誤差＝16.2±6.0)顯著地(P＜0.05)增強受懲罰的響應，它預示抗焦慮效果。該結果模式類似于使同樣的這兩組小鼠口服商品化抗焦慮藥地西泮后的結果，它預示OFQ作為一種抗焦慮藥對病人的療效。
測試抗焦慮效果的亮-暗盒試驗(light-dark box task)(實施例3)表明與載體注射(平均值±標準平均誤差＝11±5sec)相比，在0.3nmol/小鼠(平均值±標準平均誤差＝54±14sec)和1nmol/小鼠(平均值±標準平均誤差＝58±19sec)的劑量下，OFQ顯著地(P′s＜0.05)提高了小鼠在亮盒中逗留的時間。而且，與載體注射(平均值±標準平均誤差＝3.0±0.5)相比，在0.3nmol/小鼠(平均值±標準平均誤差＝1.2±0.6)、1nmol/小鼠(平均值±標準平均誤差＝0.7±0.2)和3nmol/小鼠(平均值±標準平均誤差＝0.4±0.3)的劑量下，OFQ也顯著地(P′s＜0.05)減少了小鼠的持移欲望。該結果預示OFQ的抗焦慮活性。
聽原性癲癇發(fā)作模型(實施例4)表明OFQ對于遺傳上對聲音敏感的小鼠因聲音而引起的緊張性驚厥有防護效果，其ED50值為0.7nmol/小鼠。該結果預示了OFQ對癲癇和減輕驚厥的治療效果。
因此，本發(fā)明還涉及可通過前述方法得到的化合物，例如OFQ及其衍生物；還涉及包括一種或多種這類化合物與一種治療上呈惰性的載體材料的藥物組合物。此外，本發(fā)明還涉及這類化合物在制備用于治療精神病和/或神經(jīng)病的組合物方面的應用；也涉及治療精神病和/或神經(jīng)病的方法，該方法包括用治療有效量的OFQ或其衍生物給藥。精神病和/或神經(jīng)病的實例有癲癇、焦慮或驚厥。
“OFQ及其衍生物”這一術語是指肽F-G-G-F-T-G-A-R-K-S-A-R-K-L-A-N-Q、其片段和/或其非天然存在的肽或其突變體。這類衍生物是指這樣的肽即天然OFQ肽或其片段中的一個或多個氨基酸被取代或缺失但未損失拮抗劑活性。這類衍生物可用肽化學中的已知方法制備。
“OFQ及其衍生物”這一術語還包括這樣的衍生物它通過本技術中已知的方法、從殘基上作為側(cè)鏈的官能基或N-或C-端基來制備，這種衍生物只要在藥物上可被接受，即它們不會破壞肽的拮抗劑活性、不會給含它們的組合物帶來毒性，就可包括在本發(fā)明中。這些衍生物可包括例如聚乙二醇側(cè)鏈，它可掩蔽抗原位點和/或延長OFQ肽衍生物在體液中的滯留時間。其它衍生物包括羧基的脂族酯、羧基與氨或與伯胺或仲胺反應而得的酰胺、氨基酸殘基的游離氨基與?；?例如鏈烷?；蛱辑h(huán)芳酰基)作用而形成的N-?；苌锘蛴坞x羥基(例如絲氨?；蛱K氨酰殘基)與?；饔枚纬傻腛-酰基衍生物。
“OFQ及其衍生物”這一術語還包括上述衍生物的可溶形式，該可溶形式可通過本技術中的已知方法例如通過化學合成而制備。
服用OFQ及其衍生物的劑量范圍可由本領域中普通技術人員來確定而不必實施過多試驗?？傊?，適當劑量為只要大到足以產(chǎn)生期望的效果。劑量不能大到引起相反的副作用，如不希望的交叉反應、過敏性反應等等。一般地，劑量將隨病人的年齡、狀況、性別和病情程度、禁忌癥-如果有的話，免疫耐受性和其它類似的變量而改變，它可由各個醫(yī)師自己決定。預期的劑量范圍是約0.1ng/kg/天～約0.1mg/kg/天。OFQ肽及其衍生物的給藥方法可以是腸胃外注射、或隨時間逐漸灌注，也可通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或皮下給藥。
用于腸胃外給藥的制劑包括無菌的或水溶性的或非水溶性均溶液、懸浮液和乳濁液。非水溶性溶劑的實例有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、以及可注射的有機酯如油酸乙酯。水溶性載體包括水、醇/水溶液、乳濁液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸鹽林格氏溶液、或不易揮發(fā)的油。靜脈用載體包括如那些基于林格氏葡萄糖的液體和營養(yǎng)素再生劑、電解質(zhì)再生劑等等。也可存在防腐劑和其它添加劑例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等等。一般可參見Remington’s Pharmaceutical Science，18thEd.，Mack Eds.，1990。
本發(fā)明還涉及可通過前速方法獲得的化合物，涉及包括一種或多種這類化合物和一種治療上呈惰性的載體材料的藥物組合物。
進一步地，本發(fā)明包括LC132受體在篩選下列治療中有用的化合物的篩選檢查中的應用，即在精神病和/或神經(jīng)病的治療、尤其是在前述的焦慮、癲癇及驚厥方面的治療中有用的化合物。
通過下述實施例將詳細地闡述本發(fā)明、但不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例實施例1LC132拮抗劑活性的測定和毛喉素刺激的cAMP積累的抑制為進行cAMP濃度的測定，將LC132受體轉(zhuǎn)染的CHO細胞或CHO dhfr-(野生型)細胞置于24孔的板上并讓其長到鋪滿為止。除去培養(yǎng)介質(zhì)，將待試驗化合物或肽溶于含10mM HEPES(pH 7.4)1mM毛喉素和1mM Ro20-1724(可從RBI獲得)、總體積為0.2ml的Dulbecco’s Modified EagleMedium后加入，然后將這些細胞在37℃下培養(yǎng)10min。加入0.5ml冰冷的乙醇而停止反應，并將這些板在-80℃下冷凍12小時。將板進行離心處理，除去其中的上層清液部分，再干燥后用于cAMP測定。按制造商的說明實施cAMP測定(Biotrak SPA，Amersham)。配體結合試驗是在96孔深底微孔板上實施的。收集穩(wěn)定地表達LC132受體的CHO細胞，使其再懸浮于含50mM Tris-HCl(pH7.8)、5mM MgCl2、1mM EGTA、0.1％BSA和抑肽酶、亮肽素和胃酶抑素各0.1mg/ml的10倍體積的結合緩沖液中。應用組織勻漿器(setting 4 for 30sec；PT20，Kinematica，Lucerne，Switzerland)來制膜。在4℃下、于45,000×g下離心10min后得總的膜顆粒。將所得沉淀按上述方法實施兩次再懸浮和離心處理，最后用適當體積的結合緩沖液將膜稀釋，并于-70℃下貯存。利用BCA Protein Assay Kit(Pierce)來測定蛋白質(zhì)濃度。在室溫下和總體積為200μl的結合緩沖液中，將[125I]Tyr14-orphanin與膜(10-18μg蛋白質(zhì))一起培養(yǎng)1小時。為進行競爭結合試驗，一同加入50,000cpm的[125I]Tyr14-orphanin(62.5pM)和所需濃度的、未標記的肽。在50nM OFQ的存在下測定非特異性結合。通過WhatmanGF/C濾器利用Brandel多道采集機(Brandel multichannel harvester)實施快速真空過濾而分離結合的和游離的配體。先用含0.1％BSA的、0.3％聚亞乙基亞胺在室溫下對GF/C濾器預處理1小時。將濾器用1ml pH7.5、冰冷的50mM Tris-HCl洗滌6次，然后用γ計數(shù)器來計數(shù)。
實施例2抗焦慮效果的自發(fā)反應抵觸試驗采用雌性患白化病的小鼠(IbmMORO(SPF)；Biological ResearchLabs，F(xiàn)ullinsdorf，Switzerland)。在試驗的起始點時，這些小鼠至少是2-3月大的、且預先接受過自發(fā)反應抵觸工作(operant conflicttask)的良好訓練。將這些小鼠分別置于底層鋪上木屑的Macrolon型塑料籠(大約13×23×13cm)中。調(diào)節(jié)鼠籠中的溫度和濕度，將鼠籠維持在自然的亮-黑循環(huán)狀態(tài)。自來水可隨意地獲取，但接觸標準的實驗食物受到限制。將小鼠的體重維持在其自由進食時的大約80-85％。訓練和試驗方法由Martin et al.(Pharmacol. Biochem. Behav. 46905-910，1993)提供對不允許進食的小鼠在工作中實施良好的訓練，其中在初始5分鐘內(nèi)每壓一次杠桿(未受懲罰的響應)就自動地提供一次食物獎勵；然后在隨后的15分鐘內(nèi)對于每次壓杠桿(受懲罰的響應)，在給予食物獎勵的同時伴隨一次輕度的足電擊。與文獻中報道的相符，即試驗前30分鐘口服10mg/kg的地西泮會導致未受懲罰下的響應一定程度上的減弱，但增強了這些小鼠受懲罰下的壓杠桿行為。將小鼠分為兩組(N′s＝9)。腦內(nèi)室注射量為2μl，載體系人造腦脊髓液。給定OFQ(Research Genetics，Inc.，Huntsville，Alabama)的劑量為3nmol/小鼠。對抵觸試驗的兩部分即未受懲罰的(即在抵觸試驗的前5分鐘內(nèi))和受懲罰的(即抵觸試驗后續(xù)15分鐘期間壓杠桿同時得到食物和電震)進行評定。有關各只小鼠的處理條件對參加小鼠的行為評定的技術人員保密(未告訴他)。采用Mann-WhitneyU檢驗對照兩個處理組進行統(tǒng)計分析，認為p值小于0.05是統(tǒng)計上顯著的。
實施例3測試抗焦慮效果的亮暗盒工作(light-dark box task)采用雄性患白化病的小鼠[IbmMORD(SPF)；Biological ResearchLabs，4414 Fullingsdorf，Switzerland]。試驗前，將小鼠置于分組的籠中關數(shù)天、籠的底層鋪有木屑。調(diào)節(jié)室溫和溫度，并使鼠籠處于相反的亮-暗循環(huán)。自來水和標準的實驗食物可隨意地獲取。在亮暗盒工作中測定初次受試驗的小鼠中的初步活性。該試驗裝置是由通過一條不透光的塑料管(5×7×10cm)聯(lián)結的同樣大小(20×20×14cm)的、一只透光和一只不透光的Plexiglas盒構成的。透光盒中處于照亮狀態(tài)(盒中部的照度為4400勒克司)。腦內(nèi)室注射5分鐘后，將一只小鼠置于塑料管內(nèi)使其面向暗盒。在5分鐘內(nèi)記錄小鼠在亮盒中逗留的時間、有轉(zhuǎn)移欲望(只有頭部和前爪進入亮盒中)的次數(shù)、以及完全從不透光的盒內(nèi)轉(zhuǎn)入透光的盒中的次數(shù)。四只爪子全進入另一個盒中的小鼠被認定是已轉(zhuǎn)移了盒室。每次試驗后徹底凈化盒底；每個試驗組由10-20只小鼠構成；腦內(nèi)室注射的體積為2μl；給定OFQ(Research Genetics，Inc.，Huntsville，Alabama)的劑量為3、1、0.3和0.1nmol/小鼠。用人造腦脊髓液作載體。有關各只小鼠的處理條件對參加小鼠的行為評定的技術人員保密(未告訴他)。用學生t-檢驗評定各處理組之間的差別，認為p值≤0.05是統(tǒng)計上顯著的。實施例4測試抗癲癇/抗驚厥效果的聽原性癲癇發(fā)作模型采用幼鼠[DBA/2J(SPF)；Biological Research Labs，4414Fullinsdorf，Switzerland]。試驗前，將小鼠關在底層鋪上木屑的籠子里。調(diào)節(jié)室溫和濕度，并使鼠籠處于自然的亮-暗循環(huán)。自來水和標準的實驗食物可隨意地獲取。研究對初次受試驗的3周大的DBA/2J小鼠(已知它們在遺傳上易發(fā)作癲癇)的聽原性癲癇發(fā)作的防護效果。有關該試驗的其它細節(jié)另有報道(Martin et al.，Psychopharmacology 111415-422，1993)。簡言之，緊接著腦內(nèi)室注射后，將每只小鼠置于各別的底層鋪上木屑、開著的透光Plexiglas盒(21×44×21cm)中。在隔音室中實施試驗，包括使小鼠接受1分鐘的在110dB(將0dB定義為20μPa的壓力值時、14kHz正弦曲線樣的音調(diào)，其間記錄觀察結果。處理5分鐘之后實施聽覺刺激。8只小鼠一組地用于評定每個劑量和載體條件，腦內(nèi)室注射量為2μl；給定OFQ(Research Genetics，Inc.，Huntsville，Alabama)為10、3、1、0.1和0.01nmol/小鼠；將人造腦脊髓液用作載體；有關各只小鼠的處理條件對參加小鼠的行為評定的技術人員保密(未告訴他)。記錄未表現(xiàn)緊張性驚厥的小組部分，用概率分析計算ED50值。
權利要求
1.一種篩選治療上有用的化合物的方法，該方法包括在對于精神病和/或神經(jīng)病的篩選檢查中測試一種LC132受體拮抗劑。
2.權利要求1的方法，其中對給定化合物的LC132受體拮抗劑活性的測定包括將LC132受體與推測為LC132受體功能的拮抗劑的藥劑接觸，接著測試該給定化合物與受體的結合和/或拮抗劑活性。
3.權利要求2的方法，它包括(a)提供含LC132受體的細胞膜；(b)將該膜與推測為LC132受體拮抗劑的化合物接觸；和(c)測定該化合物是否結合到LC132受體上和是否產(chǎn)生了拮抗劑專一活性。
4.權利要求3的方法，其中的拮抗劑專一活性是通過測定對毛喉素激發(fā)的cAMP積累的抑制而確定的。
5.權利要求1的方法，其中的拮抗劑是一種對LC132受體有高親和性的配體。
6.權利要求5的方法，其中的LC132受體拮抗劑的特征是IC50值小于1μM。
7.權利要求1-6任一項的方法，其中用于精神病和/或神經(jīng)病的篩選檢查是一種有關抗癲癇、抗驚厥或抗焦慮的篩選檢查。
8.權利要求6的方法，其中所述的精神病和/或神經(jīng)病的篩選檢查是指自發(fā)反應抵觸試驗、亮-暗盒試驗或聽原性癲癇發(fā)作模型。
9.權利要求1-8中任一項的方法在對于精神病和/或神經(jīng)病的治療中有用的化合物的篩選中的應用。
10. Orphanin FQ及其衍生物在制備用于治療精神病和/或神經(jīng)病的藥劑中的應用。
11.權利要求10的應用，其中的病是指癲癇、焦慮和驚厥。
12.用于治療精神病和/或神經(jīng)病的Orphanin FQ及其衍生物。
13. LC132受體蛋白在對于精神病和/或神經(jīng)病的治療有用的化合物的篩選中的應用。
14.一種藥物組合物，它包括與治療上可接受的載體相組合的權利要求10中規(guī)定的化合物。
15.用于治療精神病和/或神經(jīng)病的方法，該方法包括用治療有效量的、權利要求10中所規(guī)定的化合物給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療上有用的化合物的篩選的方法,該方法包括在精神病和/或神經(jīng)病的篩選中測試一種LC132受體拮抗劑。更確切地說,該篩選方法基于:將LC132受體與推測為LC132受體功能的拮抗劑的藥劑接觸,接著測試該化合物的結合性和/或拮抗劑活性,然后測試有LC132拮抗劑活性的藥劑在抗癲癇、抗驚厥或抗焦慮的篩選中的效果。
文檔編號G01N33/15GK1184254SQ9711321
公開日1998年6月10日 申請日期1997年6月12日 優(yōu)先權日1996年6月13日
發(fā)明者O·西維爾, J·R·馬蒂恩, F·蒙斯瑪, J－L·莫里奧, H－P·諾斯艾克, R·雷恩施德 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司