專利名稱：檢測艾滋病毒的光譜方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于光譜技術(shù)方法用于檢測病毒，特別是檢測艾滋病毒。
艾滋病病毒(HIV)是一種引起人體免疫缺損的病毒，艾滋病是目前威協(xié)人類生命和健康的首要疾病。據(jù)文獻(xiàn)報道，1988年全世界艾滋病患者在25萬以上，而受HIV感染的人多達(dá)5百萬；1992年美國可能有36萬艾滋病例。亞洲雖是艾滋病的低發(fā)區(qū)，但是截止到1992年已有200萬人已經(jīng)感染了艾滋病。有些國家和地區(qū)，由于人口密度大，經(jīng)濟(jì)文化比較落后，醫(yī)療水平低下，艾滋病患者和感染者有快速增加的趨勢。目前，艾滋病人診斷和治療，均極端困難，醫(yī)療費(fèi)用極高。據(jù)統(tǒng)計，1981-1991年間，全世界為診治艾滋病所付出費(fèi)用高達(dá)2400億美元。
人類免疫缺損病毒，主要是通過性接觸、接觸血液和血制品以及在產(chǎn)期中的母親對嬰兒的傳染。全世界每年因輸血造成艾滋病感染的悲劇令人震驚。
艾滋病毒，曾經(jīng)于1983年首次被提取分離出來，此后于1985年在西非洲水中又鑒定出了第二種艾滋病毒。這兩種病毒分別被叫做HIV1和HIV2，它們呈現(xiàn)出相似的生物學(xué)和形態(tài)特性，它們的整體結(jié)構(gòu)是相同的，都是由RNA，蛋白質(zhì)，碳水化合物和脂類4個部份組成(見附圖6)，但卻具有遺傳和抗原的差別，圖6是用電子顯微術(shù)和其它方法對艾滋病毒復(fù)雜結(jié)構(gòu)的解剖結(jié)構(gòu)，球狀外殼中呈截頭圓錐形的核心部分是最主要的結(jié)構(gòu)特征。
艾滋病的診斷防治(包括血制品的檢驗)及抗艾滋病毒藥物研制都需要有效的檢驗方法。經(jīng)文獻(xiàn)檢索表明，從1985年到1995年間，檢測艾滋病毒的方法專利有234件，但都屬于生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法。例如免疫試驗、抗原-抗體、單克隆抗體、核酸雜交、細(xì)胞融合等方法。也有用Raman光譜法成功研究其它病毒的報道，例如1976年美國麻省理工學(xué)院Thomas等人在“J.Mol.Biol.”上發(fā)表文章談到用Raman光譜研究MS2-Phage(噬菌體)的結(jié)果，但至今尚無光譜法用于檢測艾滋病毒的報道。然而，目前用來檢測艾滋病毒的生物化學(xué)方法和分子生物學(xué)方法，本身還存在許多缺點(diǎn)方法較復(fù)雜、技術(shù)難度大、準(zhǔn)確性有問題、檢測時間周期長、需用較多血樣、易造成污染等。
本發(fā)明的目的是針對目前檢驗艾滋病毒技術(shù)方法中存在的缺點(diǎn)和問題，尋求、提供一種能直接測定含有艾滋病毒的血清、血液、精液、和唾液的物理方法，且其靈敏度高、專一性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、快速簡便。
本發(fā)明基于多年的基礎(chǔ)研究經(jīng)驗提供了一種檢測艾滋病毒的光譜方法，利用該方法和技術(shù)能夠直接、快速和準(zhǔn)確地檢測出艾滋病毒。本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容如下1、儀器和樣品準(zhǔn)備本發(fā)明用于檢測艾滋病毒的光譜儀主要為激光拉曼(Raman)光譜儀，也包括Raman微探針、FT(傅里葉轉(zhuǎn)換)-Raman光譜儀以及紅外光譜儀和FT-紅外光譜儀。測定樣品前，校正儀器使處于良好可用狀態(tài)，取液體被檢測樣品；如果被測樣品為干細(xì)胞或固體，可按儀器說明書要求制備試樣，以備檢測之用。利用光譜法測定艾滋病毒的技術(shù)，無需特殊訓(xùn)練和要求，一般光譜分析人員即可進(jìn)行。樣品檢測后的譜圖，與對照樣品(標(biāo)準(zhǔn)艾滋病毒純樣品)的圖譜比較，普通人肉眼即可辨別，是否存在艾滋病毒。
2、樣品檢測法將液體被檢物10～15μL用注射器注入石英管和或硬質(zhì)玻璃管(1～3mm直徑)，將管子置于譜儀的樣品臺上，開動儀器進(jìn)行測定。激光功率從200mW-800mW；激發(fā)線波長從紫外，可見到紅外均可，功率也隨之而變。重點(diǎn)檢驗(1)450～1750cm-1,(2)2500～2600cm-1,(3)2800～3100cm-1。光譜分辨率2-4cm-1(可以再外延1～2cm-1)，累加次數(shù)(信號平均)，步長和積分時間隨樣品的特點(diǎn)及所用的譜儀等條件而定，以達(dá)最佳信噪比為宜。如果被測樣品為細(xì)胞或固體，可按儀器說明書要求制樣，再用Raman微探針測出。
3．圖譜處理(1)先做出無艾滋病毒感染的血清的Raman譜圖；(2)再做出有艾滋病毒感染的血清的Raman光譜圖，從(1)和(2)對比可知艾滋病毒的特征Raman頻率，本發(fā)明已測得了HIV1和HIV2的特征Raman頻率(所用的樣品請看實施例)；(3)將同樣條件下測得的未知體液的Raman光譜的特征Raman頻率與(2)中提供的艾滋病毒的特征Raman頻率進(jìn)行比較，對照，可以迅速而準(zhǔn)確地判定。
下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明

圖1是陰性人血清的拉曼光譜(A)和人血清中HIV1和HIV2的拉曼光譜(B)，用作比較選擇的有關(guān)光譜區(qū)域為450至3100cm-1。實驗條件是激發(fā)線波長514.5nm，功率500mW，三單色器的四個狹縫寬度分別為700,800,800,700μm，光譜分辨率4cm-1，步長1cm,積分時間和信號平均分別為0.1和7次掃描(在450-1750cm-1),0.2和5次掃描(在2500-2600cm-1),0.2和2次掃描(2800-3100cm-1)，室溫18±2℃。
本發(fā)明的檢測實驗，所用艾滋病毒是由美國V-TECH公司提供；儀器是使用法國Jobbing Yvon公司的JY-T800型Raman光譜儀；采用美國的NIC 1180小型計算機(jī)(配有專門做拉曼光譜的程序)；激光器是美國Spectra Physics公司生產(chǎn)的164型氬離子激光器。
圖1至圖5是對圖1拉曼光譜的不同光譜區(qū)域給予更加詳細(xì)的展示。
圖2是陰性人血清的拉曼光譜圖(450-1750cm-1)，實驗條件與圖1相同。
圖3是人血清中HIV1和HIV2的光譜圖(450-1100cm-1)，實驗條件與圖1相同。
圖4．人血清中HIV1和HIV2的拉曼光譜圖(1100-1750cm-1)，實驗條件與圖1相同。
圖5．A、陰性人血清和B、人血清中HIV1和HIV2的拉曼光譜圖(2800-3100cm-1)，實驗條件與圖1相同。
本發(fā)明首次報道了人血清中艾滋病毒(HIV1和HIV2)與對照樣品陰性人血清的拉曼光譜圖，實際上將成為艾滋病毒的一套標(biāo)準(zhǔn)拉曼光譜圖，可供科研，醫(yī)療衛(wèi)生、血制品、血庫等方面作為參比標(biāo)準(zhǔn)使用，只需比較譜圖各特征峰即可確知有無艾滋病毒。這種方法在體外能夠快速、準(zhǔn)確地檢測出體液中(血液、精液、唾液等)及各種血制品等物中的艾滋病毒。
上述光譜檢測法的實驗過程和科學(xué)上的理論分析(譜圖特征峰與艾滋病毒空間結(jié)構(gòu)間關(guān)系)如下本發(fā)明所提供的人血清中艾滋病毒的拉曼光譜圖是首次得到的真實的RNA-蛋白質(zhì)-碳水化合物-脂類復(fù)合物的拉曼光譜圖，是艾滋病毒空間結(jié)構(gòu)的信息。
從圖1可清楚地看出，拉曼信號主要是產(chǎn)生于HIV1和HIV2的上述四種主要組分的譜圖，即這些突出的譜線和特征峰是產(chǎn)生自艾滋病毒的糖蛋白的碳水化合物、蛋白質(zhì)、RNA及脂類。
人血清中HIV1和HIV2的拉曼光譜，是碳水化合物產(chǎn)生的拉曼散射起著支配作用。在碳水化合物的異頭C1位上有β構(gòu)型。二股病毒RNA的骨架估計是A型構(gòu)象。病毒蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)保持有α螺旋、β-折疊、β-回折和無規(guī)卷曲的結(jié)構(gòu)。病毒的脂雙層處于凝膠相。在18℃下所測得的人血清中HIV1和HIV2的拉曼光譜譜線(450-3100cm-1)，詳見表1所示。
表1．在18℃所測得的人血清中HIV1-HIV2的拉曼光譜(450-3100cm-1)頻率(cm-1) 病毒的四種組成碳水化合物 RNA 蛋白質(zhì) 脂類465493Man503skeletal modes r S-S str51 GlcNac S-S str521 S-S str537GlcNac S-S str548 Trp581C,G Trp596C602Man613620 Phe631GlcNac r640 Trp669Man G676684692703GlcNac C-S str717 C-S strC-N sym728A736GlcNac743Man Ⅱe,Asn751C759 Trp,Val769Man778786 C,U Thr814 P Asn832Man Tyr,Val851 Tyr859880β-configuration C-C str,TrpMan Val907Man C-C str926COH C-C str933GlcNac C-C str952Man C-C str
表1．(續(xù))頻率(cm-1) 病毒的四種組成碳水化合物 RNA 蛋白質(zhì) 脂類974 Man r994 CH2rock1004 rPhe1048 Cl-H bendingrC-N strC-O,C-C,GlcNac1089 COH C-N strC-C str1106 Man P1123 Man,GlcNac C,U C-N str1132 Man C-N strC-C str1157 r C-N str11721178 G,A,CTyr11931205 Tyr,Phe1226 A AmideⅢ1237 U,C AmideⅢ1244 AmideⅢ1250 A,C AmideⅢ1264 AmideⅢ1277 CH2OH,Man AnideⅢ1282 Man,GlcNac,COH AmideⅢ1303 A,C AmideⅢ1322 GlcNac GC-H def1330 C(6)-H2,CH3COH1341 AC-H def,Trp1348 COH bending,Man1356 Trp1365 GlcNac GC-H def1379 CH3,GlcNac,G,U,AMan1394 C-H bending1408 Man CO2sym str1419 G,A1433 GlcNac Trp(N-H def)1456 CH2hcnding CH2bending CH2bending1484G,A1494 Man1508A15201527C1537 ManG1555 GlcNac AmidcⅡ,Trp1581G,A Trp1567
表1．(續(xù))頻率(cm-1) 病毒的四種組成碳水化合物 RNA 蛋白質(zhì) 脂類16131620Man C=O str,UTrp,Tyr,Phe16281635GlcNac(AmideⅠ)1644 AmideⅠ1660CO str, AmideⅠU,G,C1669 AmideⅠ1681C=O,str AmideⅠU,G,C16961725 C=O str1740 C=O str2552 S-H str,Cys2578 S-H str,Cys2853 CH2sym str2883 C-H str CH2asym str2900C-Hstr,Man2935C-H str,Man C-H str C-H str CH3sym str2979C-H str,Man C-H str C-H str縮寫詞說明標(biāo)準(zhǔn)3-字符號是用于各氨基酸和碳水化合物；一字符號是用于RNA堿；r=ribose，核糖；p=磷酸酯；Man=D-Mannose，甘露糖；GlcNac=N-乙?；?D-葡萄糖胺。其中已知有一些特殊類型的振動模式，它們由以下縮寫詞表示sym=對稱，str=伸縮，def=-形變，A=腺嘧啶，U=尿嘧啶，G=鳥嘧啶，C=胞嘧啶，Trp=色氨酸，Tyr=酪氨酸，Phe=苯丙氨酸。
1、陰性人血清的拉曼光譜圖說明陰性人血清的拉曼光譜的一些譜線主要是屬于蛋白質(zhì)(參見圖2)。這此些譜線是分別出現(xiàn)于500,521,543cm-1(S-S Str),744cm-1,(C-S,Str),832,852cm-1(Tyr),1003cm-1(Phe),2554cm-1(S-Hstr),1070,1081,1124cm-1(C-N str),1342cm-1(C-H def),1459cm-1(CH2彎曲),2935,2978cm-1(C-H Str)。主鏈酰胺Ⅲ和酰胺Ⅰ的譜線是分別出現(xiàn)于1226,1232cm-1(β-折疊)，1299cm-1(α-螺旋)，1253cm-1(無規(guī)卷曲)以及1655CM-1(α-螺旋)，1668CM-1(β-折疊或無規(guī)卷曲)。有趣的是，似乎陰性人血清的蛋白質(zhì)光譜中沒有來自β-回折和色氨酸的信號。此外，在陰性人血清的拉曼譜圖中也沒有來自脂類，碳水化合物和RNA的信號。
2、人血清中HIV1和HIV2的拉曼光譜圖解釋相比之下，人血清中HIV1和HIV2的拉曼光譜的突出的拉曼譜線是產(chǎn)生于病毒糖蛋白的碳水化合物，蛋白質(zhì)(包括各種酶)，RNA和脂雙層。這四種組份的譜線有時是獨(dú)立的，有時又被此重疊。
(1)人血清中HIV1和HIV2的碳水化合物的拉曼光譜重量占包膜糖蛋白的50％的是碳水化合物，屬于HIV1和HIV2的碳水化合物的一些強(qiáng)譜線出現(xiàn)于880,1048,1089,1277,1348及1456cm-1.在880cm-1的譜線是屬于異頭C1位上的β-構(gòu)型。甘露糖和N-乙酰糖胺是GP120寡糖的主要成分，其強(qiáng)譜線出現(xiàn)于493,880,1048,1272,1350,1450,1466cm-1。 N-乙酰-O-糖胺的強(qiáng)譜線出現(xiàn)于515,537,1048,631,736,1282,1322,1330,1379及1635cm-1。
(2)人血清中HIV1和HIV2的蛋白質(zhì)的拉曼光譜這些病毒的蛋白質(zhì)包括基質(zhì)蛋白、蛋白外殼，核外殼、蛋白酶、反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶、整合酶與核糖核酸酶等。此外，還有病毒的多肽。
主鏈構(gòu)象HIV病毒蛋白的主鏈酰胺Ⅲ的譜線出現(xiàn)于1237,1226cm-1(β-折疊)，1264,1277,1282cm-1(α-螺旋)，1303cm-1(β-回折)及1244,1250cm-1(無規(guī)卷曲)。蛋白質(zhì)的主鏈酰胺Ⅰ的譜線，出現(xiàn)于1644和1681cm-1(β-回折)，1660cm-1(α-螺旋或無規(guī)卷曲)及1669cm-1(β-折疊或無規(guī)卷曲)。C-N伸縮振動出現(xiàn)于1048,1089,1123,1132,1157cm-1。CH2彎曲出現(xiàn)于1456cm-1和C-H伸縮振動在2883,2935及2979cm-1等譜線，都是很清楚和很強(qiáng)的。
側(cè)鏈構(gòu)象屬于側(cè)鏈的譜線是產(chǎn)生于芳香殘基，出現(xiàn)于548,581,759,880,1341,1356,1433,1555,1581及1620cm-1(色氨酸的吲哚環(huán))，640,832,851,1178,1205，及1620cm-1(酪氨酸的P-羥基苯環(huán))，620,1004,1205及1620cm-1)(苯丙氨酸的單取代苯環(huán))。色氨酸在1356cm-1的譜線也很清楚。此外，還有胱氨酸，蛋氨酸等的S-S鍵、在503、515、521及537cm-1的伸縮振動及半胱氨酸的-SH基在2552,2578cm-1的譜線；天冬氨酸和谷氨酸殘基的羧基出現(xiàn)于1725,1740cm-1和1408cm-1。
(3)人血清中HIV1和HIV2的RNA的拉曼光譜這主要是主鏈磷酸二酯，磷酸離子，4個堿基A.G.C.U和核糖的空間結(jié)構(gòu)。主鏈磷酸二酯(PO2)在814cm-1的對稱伸縮振動譜線是明顯的，它表明該病毒的雙股RNA呈A型構(gòu)象，在1106cm-1的對稱伸縮屬于磷酸離子。病毒RNA中的核糖C-O和C-C伸縮振動是出現(xiàn)在974,1004,1048及1157cm-1，核糖骨架變形譜線出現(xiàn)于503和631cm-1。此外，還有堿基的許多的譜線。
(4)人血清中HIV1和HIV2的脂類的曼光譜病毒的脂類所產(chǎn)生的譜線出現(xiàn)于717,1089,1132,1456,2853,2883及2935cm-1。這些譜線分別屬于膽堿的C-N對稱伸縮，C-C主鏈振動，CH2彎曲振動及C-H伸縮振動。
(5)結(jié)論將人血清HIV1和HIV2的拉曼光譜圖(A)與陰性人血清的拉曼光譜圖(B)進(jìn)行比較可以看出在B中的強(qiáng)的特征譜線880,1048,1089,1277,1348,1456,1644,1660,2883,2935,以及2979cm-1，是十分明顯地表明著它們雙方的差別。
本發(fā)明的效果利用光譜法檢測艾滋病毒具有很高的準(zhǔn)確性，因為Raman和紅外光譜圖都具有“指紋”鑒定的特征。美國和法國的Raman光譜儀的波數(shù)精度高達(dá)±0.1CM-1，分辨率高達(dá)0.28cm-1(檢收指標(biāo))，因而該圖譜有很高的重現(xiàn)性。
本發(fā)明檢測艾滋病的光譜方法，與主述生化及分子生物學(xué)方法相比，具有下列優(yōu)點(diǎn)(1)能直接測定含有艾滋病毒(例如HIV1,HIV2)的血清和血液、唾液、精液等，且所需樣品量少，每次只需15-20μL即可；(2)靈敏度高能夠直接和同時測得艾滋病毒的四種組成RNA、蛋白質(zhì)、糖和脂類)及它們的空間結(jié)構(gòu)的信息；(3)專一性極強(qiáng)和準(zhǔn)確性極高有無艾滋病毒的血液或血清呈現(xiàn)出的信息(譜圖)完全不同；(4)快速簡便檢測一個樣品大約需要0.5-3小時(視譜儀的檢測器類型而定)。對初中畢業(yè)生經(jīng)短期培訓(xùn)操作規(guī)程即可進(jìn)行檢測，對照標(biāo)準(zhǔn)樣品圖譜即可判定血液或血清中是否有艾滋病毒；(5)安全無污染對測試人員及環(huán)境無污染；(6)設(shè)備投資的效益高建立檢測裝置，購買進(jìn)口激光拉曼光譜儀需要費(fèi)用約10-15萬美元，但可連續(xù)使用30-40年，作為艾滋病檢測中心長遠(yuǎn)考慮是合算的。(其間只需調(diào)換消耗性器材如激光管等)。
實施例1被檢測的樣品是陰性人血清(未被HIV感染)和強(qiáng)陽性人血清(含有HIV1和HIV2),HIV即人類免疫缺損病毒。它們均來自美國V-TECH公司(地址在Pomona,CA,91767,U.S.A)。(見“說明書”)樣品注入1.0mm內(nèi)徑的石英管內(nèi)。
用法國的Jobing Yvon公司的JY-T800 Raman光譜儀進(jìn)行測定。用美國的NIC1180小型計算機(jī)(配有專門做Raman光譜的程序)控制及數(shù)據(jù)處理。激光器是美國Spectra-Physics公司生產(chǎn)的164型氬離子激光器，激發(fā)線波長514.5nm，功率500mW，光譜分辨4cm-1，三單色器的4個狹縫寬度700,800,800,700μm，步長1cm-1，積分時間和信號平均0.1和7次掃描(在450-175cm-1),0.2和5次掃描(2500-2600cm-1),0.2和2次掃描(2800-3100cm-1)，室溫18°±2℃。獲得HIV1和HIV2的Raman光譜和特征Raman頻率與指定表(450-1750cm-1,2500-2600cm-1,2800-3100cm-1)見附圖1-5和表1。對照，比較陰性人血清與含HIV1和HIV2的人血清，便可確知艾滋病毒存在。實施例2實驗方法同實施例1，不同之處在于使用紅外光譜，結(jié)果也得到同樣的譜圖和特征譜線。
權(quán)利要求
1.一種檢測病毒的光譜方法，其特征在于對艾滋病毒的檢測，包括(1)檢測前的準(zhǔn)備，即調(diào)整光譜儀器，將液體被檢物注入直徑為1-3mm的石英管或硬質(zhì)玻璃管中，置于儀器的樣品臺上，(2)樣品測定，包括對a．無艾滋病毒感染的(陰性)血清和b．有艾滋病毒感染的(陽性)血清，進(jìn)行光譜檢測，重點(diǎn)檢測450-1750cm-1,2500-2600cm-1和2800-3100cm-1，得到附圖1-5的一系列譜圖，及表1中列示的一系列譜線，(3)圖譜處理從a與b兩種譜圖對比，可確知艾滋病毒的特征拉曼頻率(拉曼譜線)，(4)未知體液的艾滋病毒鑒定將同樣條件下測得的未知體液的拉曼光譜的特征拉曼頻率(譜線)與b．提供的艾滋病毒的特征拉曼頻率(譜線)進(jìn)行比較對照，便可迅速準(zhǔn)確地判斷未知體中是否有艾滋病毒。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測艾滋病毒的光譜方法，其特征在于得到的有艾滋病毒的拉曼光譜，包括在880,1048,1089,1272,1348,1456,1644,1660cm-1及2578,2883,2935和2978cm-1的強(qiáng)譜線和屬于HIV1和HIV2的4個組份的全部特征Raman頻率。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測病毒的光譜方法，其特征在于所使用的光譜儀器包括激光拉曼光譜儀、拉曼微探針、傅里葉轉(zhuǎn)換拉曼光譜儀、紅外光譜儀及傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀(帶光纖和探頭)。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測病毒的光譜方法，其特征在于所說的液體被檢物包括體液、血液、血清、精液和唾液及各種血制品。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測體外液體被檢物中是否存在艾滋病毒的拉曼光譜方法,重點(diǎn)是檢測450—3100cm
文檔編號G01N21/25GK1210259SQ9711685
公開日1999年3月10日 申請日期1997年9月2日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月2日
發(fā)明者許以明 申請人:中國科學(xué)院生物物理研究所