專利名稱：提高離心前紅細胞的聚焦作用和/或凝集作用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種減小紅細胞間相互排斥的自然趨勢的方法。尤其是，本發(fā)明涉及一種使抗凝全血的離心樣品中紅細胞層和淡黃色膜(buffy coat)粒細胞層之間的界面清晰的方法。
U.S.專利4,027,660；4,082,085；4,137,755；和5,086,784涉及一種設(shè)備和工藝，該設(shè)備和工藝可物理性地拉伸在透明管中，如毛細管中離心血樣的血液組分層。然后，血細胞參數(shù)的測定由U.S.專利4,156,570和4,558,947中公開的儀器完成。正如U.S.專利4,779,976中描述的，此技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用在獸醫(yī)上。上述技術(shù)通常稱之為定量淡黃色膜分析(“q.b.c.a.”)技術(shù)。
此技術(shù)的研究者遇到了被稱之為“流動”現(xiàn)象的問題，該現(xiàn)象與上述的q.b.c.a.技術(shù)有關(guān)。此流動問題部分是由于紅細胞組分上升至淡黃色膜的粒細胞層的結(jié)果；部分是由于粒細胞沉降至離心的紅細胞層上部的結(jié)果，二者都是由于紅細胞和粒細胞密度的部分重疊。
一些解決方法被設(shè)計來減小流動。一種解決方法涉及了利用添加劑，如草酸鉀，來減少紅細胞的水分，即增加了紅細胞的密度。此解決方法在U.S.專利4,159,896和4,181,609中說明。但此解決方法不能完全地消除流動問題。
另一種解決流動問題的嘗試在U.S.專利4,695,553中探討。此解決方法是，血樣首先在管中以一個方向離心，然后將管反放入離心機，使血樣在管中以相反方向離心。此方法的原理是，在第一次離心步驟中，最輕的紅細胞會將在壓積的紅細胞層的上部；然后當再次反方向離心后，最輕的紅細胞可與上面覆蓋的重的紅細胞接合，因此可以不上升至粒細胞界面。這種解決方法很麻煩，需要大量的技術(shù)人員完成。
第三個解決流動問題的方法涉及，向血樣中加入抗體，或其它對紅細胞表面抗原具有特異性的結(jié)合劑。一種適當?shù)目贵w是種特異性抗血型糖蛋白抗體。此抗體可使相鄰紅細胞彼此結(jié)合，由此導致紅細胞附聚。U.S.4,594,165和U.S.4,940,668描述了與上述q.b.c.a.技術(shù)有關(guān)的紅細胞附聚引發(fā)抗體的應(yīng)用。為了使抗體發(fā)揮其預期的作用，各個紅細胞在離心步驟前必須能夠彼此相對靠近，使抗體可以將相鄰紅細胞彼此結(jié)合起來。
在通過q.b.c.a.技術(shù)對抗凝全血樣品進行分析時，尤其是采用紅細胞特異性抗體時，一個復雜化因素是紅細胞之間彼此排斥的自然趨勢。排斥現(xiàn)象是由于“Z-電位”產(chǎn)生的，該電位是由于紅細胞表面負電荷的存在，而電荷的存在是因為紅細胞膜上的唾液酸根導致的。
血中的紅細胞還有一種聚集的趨勢并形成為“紅細胞錢串”或“幣堆”。紅細胞錢串化趨勢是影響透明管中全血樣品的紅細胞沉降速度測定的因素，也影響比重。U.S.4,135,819中探討了紅細胞錢串化現(xiàn)象。全血樣品中的紅細胞成錢串化趨勢的相反作用是上述的Z-電位排斥現(xiàn)象。
1975年9月2日批準的U.S.專利3,902,964，D.J Greenspan描述了一種方法和裝置，可利用化學手段從血組成中分離出血漿或血清。此專利提出將正電性聚合物，如聚凝胺和血細胞凝集素植物提取物-植物血凝素，加入到血樣中以提高血液中成分的凝集作用及這些成分由血清和血漿中的沉積。Greenspan發(fā)明的目的是將上述血樣組分不通過離心即能夠產(chǎn)生快速重力性地分離。Greenspan發(fā)明提出，一個正電性聚合物與一個植物血凝素結(jié)合，實際上可將血樣中的組分從血漿或血清中分離出來而不用離心血樣。此參考文件并沒有討論任何關(guān)于解決抗凝全血離心樣品中，紅細胞層和粒細胞層之間的清晰輪廓界面問題的解決方法。則根據(jù)上述Greenspan專利的說教不能認定其對離心抗凝人全血中流動現(xiàn)象的反作用有重要的改進作用。
需要一定程度地中和或減小動物和人的紅細胞Z-電位，來提高紅細胞聚集作用，紅細胞錢串化和凝集作用，以改善上述人和動物的q.b.c.a技術(shù)。
本發(fā)明涉及一種提高人和動物的，尤其是奶牛的，紅細胞錢串化或其它聚集作用趨勢的方法。本發(fā)明的實施顯著地減小了紅細胞Z-電位導致的排斥力強度。由受試者血樣中存在的結(jié)合劑所產(chǎn)生的紅細胞聚集作用；錢串化作用；或凝集作用，可被一定程度地提高，能有效地使離心的抗凝全血樣品中紅細胞和粒細胞層間的界面清晰。
本發(fā)明涉及向血樣中添加復合試劑，其中該試劑將中和或減小紅細胞Z-電位的排斥作用。應(yīng)用的試劑包括高分子量陽離子大分子物質(zhì)的結(jié)合物，即分子量約大于50,000道爾頓的物質(zhì)。溶液中適當試劑結(jié)合物將形成混合物分子團，該分子團可成為紅細胞聚集和錢串化的引發(fā)劑。特別是，試劑結(jié)合物包括將以下物質(zhì)結(jié)合聚凝胺；魚精蛋白硫酸鹽；陽離子抗生素，如萬古霉素；聚乙二醇(PEG)；羥基二乙基淀粉(HES)；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；和高分子量葡聚糖。本發(fā)明中所用的術(shù)語“分子團”涉及亞顯微顆粒，該種顆粒在溶液，尤其在哺乳動物的抗凝全血中，具有熱力學穩(wěn)定性。分子團由二個或更多的大分子形成，至少其中之一在分子團上形成正電性外層，該正電性層中和或減小由紅細胞Z-電位產(chǎn)生的排斥力強度。優(yōu)選在含水溶液中形成高分子分子團，例如與抗凝全血樣品混合的生理鹽水。某些超高分子量帶正電荷物質(zhì)，如PVP，也可單獨或與其它上述試劑結(jié)合使用。
為了滿足在抗凝全血的離心樣品中制備清晰紅細胞-粒細胞界面的需要，本發(fā)明還試圖向血樣中加入紅細胞特異性結(jié)合劑，如抗血型糖蛋白抗體或植物凝血素，并與上述大分子劑結(jié)合。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種處理抗凝全血樣品的方法，以提高血樣中紅細胞成錢串化或其它聚集作用的趨勢。
本發(fā)明進一步的目的是提供一種方法，其中由紅細胞Z-電位導致的紅細胞排斥作用可被抑制。
本發(fā)明又一個目的是提供一種方法，其中血樣與含有一種或多種可一定程度地提高紅細胞聚集作用的高分子量陽離子物質(zhì)進行混合，它們將在血樣離心時通過紅細胞密度依重力沉降出層次。
本發(fā)明另一個目的是提供一種方法，其中血樣還可與能使紅細胞凝集的結(jié)合劑混合，它們在血樣離心時通過紅細胞密度依重力沉降出層次。
本發(fā)明的這些和其它的目的及進步，將通過下列結(jié)合有附圖的本發(fā)明優(yōu)選實施例具體說明，使所屬領(lǐng)域技術(shù)人員更易理解。
附圖簡述

圖1.是一個透明樣品管的透視圖，該透明樣品管含有離心血樣和細胞層拉伸插入物；圖2.是一個紅細胞彼此排斥狀態(tài)的圖解說明，該彼此排斥狀態(tài)是由于其表面負電荷導致的；圖3.是一個由葡聚糖和聚凝胺結(jié)合形成的分子團的圖示，其中該分子團具有表面正電荷；圖4.是一個狀態(tài)圖示，該狀態(tài)是當分子團加入到血樣中，通過減小或中和Z-電位的影響，使相鄰紅細胞更加緊密聚集情形。
圖5.是一個狀態(tài)的圖示，在該狀態(tài)中，分子團加入到血樣中起減小或中和紅細胞彼此排斥強度的作用，以使血樣中紅細胞特異性結(jié)合劑將各個紅細胞凝集。
完成發(fā)明的最優(yōu)選方式將附圖作為參考，附圖1表示在本發(fā)明試驗方法中優(yōu)選的血液取樣和測試的裝置類型。該裝置包括抗凝全血樣品可在其中抽取和離心的透明管2。透明管2含有通常為圓柱形的血細胞層拉伸插子6，該插子具有特定的比重，并能在管2的離心抗凝全血樣品紅細胞層8中漂浮。管2的底部用蓋4封閉，以保證管2樣品的離心。當血樣在管2中離心時，其各組成按照特定的比重沉降分層。最重層是紅細胞層8；然后依次為淡黃色膜10；和血漿層12。淡黃色膜10有三個主要組成層，即，粒細胞層14，淋巴細胞/單核細胞層16，和血小板層18。紅細胞層8和粒細胞層14間的界面20是清晰的和明確的分界，這是由于在血樣中加入了高分子量的陽離子大分子結(jié)合物，并同時加入紅細胞結(jié)合劑，或在某些情況下可不加后者。
附圖2.圖示了一種狀態(tài)；在該狀態(tài)中，抗凝全血樣品的相鄰紅細胞22趨于彼此排斥，這是由于Z電位的表面負電荷造成的；當排斥達到一定程度時，將干擾相鄰細胞22上的紅細胞特異性結(jié)合劑24將細胞22彼此凝集的能力。為了造成結(jié)合劑引起的相鄰紅細胞22的聚集，結(jié)合劑單體24必須能附著在各紅細胞22表面膜上。圖2.表示，在某些情況下，由Z-電位排斥力產(chǎn)生的相鄰紅細胞間的空隙很大，使結(jié)合劑單體24無法使相鄰紅細胞22聚集。
圖3.是本發(fā)明所述的分子團形成的圖示。分子團通常由字符M表示，并由一群大分子形成。實際中的分子團M包括由許多核心葡聚糖分子D，許多聚凝胺分子組成的外表面。葡聚糖分子D提供了分子團M的預期體積；聚凝胺分子P提供了預期的分子團M的表面正電荷，如圖3.所示。
附圖4.是一個狀態(tài)的圖示，在該狀態(tài)中牛抗凝全血樣品的高分子量陽離子分子團引發(fā)紅細胞錢串化和其它的紅細胞聚集。在圖4.中數(shù)字22代表各個紅細胞，字符M代表陽離子性高分子量的改善紅細胞錢串化或紅細胞聚集的分子團，如PVP。陽離子分子團或大分子M的混合物分配在紅細胞22之間，并有效地使紅細胞22盡可能地彼此接近。由于陽離子高分子分子團或大分子M的摻入，紅細胞22的聚集作用提高了。
附圖5.是一種狀態(tài)的圖示，該狀態(tài)中分子團或大分子M引發(fā)了錢串化或其它紅細胞聚集的形成，并達到一定程度以滿足紅細胞結(jié)合劑24凝集紅細胞22的需要。
上述確定技術(shù)的特定應(yīng)用涉及了抗凝牛全血離心樣品的q.b.c.a.技術(shù)。牛血迄今為止被證明不能用q.b.c.a.技術(shù)分析。原因是牛紅細胞表現(xiàn)出的異常高的Z-電位。
從抗凝牛全血樣品中抽取紅細胞，先不結(jié)合上述類型的高分子量分子團或大分子而進行沉積，在顯微鏡下顯示出零堆積，聚集或錢串化?？鼓Ｈc抗體混合；用高分子量陽離子分子分離；然后在上述q.b.c.a.的含插子管裝置中離心。結(jié)果得到一個離心混合物，該混合物在紅細胞/粒細胞間得到一個不清晰和含糊的界面，該界面無法提供臨床可接受的測量量度，應(yīng)用于以q.b.c.a.技術(shù)為依據(jù)的白細胞和血小板差示計數(shù)。
相反的，當高分子量分子團結(jié)合物的鹽溶液，特定情況下和大分子，與抗凝牛全血混合，在顯微鏡下可觀察到顯著的紅細胞聚集或錢串化。特別有效的是高分子量試劑包括由聚凝胺和葡聚糖形成的分子團；聚凝胺和PVP形成的分子團；和陽離子PVP大分子。發(fā)現(xiàn)與含有上述試劑的鹽溶液混合的牛血樣，經(jīng)沉積，在顯微鏡下觀察到的結(jié)果是大量紅細胞形成聚集或錢串。當抗凝牛血樣單獨與含有聚凝胺和葡聚糖試劑二者之一的鹽溶液混合時，證明不能產(chǎn)生顯著的紅細胞聚集或錢串形成。
根據(jù)本發(fā)明方案，抗凝牛全血樣品與含分子團的鹽溶液混合，該分子團由聚凝胺和葡聚糖組成。混合物在現(xiàn)有技術(shù)所用的q.b.c.a.的含插子管的裝置中離心，所得沉降分離混合物顯示出一個清晰并良好分界的紅細胞-粒細胞界面，此界面足夠提供臨床可接受的量度，應(yīng)用在根據(jù)q.b.c.a.技術(shù)手段的白細胞計差示數(shù)，及血細胞比容，血紅蛋白和血小板計數(shù)。
通過q.b.c.a.技術(shù)測定牛血清時，首先優(yōu)選的應(yīng)用溶液是由約65mg聚凝胺和約65mg葡聚糖/ml鹽水形成的分子團組成。上述混合物使紅細胞產(chǎn)生足夠的聚集，以便能夠進行精確的白細胞和血小板差示計數(shù)，并可在抗凝牛全血的離心樣品中進行精確的紅細胞比容和血紅蛋白讀數(shù)。血液相對于鹽水的可行性濃度在約2∶1到約10∶1的范圍。
通過q.b.c.a.技術(shù)測定牛血清時，第二優(yōu)選的應(yīng)用方案是由約65mg聚凝胺和約65mgPVP/ml鹽水形成的分子團組成。上述混合物使紅細胞產(chǎn)生足夠的聚集，以便能夠進行精確的白細胞和血小板差示計數(shù)，并可在抗凝牛全血的離心樣品中進行精確的紅細胞比容和血紅蛋白讀數(shù)。血液相對鹽水的可行性濃度在約2∶1到約10∶1的范圍。
通過q.b.c.a.技術(shù)測定牛血清時，第三優(yōu)選的應(yīng)用方案是由65mgPVP的大分子/ml鹽水組成。上述混合物也可使紅細胞產(chǎn)生足夠的聚集，以便能夠進行精確的白細胞差示計數(shù)，并可在抗凝牛全血的離心樣品中進行精確的紅細胞比容，血紅蛋白，和血小板計數(shù)的讀數(shù)。血液相對于鹽水的可行性濃度在約2∶1到約10∶1的范圍。
在牛血分析中，最優(yōu)選應(yīng)用的分子團和大分子的鹽水溶液濃度的確定，是由IDEXX Laboratories，Inc.的Messers. John Roche，PaulWeiss和Travis Waldron工作室完成的。
上述確認技術(shù)的另一個應(yīng)用涉及了抗凝全血離心樣品的q.b.c.a.技術(shù)，其中該血樣表現(xiàn)出流動問題。如上所述，具有確定的過度流動的人血液，至今為止被證明還難以用q.b.c.a.技術(shù)分析。此現(xiàn)象的原因還不清楚。
已知具有“流動”作用的人抗凝全血樣品，與聚凝胺和葡聚糖分子團的鹽溶液混合，然后用圖1所示并描述的q.b.c.a.技術(shù)裝置進行離心。結(jié)果得到了一種離心混合物，該混合物雖然改善了流動問題，但仍不足以提供臨床可接受量度，應(yīng)用于以q.b.c.a.技術(shù)為依據(jù)的白細胞差示計數(shù)，或血細胞比容和血紅蛋白計數(shù)中。同樣，流動性血樣和單獨一種較高分子量試劑的混合物，或流動性血樣和抗血型糖蛋白抗體的混合物，都不能改善流動作用。
當流動性血樣與聚凝胺和葡聚糖分子團的結(jié)合物混合，并再結(jié)合抗血型糖蛋白抗體，粒細胞-紅細胞的分離得到了改善；且在具有合理百分比的離心流動性血樣中，上述兩種細胞層間的界面明顯清晰了。當與聚凝胺-葡聚糖分子團溶液和抗血型糖蛋白抗體結(jié)合時，約一半的流動性測試血樣被證明其細胞分離程度顯著提高，可確保應(yīng)用q.b.c.a.技術(shù)來完成精確白細胞和血小板差示計數(shù)，及紅細胞比容和血紅蛋白讀數(shù)。
特別是，流動性人血液與抗血型糖蛋白抗體，和含有約65mg和約65mg葡聚糖/ml鹽水的分子團的鹽溶液進行混合。將此血液-試劑混合物沉積，在顯微鏡下可觀察到產(chǎn)生了大量的紅細胞聚集或紅細胞錢串的形成。對于分析流動性人血樣，血液與紅細胞聚集劑溶液的比濃度，優(yōu)選范圍約是2∶1至10∶1。由一個極常規(guī)的方法也可得到相似的結(jié)果，該方法是將適當濃度的結(jié)合劑和/或紅細胞-聚集劑，在血樣管壁上形成一層干的溶于血液的包被層。當與紅細胞結(jié)合劑結(jié)合時，上述聚凝胺-PVP分子團和PVP大分子也可有效的減小流動問題。
因此容易理解的是，單獨向血樣中加入陽離子高分子量分子團化合物的結(jié)合物，或加入陽離子大分子試劑，或某些情況下，與紅細胞特異性結(jié)合試劑結(jié)合，將顯著地提高紅細胞聚集，成錢串化和凝集的能力。按此方法處理的血樣可因此在q.b.c.a.技術(shù)中更易于精確地分析。尤其是，處理的抗凝牛全血樣品可應(yīng)用上述技術(shù)分析，處理的流動性人血樣品也可應(yīng)用上述技術(shù)得到更好地分析。
由于在不超出本發(fā)明原理的范圍內(nèi)，即可做出與本發(fā)明公開實施例的許多變化和不同，本發(fā)明不局限于這些其它方式，但以所附權(quán)利要求書中所要求的為限。
權(quán)利要求
1.一種在離心抗凝全血樣品的紅細胞層和粒細胞層間形成良好確定的和清晰的界面的方法，該方法包括的步驟如下a)將一定量的分子團與血樣混合以提供一種血液-分子團混合物，該分子團由至少兩種不同的高分子量顆粒組成，并具有表面正電荷；及b)在透明管中離心血液-分子團混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中的步驟還包括將該血液-分子團混合物與紅細胞特異性結(jié)合劑在該離心步驟前進行混合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中所述血樣為牛血。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中該高分子量顆粒是選自一組由聚凝胺，魚精蛋白硫酸鹽，陽離子抗生素，聚乙二醇(PEG)，羥基二乙基淀粉(HES)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，和葡聚糖組成的試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中該分子團由聚凝胺和葡聚糖的混合物形成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中該分子團是由聚凝胺和PVP形成的。
7.一種在離心抗凝牛全血樣品的牛紅細胞層和牛粒細胞層間形成良好確定的和清晰的界面的方法，該方法包括的步驟如下a)將一定量的分子團與牛血樣混合以提供一種牛血液-分子團混合物，該分子團由至少兩種不同的高分子量顆粒組成，并具有表面正電荷；及b)在透明管中離心牛血液-分子團混合物。
8.一種在離心抗凝全血樣品的紅細胞層和粒細胞層間形成良好確定的和清晰的界面的方法，該方法包括的步驟如下a)將一定量的分子團與血樣混合以提供一種血液-分子團混合物，該分子團由一群葡聚糖和聚凝胺組成；及b)在透明管中離心血液-分子團混合物。
9.一種在離心抗凝全血樣品的紅細胞層和粒細胞層間形成良好確定的和清晰的界面的方法，該方法包括的步驟如下a)將一定量的分子團與血樣混合形成一種血液-分子團混合物，該分子團由一組聚乙烯吡咯烷酮和聚凝胺組成；及b)在透明管中離心血液-分子團混合物。
10.一種減少抗凝全血樣品中由紅細胞Z電位導致的排斥力強度的方法，該方法包括的步驟是，通過將一定量的分子團與血樣混合，形成一種抗凝的血液-分子團混合物，該分子團由至少兩種不同的高分子量顆粒組成，并具有表面正電荷。
11.根據(jù)權(quán)利要求10中的方法，其中該高分子顆粒包括葡聚糖和聚凝胺。
12.根據(jù)權(quán)利要求10中的方法，其中該高分子顆粒包括聚乙烯吡咯烷酮和聚凝胺。
13.一種在離心抗凝全血樣品的紅細胞層和粒細胞層間形成良好確定的和清晰的界面的方法，該方法包括的步驟如下a)將一定量的分子團與血樣混合形成一種血液-分子團混合物，該分子團由一組聚乙烯吡咯烷酮和聚凝胺組成；及b)在透明管中離心血液-分子團混合物。
14.一種減少抗凝全血樣品中由紅細胞Z電位導致的排斥力強度的方法，該方法包括的步驟是，通過將一定量的分子團與血樣混合，形成一種抗凝的血液-分子團混合物，該分子團由至少兩種不同的高分子量顆粒組成，并具有表面正電荷。
15.一種在離心抗凝全血樣品的紅細胞層和粒細胞層間形成良好確定的和清晰的界面的方法，該方法包括的步驟如下a)提供一種抗凝全血和陽離子大分子試劑的混合物；及b)在透明管中離心血液一試劑混合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15中的方法，其中該大分子試劑是聚乙烯吡咯烷酮。
17.根據(jù)權(quán)利要求15中的方法，其中所述血樣是牛血液。
18.一種減小抗凝全血樣品中由紅細胞Z電位導致的排斥力強度的方法，該方法包括的步驟是，通過將一定量陽離子大分子與血樣混合，形成一種抗凝的血液-陽離子大分子混合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18中的方法，其中該大分子試劑是聚乙烯吡咯烷酮。
20.根據(jù)權(quán)利要求18中的方法，其中血樣是牛血液。
21.一種含水介質(zhì)中分子團溶液，該分子團由一組大分子試劑組成，該試劑包括一個核芯的大分子組分和一表面大分子組分，該表面大分子組分為分子團提供了表面正電荷。
22.根據(jù)權(quán)利要求21中的溶液，其中該含水介質(zhì)是鹽溶液。
23.根據(jù)權(quán)利要求21中的溶液，其中該分子團是由一組葡聚糖和聚凝胺組成。
24.根據(jù)權(quán)利要求21中的溶液，其中該分子團由一組聚乙烯吡咯烷酮和聚凝胺組成。
25.一種血液分析裝置，包括一透明血液管，該管有一個接收和容納血樣的腔體，該管腔被一層干燥試劑包涂，該試劑溶于血液并包括大分子試劑，該大分子試劑能夠在溶液中形成分子團，并有效地抑制管中抗凝全血的紅細胞Z-電位。
全文摘要
哺乳動物抗凝全血樣品與試劑的結(jié)合物混合,該試劑可減小哺乳動物紅細胞彼此間具有的天然排斥力。然后,經(jīng)處理的血樣在含有淡黃色膜擴展插子的管中離心,在管中該插子可物理性的擴展血樣的淡黃色膜組成的軸向長度。通過減小紅細胞彼此間排斥的傾向,得到紅細胞和淡黃色膜間的一個清晰的界限。加入血樣中的凝集試劑的作用也會提高。上述方法和試劑首次使精確分析抗凝牛全血的離心樣品,并得到血細胞比容,及白細胞差示計數(shù)成為可能。另外,具有流動性傾向的人血樣品,也可通過加入適當降低紅細胞排斥試劑及凝集試劑,進行精確分析。
文檔編號G01N33/50GK1196486SQ97126498
公開日1998年10月21日 申請日期1997年11月21日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月22日
發(fā)明者S·C·沃德羅, R·A·萊文 申請人:S·C·沃德羅, R·A·萊文