專利名稱:抗原特異性lgG的檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種用于測(cè)定體液中G類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體的方法,該方法通過(guò)與至少兩種不同的受體R1和R2一起溫孵所述的樣品(其中的兩種受體都能特異性地結(jié)合到抗體上,R1被結(jié)合或者可以被結(jié)合到固相上,而R2攜帶一個(gè)標(biāo)記),從液相中分離出固體以及測(cè)量所述的標(biāo)記(其中由待測(cè)定的抗體特異性識(shí)別的呈單體形式的結(jié)合配偶體和標(biāo)記的綴合物被用作R2)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
具體地說(shuō),本發(fā)明涉及一種在有IgM類免疫球蛋白存在下,特異性地檢測(cè)IgG類免疫球蛋白的方法。
為了對(duì)外源物質(zhì)的引入產(chǎn)生響應(yīng),哺乳動(dòng)物生物體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了亦被稱為免疫球蛋白的抗體。它們防御亦被稱作抗原的外源物質(zhì)??梢园衙庖咔虻鞍讋澐譃槲鍌€(gè)不同的種類。人們?cè)贛,G,A,E和D類的免疫球蛋白之間進(jìn)行劃分。這五類免疫球蛋白的每一種都在重鏈的組成上有所不同,被稱作μ、γ、α、ε和δ鏈。
每一類免疫球蛋白在生物體中都具有不同的功能。隨著與抗原的第一次接觸、即所謂的第一次免疫接種,出現(xiàn)了M類免疫球蛋白。但是,隨著感染的進(jìn)行,這些免疫球蛋白的濃度迅速降低。G類免疫球蛋白在第一次免疫接種之后首先緩慢地形成,并且當(dāng)用同一抗原進(jìn)行第二次感染時(shí)大量地出現(xiàn)。A類免疫球蛋白是在生物體的粘膜表面上發(fā)現(xiàn)的,并且它決定著該處的防御過(guò)程。E類免疫球蛋白主要導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)。D類免疫球蛋白的確切功能迄今仍是未知的。
在血液中,各個(gè)種類的免疫球蛋白存在的濃度差別非常大。因此,G類免疫球蛋白(IgG)是正常人血清中的主要種類,其份額約為75%,這對(duì)應(yīng)于8至18mg/ml的血清含量。第二種最頻繁出現(xiàn)的免疫球蛋白為IgA,它的平均血清濃度為0.9至4.5mg/ml。M類免疫球蛋白存在的濃度為0.6至2.8mg/ml,D類免疫球蛋白存在的濃度為0.003至0.4mg/ml。IgE抗體的比例是最低的,它在血清中僅以0.02至0.05μg/ml的濃度存在。
為了有區(qū)別地診斷許多的疾病,重要的是檢測(cè)對(duì)具體的抗原具有特異性的一類或幾類非常具體的免疫球蛋白的抗體。僅僅可以通過(guò)種類-特異性抗體測(cè)試或者通過(guò)排除某些種類的免疫球蛋白的存在(例如,檢測(cè)IgG和IgA抗體、而不檢測(cè)IgM抗體)來(lái)保證對(duì)病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染的令人滿意的診斷。這對(duì)于區(qū)分新近的或者急性的感染和更早些時(shí)候已經(jīng)發(fā)生的感染以及對(duì)于臨床監(jiān)測(cè)感染的過(guò)程來(lái)說(shuō)是特別重要的??贵w的種類-特異性檢測(cè)對(duì)HIV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、弓形體病病毒、風(fēng)疹病毒和衣原體的感染來(lái)說(shuō)尤其重要。對(duì)于測(cè)定保護(hù)抗體的滴度以及檢查免疫接種的成功來(lái)說(shuō),特異于具體抗原的抗體的種類-特異性檢測(cè)也是必需的。因此從診斷的觀點(diǎn)來(lái)看,在尤其檢測(cè)感染的非急性期的抗體(比如IgG和IgA抗體)方面有很大的興趣。
在現(xiàn)有技術(shù)中,已經(jīng)描述了多種用于檢測(cè)對(duì)抗原具有特異性的具體種類的抗體的方法。因此,通過(guò)把特異性抗體結(jié)合到用特異性的抗原包被的固相上,頻繁地檢測(cè)具體種類的抗原-特異性抗體。通過(guò)把特異性地針對(duì)某類人Ig的抗體結(jié)合到待檢測(cè)的Ig分子上,檢測(cè)特異于抗原的、目前被結(jié)合到固相上的免疫球蛋白(Ig)。給針對(duì)人Ig的抗體提供一個(gè)標(biāo)記,借此進(jìn)行檢測(cè)。但是,這樣的一種測(cè)試方法僅在下列情況下是可能的,即如果在與針對(duì)人Ig的種類-特異性標(biāo)記的抗體反應(yīng)之前,通過(guò)洗滌除去所有的非特異性非結(jié)合的Ig。因此,作為通常需要的、用于自動(dòng)系統(tǒng)的一步測(cè)試方法是不可能的。
根據(jù)在美國(guó)專利4,292,403中所述的方法,通過(guò)把種類-特異性抗體固定化在結(jié)合待測(cè)定的樣品抗體的固相上、隨后加入特異性抗原并把已結(jié)合的抗原結(jié)合到進(jìn)一步進(jìn)行了標(biāo)記的對(duì)所述抗原具有特異性的抗體上,檢測(cè)具體種類的免疫球蛋白的抗原-特異性抗體。但是,該方法的缺點(diǎn)為待測(cè)定種類的所有抗體都必須結(jié)合到固定化的種類-特異性抗體上。而樣品抗體并不是對(duì)抗原特異性地結(jié)合著。這就可能減小了測(cè)試的靈敏度,因?yàn)閷?duì)抗原-特異性抗體而言可能不存在足夠的游離的結(jié)合位點(diǎn)。在這種測(cè)試方法中,幾個(gè)洗滌步驟也是必需的。這種方法不能實(shí)現(xiàn)一步測(cè)試方法。
由所謂的橋測(cè)驗(yàn)Brückentest提供了以一步測(cè)試進(jìn)行抗體檢測(cè)的一種可能性。在EP-A-0 280 211中描述了橋測(cè)驗(yàn)的概念。在該方法中,把能夠特異性地結(jié)合到待測(cè)定的抗體上的第一受體(比如抗原)結(jié)合到固相上。待測(cè)定的抗體結(jié)合到固相-結(jié)合的抗原上。此外,在測(cè)試混合物中存在另一種提供了標(biāo)記的特異性抗原。通過(guò)標(biāo)記來(lái)檢測(cè)抗體。在這種測(cè)試中,檢測(cè)了所有的抗原-特異性抗體、而不僅僅是具體種類的抗體。
在EP-A-0 307 149和美國(guó)專利5,254,458中,公開了以橋測(cè)驗(yàn)原理為基礎(chǔ)的用于檢測(cè)特異地針對(duì)抗原的抗體的方法。在這一情況下,使用從抗原的某個(gè)表位得到的、經(jīng)重組生成的肽來(lái)結(jié)合待檢測(cè)的抗體。把肽固定化到固相上。樣品抗體結(jié)合到肽上。把進(jìn)一步進(jìn)行了標(biāo)記的肽結(jié)合到樣品抗體上以進(jìn)行檢測(cè)。為了增加試驗(yàn)的特異性,在不同的生物體中表達(dá)重組肽。另外在這種方法中,所有種類的抗體都結(jié)合到肽上。例如,這就不可能在IgG和IgM抗體之間加以區(qū)別。
EP-A-0 386 713描述了一種使用兩種固體載體檢測(cè)抗HIV的抗體的方法,其中把不同的HIV抗原固定化到兩種固體載體上,使它們各自與樣品的等分試樣和標(biāo)記的HIV抗原接觸,其中通過(guò)在至少一次試驗(yàn)中的陽(yáng)性反應(yīng)來(lái)檢測(cè)抗體的存在。公開了作為HIV抗原的經(jīng)重組生產(chǎn)的多肽。在EP-A-0 627 625中公開了一種以Western印跡為基礎(chǔ)的方法,其中通過(guò)重組蛋白或合成肽也可以檢測(cè)HIV抗體。但是,這兩種方法都不能實(shí)現(xiàn)抗原-特異性抗體的種類-特異性檢測(cè)。
先有的方法不能使某類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體以一步法進(jìn)行檢測(cè)。從現(xiàn)有技術(shù)的狀態(tài)已知的、以橋測(cè)驗(yàn)概念為基礎(chǔ)的(其中使用了標(biāo)記的抗原和能夠結(jié)合到固相上的抗原)檢測(cè)的免疫學(xué)方法的確能夠進(jìn)行一步試驗(yàn)。但是迄今為止,利用這一簡(jiǎn)單的原理,僅僅已經(jīng)可能共同檢測(cè)出IgG和IgM類的抗體。
因此,所述的目的為提供一種用于檢測(cè)針對(duì)特異性抗原的非急性感染的抗體的改進(jìn)方法、即具體地講為IgG類。與此同時(shí),該方法應(yīng)當(dāng)保證特異性相同的IgM抗體不被檢測(cè)到。為了在自動(dòng)系統(tǒng)中有利地使用,該方法應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地由一步試驗(yàn)的原理組成。
這一目的是通過(guò)根據(jù)本發(fā)明用于測(cè)定G類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的,該方法通過(guò)與至少兩種不同的受體R1和R2一起溫孵所述的樣品(其中的兩種受體都能特異性地結(jié)合到抗體上,R1被結(jié)合或者可以結(jié)合到固相上,而R2攜帶一個(gè)標(biāo)記)來(lái)實(shí)現(xiàn),其特征在于由待測(cè)定的抗體特異性識(shí)別的呈單體形式的結(jié)合配偶體和標(biāo)記組成的綴合物被用作R2。
本發(fā)明的方法可以進(jìn)行樣品中G類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體的測(cè)定,其中存在著抗原-特異性相同的IgM類抗體。
存在于樣品中的與待檢測(cè)的IgG抗體具有同樣特異性的IgA,IgD和IgE抗體以低于IgG抗體濃度很多的濃度存在。具體說(shuō)來(lái),IgD和IgE類以低于IgG濃度幾個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度存在,從而在該檢測(cè)方法中它們的反應(yīng)性沒(méi)有或者幾乎不改變測(cè)量的結(jié)果。IgA抗體以對(duì)應(yīng)于總IgG含量的大約10%的濃度存在。因而在該方法中,推測(cè)還將測(cè)量到IgA抗體。由于所述方法的主要目的為檢測(cè)非急性感染的抗體,因此同為非急性感染的兩種抗體、即IgG和IgA抗體的共同的檢測(cè)就并不重要了。由于IgG抗體是非急性感染中主要種類的免疫球蛋白,因此在下文中使用術(shù)語(yǔ)IgG檢測(cè)。必需做到的是,必需不檢測(cè)出僅在急性感染中大量存在的抗原特異性相同的IgM抗體。
結(jié)果已經(jīng)令人吃驚地弄清楚的是根據(jù)本發(fā)明在以雙-抗原測(cè)試原理為基礎(chǔ)的橋測(cè)驗(yàn)中呈單體形式的結(jié)合配偶體的用途使得能夠僅僅檢測(cè)出特異地針對(duì)具體抗原的IgG類抗體。存在于同一樣品中的特異性相同的IgM類抗體令人吃驚地與單體肽不反應(yīng)或者僅僅在可忽略不計(jì)的微弱的程度上反應(yīng),從而不干擾IgG的檢測(cè)。術(shù)語(yǔ)“可忽略不計(jì)的微弱的”是指IgM抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)被呈單體形式的結(jié)合配偶體不能檢測(cè)到地結(jié)合著。推測(cè)起來(lái)這是由于與以單個(gè)分子形式存在的IgG抗體相比,五聚的IgM抗體與單體表位的親和力要低許多。
由于IgM抗體不干擾,因此在本發(fā)明的方法中,用于分離IgM抗體的連續(xù)測(cè)試步驟就不是絕對(duì)必需的。因而,所述方法的特殊的優(yōu)點(diǎn)為簡(jiǎn)化了測(cè)試的步驟。
除了其中的測(cè)試試劑存在于液相中的所謂的濕法測(cè)試以外,還可以使用適于蛋白或抗體檢測(cè)的所有標(biāo)準(zhǔn)的干法測(cè)試形式。在這些干法測(cè)試或者例如在EP-A-0 186 799中所述的測(cè)試帶(Teststreifen)中,將測(cè)試組分施加到載體上。因此如果以測(cè)試帶的形式來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法的話,就不需要洗滌步驟。但是,本發(fā)明的方法優(yōu)選是以濕法測(cè)試進(jìn)行的。
在一起溫孵所有的受體和樣品以及在一個(gè)步驟中實(shí)現(xiàn)所述的方法是可能的。在溫孵之后,該方法可以選擇地僅需要一個(gè)洗滌的步驟。
一般使用兩種不同的受體R1和R2來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。如果使用了濕法測(cè)試的話,受體R2存在于液相中。R1可以存在于液相中或者已經(jīng)被結(jié)合到固相上。如果R1和R2存在于液相中的話,優(yōu)選它們的濃度是相同的。已經(jīng)證明了0.5∶1.0至1.0∶5.0的R1∶R2的濃度之比是非常合適的。最佳的濃度比可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易地測(cè)試出來(lái)。
如果把能夠結(jié)合到固相上、但是仍然沒(méi)有結(jié)合到固相上的受體用作R1的話,那么與受體R1和R2一起溫孵樣品。在該過(guò)程中,樣品抗體結(jié)合到R1和R2上。這一溫孵可以在有固相存在的條件下進(jìn)行。在該過(guò)程中形成了一種復(fù)合物,它包括固相-R1-樣品抗體-R2。隨后從液相中分離出固相,可以選擇地洗滌并測(cè)量R2的標(biāo)記。通常是在固相中測(cè)量所述標(biāo)記的,但是也可以在液相中進(jìn)行測(cè)定。
如果與R1和R2一起溫孵樣品是在沒(méi)有固相的條件下進(jìn)行的話,那么隨后必須使整個(gè)的測(cè)試混合物與固相接觸,可以選擇地進(jìn)行洗滌并且測(cè)量標(biāo)記。
如果受體R1已呈固相-結(jié)合的形式,那么把樣品和受體R2加入固相-結(jié)合的受體R1中并一起溫孵。另外的步驟對(duì)應(yīng)于以上所述的方法。
但是也可能通過(guò)幾個(gè)步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。在這種情況下,合適的做法是首先與受體R1和R2一起溫孵樣品。隨后與其它的受體一起溫孵形成的R1、R2和待測(cè)定的抗體的復(fù)合物,由此該方法可以通過(guò)幾個(gè)步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外的測(cè)試步驟對(duì)應(yīng)于前面描述的方法。
受體R2為一種呈單體形式的結(jié)合配偶體和標(biāo)記的綴合物。根據(jù)本發(fā)明呈單體形式的結(jié)合配偶體恰好含有一個(gè)表位區(qū)或者對(duì)待測(cè)定的抗體而言僅有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)、即與待測(cè)定的IgG抗體特異地發(fā)生免疫反應(yīng)的結(jié)構(gòu)。結(jié)合配偶體的單體結(jié)構(gòu)是重要的,這就確保了僅有待檢測(cè)的抗原-特異性IgG抗體結(jié)合到呈單體形式的結(jié)合配偶體上并且沒(méi)有特異性相同的IgM抗體的干擾。
表位區(qū)例如可以從抗原或者抗-獨(dú)特型抗體得到。在呈單體形式的結(jié)合配偶體的情況下,表位區(qū)還可以由糖和/或脂類結(jié)構(gòu)或者肽、脂類和/或糖組分組合的結(jié)構(gòu)得到??梢允褂每捎杀砦粎^(qū)得到的所有結(jié)構(gòu),所述結(jié)構(gòu)具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn),而在有特異性相同的IgM抗體存在的條件下待檢測(cè)的IgG類抗體特異地結(jié)合到所述結(jié)合位點(diǎn)上。對(duì)結(jié)合位點(diǎn)、即對(duì)以單體形式使用的結(jié)合配偶體而言,唯一的前提條件是保留對(duì)于IgG的特異結(jié)合能力。這一條件也適用于在結(jié)合位點(diǎn)中存在糖或脂類結(jié)構(gòu)的情況。
根據(jù)本發(fā)明,還可能使用位于結(jié)合位點(diǎn)兩側(cè)或與結(jié)合位點(diǎn)重疊的呈單體形式的結(jié)合配偶體,其中待檢測(cè)的IgG抗體特異性地結(jié)合到所述結(jié)合位點(diǎn)上。因而還可能檢測(cè)到交叉反應(yīng)的IgG抗體,該抗體的結(jié)合位點(diǎn)與待檢測(cè)的表位重疊。因此,優(yōu)選使用呈單體形式的結(jié)合配偶體的混合物來(lái)檢測(cè)抗原-特異性IgG抗體。
優(yōu)選使用肽作為呈單體形式的結(jié)合配偶體。在以蛋白作為分析物的情況下,結(jié)合位點(diǎn)被認(rèn)為是一種肽,它的序列為蛋白抗原的蛋白序列的一部分,并且針對(duì)該蛋白的抗體(在本發(fā)明的情況下為IgG抗體)特異性地結(jié)合到它的上面。除了這些肽以外,還認(rèn)為結(jié)合位點(diǎn)包括具有氨基酸序列的肽,它具有與前述的肽基本上相當(dāng)?shù)奶禺愋院?或結(jié)合到待檢測(cè)的IgG抗體上的親和力。這些肽優(yōu)選地可以由前述的肽通過(guò)取代、缺失或插入個(gè)別的氨基酸殘基得到。
即使在有特異性相同的IgM抗體存在的條件下,仍可以使用具有這樣一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的所有的肽,其中待測(cè)定的IgG類抗體特異地結(jié)合到所述位點(diǎn)上。對(duì)結(jié)合位點(diǎn)、即對(duì)所使用的肽而言,唯一的前提條件為保留了它特異性地結(jié)合到IgG上的能力。結(jié)合位點(diǎn)被認(rèn)為是一種肽,它的序列為蛋白抗原(分析物)的蛋白序列的一部分,并且抗該蛋白的抗體特異性地結(jié)合到其上,在本發(fā)明中所述的抗體為IgG抗體。除了這些肽以外,還認(rèn)為結(jié)合位點(diǎn)包括具有氨基酸序列的肽,它具有與前述的肽基本上相同的特異性和/或結(jié)合到待測(cè)定的IgG抗體上的親和力。這些肽優(yōu)選地可以由前述的肽通過(guò)取代、缺失或插入單個(gè)氨基酸殘基得到。
還認(rèn)為本發(fā)明的對(duì)應(yīng)于特異性結(jié)合位點(diǎn)的肽包括肽的衍生物,其中通過(guò)化學(xué)反應(yīng)已經(jīng)使一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生化。具體說(shuō)來(lái),本發(fā)明的肽的衍生物的例子為那些其中的主鏈或/和活性氨基酸側(cè)基(例如游離的氨基、游離的羧基或/和游離的羥基)已被衍生化的分子。氨基衍生物的具體實(shí)例為氨磺?;虬奔柞?、硫代氨基甲酸乙酯的衍生物以及銨鹽(例如鹽酸化物)。羧基衍生物為鹽、酯和酰胺。羥基衍生物的例子為O-?;騉-烷基衍生物。所述的肽優(yōu)選是根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法通過(guò)化學(xué)合成生產(chǎn)的,并且在此不必進(jìn)行特別的說(shuō)明。從原理上來(lái)講,所述的肽還可以通過(guò)重組的方法生產(chǎn)。但是,較長(zhǎng)的多肽通常傾向于發(fā)生二聚或聚合,從而為了確保單體的性質(zhì),優(yōu)選通過(guò)化學(xué)合成來(lái)生產(chǎn)所述的肽。
此外,術(shù)語(yǔ)肽的衍生物還包括這樣的一些肽,其中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被20種“標(biāo)準(zhǔn)”氨基酸的天然存在的或者非天然存在的氨基酸同系物取代。上述同系物的實(shí)例為4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸、3-甲基組氨酸、高絲氨酸、鳥氨酸、β-丙氨酸和4-氨基丁酸。肽的衍生物必須具有與所述的肽基本上相當(dāng)?shù)奶禺愋曰?和結(jié)合到待測(cè)定的IgG抗體上的親和力,其中所述衍生物是由所述的肽得到的。
本發(fā)明的對(duì)應(yīng)于特異性結(jié)合位點(diǎn)的肽也被稱為肽-模擬物質(zhì)、即下文中的肽-模擬物,該物質(zhì)具有與前述的肽或肽的衍生物基本上相同的特異性或/和結(jié)合到待測(cè)定的IgG抗體上的親和力。肽-模擬物是化合物,就其與待測(cè)定的抗體的相互作用而論,肽-模擬物可以代替肽,并且尤其是對(duì)蛋白酶和肽酶來(lái)說(shuō),所述的模擬物可以比天然的肽具有更高的穩(wěn)定性。在下列文獻(xiàn)中描述了用于生產(chǎn)肽-模擬物的方法Giannis和Kolter,“Angew.Chem.”105(1993),1303-1326以及Lee等人,《日本化學(xué)協(xié)會(huì)會(huì)刊》66(1993),2006-2010。
本發(fā)明的結(jié)合位點(diǎn)的長(zhǎng)度、即單體肽的長(zhǎng)度通常至少為4個(gè)氨基酸。所述長(zhǎng)度優(yōu)選介于4至20個(gè)、6至15個(gè)或者特別優(yōu)選介于9至12個(gè)氨基酸之間。就肽-模擬物或肽的衍生物而言,考慮到分子的大小,類似的長(zhǎng)度是必須的。
本發(fā)明的作為呈單體形式的結(jié)合配偶體的單體肽含有表位,其中待測(cè)定的IgG抗體特異性地結(jié)合到該表位上。但是,不再對(duì)應(yīng)于特異性表位的其它側(cè)翼肽序列可以存在于所述肽的N-末端和/或C-末端。而且,給所述的肽提供為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟悉的間隔基團(tuán)也是可能的。唯一的前提條件是作為呈單體形式的結(jié)合配偶體的肽實(shí)際上是作為單體存在的并且保留了結(jié)合到待測(cè)定的IgG抗體上的能力。
受體R2的另一個(gè)組分為標(biāo)記??梢灾苯訖z測(cè)到的物質(zhì)優(yōu)選用作標(biāo)記,例如化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)或者金溶膠、乳膠或金粒子。酶或其它生物分子也優(yōu)選作標(biāo)記、比如半抗原。在半抗原中,洋地黃毒苷是一種特別優(yōu)選的標(biāo)記。用于標(biāo)記的方法為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟悉并且在此不必進(jìn)一步加以說(shuō)明。通過(guò)測(cè)量化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)或者金溶膠、乳膠或金粒子或者通過(guò)測(cè)量由所述酶轉(zhuǎn)化的底物,以眾所周知的方式直接檢測(cè)標(biāo)記。
還可以間接地檢測(cè)所述的標(biāo)記。在這種情況下,另一個(gè)受體(其自身又被偶聯(lián)到一個(gè)產(chǎn)生信號(hào)的基團(tuán)上)特異性地結(jié)合到R2的標(biāo)記(比如洋地黃毒苷這樣的半抗原)上。通過(guò)為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟悉的方法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生信號(hào)的基團(tuán),例如化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)或者酶或金粒子。例如,抗體或抗體的片段可以用作特異性地結(jié)合到R2的標(biāo)記上的另一種受體。如果使用了標(biāo)記的這種間接檢測(cè)的話,那么R2標(biāo)記優(yōu)選為洋地黃毒苷或者另一種半抗原,并且通過(guò)偶聯(lián)到過(guò)氧化物酶上的抗體進(jìn)行檢測(cè),所述抗體針對(duì)洋地黃毒苷或者半抗原。
受體R1的基本組成為能夠特異性地結(jié)合到待測(cè)定的IgG抗體上的結(jié)合配偶體。受體R1可以被直接結(jié)合到固相上或者能夠結(jié)合到固相上。如在受體R2中的呈單體形式的結(jié)合配偶體可以用作能夠特異性地結(jié)合到待測(cè)定的IgG抗體上的結(jié)合配偶體。但是,使用不以單體形式存在的結(jié)合配偶體也是可能的、即所述的結(jié)合配偶體可以有多于一個(gè)的表位或結(jié)合位點(diǎn)。重要的是保留了結(jié)合配偶體特異性地結(jié)合到待測(cè)定的IgG抗體上的能力。但是,呈單體形式的結(jié)合配偶體和特別優(yōu)選的肽也用于受體R1。通過(guò)與針對(duì)R2的肽同樣的方法來(lái)生產(chǎn)R1中所包含的肽。
抗體-特異性結(jié)合配偶體或者包含在受體R1和R2中的肽可以是相同的或者是不同的,但它們都必須能夠同時(shí)結(jié)合到待測(cè)定的IgG抗體上。
R1或者可以被直接結(jié)合到固相上。通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)R1與固相的直接結(jié)合。R1還可以通過(guò)特異性結(jié)合系統(tǒng)而被間接地結(jié)合到固相上。在這種情況下,R1是一種由如上說(shuō)明的肽和特異性結(jié)合系統(tǒng)的反應(yīng)配偶體組成的綴合物。在這種情況下,認(rèn)為特異性結(jié)合系統(tǒng)是兩個(gè)可以彼此特異性地反應(yīng)的配偶體。在該情況下,結(jié)合能力可以以免疫反應(yīng)或者另一種特異性的反應(yīng)為基礎(chǔ)。優(yōu)選地使用生物素和親和素的組合或者生物素和鏈霉抗生物素蛋白的組合作為特異性結(jié)合系統(tǒng)。其它優(yōu)選的組合為生物素和抗生物素、半抗原和抗-半抗原、抗體的Fc片段和抗該Fc片段的抗體、或者糖和凝集素。那么,這種可以特異性結(jié)合配對(duì)的反應(yīng)配偶體之一即為形成受體R1的綴合物的一部分。
此外,特異性結(jié)合系統(tǒng)的其它反應(yīng)配偶體存在于固相中。通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的常規(guī)方法,可以將特異性結(jié)合系統(tǒng)的其它反應(yīng)配偶體結(jié)合到不溶的載體物質(zhì)上。在這種情況下,共價(jià)結(jié)合以及吸附結(jié)合是適宜的。特別合適的固相為由聚苯乙烯或類似的塑料制成的試管或微量滴定板,其內(nèi)表面被特異性結(jié)合系統(tǒng)的反應(yīng)配偶體所包被。顆粒狀物質(zhì),諸如乳膠顆粒、分子篩物質(zhì)、玻璃珠、塑料管等也是合適的并且是特別優(yōu)選的。多孔的層狀載體、比如紙也可以用作載體。
在本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,利用由呈單體形式的結(jié)合配偶體和特異性結(jié)合系統(tǒng)的反應(yīng)配偶體組成的綴合物作為R1。在該優(yōu)選實(shí)施方案中,一同溫孵受體R1和R2以及含有待測(cè)定的IgG抗體的樣品。在該方法中,受體R1和R2的肽的部分特異性地與待測(cè)定的IgG抗體反應(yīng)。使這種由R1、樣品抗體和R2組成的復(fù)合物結(jié)合到固相上,所述固相通過(guò)作為R1的組成的特異性結(jié)合系統(tǒng)的反應(yīng)配偶體而被特異性結(jié)合系統(tǒng)的其它反應(yīng)配偶體所包被。結(jié)果,使得由R1、樣品抗體和R2組成的整個(gè)復(fù)合物結(jié)合到固相上。在已經(jīng)從液相中分離出固相并且任選地洗滌固相之后,通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法來(lái)檢測(cè)R2的標(biāo)記。這一測(cè)試方法可以在特異性相同的IgM抗體存在的情況下,特異性地檢測(cè)出IgG抗體。
在本發(fā)明的方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,除了受體R1和R2之外使用了其它的受體。在該測(cè)試方法中,利用由呈單體形式的結(jié)合配偶體和特異性結(jié)合系統(tǒng)的反應(yīng)配偶體(比如生物素)組成的綴合物作為R1。一同溫孵受體R1和R2以及含有待測(cè)定的IgG抗體的樣品。在該方法中,受體R1和R2的肽的部分特異性地與待測(cè)定的IgG抗體反應(yīng)。通過(guò)作為R1的組成的特異性結(jié)合系統(tǒng)的一個(gè)反應(yīng)配偶體來(lái)實(shí)現(xiàn)與所述固相的結(jié)合,其中所述固相被特異性結(jié)合系統(tǒng)的其它反應(yīng)配偶體(例如被鏈霉抗生物素蛋白)所包被。結(jié)果,使由R1、R2和樣品抗體組成的整個(gè)復(fù)合物結(jié)合到固相上。在從液相中分離出固相并且任選地洗滌固相之后,與特異性地識(shí)別R2的標(biāo)記的其它受體一起溫孵已結(jié)合到固相上的復(fù)合物。把另一種受體偶聯(lián)到產(chǎn)生信號(hào)的基團(tuán)(比如酶)上。在經(jīng)歷了另一任選的洗滌步驟之后,通過(guò)產(chǎn)生信號(hào)的基團(tuán)來(lái)檢測(cè)樣品抗體,在這種情況下通過(guò)由酶轉(zhuǎn)化的底物進(jìn)行檢測(cè)。如果使用了這種測(cè)試方法的話,優(yōu)選采用洋地黃毒苷作為R2標(biāo)記。在這種情況下,其它受體是由針對(duì)洋地黃毒苷的抗體或抗體片段和過(guò)氧化物酶組成的。在該測(cè)試方法中,與R1和R2以及其它受體一起溫孵樣品也可以同時(shí)進(jìn)行。
該測(cè)試方法還非常適于應(yīng)用到自動(dòng)系統(tǒng)中,但其中需要兩個(gè)或者多個(gè)洗滌步驟。如果打算檢測(cè)幾種抗原-特異性抗體(比如抗gp41,p17等的HIV抗體)的話,那么該測(cè)試方法的主要優(yōu)點(diǎn)就變得顯而易見(jiàn)了。在這種情況下,所述的其它受體可以用作通用的標(biāo)記,這是因?yàn)檫@種其它受體特異性地識(shí)別R2標(biāo)記。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的所有生物液體都可以用作樣品。體液(諸如全血、血清、血漿、尿、唾液等)優(yōu)選用作樣品。
除了上述樣品以外,固相和前述的受體、取決于應(yīng)用而可能需要的其它添加劑(諸如緩沖液,鹽,洗滌劑,蛋白添加劑、比如BSA)可以存在于測(cè)試混合物中。必需的添加劑是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的,并且可以由所述的技術(shù)人員通過(guò)簡(jiǎn)單的方式加以確定。
為了確保IgM抗體或類風(fēng)濕因子不干擾抗原-特異性IgG的檢測(cè),可能可以選擇地使用其它的措施來(lái)減少干擾。這些措施例如包括使用還原性物質(zhì),比如在EP-B-0 341 439公開的方法中的二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)或β-巰基乙醇。此外,抗-Fd抗體可以選擇地用于消除類風(fēng)濕因子的干擾。在WO 96/14338中公開了上述概念??梢詥为?dú)或者以任意的組合采用用于減少干擾的各種措施。
本發(fā)明的另一個(gè)主題為一種用于測(cè)定G類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體的試劑,其中除了用于免疫測(cè)定的常用的測(cè)試添加劑(諸如緩沖液、鹽、洗滌劑等)以外,所述試劑還包含能夠結(jié)合到待測(cè)定的抗體上的受體R2,所述受體是由呈單體形式的結(jié)合配偶體和標(biāo)記組成的。
此外,本發(fā)明的一個(gè)主題為一種用于測(cè)定G類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體的試劑,其中除了用于免疫測(cè)定的常用的測(cè)試添加劑以外,所述試劑還包含能夠結(jié)合到待測(cè)定的抗體上的兩種受體R1和R2,其中的R1能夠結(jié)合到固相上、而R2攜帶一個(gè)標(biāo)記,其中受體R2的基本組成是呈單體形式的結(jié)合配偶體。
此外,本發(fā)明的另一個(gè)主題為一種用于測(cè)定G類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體的試劑,其中除了用于免疫測(cè)定的常用的測(cè)試添加劑以外,所述試劑還包含能夠結(jié)合到待測(cè)定的抗體上的兩種受體R1和R2,其中的R1能夠結(jié)合到固相上、而R2攜帶一個(gè)標(biāo)記,其中兩種受體的基本組成都是呈單體形式的結(jié)合配偶體。
另外,本發(fā)明的一個(gè)主題為呈單體形式的結(jié)合配偶體用于測(cè)定G類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體的用途。
本發(fā)明通過(guò)下面的實(shí)施例加以解釋。
實(shí)施例1.當(dāng)使用單體表位和多聚體表位時(shí),與<HIV2>MAKs(IgG和IgM)的反應(yīng)性測(cè)試方法的描述生物素-標(biāo)記的和洋地黃毒苷-標(biāo)記的單體(試驗(yàn)A)或多聚體(試驗(yàn)B)抗原(HIV2)與樣品抗體和鏈霉抗生物素蛋白-包被的固相反應(yīng)(在25℃或37℃下溫孵大約60至180分鐘,在本實(shí)施例中120分鐘,25℃)。在洗滌步驟之后,結(jié)合到壁上的免疫復(fù)合物與抗-洋地黃毒苷-過(guò)氧化物酶的綴合物反應(yīng)(在25℃或37℃下溫孵大約30至120分鐘,在本實(shí)施例中60分鐘,25℃)。在另一洗滌步驟之后,通過(guò)底物的反應(yīng)來(lái)檢測(cè)過(guò)氧化物酶綴合物-標(biāo)記的免疫復(fù)合物(在25℃下溫孵綴合物60分鐘)。一般說(shuō)來(lái),綴合物的溫孵可以在25℃或37℃下進(jìn)行大約30至120分鐘。
反應(yīng)步驟(除了底物的反應(yīng)之外)在Tris/HCl緩沖液(pH7.5,50至150mM,在本實(shí)施例中為100mM)中發(fā)生,所述緩沖液包含約0.05至0.4%的洗滌劑(此處為0.2%的聚多卡醇)以及約0.5%的蛋白/蛋白衍生物的添加劑(此處尤其為來(lái)自乳白蛋白和BSA的胨)。
在這種情況下,所述的樣品抗體為抗HIV2表位的單克隆小鼠抗體(IgM與IgG),將該抗體在抗-HIV陰性人血清中稀釋到大約2-20μg/ml。
表1試驗(yàn)A和B的試驗(yàn)結(jié)果的比較吸光度的單位為mE
呈單體形式的HIV2-特異性結(jié)合配偶體的使用使得能夠特異性地檢測(cè)抗HIV2的IgG抗體??乖禺愋韵嗤腎gM類抗體卻不被識(shí)別(試驗(yàn)A)。
當(dāng)使用呈多聚體形式的HIV2-特異性結(jié)合配偶體時(shí),區(qū)別IgG和IgM是不可能的(試驗(yàn)B)。
2.與黑猩猩HIV2血清轉(zhuǎn)變的血清抗體的反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例1。
表2通過(guò)試驗(yàn)A和B的黑猩猩血清轉(zhuǎn)變的試驗(yàn)結(jié)果吸光度的單位為mE
在待檢測(cè)的HIV2感染后,呈單體形式的結(jié)合配偶體的使用可以使血清轉(zhuǎn)變。在感染后第3周時(shí),試驗(yàn)A的優(yōu)點(diǎn)特別明顯僅有不被呈單體形式的結(jié)合配偶體檢測(cè)到的IgM抗體存在。在IgG抗體出現(xiàn)后,試驗(yàn)A僅僅顯示出陽(yáng)性信號(hào)。使用多聚體表位的試驗(yàn)B不能區(qū)分特異性相同的IgG和IgM。
3.與病人HIV1血清轉(zhuǎn)變的血清抗體的反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例1,但抗原為HIV1。
表3通過(guò)試驗(yàn)A和B的HIV1血清轉(zhuǎn)變的試驗(yàn)結(jié)果吸光度的單位為mE
在用HIV1(類似于實(shí)施例2的HIV2)感染的情況下,試驗(yàn)A也可以使得可靠地檢測(cè)出IgG抗體。
4.用含有單體表位的肽檢測(cè)抗風(fēng)疹病毒的IgG測(cè)試方法的描述在購(gòu)自德國(guó)Boehringer Mannheim GmbH的Elecsys2010儀器中,按照生產(chǎn)廠家的說(shuō)明,通過(guò)本發(fā)明的呈單體形式的結(jié)合配偶體來(lái)檢測(cè)風(fēng)疹病毒-特異性IgG。使用了下列試劑試劑R1風(fēng)疹病毒E1抗原的環(huán)肽,生物素化的。
Tris緩沖液,pH7.5,0.2%Myrij,0.2%BSA,0.1%R-IgG試劑R1風(fēng)疹病毒E1抗原的環(huán)肽,ruthenylated。
Tris緩沖液,pH7.5,0.2%Myrij,0.2%BSA,0.1%R-IgG使用人血清樣品作為樣品。
所述的測(cè)試是通過(guò)下列步驟完成的1.30μl樣品+65μlR1+65μlR22.在37℃下溫孵9分鐘3.加入40μl的SA-包被的磁珠4.在37℃下溫孵9分鐘5.檢測(cè)反應(yīng)測(cè)量電化學(xué)發(fā)光信號(hào)表4結(jié)果
僅有含抗原-特異性IgG的樣品被識(shí)別為陽(yáng)性。根據(jù)本發(fā)明,僅含抗原-特異性IgM(第1.3和1.4號(hào))的樣品不被識(shí)別為陽(yáng)性。
權(quán)利要求
1.用于測(cè)定G類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體的方法,該方法通過(guò)與至少兩種不同的受體R1和R2一起溫孵所述的樣品,其中的兩種受體都能特異性地結(jié)合到所述抗體上,R1被結(jié)合到固相上或者可以被結(jié)合到固相上、而R2攜帶一個(gè)標(biāo)記,其特征在于,使用由待測(cè)定的所述抗體特異性識(shí)別的呈單體形式的結(jié)合配偶體和標(biāo)記的組成的綴合物作為R2。
2.如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的方法,其特征在于,R1的基本部分為呈單體形式的結(jié)合配偶體。
3.如權(quán)利要求1或2所要求保護(hù)的方法,其特征在于,使用生物素/抗生物素蛋白;生物素/鏈霉抗生物素蛋白;生物素/抗生物素;半抗原/抗半抗原;抗體的Fc片段/抗該Fc片段的抗體;糖/凝集素作為用于把R1結(jié)合到所述固相上的特異性結(jié)合系統(tǒng)。
4.如權(quán)利要求1至3之一所要求保護(hù)的方法,其特征在于,所述的受體R2是用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)、酶或另一種生物分子標(biāo)記的。
5.如權(quán)利要求1至4之一所要求保護(hù)的方法,其特征在于,所述的樣品與R1和R2同時(shí)溫孵。
6.如權(quán)利要求1至5之一所要求保護(hù)的方法,其特征在于,所述的測(cè)試混合物與特異性地結(jié)合到所述受體R2的所述標(biāo)記上的其它受體一起溫孵,其中所述的其它受體為一種對(duì)R2的所述標(biāo)記具有特異性的受體和標(biāo)記組成的綴合物,隨后測(cè)定所述的標(biāo)記。
7.如權(quán)利要求1至6之一所要求保護(hù)的方法,其特征在于,R1中被所述待測(cè)定的抗體特異性識(shí)別的呈單體形式的結(jié)合配偶體的數(shù)量大于R2中被所述待測(cè)定的抗體特異性識(shí)別的呈單體形式的結(jié)合配偶體的數(shù)量或者與之相同。
8.用于測(cè)定如前述權(quán)利要求之一所要求保護(hù)的G類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體的試劑,其特征在于,除了用于免疫測(cè)定的常用的測(cè)試添加劑以外,所述試劑包含能夠結(jié)合到所述待測(cè)定的抗體上的受體R2,所述受體是由呈單體形式的結(jié)合配偶體和標(biāo)記組成的。
9.呈單體形式的結(jié)合配偶體用于測(cè)定G類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在有M類免疫球蛋白存在的情況下,用于測(cè)定體液中G類免疫球蛋白的抗原特異性抗體的方法,該方法通過(guò)與至少兩種不同的受體R
文檔編號(hào)G01N33/68GK1245561SQ97181481
公開日2000年2月23日 申請(qǐng)日期1997年11月26日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月29日
發(fā)明者E·法茨, U·施米特 申請(qǐng)人:羅赫診斷器材股份有限公司