專利名稱：低密度脂蛋白中膽固醇的定量方法
技術(shù)范圍本發(fā)明涉及對(duì)動(dòng)脈硬化癥臨床診斷很重要的低密度脂蛋白(LDL)中膽固醇(下面稱為“LDL膽固醇”。本說明書中單獨(dú)說“膽固醇”的時(shí)候包括酯型膽固醇和游離型膽固醇兩者。)的分別定量方法。
背景技術(shù)：
LDL在血液中主要起著運(yùn)輸膽固醇的作用，在動(dòng)脈粥樣硬化中血管壁沉積的膽固醇主要是來源于LDL。血漿中LDL的增加是缺血性心臟病等粥樣硬化性疾病的主要危險(xiǎn)因子之一，所以LDL膽固醇的分別定量在臨床上很有用。
傳統(tǒng)的LDL膽固醇定量方法包括由分離操作和膽固醇定量操作兩個(gè)步驟組成的方法，以及分別求出血中總膽固醇、HDL中的膽固醇和甘油三酯并根據(jù)Friedewald公式算出LDL膽固醇量的方法。
分離操作有超速離心法、沉淀法、免疫化學(xué)法等。使用超速離心法時(shí)，利用比重差以超速離心機(jī)分離LDL，然后測定膽固醇量。沉淀法是加入HDL抗體、多價(jià)陽離子和2價(jià)陽離子等，使之生產(chǎn)不溶性沉淀，定量離心分離所得上清中LDL膽固醇的方法(WPI Acc No.85-116848/20)。免疫化學(xué)法是將抗HDL、VLDL、CM的抗體結(jié)合于膠乳，凝集反應(yīng)后用離心或過濾的方法除去膠乳，從而定量LDL膽固醇的方法(WPI Acc No.84-301275/49)。這些傳統(tǒng)方法都有簡便性和經(jīng)濟(jì)性的問題。
根據(jù)Friedewald公式，從總膽固醇中減去HDL膽固醇，再減去甘油三酯的1/5量，求出LDL膽固醇。但是，此方法受飲食和個(gè)體差異的影響，所以有正確性的問題。
此外，近年來報(bào)道有不需要分離操作的LDL膽固醇定量方法(WPIAcc No.83-766269/38)，但對(duì)LDL的特異性不高。
發(fā)明的公開本發(fā)明的目的在于提供無需復(fù)雜離心分離操作、能簡便地分別定量LDL膽固醇的方法。
本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，第一步先除去除低密度脂蛋白中膽固醇以外的膽固醇，第二步測定殘留的膽固醇，能夠定量低密度脂蛋白中的膽固醇，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供了一種可能含有低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和/或乳糜微粒的被測樣品中低密度脂蛋白的膽固醇的定量方法，它由除去被測樣品中高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和乳糜微粒中膽固醇的第一步驟和隨后定量被測樣品中殘留膽固醇的第二步驟組成。
根據(jù)本發(fā)明，提供了無需復(fù)雜的離心分離操作，能夠簡便地分別定量LDL膽固醇的方法。
圖的簡單說明

圖1表示在實(shí)施例1中LDL膽固醇的測定結(jié)果和Friedewald算出值的相關(guān)關(guān)系。
圖2表示在實(shí)施例2中LDL膽固醇的測定結(jié)果和Friedewald算出值的相關(guān)關(guān)系。
圖3表示在實(shí)施例4中，不存在及存在HDL、VLDL和CM的情況下LDL膽固醇濃度和根據(jù)本發(fā)明方法測定所得吸光度的相關(guān)關(guān)系。
發(fā)明實(shí)施的最佳形式作為脂蛋白中所含的膽固醇，有酯型膽固醇(膽固醇酯)和游離型膽固醇。在本說明書中，單獨(dú)說“膽固醇”的時(shí)候同時(shí)包括二者。
作為用于本發(fā)明方法的被測樣品，可以是可能含有HDL、LDL、VLDL和CM等脂蛋白的樣品中的任一種，例如有血液、血清、血漿等體液及其稀釋物，但并不僅限于此。
本發(fā)明的方法由第一步驟和第二步驟構(gòu)成，在第一步驟中除去被測樣品中HDL、VLDL和CM中的膽固醇，在隨后的第二步驟中定量被測樣品中殘留膽固醇。因?yàn)樵诘谝徊襟E中除去了HDL、VLDL和CM中的膽固醇，第二步驟定量的膽固醇主要是樣品中LDL中的膽固醇。
第一步中的“除去”指的是分解膽固醇，而且其分解產(chǎn)物在隨后的第二步中不被檢出。作為選擇性除去LDL以外的脂蛋白，即HDL、VLDL、CM等中所含的膽固醇的方法例如有以下的方法。
即，在作用于低密度脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性劑的存在下，用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶進(jìn)行作用，除去產(chǎn)生的過氧化氫。
作為除去過氧化氫的方法，例如有用過氧化氫酶進(jìn)行作用將其分解成水和氧的方法，以及使用過氧化物酶使酚類或苯胺類氫供體化合物和過氧化氫反應(yīng)轉(zhuǎn)化為無色醌類的方法，但并不僅限于此。
第一步反應(yīng)液中的膽固醇酯酶濃度優(yōu)選0.2～1.0U/毫升，作為其來源，優(yōu)選假單胞菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的物質(zhì)。此外，膽固醇氧化酶的濃度優(yōu)選0.1～0.7U/毫升，優(yōu)選使用細(xì)菌和酵母來源的物質(zhì)。更進(jìn)一步，過氧化氫酶的濃度優(yōu)選40～100U/毫升。此外，過氧化氫轉(zhuǎn)化為無色醌類時(shí)的過氧化物酶濃度優(yōu)選0.4～1.0U/毫升，作為酚類或苯胺類氫供體化合物的濃度，優(yōu)選0.4～0.8mmol/L。
作為第一步中所用的作用于LDL以外的脂蛋白的表面活性劑的優(yōu)選例子，例如有HLB為13以上15以下、優(yōu)選13以上14以下的聚氧化烯衍生物。作為衍生物的例子例如有高級(jí)醇縮合物、高級(jí)脂肪酸縮合物、高級(jí)脂肪酰胺縮合物、高級(jí)烷胺縮合物、高級(jí)烷基硫醇縮合物、烷基酚縮合物等。還有，表面活性劑的HLB計(jì)算方法眾所周知，例如《新表面活性劑》(掘內(nèi)博著、昭和61年、三共出版社)中記載的。
作為HLB值13以上15以下的聚氧化烯衍生物的優(yōu)選具體例子，例如有聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯鯨蠟醚、聚氧乙烯油醚、聚氧乙烯高級(jí)醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等HLB值為13以上15以下的化合物，但并不僅限于此。
此外，作為第一步所用的表面活性劑，可以使用陽離子表面活性劑。作為此時(shí)的陽離子表面活性劑，優(yōu)選下述一般式(I)所示的具有季銨鹽作為親水基團(tuán)的物質(zhì)。

其中式(I)中，R分別各自獨(dú)立地表示碳數(shù)1～8的直鏈烷基，R1表示碳數(shù)3～20的烯基。
第一步中所用的上述表面活性劑的濃度優(yōu)選0.1～10克/升左右，更優(yōu)選0.5～5.0克/升左右。
第一步優(yōu)選在pH5～8的緩沖液中進(jìn)行，作為緩沖液優(yōu)選Tris、三乙醇胺、Good’s等含有胺的緩沖液。特別優(yōu)選作為Good’s的Bis-Tris、PIPES、MOPSO、BES、HEPES和POPSO緩沖液，緩沖液的濃度優(yōu)選10～500mM。
在第一步中，為抑制和LDL的反應(yīng)并提高其它脂蛋白的除去程度，反應(yīng)液中可含有2價(jià)的金屬離子。作為2價(jià)的金屬離子，例如可以使用銅離子、鐵離子和鎂離子等，特別優(yōu)選鎂離子。2價(jià)金屬離子的濃度優(yōu)選5～200mM。
還有，在第一步的反應(yīng)液中，可任意地加入脂蛋白分解酶。因特別可使VLDL中的膽固醇容易反應(yīng)，優(yōu)選加入這種酶。此酶在反應(yīng)液中的濃度優(yōu)選5.0～10.0U/毫升。
第一步的反應(yīng)液溫度優(yōu)選25～40℃左右，最優(yōu)選37℃。此外，反應(yīng)時(shí)間可以是2～10分鐘左右。
在隨后的第二步中，定量被測樣品中的殘留膽固醇。例如可以通過至少加入作用于LDL的表面活性劑，定量如第一步中加入的膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用生成的過氧化氫而進(jìn)行。在這里，至少作用于LDL的表面活性劑可以是只選擇性作用于LDL的表面活性劑，也可以是作用于所有脂蛋白的表面活性劑。
作為作用于所有脂蛋白的表面活性劑的優(yōu)選例子，例如有HLB11以上不足13、優(yōu)選12以上不足13的聚氧化烯衍生物。作為衍生物的例子，例如有高級(jí)醇縮合物、高級(jí)脂肪酸縮合物、高級(jí)脂肪酰胺縮合物、高級(jí)烷胺縮合物、高級(jí)烷基硫醇縮合物、烷基酚縮合物等。
作為HLB11以上不足13的聚氧化烯衍生物的優(yōu)選例子，例如有聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯鯨蠟醚、聚氧乙烯油醚、聚氧乙烯高級(jí)醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等HLB11以上不足13的化合物，但并不僅限于此。
此外，作為僅選擇性作用于LDL的表面活性劑，例如有陰離子表面活性劑。作為這里所用的陰離子表面活性劑，沒有特殊的限定，優(yōu)選芳香環(huán)上結(jié)合有碳數(shù)4～18的直鏈或支鏈烷基的物質(zhì)。在這里，芳香環(huán)優(yōu)選苯、萘、聯(lián)苯等只由碳?xì)錁?gòu)成的物質(zhì)。更優(yōu)選上述芳香環(huán)中結(jié)合有如磺酸鹽等親水基團(tuán)的物質(zhì)。這樣的優(yōu)選陰離子表面活性劑的例子如下述式(II)～(VI)所示。

其中在式(II)～(VI)中，R分別各自表示碳數(shù)4～18的直鏈或直鏈烷基。此外，作為第二步中所用的優(yōu)選陰離子表面活性劑，例如有高級(jí)醇硫酸鈉等。
第二步所用的表面活性劑的濃度優(yōu)選0.1～100克/升，更優(yōu)選1～50克/升。
第二步的其它優(yōu)選反應(yīng)條件和第一步中的優(yōu)選反應(yīng)條件相同。
下面就基于實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的說明。但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1第1試劑BES緩沖液、pH6.0 100mmol/LHDAOSN-(2-羥基磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺 0.7mmol/L假單胞菌屬細(xì)菌來源膽固醇酯酶(旭化成工業(yè)社制造，商品名“CEN”) 0.8U/毫升鏈霉菌屬細(xì)菌來源膽固醇氧化酶(東洋紡織社制造，商品名“COO”)0.5U/毫升過氧化氫酶 80U/毫升氯化鎂 10mmol/L花王社制造的Emulgen B66(聚氧乙烯衍生物(HLB＝13.2))0.2％第2試劑BES緩沖液、pH7.0 50mmol/L4-氨基安替比林 4.0mmol/L過氧化物酶 2.4單位/毫升疊氮化鈉 0.1％花王社制造的Emulgen A60(聚氧乙烯衍生物(HLB＝12.8))5.0％分別將含有膽固醇濃度為100毫克/dl的精制HDL、LDL、VLDL、CM的各4微升樣品和預(yù)先37℃加溫的300微升第1試劑混合，在37℃下反應(yīng)5分鐘后，加入100微升第2試劑反應(yīng)5分鐘，測定600nm處的吸光度。從所測定的吸光度算出膽固醇量，并和樣品中的膽固醇量相比算出捕捉率。結(jié)果如下表所示。表1

如表2所示，根據(jù)上述方法，當(dāng)其它脂蛋白中的膽固醇基本不被捕捉而LDL中膽固醇的大部分可被捕捉，因此LDL中的膽固醇可以被選擇地定量。實(shí)施例2第1試劑PIPES緩沖液、pH7.050mmol/LHDAOS 0.7mmol/L假單胞菌屬細(xì)菌來源膽固醇酯酶(旭化成工業(yè)社制造，商品名“CEN”) 0.8U/毫升鏈霉菌屬細(xì)菌來源膽固醇氧化酶(東洋紡織社制造，商品名“COO”) 0.5U/毫升過氧化氫酶80U/毫升氯化鎂10mmol/L花王社制造的Emulgen B66 0.2％第2試劑PIPES緩沖液、pH7.050mmol/L4-氨基安替比林4.0mmol/L過氧化物酶2.4單位/升疊氮化鈉 0.1％Triton×100 3.0％進(jìn)行和實(shí)施例1相同的操作，求出各脂蛋白的反應(yīng)性。結(jié)果如下表2所示。表2

實(shí)施例3試樣使用健康人血清，進(jìn)行實(shí)施例1、2的操作，求出LDL膽固醇濃度。作為對(duì)照方法，用Friedewald公式(CLIN.CHEM.、41、1414、1995)求出血清的LDL膽固醇濃度。其結(jié)果如圖1和圖2的相關(guān)圖所示。
如圖1和圖2所示，根據(jù)兩種方法定量的結(jié)果很一致，說明本發(fā)明的方法能夠正確地定量LDL中的膽固醇。實(shí)施例4第1試劑Good’s緩沖液、pH7.050mmol/lHDAOS 0.7mmol/l膽固醇酯酶 0.8U/毫升膽固醇氧化酶0.5U/毫升過氧化氫酶 80單位/毫升陽離子表面活性劑(氯化月桂基三甲基銨)0.1％第2試劑4-氨基安替比林 4.0mmol/l過氧化物酶 2.4單位/毫升疊氮化鈉0.1％非離子表面活性劑(聚氧乙烯月桂醚)0.1％(非離子表面活性劑在第2反應(yīng)中使用)將20微升試樣和180微升預(yù)先加熱到37℃的第1試劑混合，在37℃下下反應(yīng)5分鐘后，加入60微升第2試劑，反應(yīng)5分鐘，在600nm下測定吸光度。
圖3表示LDL膽固醇濃度和吸光度的關(guān)系，表明即使在HDL、VLDL和CM存在下也能夠特異性且濃度依賴性地測定LDL膽固醇。
實(shí)施例5試樣使用血清，進(jìn)行實(shí)施例4的操作，求出LDL膽固醇濃度。作為對(duì)照方法，使用Friedewald公式(CLIN.CHEM.，41，1414，1995)求出血清中LDL膽固醇的濃度。其結(jié)果如表3所示。如表3所示，根據(jù)本發(fā)明方法的結(jié)果和根據(jù)Friedwald公式所得的結(jié)果具有良好的相關(guān)性。
權(quán)利要求
1.一種可能含有低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和/或乳糜微粒的被測樣品中低密度脂蛋白中的膽固醇的定量方法，它由除去被測樣品中高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和乳糜微粒中膽固醇的第一步驟和隨后定量被測樣品中殘留的膽固醇的第二步驟組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1記載的方法，其中的第一步驟是在作用于低密度脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性劑的存在下，用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶進(jìn)行作用，除去生成的過氧化氫。
3.根據(jù)權(quán)利要求2記載的方法，上述第二步驟是往上述第一步驟的產(chǎn)物中加入至少作用于低密度脂蛋白的表面活性劑，定量上述膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用所生成的過氧化氫。
4.根據(jù)權(quán)利要求3記載的方法，上述至少作用于低密度脂蛋白的表面活性劑為作用于所有脂蛋白的物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)記載的方法，上述第一步驟所用的作用于除低密度脂蛋白以外脂蛋白的表面活性劑為HLB值13以上15以下的聚氧化烯衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4記載的方法，上述第二步驟所用的作用于所有脂蛋白的表面活性劑為HLB值11以上13以下的聚氧化烯衍生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求2記載的方法，上述第一步驟所用的作用于除低密度脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性劑為陽離子表面活性劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7記載的方法，上述陽離子表面活性劑為季銨鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求3記載的方法，上述第二步驟所用的至少作用于低密度脂蛋白的表面活性劑為陰離子表面活性劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求2～9任一項(xiàng)記載的方法，上述第一步驟中表面活性劑的濃度為0.1～10克/升。
11.根據(jù)權(quán)利要求6或9記載的方法，上述第二步驟中HLB值11以上13以下的上述聚氧化烯衍生物或上述陰離子表面活性劑的濃度為1～100克/升。
12.根據(jù)權(quán)利要求1～11任一項(xiàng)記載的方法，上述第一步驟和第二步驟在pH5～8的緩沖液中進(jìn)行。
13.根據(jù)權(quán)利要求12記載的方法，上述緩沖液中含有胺。
14.根據(jù)權(quán)利要求1～13任一項(xiàng)記載的方法，上述第一和第二步驟在溫度25～40℃下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明公開了無需復(fù)雜離心操作、能夠簡單地分別定量LDL膽固醇的方法。本發(fā)明的低密度脂蛋白中膽固醇的定量方法由除去被測樣品中高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和乳糜微粒中膽固醇的第一步驟和隨后定量被測樣品中殘留膽固醇的第二步驟構(gòu)成。
文檔編號(hào)G01N33/92GK1253627SQ97182112
公開日2000年5月17日 申請(qǐng)日期1997年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月14日
發(fā)明者松井寬史, 水野和重, 伊藤康樹, 小原秀一, 藤原明, 高杉憲一, 岡田正彥 申請(qǐng)人:電化生研株式會(huì)社