專利名稱：測定組織或細胞物理化學(xué)特性的方法、檢測藥品的方法及其裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及根據(jù)生物的組織或細胞物理化學(xué)環(huán)境的變化，測定組織或細胞的物理化學(xué)特性的方法、以及對于初次施用給生物的各種中樞神經(jīng)藥，檢測其藥效的方法及其裝置。本發(fā)明主要應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)、醫(yī)療科學(xué)、藥學(xué)、食品科學(xué)以及神經(jīng)生理學(xué)等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來伴隨著送電線設(shè)備、手提電話、計算機控制器等電器的使用，身體附近存在著很強的電磁場。還有，伴隨著藥學(xué)、食品科學(xué)和有機化學(xué)等的進步，不斷開發(fā)出新的藥物、食品添加劑及以往天然所沒有的化學(xué)物質(zhì)。為了弄清這些人工的物理化學(xué)環(huán)境使生物受到的影響，我們以人為主要對象，應(yīng)用統(tǒng)計的方法，進行了調(diào)查實驗及動物實驗。
然而在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域，以人為對象進行的統(tǒng)計調(diào)查實驗，設(shè)定一定條件的人群非常困難，也相當(dāng)需要調(diào)查時間。人們在遺傳背景、生活習(xí)慣及過去飲食歷史等方面都有微妙的差異。例如，為了探討電磁波對人體產(chǎn)生癌癥的影響，假定我們身旁的高壓線為電磁波發(fā)生源。這種情況下，對于在高壓線附近生活的人，設(shè)定其調(diào)查條件有困難，調(diào)查條件包括遺傳史、飲食生活史、產(chǎn)生癌癥臟器的分類、年齡、體重、性別、愛好、病歷及有無病毒感染等。為了進行統(tǒng)計調(diào)查實驗，以很容易共同設(shè)定上述條件的實驗動物為圖案進行實驗十分必要。重要的是可進行上述實驗不可能做的組織水平、特別是有關(guān)細胞網(wǎng)絡(luò)的實驗。在藥學(xué)領(lǐng)域，例如在開發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)新藥時，歷來都是制備實驗動物腦的分離神經(jīng)細胞，分散培養(yǎng)，從細胞水平對新藥效果分別進行藥理學(xué)的、電生理學(xué)的、形態(tài)學(xué)及免疫學(xué)的檢測。然而，大腦的機能是由神經(jīng)細胞的集合體系—神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來執(zhí)行的，因此，如前所述大腦的高級機能是基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的整體行為，那么，弄清藥品對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的確切影響是非常重要的，這是無須爭論的。盡管如此，歷來不能在組織水平檢測藥物對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)及細胞網(wǎng)絡(luò)的影響，首先是因為沒有神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)腦切片的篩選技術(shù)。因此，存在著這樣的現(xiàn)狀種種藥品對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的作用機理不明確，而經(jīng)一般藥理試驗確認有效就應(yīng)用于臨床。例如，有名的治療失眠藥幻覺劑(ハルシォン)，一般認為其作用機理是抑制了大腦邊緣系統(tǒng)和大腦皮質(zhì)的神經(jīng)過度興奮，它是由GABA受體機能亢進而引起的。然而這種效果是指對每個神經(jīng)細胞有效，而對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)整體有怎樣的影響還不清楚。還有正在給患者使用的抗精神分裂病藥氟哌丁苯及氯氮平也沒檢測其對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的影響。相反，用以往的篩選方法無法判斷對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)有效且副作用小的藥物，故而這樣的藥物可能不應(yīng)用于臨床。
人們現(xiàn)在認識到，在活體器官水平進行研究的必要性在于不僅要弄清神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的機能，對其它活體器官的研究也是必要的。在醫(yī)藥學(xué)等生物學(xué)領(lǐng)域，希望開發(fā)出高效高質(zhì)量的裝置，很好地進行這項研究。
如上所述，強烈希望開發(fā)出一種裝置，其特點是對從生物體取出的組織或細胞的物理化學(xué)特性，可進行動態(tài)觀測；可將組織或細胞周圍的物理化學(xué)環(huán)境維持一定；而且可根據(jù)實驗的目的任意改變組織或細胞周圍的物理化學(xué)環(huán)境；更進一步講能同時檢測大量的樣品。
本發(fā)明的目的是提供檢測所需合適藥品的方法，測定組織或細胞物理化學(xué)特性的方法及其裝置。
發(fā)明的公開為達到以上目的，本發(fā)明測定生物組織或細胞物理化學(xué)特性的方法是改變包圍生物組織或細胞的物理化學(xué)環(huán)境，觀測其對組織或細胞的物理化學(xué)特性所產(chǎn)生的影響。首先保持生物組織或細胞周圍的物理化學(xué)環(huán)境一定，然后任意改變物理化學(xué)環(huán)境，觀測組織或細胞的物理化學(xué)特性，比較組織或細胞在物理化學(xué)環(huán)境變化前后的物理化學(xué)特性。
如上所述，本發(fā)明測定生物組織等的物理化學(xué)特性方法是在物理化學(xué)環(huán)境保持一定的狀態(tài)下，測定從生物體取出的組織或細胞的物理化學(xué)特性，接著，改變物理化學(xué)環(huán)境的一部分或全部，再對組織或細胞的物理化學(xué)特性進行測定。通過比較在改變物理化學(xué)環(huán)境前后，組織或細胞的物理化學(xué)特性，可弄清物理化學(xué)環(huán)境的改變對組織或細胞的影響。例如，由于添加化學(xué)物質(zhì)而改變物理化學(xué)環(huán)境時，就可用此測定方法檢測該化學(xué)物質(zhì)對活體所造成的影響。另外，由于電磁場的作用而改變物理化學(xué)環(huán)境時，也可用此測定方法檢測電磁場對活體所造成的影響。
測定組織等物理化學(xué)特性的方法優(yōu)選包括以下內(nèi)容為觀測生物組織或細胞的物理化學(xué)特性而應(yīng)用的裝置，這個裝置至少應(yīng)有細胞培養(yǎng)手段、環(huán)境調(diào)整手段、觀測手段及比較手段。測定方法包括以下(A)～(E)步驟(A)用細胞培養(yǎng)手段，培養(yǎng)組織或細胞，再用細胞培養(yǎng)手段，維持組織或細胞周圍的第1物理化學(xué)環(huán)境的步驟。
(B)用上述觀測手段，觀測在第1物理化學(xué)環(huán)境中，組織或細胞的第1物理化學(xué)特性的步驟。
(C)用上述環(huán)境調(diào)整手段，改變第1物理化學(xué)環(huán)境至第2物理化學(xué)環(huán)境的步驟。
(D)用觀測手段，觀測在第2物理化學(xué)環(huán)境中，組織或細胞的第2物理化學(xué)特性的步驟。
(E)用比較手段，比較組織或細胞的第1、第2物理化學(xué)特性的步驟。
用這個優(yōu)選方案的方法，可以很容易測定組織或細胞的物理化學(xué)特性。
另外，更優(yōu)選的實施方案是包括將上述第1的物理化學(xué)環(huán)境變?yōu)榈?的物理化學(xué)環(huán)境的步驟的方法，即將上述細胞培養(yǎng)手段中使用的第1培養(yǎng)基置換為上述培養(yǎng)手段中使用的第2培養(yǎng)基。這種情況下，第1及第2培養(yǎng)基優(yōu)選含有一個或多個任意濃度的藥品。
因此，本發(fā)明測定生物組織或細胞的物理化學(xué)特性的裝置，其功能是改變生物組織或細胞周圍的物理化學(xué)環(huán)境，觀測其對組織或細胞的物理化學(xué)特性所造成的影響。這個裝置包括下面(A)～(E)手段(A)細胞培養(yǎng)手段培養(yǎng)上述組織或細胞，維持組織或細胞周圍的物理化學(xué)環(huán)境。
(B)觀測手段觀測在第1物理化學(xué)環(huán)境中，上述組織或細胞的物理化學(xué)特性。
(C)環(huán)境調(diào)整手段調(diào)整維持在組織或細胞周圍的物理化學(xué)環(huán)境。
(D)觀測手段用環(huán)境調(diào)整手段，改變第1物理化學(xué)環(huán)境至第2物理化學(xué)環(huán)境時，觀測上述組織或細胞的物理化學(xué)特性。
(E)比較手段比較在第1及第2物理化學(xué)環(huán)境中，上述組織或細胞的物理化學(xué)特性。
在該裝置中，上述的環(huán)境調(diào)節(jié)手段優(yōu)選包括向細胞培養(yǎng)手段所使用的培養(yǎng)基中加入化學(xué)物質(zhì)、微生物及病毒；將第1培養(yǎng)基置換成第2培養(yǎng)基，第1培養(yǎng)基為細胞培養(yǎng)手段所使用的培養(yǎng)基，它含任意濃度的一個或多個藥品，第2培養(yǎng)基為細胞培養(yǎng)手段所使用的培養(yǎng)基，它含任意濃度的一個或多個化學(xué)物質(zhì)、微生物及病毒。
并且，上述化學(xué)物質(zhì)的概念不僅指人工合成的化學(xué)物質(zhì)，還包含蛋白質(zhì)、核酸、糖類、脂肪等天然化學(xué)物質(zhì)。以下化學(xué)物質(zhì)與此相同。
對該裝置來說，上述的環(huán)境調(diào)整手段優(yōu)選包括使用向細胞培養(yǎng)手段使用的培養(yǎng)基中添加物質(zhì)的手段、把細胞培養(yǎng)手段使用的第1培養(yǎng)基置換為細胞培養(yǎng)手段使用的第2培養(yǎng)基。
另外，上述觀測手段為電位測定裝置，它能測定組織或細胞的電生理學(xué)特性。這個裝置優(yōu)選包括下述(A)及(B)。
(A)配備了一體化細胞設(shè)置器。它包括在基板上配備多個微小電極；為了在微小電極上放置組織或細胞，配備細胞放置部；為了給予微小電極電信號并將電信號從微小電極導(dǎo)出，配備電連接手段。
(B)對輸出信號進行處理的手段按上述一體化細胞設(shè)置器的電連接手段進行連接，由組織及細胞的電生理活動，產(chǎn)生輸出信號，對輸出信號進行處理。
并且，除了(A)和(B)，優(yōu)選還包括下述的(C)。
(C)按上述一體化細胞設(shè)置器的電連接手段進行連接，給予組織及細胞電刺激的手段。
例如，用這樣的優(yōu)選方案的裝置，可進行以下測定將組織或細胞放置在一體化細胞設(shè)置器的細胞設(shè)置部上，作為樣本，使多個微小電極與組織或細胞接觸。在多個由電路連接的微小電極中，向其中任意一對電極間施加刺激信號。其它各電極隨時間而變化的誘發(fā)電位，經(jīng)過必要的信號處理，在顯示裝置輸出并儲備在記憶裝置。其次，改變物理化學(xué)環(huán)境進行同樣的測定。從記憶裝置調(diào)出物理化學(xué)環(huán)境變化前的測定結(jié)果，使之與物理化學(xué)環(huán)境變化后的測定結(jié)果相比較。不施加電信號的自發(fā)電位也可進行同樣測定。
因此，本發(fā)明優(yōu)選方案的裝置是這樣的因為進行體系化系列工程測定，所以可以對組織等的物理化學(xué)特性進行高效測定，例如，可對藥品篩選的大量處理工作，進行必要有效的測定。另外本發(fā)明優(yōu)選方案的裝置還應(yīng)該是這樣的能很容易測定活體器官(例如小鼠的大腦切片及心臟切片)的動作電位；以往進行的細胞水平或活體器官整體的收縮實驗，由藥理檢測所進行的判斷太多，而本發(fā)明裝置，在作活體器官應(yīng)用部位相互間作用實驗時，進行多點位實驗。其結(jié)果，可以從整體上了解有無相容效果，從而能得到大量的可信度高的資料。用這一方法，可進行高效、低成本的藥品篩選試驗。
并且，本發(fā)明裝置的優(yōu)選方案是準備多個一體化細胞設(shè)置器，一邊對多個組織或細胞進行培養(yǎng)，一邊測定其物理化學(xué)的特性。為了能一次處理多個組織或細胞，配備多陣列的一體化細胞設(shè)置器，從而可以大幅提高測定效率，成為藥品篩選的合適的裝置，因為藥品篩選需要進行大量的樣品處理工作。
上述多陣列一體化細胞設(shè)置器優(yōu)選包括能對多個組織或細胞的物理化學(xué)環(huán)境進行個別調(diào)整的環(huán)境調(diào)整手段。
其次，本發(fā)明檢測藥品的方法是配備檢測手段，對添加了化學(xué)物質(zhì)、微生物或病毒的組織或細胞的電特性進行檢測；配備圖象檢測手段，從外部對組織或細胞的視覺特性進行觀測；在給組織或細胞添加化學(xué)物質(zhì)、微生物或病毒時測定組織或細胞的電特性及其視覺特性，由這兩個參數(shù)，判定化學(xué)物質(zhì)、微生物或病毒是否對組織或細胞有影響。
本發(fā)明檢測藥品的裝置包括電測定部分，對添加了化學(xué)物質(zhì)、微生物或病毒的組織或細胞的電特性進行測定；視覺特性檢測部分，對組織或細胞的視覺特性進行測定；藥品檢測裝置，測定經(jīng)電特性及視覺特性檢測后的化學(xué)物質(zhì)、微生物或病毒對組織或細胞的影響。
附圖簡述

圖1是本發(fā)明一實施例使用細胞電位測定裝置的一體化細胞設(shè)置器的斜視圖。圖2是一體化細胞設(shè)置器的組裝圖。圖3是在構(gòu)成一體化細胞設(shè)置器的一體化復(fù)合電極的中央，設(shè)計的64個微小電極和引線圖案的平面圖。圖4是一體化復(fù)合電極的斷面模式圖。圖5是一體化復(fù)合電極被上部及下部夾具夾持固定下的平面圖及側(cè)斷面圖。圖6是圖5的一體化復(fù)合電極與上下夾具的斜視圖。圖7是在上部夾具上配備的接觸零件的側(cè)視圖。圖8是從圖2逆向看，一體化細胞設(shè)置器的組裝圖。圖9是本發(fā)明裝置的構(gòu)件構(gòu)成圖。圖10是用本發(fā)明裝置測定麻黃堿對培養(yǎng)細胞的誘發(fā)電位所產(chǎn)生的急性效果圖。圖11是用本發(fā)明裝置測定麻黃堿對培養(yǎng)細胞的誘發(fā)電位所產(chǎn)生慢性效果圖。圖12是用本發(fā)明裝置測定乙酰膽堿對培養(yǎng)細胞的自發(fā)動作電位的效果圖。圖13是用本發(fā)明裝置測定腎上腺素對培養(yǎng)細胞的自發(fā)動作電位的效果圖。圖14是由多個一體化復(fù)合電極所形成的多陣列化例子的上表面圖。圖15是將多陣列一體化復(fù)合電極裝配在多陣列用印刷電路板上，其裝配狀態(tài)的上表面圖。圖16是應(yīng)用多陣列一體化細胞設(shè)置器的裝置，關(guān)于其構(gòu)成實施例的構(gòu)件圖。圖17是向多陣列一體化細胞設(shè)置器送排液系統(tǒng)的斜視圖。
實施發(fā)明的最佳方案以下按附圖來說明本發(fā)明的實施例。
首先說明本測定裝置所使用的一體化細胞設(shè)置器。1是一體化細胞設(shè)置器，圖1為它的斜視圖，圖2為它的組裝圖。如圖所示，在玻璃板上設(shè)立多個微小電極和引線圖案，成為一體化復(fù)合電極2，兩部分夾具3和4將一體化復(fù)合電極上下夾持固定，由夾具固定的印刷電路板5。
一體化電極與特開平6-78889號公報等所公開的內(nèi)容大致相同。在厚1.1mm，50mm見方的透明硼硅酸玻璃基板中央，64個微小電極11形成8×8的矩陣形狀，各微小電極由引線圖案12連接(參照圖3)。各電極11為邊長50μm的正方形(面積25×102μm2)，相鄰兩電極中心間距離為150μm。在基板四邊，形成每邊16個，共64個電接點7(參照圖2)，這些電接點與基板中央64個微小電極由引線圖案12一一對應(yīng)進行連接。各邊的16個電接點以間距1.27mm排列。以下根據(jù)圖4的斷面圖，來說明一體化復(fù)合電極2的制造方法。為了容易看清，在圖4中將各部分按比例放大進行描繪。
在玻璃板13的表面涂上一層150nm的ITO(氧化銦錫)膜，由光致抗蝕劑及銅板形成引線圖案12，在它上面涂上一層厚1.4μm的聚酰亞胺膜，同樣形成絕緣被膜14。在微小電極和電接點處，將ITO膜露出，在這個部分施加厚500nm的鍍鎳15及厚50nm的鍍金16。用硅酮系的粘合劑，把內(nèi)徑22mm，外徑25mm，高10mm的聚苯乙烯圓筒或玻璃圓筒6(參照圖2)粘合到玻璃盤13上的絕緣被膜14表面。這個聚苯乙烯圓筒或玻璃圓筒6的中心與玻璃板13的中心重合，即其中心與64個微小電極11的中心重合，以這種狀態(tài)固定。這個聚苯乙烯圓筒或玻璃圓筒6的內(nèi)側(cè)相當(dāng)于細胞設(shè)置部。向這個聚苯乙烯圓筒或玻璃圓筒6內(nèi)，注滿重量1％的氯鉑酸，重量0.01％的醋酸鉛，重量0.0025％的鹽酸水溶液，通入20mA/cm2的電流1分鐘，在微小電極11的鍍金表面上析出鉑黑11a。
其次，說明從上下夾持固定一體化復(fù)合電極2的兩部分夾具3和4。夾具3、4是由樹脂形成的。如圖2所示，為了定位一體化復(fù)合電極2的邊緣部分，在夾具3、4的中間部分配備臺階和矩形開口。為上部夾具3配備一對固定器具8和16個×4對的接觸零件9。夾持固定一體化復(fù)合電極2的夾具3、4用各圖來表示圖5(A)為頂視圖；圖5(B)為側(cè)面圖(B-B斷面)；圖6為從背面方向看斜視圖。從這些圖可知，固定器具8在上部夾具3相對的兩邊，用軸栓8a來進行軸定位。在下部夾具4的背面相對的兩邊形成溝槽4a，固定器具8的凸條8b嵌在溝槽4a中，由此，上下夾具3、4將一體化復(fù)合電極2在夾持狀態(tài)下結(jié)實地固定。
與一體化復(fù)合電極2的電接點7相對應(yīng)，在上部夾具3上設(shè)立64個接觸零件9。將銅化鈹鍍上鎳及金，將這樣極富彈力的良導(dǎo)體金屬板加工形成接觸零件9，形成如圖7所示的形狀。即接觸零件9是這樣構(gòu)成的軸部9a及其基部9b，從基部9b開始通過彎曲部9c延長至可動接觸部9d。由此構(gòu)造，可動接觸部9b對基部9b可能產(chǎn)生彈性變位。在上部夾具3上，形成64(16×4)個部分，它們是接觸零件9的軸部9a的插通孔與基部9b的嵌槽。
如圖2及圖5所示，將接觸零件9插入上述孔及槽中，使其處于固定狀態(tài)，軸部9a從上部夾具3突出來?；?b的長度不同，由此形成2種接觸零件9，將其交互配置，從上部夾具3突出來的16個軸部9a象很多小鳥一樣排成2列。如后面所述，這些軸部9b用連接器連接，因為與外部連接用的印刷電路板5，實際裝配了連接器。
一方面，將接觸零件9向上部夾具3的孔及槽插入固定，在這種狀態(tài)下，接觸零件9的可動接觸部9d從上部夾具3的下面突出來，這種情況，在圖8中很好地表示出來。圖8是圖2組裝圖的反向組裝圖。用夾具3、4將一體化復(fù)合電極2夾持固定，在此狀態(tài)下，各接觸零件9的可動接觸部9d與一體化復(fù)合電極2的電接點7相接觸，由彎曲部9c的彈性變形將所定的接觸壓力給予接觸部。這樣，通過一體化復(fù)合電極2的微小電極11的引線圖案12而連接的電接點7，在對接觸零件9有小的接觸電阻下(30毫歐以下)，完成電路連接。
下面，對印刷電路板5進行說明。這個印刷電路板5不但起固定一體化復(fù)合電極2與夾具3、4的裝配部件的作用，而且還承擔(dān)以下任務(wù)從一體化復(fù)合電極2的微小電極11的引線圖案12、電接點7、至接觸零件9，將它們的電路連接通過連接器向外部引出。并且也具有很容易使用測定裝置的組件的功能。
印刷電路板5是由兩面圖案環(huán)氧玻璃基板構(gòu)成的。圖8表示其背面，在中央圓形開口的周圍4個地方，設(shè)立連接器5a。兩列小鳥形狀的16個軸部9a從上部夾具3的背面4個地方突出來，將其一一對應(yīng)插入連接器5a中，由此，將一體化復(fù)合電極2與夾具3、4的裝配部件固定在印刷電路板5上，再由電路連接。
在印刷電路板5的兩側(cè)邊緣部分5b上，形成相距2.54mm的電接點，用于兩面邊緣的連結(jié)。這些電接點與中央部分的連接器5a由引線圖案5c連接。兩側(cè)連接器5a的內(nèi)側(cè)列由表面圖案、外側(cè)列由背面圖案引出，在邊緣部5b的正反兩面形成32個，總計64個電接點。為了確實起到機械固定作用，也可以用螺絲釘在印刷電路板5上固定上部夾具3。
由此構(gòu)成了一體化細胞設(shè)置器1，用它來構(gòu)成細胞電位測定裝置，其合適的實施例用圖9來表示。本實施例的測定裝置包括上述一體化細胞設(shè)置器1；包含倒立顯微鏡21的圖像檢測手段20，倒立顯微鏡21可以對一體化細胞設(shè)置器1上所放置的細胞進行光學(xué)觀察；檢測細胞電特性的手段10；計算機30，它包括給予細胞電刺激的手段和對細胞的輸出信號進行處理、比較的手段；維持細胞培養(yǎng)環(huán)境的細胞培養(yǎng)手段40，為了向培養(yǎng)基添加任意濃度的任意化學(xué)物質(zhì)、或者除去添加的化學(xué)物質(zhì)，配備環(huán)境調(diào)整手段50。
除了一體化細胞設(shè)置器1配置的倒立顯微鏡21(奧林巴斯制造IMT-2-F或I×70相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品)，圖像檢測手段20還包括其它裝置顯微鏡用的SIT照像機22(浜松ホトニクス制造C2400-08相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品)、高精度顯示器23以及圖像文件裝置24(松下電器公司制造TQ-2600或FTQ-3100F相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品)。但是，高精度顯示器23也可兼用計算機30的顯示器。再有，上述括弧內(nèi)所示的具體裝置只是一個例子，不局限在這些物品范圍之內(nèi)，以下也與此同樣。
計算機30使用在WINDOWS相應(yīng)的個人計算機中的A/D變換板及裝載的測定用軟件。A/D變換板包括圖9的A/D變換器31及D/A變換器32。A/D變換器31是12比特64波道，D/A變換器32是12比特8波道。
測定用軟件包括能設(shè)定刺激信號的給予條件及得到檢測信號的記錄條件的軟件。用這個測定用軟件，計算機30不僅包含以下手段，即給予細胞刺激信號的手段以及對細胞輸出信號進行處理和比較的手段，計算機30還管理著圖像檢測手段20(SIT照像機及圖像文件裝置)和細胞培養(yǎng)手段40。測定用軟件的主要做法用以下個個圖像進行說明。
由于可以用鍵盤或鼠標在圖像上描繪刺激波形，因而參數(shù)設(shè)定圖像可以設(shè)定復(fù)雜的刺激條件。以輸入波道64，抽樣率10kHz，可對應(yīng)連續(xù)記錄數(shù)小時來設(shè)定記錄條件。用鼠標或筆指示圖像上表示的顯微鏡像，由此可指定兩個電極，即給予刺激信號的電極和從細胞取出檢測信號的電極。其它諸條件都可以用鍵盤來進行設(shè)定，如細胞培養(yǎng)手段40的溫度及pH等，環(huán)境調(diào)整手段50的閥門轉(zhuǎn)換及泵的開通、關(guān)閉以及泵的流速等。
從細胞檢測出來的自發(fā)動作電位及誘導(dǎo)電位，其記錄圖像用實時處理最大64波道來表示。
如上所述，從計算機30輸出刺激信號時，經(jīng)過D/A變換器323及絕緣體10b給予細胞，電特性檢測手段10包括絕緣體10b(BAK電子公司制造BSI-2相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品)。即，在一體化細胞設(shè)置器1的64個微小電極11中，選擇兩點，向其施加刺激信號。然后，各微小電極11與GND能級(培養(yǎng)基的電位)間產(chǎn)生誘發(fā)電位，經(jīng)64波道部分的高感度增幅器10a(日本光電AB-610J相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品)及A/D變換器31，向計算機30輸入。
下一步，在細胞培養(yǎng)手段40中配備溫度調(diào)節(jié)器41、空氣和二氧化碳混合氣體的供給手段42。實際上，用Medical Systems公司制造的微型培養(yǎng)箱PDMI-2相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品與溫度調(diào)節(jié)器TC-202相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品以及CO2等，就構(gòu)成了細胞培養(yǎng)手段40。根據(jù)パルチヱ，這個微型培養(yǎng)箱的溫度可控制在0～50℃的范圍，對應(yīng)送液速度3.0mL/min以下，給氣速度1.0ML/min以下?；蛘咭部梢允褂脙?nèi)藏溫度調(diào)節(jié)器的微型培養(yǎng)箱(奧林巴斯公司制造IMT2-IBSV相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品)。
然后，配備環(huán)境調(diào)整手段50，它包括溶液瓶51、溶液瓶52、閥門53、泵54及泵55。溶液瓶51中為普通培養(yǎng)時用的培養(yǎng)基，溶解瓶52中為在前培養(yǎng)基中溶解了任意濃度的任意化學(xué)物質(zhì)的溶液，即樣品溶液。由于閥門53的轉(zhuǎn)換，可以用泵54向一體化細胞設(shè)置器1輸送溶液，也可以設(shè)定培養(yǎng)基或樣品溶液的某一個。泵55與泵54的設(shè)定流速相同，且同時工作，吸引一體化細胞設(shè)置器1內(nèi)的溶液。這樣，一體化細胞設(shè)置器1內(nèi)的溶液量經(jīng)常保持一定，而溶液的組成是可以變化的。
另外，以上裝置是以一個裝備好的一體化細胞設(shè)置器為例進行說明的，本發(fā)明不局限于此。即也可以在玻璃板上形成多個一體化復(fù)合電極，而且也可以在各個電極上形成多個聚苯乙烯圓筒或玻璃圓筒。這樣，配備了多陣列一體化細胞設(shè)置器的裝置，因為能一次處理多個組織或細胞，而能進行大量高效的測定，并且成為藥品篩選最合適的裝置，對大量的樣品進行必要的處理。
圖14為多陣列化的例子，它由縱3×橫4(共12個)一體化復(fù)合電極所形成。如圖所示，在長84mm、寬127mm、厚1.1mm的透明硼酸鹽玻璃基板上，縱3×橫4地配列(共12個)微小電極11及其引線圖案12(參照圖3)，構(gòu)成多陣列一體化復(fù)合電極60(以下簡稱為多陣列)。各圖案的中央部分與圖3所示單個的一體化復(fù)合電極2的結(jié)構(gòu)相同，64個微小電極11形成8×8矩陣形狀，各微小電極由引線圖案12連接。電極尺寸(50μm見方)及電極中心間距離(150μm)與一體化復(fù)合電極2相同。由于具有相同的情況，所以只對一部分的微小電極11、引線圖案12及電接點61做具體記載，其它部分省略記載。
在各圖案的4邊，形成每邊16個，共64個電接點61。這些電接點61與圖案中央64個微小電極11由引線圖案12一一對應(yīng)進行連接。為了達到多陣列60整體尺寸(長84mm，寬127mm)，從而很容易使用，各邊的16個電接點61以間距0.635mm排列，與一體化復(fù)合電極2不同。
如圖所示那樣，本多陣列60由相同的長3×寬4的矩陣狀圖案配置，所有引線圖案12的長度大致一定。因此，與引線圖案12有關(guān)的電阻值也大致一定，這樣可得到適于測定電生理的多陣列60。相反，以微小電極11為例，將它配置在與圖14相同的位置上，將全體電接點61配置在硬質(zhì)玻璃基板端部，配置引線圖案12將兩者一一對應(yīng)進行連接，基板邊緣部分的微小電極11的引線圖案12與基板中央部分的微小電極11的引線圖案12，這兩者的長度有很大差別，因而引線圖案12的電阻會有很大差別，不適合進行電生理測定。
將上述總計12個微小電極11及其引線圖案12配置在硬質(zhì)玻璃基板上，然后將12個內(nèi)徑10mm、外徑12mm、高10mm的玻璃圓筒或聚苯乙烯圓筒62用硅硐系統(tǒng)粘合劑粘合在玻璃基板上。這個玻璃圓筒或聚苯乙烯圓筒62在各圖案的中心，即其中心與64個微小電極11的中心重合，以這種狀態(tài)固定，圓筒里面相當(dāng)于細胞設(shè)置部。
多陣列60的微小電極11及其引線圖案12的形成方法與上述一體化復(fù)合電極2的情況相同，故省略其說明。
多陣列用夾具與一體化復(fù)合電極2用的夾具3、4相同(參照圖1、圖2、圖5、圖6、圖7及圖8)，這兩部分分開的夾具將一體化復(fù)合電極夾持固定。但多陣列用夾具會根據(jù)以下內(nèi)容而變化多陣列60的微小電極11、其引線圖案12以及電接點61，與它們的位置及數(shù)量相對應(yīng)的各部分尺寸是變化的；接觸零件9(參照圖7)的數(shù)量及配置等是變化的。多陣列60所具有的64×12(共768)個的電接點61與電路連接的機理與夾具3、4相同。
圖15為多陣列用印刷電路板70的頂視圖(圖示為多陣列60裝配好的狀態(tài))，用它固定多陣列60及其多陣列用夾具。除了這個用途，多陣列用印刷電路板70還擔(dān)當(dāng)以下任務(wù)將多陣列微小電極11的引線圖案12、電接點61至接觸零件9進行電路連接，并通過連結(jié)器向外引出。多陣列60及多陣列用連接器在多陣列用印刷電路板70上固定，其各電路的連接方法與前面所述電路連接方法相同，即一體化復(fù)合電極2和夾具3、4在印刷電路板5(參照圖1、圖2及圖8)上固定時各電路的連接方法。
多陣列用印刷電路板70的四個邊緣部分為70b，在70b上形成兩面邊緣連接器用的電接點70d，其間距為1.27mm。這些電接點70d與接觸零件9的軸部9a(參照圖7)用引線圖案70c連接。軸部9a象兩列許多小鳥一樣配置，其內(nèi)側(cè)一列與表面電接點70d連接，外側(cè)一列與背面電接點70d連接(圖15是從上面看圖，所以能看見表面電接點70d)。由于電接點70d的數(shù)目很多，若用多陣列印刷電路板70的正反兩面配置引線圖案70c，空間有限，因而，在多陣列用印刷電路板70上，可使用多層構(gòu)造的電路板。圖15所表示的是第一層的引線圖案70c。如圖所示第一層配置內(nèi)側(cè)一列軸部9a的一部分(每邊三個軸部9a)引線圖案70c，同樣，第2層至第6層，若按順序配置3個或2個軸部9a的引線圖案70c。這樣，就可以很容易地配置引線圖案70c。
用以上多陣列一體化復(fù)合電極81構(gòu)成細胞電位測定裝置，其最適的實施例以圖16表示。本實施例的測定裝置配備了以下部件上述多列一體化復(fù)合電極81、含倒立顯微鏡的細胞觀察手段，對放置在多陣列一體化復(fù)合電極81上的細胞進行光學(xué)觀察、資料記錄輔助系統(tǒng)82，它包括給予細胞刺激信號的手段以及對細胞的輸出信號進行處理的手段、控制資料記錄輔助系統(tǒng)82的主控制器83、輸送或排放任何藥液的系統(tǒng)84、電信號增幅裝置85，從各孔取出相似電信號并對其進行增幅，電信號總數(shù)與電路總數(shù)相同(本實施例有64條電路，故有64個相似電信號)、生成刺激電信號的絕緣體86，這個刺激電信號給予各孔的64條電路。
在此，資料記錄輔助系統(tǒng)82對各孔專門配置的64個相似電信號進行數(shù)字變換，對這個數(shù)字變換后的資料，不記錄也不讀出，并且64個電刺激信號是通過以下裝置來構(gòu)成的。這些裝置是可以將數(shù)字資料象以前電信號一樣輸出的裝置、64條電路的A/D變換裝置、64條電路的D/A變換裝置、磁盤或光盤或磁帶等資料記錄裝置以及控制這些裝置的控制器。這個資料記錄輔助系統(tǒng)82不僅配備了顯示器，還可確認個別的動作狀況。主控制器83對各孔專用而設(shè)置的資料記錄輔助系統(tǒng)82進行集中管理和控制。用管理和控制裝置設(shè)定各資料記錄輔助系統(tǒng)82的動作環(huán)境、由附屬的顯示器顯示記錄資料。
如圖所示，用玻璃圓筒或聚苯乙烯圓筒使電極群獨立存在，作為試驗對象的組織或細胞在這樣的多陣列一體化復(fù)合電極81的各孔中，可按下述培養(yǎng)實施例所示的方法進行培養(yǎng)。并且，通過圖17所示的送排液系統(tǒng)，可改變物理化學(xué)環(huán)境。這個送排液系統(tǒng)配備了24個送液泵(PI)和12個排液泵(PO)，各孔與2個送液泵1個排液泵連通。由于蓋在圖15的印刷電路板70上，這個送排液系統(tǒng)可以對各孔無菌輸送2種任意藥品濃度任意量的試驗液，還可以對藥品的功效進行電生理檢測。而且也可進行無菌排液。因為送液泵配備了閥門，所以由各泵可輸送任意2種液體，一共可檢測4種試驗液。各泵的送排液量及閥門的開關(guān)，由主控制器83控制。
下面說明的是有關(guān)從各孔取得的電信號的記錄和生成給予各孔電刺激信號時的動作。
主控制器83與各個資料記錄輔助系統(tǒng)82之間，由可以相互通信的母線連接。對于各個資料記錄輔助系統(tǒng)82，主控制器83不設(shè)定個別的資料記錄參數(shù)(采樣速度、采樣時間，采樣間隔、采樣途徑)以及資料記錄的開始、停止等；而可以將刺激波形的資料發(fā)送給各孔。這時各參數(shù)的設(shè)定方法是與單一孔一樣進行同樣的設(shè)定，并且可同時設(shè)定全部的孔。通過構(gòu)筑具有幾份單一孔設(shè)定畫面的多窗口，這個很容易實現(xiàn)。根據(jù)這個設(shè)定，資料記錄輔助系統(tǒng)82獨立地各自按照主控制器83的命令，進行A/D轉(zhuǎn)換、資料記錄以及D/A轉(zhuǎn)換。對各孔輸出信號的記錄及向各孔輸入刺激波形，與單一孔情況相同。這時，由于各資料記錄輔助系統(tǒng)82置身于自己的控制器操縱之下，主控制器83沒有負荷。而且同時控制多個孔時，主控制器83也不會遇到過量的負荷。主控制器83可以將任意指定的資料記錄輔助系統(tǒng)82的資料按順序發(fā)送，由主控制器83，可對單一孔的資料進行同樣的處理。
用以上測定組織或細胞物理化學(xué)特性的裝置，改變在一體化細胞設(shè)置器上培養(yǎng)的組織或細胞的物理化學(xué)環(huán)境，測定環(huán)境變化前后組織或細胞的物理化學(xué)特性的變化。關(guān)于測定的實施例進行以下說明。
(實施例1)用大鼠大腦皮質(zhì)切片作為神經(jīng)組織，用后面實施例所示的培養(yǎng)法進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中加入屬于興奮劑的一種麻黃堿來改變其物理化學(xué)環(huán)境。作為組織或細胞的物理化學(xué)特性是測定細胞的電生理學(xué)特性，即在給予刺激信號時，測定誘發(fā)電位。
首先進行細胞培養(yǎng)，為了提高一體化復(fù)合電極2的各微小電極11與細胞的接合性，在一體化復(fù)合電極2的表面覆蓋一層厚50μm以下的膠原凝膠。然后在微小電極11上面的膠原凝膠上放置大鼠的大腦皮質(zhì)切片(厚500μm以下)進行培養(yǎng)。圖10表示向培養(yǎng)6天的培養(yǎng)基中加入各種濃度的麻黃堿，30分鐘后測定的誘發(fā)電位以及添加各麻黃堿之前的誘發(fā)電位。圖11表示向培養(yǎng)3天的培養(yǎng)基中加入各種濃度的麻黃堿，3天后測定的誘發(fā)電位以及添加各麻黃堿之前的誘發(fā)電位。即圖10表示麻黃堿的急性效果，圖11表示麻黃堿的慢性效果。
關(guān)于急性效果(參照圖10)，0.1mM的麻黃堿，沒有使誘發(fā)電位受到影響。添加0.5mM的麻黃堿，誘發(fā)電位的振幅稍稍減小。1mM時，誘發(fā)電位大體上消失。其后，除去溶液中的麻黃堿，使培養(yǎng)基的組成恢復(fù)到通常的狀態(tài)，誘發(fā)電位大體上回復(fù)到以前的狀態(tài)。圖10表示如下圖10(a)為添加麻黃堿之前，圖10(b)為添加0.1mM麻黃堿，圖10(c)為添加0.5mM麻黃堿，圖10(d)為添加1mM麻黃堿，圖10(e)為除去麻黃堿后，各自的狀態(tài)。
關(guān)于慢性效果(參照圖11)，添加0.1mM的麻黃堿，則誘發(fā)電位完全消失，而這個濃度，是不能使急性誘發(fā)電位受到影響的。并且，以它的十分之一濃度，即0.01mM添加時，誘發(fā)電位依然消減。更進一步，除去麻黃堿，誘發(fā)電位也不恢復(fù)。圖11表示如下圖11(a)為添加麻黃堿之前，圖11(b)為添加0.01mM麻黃堿，圖11(c)為添加0.1mM麻黃堿，各自的狀態(tài)。
(1)培養(yǎng)基Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基與Ham F12培養(yǎng)基1∶1形成混合培養(yǎng)基(GIBCO公司制造430-2500EB)，向混合培養(yǎng)基中添加以下物質(zhì)*葡萄糖(glucose，GIBCO 820-5023 IN)2.85mg/L(與上述培養(yǎng)基中所含的葡萄糖合在一起，總共達到6mg/L)*丁二胺(putrescine，SIGMA公司P5780)100nM*黃體酮(progesterone，SIGMA P8783)20nM*氫化可的松(hydrocortisone，SIGMA HO888)20nM*亞硒酸鈉(sodium selenite，WAKO公司198-0319)20nM*胰島素(insulin，SIGMA 16634)5mg/L*轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，SIGMA T1147)100mg/L*重碳酸鈉2.438 mg/L*添加適量鹽酸及氫氧化鈉，調(diào)整pH至7.4。
添加了以上物質(zhì)后，將培養(yǎng)基過濾除菌，在4℃保存以備使用。以下，本培養(yǎng)基簡稱為“培養(yǎng)基”。
(2)一體化復(fù)合電極上的孔的構(gòu)成為了方便地在一體化復(fù)合電極2上培養(yǎng)神經(jīng)細胞或神經(jīng)組織，用以下所記載的方法接合圓筒6，其內(nèi)徑為22mm，外徑為25mm，高為10mm，由聚苯乙烯或玻璃制造。
(a)在聚苯乙烯或玻璃制造的圓筒6(內(nèi)徑22mm，外徑25mm，高10mm)的下面，涂滿足量的液體硅系粘合劑(ダウコ-ニソグ891或信越化學(xué)KE-42RTV)。
(b)注意使一體化復(fù)合電極2的中心與圓筒6的中心一致，并將兩者接合。
(c)在沒有灰塵的環(huán)境中放置24小時，使粘合劑固定。
(d)在70％酒精中浸潤5分鐘后，在干燥機內(nèi)風(fēng)干從而進行滅菌，準備對一體化復(fù)合電極2的表面進行處理。
(3)一體化復(fù)合電極2的表面處理為了提高一體化復(fù)合電極2表面的細胞粘合性，用以下方法在一體化復(fù)合電極2的表面構(gòu)建膠原凝膠。以下操作，全部在無菌環(huán)境中進行。
(a)準備以下A、B、C溶液，冰浴中放置。A.0.3％體積稀鹽酸膠原溶液(pH3.0，新明膠細胞質(zhì)ix類型I-A)B.Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基與Ham F12培養(yǎng)基1∶1混合，形成培養(yǎng)基(GIBCO 430-2500 EB)，不向其中加入重碳酸鈉，制作濃度為通常所用的10倍的液體，過濾滅菌。C.在0.05N 100mL氫氧化鈉溶液中，溶入重碳酸鈉2.2g、HEPES(GIBCO 845-1344IM)4.77g，過濾滅菌。
(b)一邊冷卻，一邊將A、B、C溶液以8∶1∶1的比例進行混合。這時，要將A與B充分地混合后，再加入C進行混合。
(c)在預(yù)先冷卻至4℃放置的一體化復(fù)合電極2的孔內(nèi)，將(b)的混合溶液1mL分散注入其中，將孔的內(nèi)表面全部覆蓋后，用玻璃吸管，盡可能除去混合溶液。這樣可構(gòu)成厚50μm以下的混合溶液膜。
(d)構(gòu)成混合溶液膜的一體化復(fù)合電極2，在37℃溫育30分鐘，使混合溶液凝膠化，構(gòu)成膠原基質(zhì)。
(e)向一體化復(fù)合電極2的孔內(nèi)加入1mL消毒水，放置約5分鐘后除去消毒水，洗凈。
(f)將(e)的操作，再反復(fù)進行2次(共3次)。
(g)在一體化復(fù)合電極2的孔內(nèi)，Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基與Ham FH12培養(yǎng)基1∶1混合，形成混合培養(yǎng)基(GIBCO 430-2500EB)，向其中加入上述添加物(胰島素及轉(zhuǎn)鐵蛋白除外)，然后將1mL此溶液分散注入一體化復(fù)合電極2的孔內(nèi)，在溫度37℃、相對濕度97％以上、CO2濃度5％、空氣濃度95％的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)保存，以備使用。
(4)神經(jīng)細胞或神經(jīng)組織的培養(yǎng)培養(yǎng)形態(tài)大致可分為2種。即，神經(jīng)細胞的分散培養(yǎng)與神經(jīng)組織的器官培養(yǎng)。以下，對每個培養(yǎng)形態(tài)進行描述。
(4-1)大鼠大腦皮質(zhì)視覺中樞神經(jīng)細胞的分散培養(yǎng)法以下操作，全部在無菌環(huán)境中進行。
(a)妊娠后16～18日的SD大鼠胎兒，將其腦摘出，在冰冷的Hank’s平衡鹽液(GIBCO 450-1250EB)中浸潤。
(b)從存放于冰冷Hank’s平衡鹽液中的腦，將其視覺皮質(zhì)切出，轉(zhuǎn)移至Engle基本培養(yǎng)基(GIBCO 450-1100 EB)中。
(c)在Engle基本培養(yǎng)基中，將視覺皮質(zhì)盡量細小地分開，最大切為僅0.2mm見方。
(d)把切斷后的細小視覺皮質(zhì)，放入離心試管中，用不含鈣及鎂的Hank’s平衡鹽液洗凈三次后，分散在適量的相同溶液中。
(e)向上述(d)離心試管中，加入Hank’s平衡鹽液，容量加倍。這種平衡鹽液有0.25％的胰蛋白酶在其中溶解，而不含鈣及鎂。緩慢攪拌，保持37℃恒溫狀態(tài)15分鐘，進行酶反應(yīng)。
(f)向上述(1-1)表示的培養(yǎng)基(含添加物，以下簡稱“培養(yǎng)基”)中加入10％體積的胎牛血清，然后將此培養(yǎng)基加入經(jīng)上述(e)步驟的離心試管中，容量加倍。用噴燈將玻璃吸管的前端口徑燒小后，緩慢地反復(fù)吸移(最多20次)，使每個細胞分離。
(g)以9806.65m/sec2(即1000g)進行5分鐘離心。離心后，棄去上清，將沉淀物懸濁在含5％胎牛血清的培養(yǎng)基中。
(h)將(g)再反復(fù)2次(共3次)。
(i)將最終得到的沉淀物，懸濁在含5％體積胎牛血清的培養(yǎng)基中，用紅血球計數(shù)板計算懸濁液中細胞的濃度。計算后，用同樣的培養(yǎng)基，調(diào)整其細胞濃度至2～4×106個/m。
(j)將上述經(jīng)(1-3)處理后在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)保存的一體化復(fù)合電極取出，除去孔內(nèi)培養(yǎng)基(不含胰島素及轉(zhuǎn)鐵蛋白)，將新的含5％體積的胎牛血清的培養(yǎng)基分散注入孔內(nèi)。然后，將(i)細胞濃度調(diào)整后的細胞懸濁液100μL慢慢地加入其中，再放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置。
(k)自上述(j)操作三天后，將培養(yǎng)基的一半與新的培養(yǎng)基交換，交換培養(yǎng)基為不含胎牛血清的培養(yǎng)基。由于胎牛血清的濃度降低，神經(jīng)細胞以外的細胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)細胞)的增殖受到抑制。
(1)以后每1～2天，就進行上述同樣的培養(yǎng)基交換。
(4-2)大鼠大腦皮質(zhì)切片培養(yǎng)法(a)出生后2天的大鼠，將其腦取出，在冰冷的含0.25％體積D-葡萄糖的Hank’s平衡鹽液中浸潤。
(b)在冰冷的含0.25％體積D-葡萄糖的Hank’s平衡鹽液中，用尖端銳利的小鑷子將附著在腦上的腦膜除去，注意不要刮傷大腦皮質(zhì)。
(c)從除去腦膜后大腦皮質(zhì)一側(cè)的腦橋至500μm的地方，用眼科手術(shù)用的小剪刀，剪去腦橋，從頭葉側(cè)至前葉側(cè)剪斷。
(d)接著，用眼科手術(shù)用的小剪刀，將(c)的切斷面垂直進行切斷，從而制作出厚200～300μm的大腦皮質(zhì)切片。
(e)再用眼科小剪刀將切片調(diào)整為1×1mm大小。
(f)在上述[(3)一體化復(fù)合電極2的表面處理]中準備好的一體化復(fù)合電極2，將它從CO2箱中取出。然后將調(diào)整大小后的大腦皮質(zhì)切片用口徑2mm以上的吸管慢慢地吸移至一體化復(fù)合電極2的孔中(注意不要有損傷)。
(g)在注意不要損傷大腦皮質(zhì)切片的同時，用噴燈燒制的前端平滑的吸管將皮質(zhì)層向微小電極11上面調(diào)整。
(h)將大腦皮質(zhì)切片放到一體化復(fù)合電極2上后，調(diào)整培養(yǎng)基的容量，使切片的底面與培養(yǎng)基接觸，上面與外面空氣接觸。
(i)調(diào)整培養(yǎng)基容量后，將一體化復(fù)合電極2放入陪替氏培養(yǎng)皿中滅菌，為了防止培養(yǎng)基干燥，將37℃的5mL消毒水分散注入陪替氏培養(yǎng)皿中。再放入CO2箱內(nèi)靜置。
(j)以后，注意培養(yǎng)基的容量，每日一次交換培養(yǎng)基。關(guān)于培養(yǎng)基的容量，與上述(i)相同。
由這個例子，從電、視覺方面捕捉到麻黃堿對細胞有什么樣的效果。作為藥品的篩選，得到了非常好的結(jié)果。
(實施例2)下面是以神經(jīng)組織以外的組織大鼠的心臟切片(組織)為測定對象來進行測定的實施例。將上述心臟切片用后述方法培養(yǎng)。另外還要記錄在以下兩個條件下自發(fā)動作電位的變化情況，這兩個條件是(i)向培養(yǎng)基添加乙酰膽堿前后，(ii)向培養(yǎng)基添加腎上腺素前后。培養(yǎng)基與實施例1所使用的培養(yǎng)基相同。一體化復(fù)合電極2的構(gòu)造及表面處理也與實施例1相同。首先進行培養(yǎng)，為了提高組織(細胞)與一體化復(fù)合電極2中的各微小電極11的接合性，將一體化復(fù)合電極2的表面用膠原凝膠(厚50μm以下)覆蓋。然后，在微小電極11的膠原凝膠上，放置并培養(yǎng)大鼠的心臟切片，這個心臟切片應(yīng)含有竇房結(jié)或房室結(jié)的心臟切片。
圖12(a)及圖12(b)表示向培養(yǎng)5天的培養(yǎng)基添加乙酰膽堿前后，上述細胞的自發(fā)動作電位。乙酰膽堿是在受刺激時，動物體內(nèi)副交感神經(jīng)末端所分泌出的化學(xué)物質(zhì)，通常具有降血壓、降心率，收縮腸管、收縮骨骼肌的作用。如圖12(b)所示，向培養(yǎng)基添加最終濃度為1mM的乙酰膽堿后，與添加前(參照圖12(a))相比，自發(fā)動作電位的發(fā)生頻率明顯降低。
圖13(a)及圖13(b)表示向培養(yǎng)5天的培養(yǎng)基添加腎上腺素前后，上述細胞的自發(fā)動作電位。已知腎上腺素能增加心臟的收縮功能。如圖13(b)所示，向培養(yǎng)基添加最終濃度為1mM的腎上腺素后，與添加前(參照圖13(a))相比，自發(fā)動作電位的發(fā)生頻率明顯上升。
以下說明的是心臟切片的合適的培養(yǎng)方法[培養(yǎng)心臟切片的實施例](1)培養(yǎng)基用與上述實施例1相同的培養(yǎng)基。
(2)一體化復(fù)合電極2上孔的構(gòu)成用與上述實施例1相同的方法構(gòu)成。
(3)一體化復(fù)合電極2的表面處理與上述實施例1進行同樣的處理。
(4)心臟切片的培養(yǎng)方法用與上述實施例1中“大鼠大腦皮質(zhì)切片培養(yǎng)法(4-2)”大致相同的方法，進行培養(yǎng)。以下，進行詳細說明。
(a)從出生后2天的SD大鼠，將其心臟取出，浸潤在冰冷的含0.25％體積的D-葡萄糖Hank’s平衡鹽液中，這時，多次交換上述Hank’s平衡鹽液，并很徹底地洗去血液。
(b)由于切片中要含有竇房結(jié)及房室結(jié)，注意要將心臟深深切開，制備心臟切片。
(c)用眼科手術(shù)用的小剪刀，將切片剪成約1×1mm大小。
(d)在上述[(3)一體化復(fù)合電極2的表面處理]中準備好的一體化復(fù)合電極2，將它從CO2箱中取出。然后將調(diào)整大小后的心臟切片用口徑2mm以上的吸管慢慢地吸移至一體化復(fù)合電極2的孔中，注意不要有損傷。
(e)在注意不要損傷心臟切片的同時，用噴燈燒制的前端平滑的吸管將心臟切片向微小電極11上面調(diào)整。
(f)將，心臟切片放到一體化復(fù)合電極2上后，調(diào)整培養(yǎng)基的容量，使切片的底面與培養(yǎng)基接觸，上面與外面空氣接觸。
(g)調(diào)整培養(yǎng)基容量后，將一體化復(fù)合電極2放入陪替氏培養(yǎng)皿中滅菌，為了防止培養(yǎng)基干燥，將37℃的5mL消毒水分散注入陪替氏培養(yǎng)皿中。再放入CO2箱內(nèi)靜置。
(h)以后，注意培養(yǎng)基的容量，每日一次交換培養(yǎng)基。關(guān)于培養(yǎng)基的容量，與上述(f)相同。
以上實施例，是將麻黃堿、乙酰膽堿及腎上腺素作為藥品給予組織或細胞。也可對其它的所應(yīng)用的化學(xué)物質(zhì)進行同樣的測定，如解熱劑、安眠藥等以及別的認為有藥效的藥品等。從而可以知道，給予這些化學(xué)物質(zhì)后，組織或細胞的物理化學(xué)特性的變化，由此結(jié)果，可以判斷出這些化學(xué)物質(zhì)作為藥品的效力如何。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性如上所述，本發(fā)明包括檢測藥品的方法、測定組織或細胞的物理化學(xué)特性的方法及裝置。其方法是從活的生物個體取出必要量的組織或細胞，適當(dāng)調(diào)整組織或細胞周圍的物理化學(xué)環(huán)境，由于環(huán)境的改變，組織或細胞的物理化學(xué)特性也發(fā)生變化，可對其進行不斷的觀察。因此，本發(fā)明可以弄清強電磁場、磁場及以往自然界不存在的化學(xué)物質(zhì)等人工物理化學(xué)環(huán)境對生物組織所造成的影響，并可顯著提高實驗效率。特別是，還可以很好地利用本發(fā)明篩選藥品來進行必要的大量處理樣品的工作。而且，用以往的技術(shù)很難對切片進行篩選，本發(fā)明則可進行高效篩選，其結(jié)果解明了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的機能，并可對腦神經(jīng)系統(tǒng)的藥物開發(fā)作出貢獻。本發(fā)明的另一個貢獻是，減少了實驗中所使用的動物數(shù)量。
權(quán)利要求
1.變化包圍生物組織或細胞的物理化學(xué)環(huán)境以觀察對上述組織或細胞的物理化學(xué)特性的影響的方法，該方法包括將包圍上述生物組織或細胞的物理化學(xué)環(huán)境保持一定，接著任意變化上述的物理化學(xué)環(huán)境，并觀測上述組織或細胞的物理化學(xué)特性，比較上述的物理化學(xué)環(huán)境變化前后上述組織或細胞的物理化學(xué)特性，測定上述生物組織或細胞物理化學(xué)特性。
2.權(quán)利要求1所述的方法，該方法至少是用含有細胞培養(yǎng)手段，環(huán)境調(diào)整手段、觀察手段以及比較手段的裝置觀察生物組織或細胞的物理化學(xué)特性，包括下述(A)～(E)步驟(A)用上述的細胞培養(yǎng)手段培養(yǎng)上述的組織或細胞，或者用上述的細胞培養(yǎng)手段保持上述組織或細胞周圍的第1物理化學(xué)環(huán)境的步驟；(B)用上述的觀察手段觀察上述第1物理化學(xué)環(huán)境中上述組織或細胞的第1物理化學(xué)特性的步驟；(C)用上述環(huán)境調(diào)整手段，將上述第1物理化學(xué)環(huán)境變?yōu)榈?物理化學(xué)環(huán)境的步驟；(D)用上述的觀察手段觀察上述第2物理化學(xué)環(huán)境中上述組織或細胞的第2物理化學(xué)特性的步驟；(E)用上述的比較手段，比較上述組織或細胞的上述第1物理化學(xué)特性與上述組織或細胞的上述第2物理化學(xué)特性的步驟。
3.權(quán)利要求2所述的方法，該方法包括將上述第1物理化學(xué)環(huán)境變?yōu)榈?物理化學(xué)環(huán)境的步驟是將上述細胞培養(yǎng)手段中使用的第1培養(yǎng)基置換為上述培養(yǎng)手段中使用的第2培養(yǎng)基。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中上述第1培養(yǎng)基和第2培養(yǎng)基含有任意濃度的一種或多種藥物。
5.包括下述(A)～(E)手段的組織或細胞的物理化學(xué)特性的測定裝置，它是變化生物組織或細胞周圍的物理化學(xué)環(huán)境以觀察對上述組織或細胞的物理化學(xué)特性的影響的裝置(A)培養(yǎng)上述組織或細胞，或者維持上述組織或細胞周圍的物理化學(xué)環(huán)境的細胞培養(yǎng)手段；(B)觀察上述組織或細胞在第1物理化學(xué)環(huán)境中的物理化學(xué)特性的手段；(C)為調(diào)整維持上述組織或細胞的物理化學(xué)環(huán)境的環(huán)境調(diào)整手段；(D)觀察用上述的環(huán)境調(diào)整手段，將第1物理化學(xué)環(huán)境變?yōu)榈?物理化學(xué)環(huán)境時上述組織或細胞物理化學(xué)特性的觀察手段；(E)將第1物理化學(xué)環(huán)境中上述組織或細胞的物理化學(xué)特性與第2物理化學(xué)環(huán)境中上述組織或細胞的物理化學(xué)特性相比較的手段。
6.權(quán)利要求5所述的裝置，其中上述環(huán)境調(diào)整手段包括向上述細胞培養(yǎng)手段中使用的培養(yǎng)基中加入化學(xué)物質(zhì)，微生物或病毒的手段，和將上述細胞培養(yǎng)手段中使用的含任意濃度的一種或多種化學(xué)物質(zhì)，微生物或病毒的第1培養(yǎng)基置換為在上述細胞培養(yǎng)手段中使用的含任意濃度的一種或多種化學(xué)物質(zhì)，微生物或病毒的第2培養(yǎng)基的手段。
7.權(quán)利要求5所述的裝置，其中上述的環(huán)境調(diào)整手段包括向上述的細胞培養(yǎng)手段中使用的培養(yǎng)基中加入物質(zhì)的手段以及將上述細胞培養(yǎng)手段中使用的第1培養(yǎng)基置換為在上述培養(yǎng)手段中使用的第2培養(yǎng)基的手段。
8.權(quán)利要求5所述的裝置，其中上述觀察手段是測定組織或細胞電生理學(xué)特性的電位測定裝置，該裝置包括(A)和(B)(A)在基板上備有多個微小電極，其上備有放置上述組織或細胞的細胞設(shè)置部，并備有給與上述微小電極電信號和從上述微小電極引出電信號的電連接手段的一體化細胞設(shè)置器；(B)用上述一體化細胞設(shè)置器的電連接手段進行連接，對上述組織或細胞的電生理學(xué)活動發(fā)出的信號進行處理的手段。
9.權(quán)利要求8所述的裝置，除了上述(A)和(B)之外，該裝置還包括下述(C)(C)用上述一體化細胞設(shè)置器的電連接手段進行連接，給予上述組織或細胞電刺激的手段。
10.權(quán)利要求8所述的裝置，通過制備多個上述的一體化細胞設(shè)置器，可以邊培養(yǎng)多個組織或細胞邊測定它們的物理化學(xué)特性。
11.權(quán)利要求10所述的裝置，包括對上述的多個一體化細胞設(shè)置器來說，對多個組織或細胞的物理化學(xué)環(huán)境可以進行個別調(diào)整的環(huán)境調(diào)整手段。
12.在上述組織或細胞中測定加入上述化學(xué)物質(zhì)，微生物或病毒時，上述組織或細胞的電特性或視覺特性，從這兩個參數(shù)來判斷加入的上述化學(xué)物質(zhì)，微生物或病毒對上述組織或細胞有無影響的藥物檢驗方法，其中備有檢測加入了化學(xué)物質(zhì)，微生物或病毒的組織或細胞的電特性的手段，或者從外部來觀察上述組織或細胞的視覺特性的圖像檢測手段。
13.一種藥品檢驗裝置，包括測定加入了化學(xué)物質(zhì)，微生物或病毒的組織或細胞的電特性的電測定部和測定上述組織或細胞的視覺特性的視覺特性檢測部，從電特性部及視覺特性檢測部的輸出結(jié)果測定上述藥物對上述組織或細胞的影響。
全文摘要
提供了測定生物組織或細胞物理化學(xué)特性的方法和裝置,該方法能根據(jù)實驗的目的任意改變組織或細胞周圍的物理化學(xué)環(huán)境。該裝置包括使生物組織或細胞周圍環(huán)境維持恒定的手段(40);任意改變物理化學(xué)環(huán)境的手段(50);測定上述組織或細胞物理化學(xué)特性的手段(10及20);比較物理化學(xué)環(huán)境變化前后組織或細胞物理化學(xué)特性的手段(30)。監(jiān)測手段(10)是測定組織或細胞電生理特性的電位測定裝置,它包括一體化細胞設(shè)置器(1),該設(shè)置器在基板上備有兩個或多個微小電極(11),細胞設(shè)置部(6)位于其上,用于放置上述的組織或細胞,其上還備有引線圖案(pattern)(12),它能給微電極(11)提供電信號并從微電極導(dǎo)出電信號。
文檔編號G01N33/50GK1183121SQ97190217
公開日1998年5月27日 申請日期1997年1月24日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月24日
發(fā)明者杉原宏和, 小林康, 岡弘章, 小川竜太, 竹谷誠 申請人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社