專(zhuān)利名稱(chēng)：使用參考微粒的分析法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及診斷領(lǐng)域，更具體地涉及使用分析方法在給定流體中檢測(cè)感興趣分析物。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)久以來(lái)，凝集反應(yīng)便被用于定性和定量地分析各種不同的細(xì)菌、細(xì)胞表面抗原、血清蛋白和臨床上感興趣的其他分析物。凝集作用通常是由抗體和有關(guān)抗原之間的反應(yīng)造成的，從而產(chǎn)生可用不同方式檢測(cè)和/或測(cè)量的聚集體。在典型的凝集分析方式中，先在諸如聚苯乙烯微粒(常稱(chēng)為“膠乳”)之類(lèi)的顆粒上涂覆一種能結(jié)合感興趣抗原的物質(zhì)，然后將涂覆后的顆粒與樣品(如血液或其他體液)混合。取決于具體的抗原，相互作用可能會(huì)導(dǎo)致顆粒相互凝集，或者可能阻礙凝集作用。在任何一種情況下，在顆粒與體液反應(yīng)之后所存在的凝集顆粒數(shù)目會(huì)顯示抗原的存在數(shù)目。通過(guò)添加與抗體結(jié)合的相應(yīng)抗原，從而發(fā)生凝集反應(yīng)，已將相同類(lèi)型的反應(yīng)用于檢測(cè)特異性抗體。
已開(kāi)發(fā)出了大量基于顆粒的免疫分析方法，它們利用抗原-抗體反應(yīng)的特異性并避免了與常規(guī)診斷方法(如發(fā)射化學(xué)標(biāo)記法)相關(guān)的問(wèn)題。例如，比濁法和濁度法監(jiān)測(cè)從大體積溶液(bulk solution)中眾多顆粒所散射的光線。前一技術(shù)測(cè)量通過(guò)顆粒聚集體懸浮液的透光性，而后一技術(shù)直接測(cè)量特定方向上的散射光。這些方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要分離步驟，但是僅在用于分析樣品中的單一分析物時(shí)它們才令人滿意。
已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了幾種使用光學(xué)流動(dòng)顆粒分析儀的凝集分析法，它們通過(guò)測(cè)量使用不同大小顆粒時(shí)的前向散射光，來(lái)感測(cè)聚集體的形成或非凝集化的程度。通過(guò)測(cè)定凝集的程度或者未反應(yīng)(即未凝集)顆粒的數(shù)目，可確定樣品中分析物的存在與否和/或數(shù)量。在授予Masson等人的美國(guó)專(zhuān)利No.4,279,617中所公開(kāi)的凝集分析法中，包括以下步驟將液體樣品與第一顆粒試劑混合，該第一顆粒試劑可與感興趣的抗原或抗體結(jié)合從而形成復(fù)合體；然后向混合物中加入第二種不同的顆粒試劑，該第二顆粒試劑會(huì)與復(fù)合體結(jié)合從而形成聚集體，但是不與游離的第一顆粒試劑結(jié)合。通過(guò)分析未凝集的第一或第二顆粒試劑，可以確定抗原或抗體的存在與否或數(shù)量。因此，為了進(jìn)行定性分析，′617號(hào)專(zhuān)利指出，僅需要計(jì)數(shù)在反應(yīng)混合物中仍處于游離狀態(tài)的第一試劑顆粒數(shù)目，然后將該數(shù)據(jù)與第一步驟中所加入的該顆粒數(shù)目加以比較。在較新的Meth.Enzymol.74106-141(1981)中出版的文章中，Masson等人新創(chuàng)了縮略詞PACIA(particle counting immunoassay，即顆粒計(jì)數(shù)免疫分析法)，來(lái)描述通過(guò)計(jì)數(shù)游離顆?；蛭捶磻?yīng)顆粒的數(shù)目來(lái)表明樣品中分析物是否存在的凝集分析法。Masson公開(kāi)了，可使用自動(dòng)計(jì)數(shù)儀來(lái)測(cè)量來(lái)自某一大小范圍內(nèi)非凝集顆粒的前向光散射，但排除所有其他顆粒的光散射。但是，PACIA法的用途很有限，尤其是因?yàn)榉翘禺愋阅磻?yīng)和類(lèi)風(fēng)濕因子干擾所造成的不準(zhǔn)確性。請(qǐng)參見(jiàn)Newman等人，Ann.Clin.Biochem.2922-42(1992)和Limet等人，J.Immunol.Meth.2825-32(1979)。
授予Cambiaso等人的美國(guó)專(zhuān)利No.4,184,849也指出了在凝集分析中使用光學(xué)計(jì)數(shù)系統(tǒng)如自動(dòng)計(jì)數(shù)儀，其中通過(guò)將樣品與兩種不同的顆粒試劑混合，這兩種顆粒試劑可相互凝集，但該凝集反應(yīng)可被待分析的特定抗體或抗原所抑制，從而檢測(cè)液體中是否存在抗體或抗原。通過(guò)測(cè)定凝集程度或非凝集程度，可以測(cè)定樣品中存在的抗原或抗體數(shù)量，非凝集程度可簡(jiǎn)單地計(jì)數(shù)非凝集顆粒的數(shù)目或使用鑒別性的標(biāo)記即可。
授予Uzgiris等人的美國(guó)專(zhuān)利No.4,191,739涉及一種凝集分析法，它通過(guò)用電阻脈沖分析(resistive pulse analysis)檢測(cè)具有某一大小的復(fù)合顆粒(multiplets)來(lái)確定樣品中蛋白質(zhì)的存在與否，其中該種顆粒是只有具有第一預(yù)定大小的顆粒與具有第二預(yù)定大小的顆粒凝集才能形成的。該方法聲稱(chēng)，通過(guò)考慮非特異形成的復(fù)合顆粒的最初分布情況，可提高分析的準(zhǔn)確度。
授予Cohen等人的美國(guó)專(zhuān)利No.4,851,329涉及一種凝集分析法，其中通過(guò)光學(xué)脈沖顆粒尺寸分析法確定凝集顆粒的團(tuán)粒尺寸分布。通過(guò)測(cè)量在一系列已知濃度的分析物稀釋液中顆粒二聚體數(shù)目與顆粒單體數(shù)目之比，或者其他任何團(tuán)粒尺寸分布的量度，可以建立標(biāo)準(zhǔn)的定量關(guān)系。
這些分析局限于單種分析物的分析。因此，仍需要一種凝集分析法，該分析法可同時(shí)測(cè)量給定樣品中的多種分析物，而且還通過(guò)減少稀釋誤差的效應(yīng)、儀器缺陷等對(duì)分析結(jié)果的影響來(lái)提高精確度。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面涉及檢測(cè)樣品中分析物是否存在的分析法，該方法包括下列步驟
(a)將樣品與預(yù)定數(shù)量或比例的測(cè)試微粒及參考微粒混合，以形成液體反應(yīng)混合物，其中在測(cè)試微粒上配置有(dispose)可結(jié)合分析物的結(jié)合分子，而參考微粒不與分析物和結(jié)合分子發(fā)生反應(yīng)，然后讓結(jié)合分子與分析物結(jié)合；(b)計(jì)數(shù)參考微粒和未反應(yīng)的測(cè)試微粒的數(shù)目；以及(c)將未反應(yīng)的測(cè)試微粒數(shù)目與參考微粒比較，得出測(cè)量值，從而確定樣品中分析物的存在與否。
較佳地，分析方法還包括步驟(d)將上述測(cè)量值與不含分析物的非反應(yīng)樣品的對(duì)照值進(jìn)行比較，在這種情況下通過(guò)計(jì)算測(cè)量值與對(duì)照值之間的變化值而確定樣品中分析物的存在與否。在一個(gè)更佳例子中，測(cè)量值是反應(yīng)后步驟(c)中未反應(yīng)測(cè)試微粒數(shù)目與參考微粒數(shù)目之比。在步驟(d)中的對(duì)照值，是對(duì)非反應(yīng)樣品采用相同程序而獲得的未反應(yīng)測(cè)試微粒數(shù)目與參考微粒數(shù)目之比。因此，對(duì)照值可稱(chēng)為“對(duì)照比值”，而測(cè)量值可稱(chēng)為“測(cè)量比值”。通過(guò)獲得對(duì)照比值與測(cè)量比值之間的差值，然后將該差值除以對(duì)照比值，可以計(jì)算出變化值。該結(jié)果也可以百分比表示。在一個(gè)更佳例子中，變化值是通過(guò)將對(duì)照比值除以測(cè)量比值而計(jì)算出的，而該結(jié)果也可以百分比表示。
根據(jù)本發(fā)明這一方面的方法，提供了顯著的優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)闇y(cè)量值和對(duì)照值代表的是未凝集顆粒的減少，而不是特定大小范圍內(nèi)顆粒凝集物的形成，所以基本上消除了形成稍大或稍小凝集物所造成的誤差。此外，因?yàn)闇y(cè)量值和對(duì)照值是作為未凝集的測(cè)試微粒數(shù)目與惰性參考微粒數(shù)目之間的相互關(guān)系計(jì)算出的(如上述的測(cè)量比值和對(duì)照比值)，因此，也基本上消除了因反應(yīng)混合物稀釋不準(zhǔn)確以及顆粒計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確所造成的誤差。該方法還提供了每種測(cè)試顆粒更高的分辨率，從而可同時(shí)進(jìn)行多種測(cè)量。它還降低了對(duì)大的顆粒聚集體進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)固有的不精確性。
參考微粒還提高了本發(fā)明分析方法的準(zhǔn)度和精度，因?yàn)樗鼈兛勺鳛榭傮w的表露性(on-board)診斷方法來(lái)評(píng)估儀器和分析方法本身。參考微粒所產(chǎn)生的響應(yīng)質(zhì)量如直方圖寬度或受檢微粒的速率(rate)，可表示系統(tǒng)的擾動(dòng)，包括系統(tǒng)的流體(如阻塞)、電學(xué)或光學(xué)特征。超過(guò)預(yù)定任意數(shù)值的參考微粒的聚集化，如二聚化、三聚化等，可表示測(cè)試微粒的非特異性結(jié)合。參考微粒還進(jìn)一步提高了稀釋準(zhǔn)確度(它是計(jì)數(shù)速率的函數(shù))。它們可鑒別出或解釋諸如系統(tǒng)漂移之類(lèi)的現(xiàn)象。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及檢測(cè)樣品中至少2種分析物是否存在的分析法，該方法包括下列步驟(a)將樣品與預(yù)定數(shù)量或比例的第一測(cè)試微粒、第二測(cè)試微粒及參考微?；旌弦孕纬煞磻?yīng)混合物，其中在第一測(cè)試微粒上配置有可結(jié)合第一分析物的第一結(jié)合分子，在第二測(cè)試微粒上配置有可結(jié)合第二分析物的第二結(jié)合分子，而參考微粒不與第一和第二分析物以及第一和第二結(jié)合分子發(fā)生反應(yīng)，然后讓第一結(jié)合分子與第一分析物結(jié)合，讓第二結(jié)合分子與第二分析物結(jié)合；(b)計(jì)數(shù)未反應(yīng)的第一測(cè)試微粒、未反應(yīng)的第二測(cè)試微粒和參考微粒的數(shù)目；以及(c)將未反應(yīng)的第一測(cè)試微粒數(shù)目與參考微粒比較，得出第一測(cè)量值，并將未反應(yīng)的第二測(cè)試微粒數(shù)目與參考微粒比較，得出第二測(cè)量值，從而確定樣品中第一和第二分析物的存在與否。
較佳地，分析方法還包括步驟(d)將第一測(cè)量值與非反應(yīng)樣品(該樣品不含第一分析物)的第一對(duì)照值進(jìn)行比較以確定樣品中第一分析物的存在與否，并將第二測(cè)量值與非反應(yīng)樣品(該樣品不含第二分析物)的第二對(duì)照值進(jìn)行比較以確定樣品中第二分析物的存在與否。該分析法可對(duì)單一樣品同時(shí)進(jìn)行多分析物分析，并提供上面論述的優(yōu)點(diǎn)。如果需要測(cè)量2種以上的分析物，可以使用額外的測(cè)試微粒。
另一方面，本發(fā)明涉及一種在檢測(cè)樣品中分析物是否存在的分析法中使用的試劑盒。該試劑盒包括下列組份(a)測(cè)試微粒，在測(cè)試微粒上配置有可結(jié)合分析物的結(jié)合分子；和(b)參考微粒，參考微粒不與分析物、測(cè)試微粒和結(jié)合分子反應(yīng)；其中測(cè)試微粒和參考微粒以預(yù)定數(shù)量或比例位于該試劑盒的每個(gè)反應(yīng)容器中。
還提供了用于檢測(cè)樣品中是否存在多種分析物的試劑盒，該試劑盒包括下列組份(a)第一測(cè)試微粒，在第一測(cè)試微粒上配置有可結(jié)合第一分析物的第一結(jié)合分子；(b)第二測(cè)試微粒，在第二測(cè)試微粒上配置有可結(jié)合第二分析物的第二結(jié)合分子；和(c)參考微粒，該參考微粒不與第一和第二分析物、第一和第二測(cè)試微粒以及第一和第二結(jié)合分子反應(yīng)；其中第一和第二測(cè)試微粒及參考微粒以預(yù)定數(shù)量或比例位于該試劑盒的每個(gè)反應(yīng)容器中。
在優(yōu)選例子中，微粒以干燥形式提供，并被合適地包裝起來(lái)以便與樣品混合。例如，可將預(yù)定數(shù)量的每種干微粒獨(dú)立地放置在多凹腔密封容器的凹腔中，當(dāng)向容器中加入流體樣品時(shí)會(huì)導(dǎo)致干微粒重組(reconstitution)并形成反應(yīng)混合物，從而允許分析物和各自結(jié)合分子之間發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。干微粒還可以組合物形式混合提供，一旦與樣品流體接觸便會(huì)重組。
本發(fā)明的分析法可有利地用于確定各種不同分析物的存在與否，如對(duì)風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒(HSV)、梅毒、巨細(xì)胞病毒和弓形體特異的抗體?？煞治龈鞣N不同樣品，其中包括血液和其他流體如血清、血漿、唾液、腦脊液(CSF)、尿液和固體的洗出液(eluate)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是在其中實(shí)施本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選例子的多凹腔容器的剖面圖。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明涉及分析樣品以檢測(cè)感興趣分析物是否存在的方法。術(shù)語(yǔ)“樣品”指可能含有感興趣分析物的生物流體如血液、血漿、血清、唾液、CSF、和尿液，以及其他類(lèi)型的流體、細(xì)胞或材料?！凹?xì)胞”指從身體器官或其他組織(如腫瘤)獲得的任何樣品，可用其制備細(xì)胞懸浮液。術(shù)語(yǔ)“分析物”指這樣的任何物質(zhì)；對(duì)于該物質(zhì)存在特異性的結(jié)合物(即結(jié)合分析物的結(jié)合分子)，或者對(duì)于該物質(zhì)可制備特異性的結(jié)合物，并且該物質(zhì)在分析中會(huì)與特異性結(jié)合物發(fā)生結(jié)合。代表性的分析物包括抗原、半抗原、抗體及其組合形式，包括蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、激素、類(lèi)固醇、維生素、藥物、核酸及其代謝產(chǎn)物。可用本發(fā)明方法檢測(cè)的有關(guān)抗體、抗原或核酸包括一旦與結(jié)合分子接觸或反應(yīng)能夠凝集的任何抗體、抗原或核酸，尤其是那些存在于生物樣品中就表明炎癥或疾病狀態(tài)的抗體和抗原。代表性的抗體包括抗風(fēng)疹病毒抗體、抗-HSV I抗體、抗梅毒抗體、抗巨細(xì)胞病毒抗體、抗弓形體抗體、抗真菌抗體、抗寄生蟲(chóng)抗體和抗-HIV抗體。代表性的感興趣抗原包括蛋白質(zhì)，比如激素如TSH、HCG、T4，糖蛋白，藥物和微生物(如細(xì)菌、病毒和原生動(dòng)物，以及它們的抗原片段如HBsAg。術(shù)語(yǔ)“半抗原”指一種低分子量的、有生理活性的物質(zhì)，它單獨(dú)時(shí)不能在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生抗體應(yīng)答反應(yīng)，但是結(jié)合于本身有免疫原性的物質(zhì)時(shí)就能夠產(chǎn)生抗體并與該抗體反應(yīng)。典型的半抗原包括藥物如雄激素、雌激素、孕激素、腎上腺皮質(zhì)激素、甲狀腺激素、生理活性胺、藥物等，以及它們的代謝副產(chǎn)物。詞語(yǔ)“結(jié)合分析物的結(jié)合分子”指特異性結(jié)合配對(duì)物中的一個(gè)成員，其中，配對(duì)物的一個(gè)分子可通過(guò)化學(xué)或物理方式特異性地結(jié)合于第二個(gè)分子，并且與其他物質(zhì)沒(méi)有交叉反應(yīng)。典型的結(jié)合分子包括抗原、抗原片段、受體、核酸、多克隆或單克隆抗體、以及它們的片段或復(fù)合物。這種對(duì)某一分析物特異的結(jié)合分子可通過(guò)市售渠道獲得，或者用標(biāo)準(zhǔn)程序制得。
為了實(shí)施本發(fā)明的分析法，首先需要提供在上面配置有與分析物結(jié)合的結(jié)合分子的微粒(以下稱(chēng)為“測(cè)試微?！?，以及對(duì)分析物和結(jié)合分子基本上惰性(即不反應(yīng))的微粒(以下稱(chēng)為“參考微粒”)。測(cè)試微?？捎萌魏翁烊坏幕蚝铣傻?、能夠在上面配置配置結(jié)合分子(如抗原或抗體)的材料制備，這樣的材料包括玻璃；丙烯酰胺或甲基丙烯酸酯；尼龍；微觀氧化物粉末；膠乳聚合物材料和它們的磁性衍生物，如烯屬不飽和單體的聚合物比如聚苯乙烯、丙烯腈和聚丁二烯以及它們的衍生物和共聚物(參見(jiàn)例如Bangs，L.B.，Uniform Latex Particle，Seragen，Indianapolis，1984和美國(guó)專(zhuān)利No.4,305,925)；葡聚糖；纖維素及其衍生物；以及天然顆粒物質(zhì)如紅細(xì)胞、花粉、脂質(zhì)體和細(xì)菌。參考顆?？捎门c測(cè)試顆粒相同或不同的材料制成。同樣，參考顆粒應(yīng)對(duì)配置在測(cè)試顆粒上的結(jié)合分子及分析物基本上惰性(即不反應(yīng))?？赏ㄟ^(guò)已知程序如化學(xué)處理而賦予參考顆粒惰性。優(yōu)選的用于參考顆粒的材料列于上面。
在優(yōu)選例子中，選擇測(cè)試微粒和參考微粒的化學(xué)構(gòu)成和/或尺寸，以使它們?cè)跈z測(cè)器的靈敏度水平和選定的計(jì)數(shù)未反應(yīng)(即未凝集)的測(cè)試微粒和參考微粒的方式下能彼此分辨開(kāi)。但應(yīng)理解，能夠產(chǎn)生均一的檢測(cè)器響應(yīng)的任何其他特性或可測(cè)量的特征都可提供合適而可靠的基礎(chǔ)，并在此基礎(chǔ)上選擇微粒用于所公開(kāi)的分析方法。較佳地，每個(gè)測(cè)試微粒和參考微粒都大小均一。在顆粒是通過(guò)基于粒徑而分辨不同顆粒的技術(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的場(chǎng)合，如在電子計(jì)數(shù)法和各種光學(xué)計(jì)數(shù)法中，測(cè)試顆粒和參考顆粒應(yīng)大小不同。同樣，在使用數(shù)種不同測(cè)試顆粒的場(chǎng)合，如在同時(shí)檢測(cè)某一樣品中是否存在多種分析物的凝集分析中，顆粒也可大小不同。一般，載體微粒的大小約為0.1μ-20μ。而參考微粒的大小約為0.1μ-20μ。這些大小范圍也取決于所用的計(jì)數(shù)技術(shù)和結(jié)合分子的性質(zhì)。采用光學(xué)計(jì)數(shù)技術(shù)分析，還可根據(jù)各自的折光率而分辨或區(qū)分測(cè)試微粒和參考微粒。眾所周知，不同組成的顆粒在不同方向上散射光的情況會(huì)不同。參見(jiàn)，M.Kerker，《光和其他電磁輻射的散射》(The Scattering of Light and Other Electromagnetic Radiation)，Academic Press，N.Y.1969，和授予Hansen等人的美國(guó)專(zhuān)利No.5,369,037。
可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如物理(被動(dòng))吸附法、易化(facilitated)(加強(qiáng))吸附法和共價(jià)偶聯(lián)法，將結(jié)合分子配置在測(cè)試顆粒上。例如，可通過(guò)用能連接蛋白質(zhì)的化學(xué)官能團(tuán)進(jìn)行改性，而將結(jié)合分子共價(jià)地偶聯(lián)于測(cè)試微粒表面。美國(guó)專(zhuān)利No.4,064,080公開(kāi)了具有末端氨基苯基基團(tuán)的苯乙烯聚合物，以及連接于該聚合物的蛋白質(zhì)。美國(guó)專(zhuān)利No.4,181,636指出了通過(guò)水溶性激活劑偶聯(lián)至免疫活性材料上的羧化的膠乳聚合物。美國(guó)專(zhuān)利No.4,210,723指出了一種外殼-核心式的膠乳聚合物顆粒，其直徑為0.15-1.5微米且在顆粒表面上有自由的環(huán)氧基。美國(guó)專(zhuān)利No.4,264,766涉及一種膠乳聚合物，它具有諸如羧基和氨基之類(lèi)的活性基團(tuán)，水溶性的多羥基化合物可共價(jià)連接在這些基團(tuán)上，而且用與活性試劑(如碳化二亞胺)處理后，這些基團(tuán)可共價(jià)偶聯(lián)于免疫活性物質(zhì)。還可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.4,521,521和4,305,925?？墒褂眠@些專(zhuān)利中公開(kāi)的技術(shù)，將結(jié)合分子連接于測(cè)試微粒。在測(cè)試微粒是聚苯乙烯顆粒的優(yōu)選例子中，可用各種其他官能團(tuán)如羥基、羧基、胺、丙烯酰胺、和聚合物型羧酸根等，在顆粒表面上替換穩(wěn)定顆粒的硫酸根帶電基團(tuán)，從而有利于結(jié)合分子配置(如涂覆或吸附)在微粒表面上。還可參見(jiàn)SeamanG.V.F.(編輯)Latex Based Technology in Diagnostics，Health & ScienceCommunications，Washington，D.C.20005(1990)。涂有結(jié)合分子的測(cè)試微粒也可購(gòu)得。
測(cè)試微粒和參考微粒宜包裝在一起，以方便在測(cè)試中使用。一種優(yōu)選的包裝是圖1所示的杯子。杯子10由分別具有內(nèi)表面13和外表面13′的壁12構(gòu)成。杯子10宜由惰性聚合物材料如聚丙烯、聚乙烯或其他合適的熱塑性材料制成。內(nèi)表面13的底部具有凹槽或腔14和16，其中分別含有干測(cè)試微粒14′和參考微粒16′。杯子用可剝離或可穿刺的密封件19加以封閉，密封件19可以是熱封的金屬箔或其他膜?？稍诟稍镏髮⑽⒘Ｖ糜诎记恢?。更佳地，微?？梢詽{料形式裝入各凹腔中，然后在凹腔中就地干燥。在干燥之前，各保持著微粒使其相互隔開(kāi)。在干燥之后搬動(dòng)杯子時(shí)，微粒可相互混合，但是這種混合在沒(méi)有液體介質(zhì)的情況下是不會(huì)引發(fā)反應(yīng)的。然而，本發(fā)明的例子并不局限于上面所敘述的特征。將各種測(cè)試微粒和參考微粒隔開(kāi)(如放置在獨(dú)立的各自凹腔中)并不是必需的。在沒(méi)有凹槽或凹腔的容器中進(jìn)行分析測(cè)試甚至是更佳的。此外，微粒也可以液體形式提供。
然后在合適的條件下，將可能含有有關(guān)分析物的樣品與預(yù)定數(shù)量的測(cè)試微粒(其上配置有結(jié)合分析物的結(jié)合分子)及參考微?；旌?，以形成液體反應(yīng)混合物并讓結(jié)合分子與分析物之間發(fā)生可測(cè)量的反應(yīng)。如果樣品本身是液態(tài)，那么可將微粒加入樣品，反之亦然。作為替換形式或額外形式，樣品和微粒也可與液態(tài)稀釋劑(通常是水性稀釋劑)混合。在一個(gè)優(yōu)選例子中，反應(yīng)是在圖1所示的容器中進(jìn)行的。為了進(jìn)行反應(yīng)，將封蓋19刺穿，或者從杯子凸緣18上取下。接著通過(guò)加入待測(cè)試的樣品(可有或沒(méi)有水性稀釋劑)，并適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行分散和拌合操作如攪拌和搖晃而重組微粒。任選地，可對(duì)重組的微粒進(jìn)行超聲波處理。
取決于分析物的性質(zhì)以及所用的樣品和微粒的數(shù)量等因素，反應(yīng)通常約為1分鐘-2小時(shí)。一旦讓可測(cè)量的反應(yīng)進(jìn)行了，則可計(jì)數(shù)未反應(yīng)的測(cè)試微粒和參考微粒并相互比較以得到測(cè)試值。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例子中，微粒是用細(xì)胞計(jì)量術(shù)計(jì)數(shù)的讓?xiě)腋∫和ㄟ^(guò)電子的或化學(xué)的流動(dòng)顆粒分析儀(FPA)，該儀器可通過(guò)監(jiān)測(cè)各顆?；蚱渚奂w(當(dāng)它們各自通過(guò)電子或光學(xué)感測(cè)區(qū)時(shí))的大小而檢測(cè)顆粒凝集情況。電子型FPA一般測(cè)量反應(yīng)混合物的電阻抗，即讓反應(yīng)混合物通過(guò)一狹窄的小口(orifice)然后測(cè)量通過(guò)小口的電阻抗。當(dāng)混合物中的液體是導(dǎo)電的而顆粒是不導(dǎo)電的情況下，當(dāng)顆?；蝾w粒團(tuán)聚物(agglomerate)通過(guò)小口時(shí)，橫跨小口的電阻抗會(huì)增加。增加的程度與微?；蚰锏拇笮≈苯酉嚓P(guān)，而且代表不同大小顆粒的信號(hào)可相互分開(kāi)。
如下所述，光學(xué)FPA通過(guò)測(cè)量各微粒光散射的不同性質(zhì)來(lái)區(qū)分微粒凝集體的粒徑和形成情況。光學(xué)FPA的例子公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利No.4,279,617、4,184,849、4,1919,739、5,286,452、5,369,037、以及未審定的共同擁有的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)08/473,187中。使用光學(xué)FPA，尤其是那些公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利No.5,286,452、5,369,037、和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)08/473,187中的FPA，是優(yōu)選的。在該例子中，未反應(yīng)的測(cè)試微粒和參考微?？筛鶕?jù)大小和/或折射率、熒光或吸光度而加以區(qū)分。
如上所述，用于計(jì)數(shù)不同類(lèi)型的微粒和微粒凝集體的技術(shù)是眾所周知的，因而并不是本發(fā)明的組成部分。然而，為了便于理解，在下面描述了用FPA進(jìn)行的顆粒計(jì)數(shù)和分類(lèi)。為了用光學(xué)FPA進(jìn)行本發(fā)明分析方法，讓反應(yīng)混合物的細(xì)流通過(guò)流通池(flow cell)，并用一束來(lái)自入射光源(如激光)的光線照射該流通池。選擇流動(dòng)流形式和光束形式，使得各微?；蚋魑⒘Ｄw一個(gè)接一個(gè)地通過(guò)光束，而且任何時(shí)候只有一個(gè)微?；蚰w處于光束之中。當(dāng)各微?；蚰w通過(guò)入射光束時(shí)所散射、反射和發(fā)射出的光線，被合適的傳感器所檢測(cè)，從而產(chǎn)生各微?；蚰w的信號(hào)。不同類(lèi)型微粒和凝集體的各自信號(hào)特征是不同的。按具體類(lèi)型微粒或凝集體的特有信號(hào)進(jìn)行歸類(lèi)，從而計(jì)數(shù)出不同類(lèi)型的微?；蚰w。例如，在光散射FPA中，由各微粒或凝集體所產(chǎn)生的散射光強(qiáng)度與顆?；驁F(tuán)聚體的大小直接相關(guān)，而且與微?；蚰w的折射率直接相關(guān)。因此，在某一強(qiáng)度范圍內(nèi)的散射光信號(hào)表示單個(gè)的非凝集的測(cè)試微粒，而另一范圍內(nèi)的信號(hào)表示非凝集的參考微粒。通過(guò)計(jì)數(shù)各范圍內(nèi)的信號(hào)，可以計(jì)數(shù)出反應(yīng)混合物中未凝集測(cè)試微粒和未凝集參考微粒的數(shù)目。在另一個(gè)光強(qiáng)度范圍內(nèi)的信號(hào)表示2個(gè)測(cè)試微粒構(gòu)成的凝集體(即二聚體)；在另外一個(gè)范圍內(nèi)的信號(hào)表示3個(gè)或更多個(gè)測(cè)試微粒構(gòu)成的凝集體(即三聚體或多聚體)。在另一個(gè)光強(qiáng)度范圍內(nèi)的信號(hào)表示2個(gè)參考微粒構(gòu)成的凝集體(即二聚體)；在另外一個(gè)范圍內(nèi)的信號(hào)表示3個(gè)參考微粒構(gòu)成的凝集體(即三聚體等，統(tǒng)稱(chēng)為自我凝集體)。用這種方式，還可以通過(guò)計(jì)數(shù)出處于自我凝集體如二聚體和三聚體形式的微粒，而確定測(cè)試微粒和參考微粒的數(shù)目。
信號(hào)的分類(lèi)和計(jì)數(shù)程序可通過(guò)確定一個(gè)統(tǒng)計(jì)分布而進(jìn)行，如基于各種類(lèi)型微粒所產(chǎn)生的光散射的某一具體特征(如脈沖高度)的直方圖。直方圖通過(guò)生成微粒的頻數(shù)分布，可作為FPA所檢測(cè)到的微粒類(lèi)型和數(shù)目的統(tǒng)計(jì)總結(jié)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例子中，用模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)換器將各受照射微粒產(chǎn)生的脈沖峰高度數(shù)字化，然后將大于某一任意確定的數(shù)值(例如為了消除因噪音而造成的假信號(hào))的每個(gè)數(shù)字化數(shù)值(如以伏特表示)傳輸給計(jì)算機(jī)程序，從而得到直方圖。該步驟可用合適的收集方式完成，如用涉及至少一個(gè)數(shù)據(jù)收集周期的直接存儲(chǔ)器存取。程序?qū)⑿盘?hào)數(shù)作為數(shù)字化值(如伏特)的函數(shù)畫(huà)出。為每種類(lèi)型的微?；蚰w確定一個(gè)涵蓋脈沖高度值預(yù)期散布的窗(window)或范圍。可修改收集方式以便為每個(gè)窗建立預(yù)定數(shù)目的計(jì)數(shù)。在一個(gè)更佳例子中，一旦得到直方圖，那么就可以通過(guò)建立預(yù)定的窗或通過(guò)自動(dòng)峰值搜索分類(lèi)而確定不同的微粒數(shù)目。上述關(guān)于FPA操作和顆粒分類(lèi)及計(jì)數(shù)技術(shù)的描述，僅僅是代表性的。有另一些FPA技術(shù)基于除散射光之外信號(hào)，如熒光顆粒發(fā)射出的光線或微粒反射的光線。還有其他一些技術(shù)使用特征組合來(lái)區(qū)分信號(hào)，如各顆粒發(fā)射的熒光和該顆粒散射光之間的關(guān)系。任何一種已知的用于計(jì)數(shù)和分類(lèi)微粒的技術(shù)都可使用。
然后計(jì)數(shù)位于未反應(yīng)的測(cè)試微粒窗和參考微粒窗中的次數(shù)(即各數(shù)據(jù)點(diǎn))的總數(shù)。在發(fā)生參考微粒非特異性凝集的情況下，還可通過(guò)計(jì)數(shù)這類(lèi)凝集體并乘上每種類(lèi)型中各參考微粒的數(shù)目，而進(jìn)一步提高分析準(zhǔn)確度。
然后將未反應(yīng)測(cè)試微粒的數(shù)目與參考微粒的數(shù)目進(jìn)行比較，得出測(cè)試值。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例子中，測(cè)量值是未反應(yīng)的測(cè)試微粒數(shù)目與參考微粒數(shù)目的比值。但是，也可使用基于這兩個(gè)數(shù)目的其他測(cè)量值，如未凝集的測(cè)試微粒數(shù)目和參考微粒數(shù)目之間的差值。在一個(gè)優(yōu)選例子中，將測(cè)量值與非反應(yīng)樣品(不含分析物)的對(duì)照值進(jìn)行比較(該對(duì)照值是用相同的上述程序測(cè)定的)，然后根據(jù)測(cè)量值和對(duì)照值計(jì)算出變化值。在一個(gè)較佳例子中，計(jì)算出的變化值是以百分比表示的測(cè)試微粒的下降值(相對(duì)于最初的預(yù)定的粒子數(shù))。根據(jù)該優(yōu)選例子(其中測(cè)量值和對(duì)照值為比值)，用對(duì)照比值減去測(cè)量比值，再將差值除以對(duì)照比值，并乘以100，從而得到變化比值。在本發(fā)明的一個(gè)更佳例子中，用對(duì)照比值除以測(cè)量比值而得到變化比值，這樣對(duì)于含有更多數(shù)量分析物的樣品變化比值就增大?？蓪⒆兓蹬c根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序(如測(cè)試已知的陽(yáng)性和陰性樣品)而得的閾值相比較。例如，如果變化值大于上閾值，那么就認(rèn)為分析為陽(yáng)性而且證實(shí)流體樣品中存在分析物。相反，低于下閾值的變化值就表示陰性結(jié)果。
本發(fā)明分析法還可用于檢測(cè)給定樣品中的多種分析物。為了以這種形式進(jìn)行分析，需要提供對(duì)每種待檢測(cè)分析物具有特異作用并可相互分辨的測(cè)試微粒，以及用于給定計(jì)數(shù)方法的參考微粒。例如，在檢測(cè)樣品中是否存在2種分析物的分析方法中，需要提供第一測(cè)試微粒、第二測(cè)試微粒和參考微粒，其中在第一測(cè)試微粒上配置有可結(jié)合第一分析物的第一結(jié)合分子，在第二測(cè)試微粒上配置有可結(jié)合第二分析物的第二結(jié)合分子。對(duì)于每種不同的未反應(yīng)測(cè)試微粒的測(cè)量值，可根據(jù)同一參考微粒數(shù)目而計(jì)算出。
與測(cè)定單一分析物的情況相同，可將用于多分析物分析法的試劑各自加工成干粉末或片劑，或者混合形成組合物。另外地或額外地，試劑還可被包裝在測(cè)試盒中，該測(cè)試盒可包括適用于在與樣品和任選的物質(zhì)(如液態(tài)稀釋劑等)混合后重組微粒，并且進(jìn)行結(jié)合分子-分析物反應(yīng)的容器。
在本發(fā)明的上述優(yōu)選的、涉及使用光學(xué)細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析樣品的例子中，可將微?；蚰w產(chǎn)生的散射光的峰高度用作判據(jù)，來(lái)區(qū)分屬于特定類(lèi)型的微粒或凝集體，如未反應(yīng)的測(cè)試微粒、參考微粒、測(cè)試微粒的凝集體等。也可使用其他的光散射性質(zhì)，包括脈沖振幅、脈沖寬度、脈沖振幅與寬度的乘積、積分脈沖面積、或者在相同或不同散射角處這些參數(shù)其他線性或非線性函數(shù)。由通過(guò)FPA的每種類(lèi)型顆粒所產(chǎn)生的光散射信號(hào)，可在前向低角度(即與入射光束軸成約3-7度)、成約85-95度(即基本上為側(cè)散射信號(hào))、或成約95-180度(即反向散射信號(hào))的位置加以測(cè)量。
然而更常見(jiàn)地，也可這樣實(shí)施本發(fā)明方法，其中未反應(yīng)的測(cè)試微粒和參考微粒是通過(guò)測(cè)量反應(yīng)混合物的電特性而計(jì)數(shù)的，如電阻-脈沖(阻抗)、電容或電阻。阻抗-脈沖技術(shù)是將顆粒懸浮在電解質(zhì)溶劑中，使得進(jìn)入孔的每個(gè)顆粒取代了一部分溶劑，從而造成孔導(dǎo)電率的改變。因?yàn)閷?dǎo)電率的改變與顆粒體積大小成比例，因此通過(guò)讓成千上萬(wàn)的顆粒通過(guò)孔，可以累積得到樣品的大小分布。因?yàn)闇y(cè)量及隨后的信號(hào)處理是很快速的，所以可在短時(shí)間內(nèi)(通常為數(shù)分鐘)獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的分布。請(qǐng)參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利No.4,191,739。在美國(guó)專(zhuān)利No.4,072,576中公開(kāi)了基于電容的分析系統(tǒng)的一種例子?；陬w粒電測(cè)量值的其他分析系統(tǒng)公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利No.5,284,748。本發(fā)明方法還可用非細(xì)胞計(jì)量術(shù)技術(shù)(如圖像分析)進(jìn)行。
如上所述，并不需要計(jì)數(shù)測(cè)試微粒的凝集體；有關(guān)凝集程度的信息，是根據(jù)反應(yīng)后留下的未凝集的測(cè)試微粒并與參考微粒數(shù)目比較而得出的。然而，如果計(jì)數(shù)凝集體，那么該計(jì)數(shù)可用作分析方法的交叉核對(duì)措施。因此，如果反應(yīng)后混合物中未凝集的測(cè)試微粒與參考微粒之比顯著低于不反應(yīng)的對(duì)照混合物中的相應(yīng)比例(這就表明測(cè)試微粒發(fā)生了明顯的凝集)，那么凝集微粒的計(jì)數(shù)就應(yīng)高。如果不是，就表明計(jì)算機(jī)給出了錯(cuò)誤信號(hào)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于闡述目的，而不起限制作用，除非另外說(shuō)明。
實(shí)施例實(shí)施例1同時(shí)檢測(cè)對(duì)鼠弓形體(Toxoplasma gondii)、風(fēng)疹病毒和巨細(xì)胞病毒(CMV)特異的抗體的分析分析試劑的制備從Interfacial Dynamics，Inc.(Portland，OR)獲得直徑為1.1微米、1.6微米、1.7微米、和1.9微米的聚苯乙烯膠乳顆粒。鼠弓形體、風(fēng)疹病毒和CMV抗原分別從Ross Southern Laboratories(Salt Lake City，UT)、Viral Antigens，Inc.(Memphis，TN)、和Advanced Biotechnologies(Columbia，MD)購(gòu)得。3種抗原用洗滌劑進(jìn)行破碎，超聲波處理，并如下用pH9.6的碳酸鹽/碳酸氫鹽溶液進(jìn)行稀釋弓形體抗原稀釋為50微克/毫升；風(fēng)疹病毒稀釋為10微克/毫升；而CMV稀釋為50微克/毫升。將洗滌過(guò)的聚苯乙烯顆粒以2％(w/v)濃度懸浮在相同的緩沖液中，并混入相同份數(shù)的顆粒和抗原，即1.6微米顆粒與弓形體溶液、1.7微米顆粒與風(fēng)疹病毒溶液、以及1.9微米顆粒與CMV溶液?；旌衔镌谑覝叵禄蝿?dòng)，即對(duì)弓形體和風(fēng)疹病毒晃動(dòng)2小時(shí)而對(duì)CMV晃動(dòng)1小時(shí)。過(guò)多的抗原通過(guò)離心法去除，3種涂覆后的顆粒懸浮液，每種都在0.1M甘氨酸pH7.0、0.1％BSA、5％蔗糖和0.1％疊氮化鈉中洗滌3次。洗滌后的顆粒以1％(w/v)再懸浮于相同的緩沖液中。
為了制備內(nèi)部參考顆粒(IRP)，將1.1微米聚苯乙烯顆粒加以洗滌并再懸浮在0.1％SDS中，然后晃動(dòng)1.5小時(shí)。接著在碳酸鹽/碳酸氫鹽溶液中洗滌3次，并在0.1M甘氨酸pH7.0、0.1％BSA、5％蔗糖和0.1％疊氮化鈉中洗滌3次，再以1％(w/v)濃度再懸浮于相同的緩沖液中。
然后在各杯子中干燥4種涂覆顆粒的混合物。先用超聲波短暫地處理每種涂覆顆粒以便分開(kāi)聚集體，然后制備4種類(lèi)型顆粒的混合物。對(duì)于每個(gè)待用杯子，混合下列份數(shù)的1％(w/v)涂覆顆粒懸浮液IRP為3.5微升；弓形體為15微升；風(fēng)疹病毒為10微升以及CMV為20微升。離心處理該混合物，從而將混合物濃縮至20微升/杯，以供使用。然后用超聲波短暫地處理混合物以便分開(kāi)聚集體。然后將20微升的混合物加入每個(gè)1500CC的杯子。
含有顆?；旌衔锏谋釉?7℃真空爐中干燥過(guò)夜。然后在杯子被密封之前，在每個(gè)杯子中放一根金屬攪拌棒。密封后的杯子儲(chǔ)藏在室溫下，以供使用。
為了進(jìn)行分析，將所需數(shù)目的杯子置于CopalisTMOne免疫分析儀器上(每次最多可放24只杯子)。用儀器刺穿杯子封蓋，加入180微升反應(yīng)緩沖液(0.5M溴化鉀、0.1M甘油、pH9.0、1％BSA、0.2％疊氮化鈉、1.5％聚乙二醇，MW6000-8000)。用該設(shè)備短暫地超聲波處理各杯子以便分開(kāi)聚集體，然后將待測(cè)試樣品(20微升人血清或?qū)φ瘴镔|(zhì))加入每個(gè)杯子中。對(duì)照物是已知存在或不存在鼠弓形體、風(fēng)疹病毒和CMV特異性抗體的樣品。一個(gè)沒(méi)有反應(yīng)性的樣品(1％β-乳球蛋白)，被用于獲得下面分析章節(jié)所討論的陰性反應(yīng)對(duì)照計(jì)數(shù)。當(dāng)樣品加入各杯子時(shí)，儀器就開(kāi)始使該杯中攪拌棒運(yùn)動(dòng)，從而開(kāi)始10分鐘的保溫期。
數(shù)據(jù)分析在每個(gè)杯子中的物質(zhì)被攪拌10分鐘之后，儀器從每個(gè)杯子中取出一份樣品。對(duì)于弓形體(在表1中為“A”)、風(fēng)疹(“B”)和CMV(“C”)，都相對(duì)內(nèi)部參考微粒，計(jì)數(shù)剩下的未反應(yīng)顆粒(即單體)的數(shù)目，當(dāng)計(jì)數(shù)到10,000個(gè)內(nèi)部參考微粒時(shí)，就結(jié)束每個(gè)杯子中對(duì)未反應(yīng)測(cè)試微粒的計(jì)數(shù)工作。用這些數(shù)目進(jìn)行表1中所列的計(jì)算。
表1

×100＝鼠弓形體抗體存在情況的數(shù)據(jù)

×100＝風(fēng)疹抗體存在情況的數(shù)據(jù)

×100＝CMV抗體存在情況的數(shù)據(jù)用數(shù)種已知的抗體陰性或抗體陽(yáng)性樣品進(jìn)行相同的程序，以便為3種抗體測(cè)試中的每一種建立截止值(cutoff)或閾值。對(duì)于鼠弓形體、風(fēng)疹病毒和CMV的截止值列于表2。
表2<

根據(jù)截?cái)嘀颠M(jìn)行解釋?zhuān)瑢⑽粗獦悠返慕Y(jié)果列于表3。
表3

說(shuō)明1.用商業(yè)化的，用于檢測(cè)鼠弓形體、風(fēng)疹病毒和CMV抗體的測(cè)試方法加以測(cè)試，而確定了這些樣品的確切的抗體狀況。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明主要可被用作診斷工具來(lái)鑒別感染或疾病。因此，它可被相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)測(cè)試人士如醫(yī)務(wù)檢驗(yàn)人員有利地使用，以確定生物流體中分析物的存在與否。本發(fā)明還可用于從其他來(lái)源如環(huán)境中取得的流體樣品。
所有在本說(shuō)明書(shū)中提到的出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)代表了本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中技術(shù)人員的水平。所有這些出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)都在此引用作為參考，就好象每篇出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)被具體地和單獨(dú)地指明被引用作為參考。
此處所描述的本發(fā)明的各種變動(dòng)形式對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。這些變動(dòng)形式也在所附權(quán)利要求限定的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定樣品中分析物是否存在的分析方法，其特征在于，該方法包括下列步驟(a)將樣品與預(yù)定數(shù)量的測(cè)試微粒及參考微?；旌?，以形成反應(yīng)混合物，其中在測(cè)試微粒上配置有可結(jié)合分析物的結(jié)合分子，而參考微粒不與分析物和結(jié)合分子發(fā)生反應(yīng)，然后讓結(jié)合分子與分析物結(jié)合；(b)計(jì)數(shù)未反應(yīng)的測(cè)試微粒和參考微粒的數(shù)目；以及(c)將未反應(yīng)的測(cè)試微粒數(shù)目與參考微粒比較，得出測(cè)量值，從而確定樣品中分析物的存在與否。
2.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，還包括步驟(d)將該測(cè)量值與非反應(yīng)樣品的對(duì)照值進(jìn)行比較。
3.如權(quán)利要求2所述的分析方法，其特征在于，該比較步驟(d)包括步驟(e)計(jì)算測(cè)量值與對(duì)照值之間的變化值。
4.如權(quán)利要求3所述的分析方法，其特征在于，該步驟(e)包括步驟(f)獲得該對(duì)照值與測(cè)量值之間的差值。
5.如權(quán)利要求4所述的分析方法，其特征在于，該步驟(f)還包括步驟(g)將該差值除以對(duì)照值。
6.如權(quán)利要求3所述的分析方法，其特征在于，該步驟(e)包括步驟(h)將該對(duì)照值除以測(cè)量值。
7.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，該步驟(c)包括步驟(i)計(jì)算未反應(yīng)測(cè)試微粒的數(shù)目與參考微粒數(shù)目之比。
8.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，該計(jì)數(shù)步驟(b)包括用電子學(xué)方法計(jì)數(shù)未反應(yīng)測(cè)試微粒和參考微粒的數(shù)目。
9.如權(quán)利要求8所述的分析方法，其特征在于，該計(jì)數(shù)步驟(b)包括測(cè)量反應(yīng)混合物的阻抗。
10.如權(quán)利要求9所述的分析方法，其特征在于，該計(jì)數(shù)步驟(b)還包括測(cè)量反應(yīng)混合物的電阻。
11.如權(quán)利要求8所述的分析方法，其特征在于，該計(jì)數(shù)步驟(b)包括測(cè)量反應(yīng)混合物的電容。
12.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，該計(jì)數(shù)步驟(b)包括用光學(xué)方法計(jì)數(shù)未反應(yīng)測(cè)試微粒和參考微粒的數(shù)目。
13.如權(quán)利要求12所述的分析方法，其特征在于，該計(jì)數(shù)步驟(b)包括用細(xì)胞計(jì)量術(shù)測(cè)量未反應(yīng)測(cè)試微粒和參考微粒的光散射特性。
14.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，該計(jì)數(shù)步驟(b)包括計(jì)數(shù)處于自我凝集體形式的未反應(yīng)測(cè)試微粒和參考微粒的數(shù)目。
15.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，測(cè)試微粒、參考微?；驕y(cè)試微粒和參考微粒兩者含有聚合物材料。
16.如權(quán)利要求15所述的分析方法，其特征在于，該聚合物材料包括聚苯乙烯或其衍生物。
17.如權(quán)利要求16所述的分析方法，其特征在于，膠乳聚合物包括聚丁二烯或其衍生物。
18.如權(quán)利要求15所述的分析方法，其特征在于，測(cè)試微粒是具有表面化學(xué)官能團(tuán)的聚合物材料。
19.如權(quán)利要求18所述的分析方法，其特征在于，該表面化學(xué)官能團(tuán)是丙烯酰胺基團(tuán)。
20.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，該分析物是抗體。
21.如權(quán)利要求20所述的分析方法，其特征在于，結(jié)合分子是與分析物抗體結(jié)合的抗原。
22.如權(quán)利要求21所述的分析方法，其特征在于，該分析物抗體是抗風(fēng)疹病毒抗體。
23.如權(quán)利要求22所述的分析方法，其特征在于，結(jié)合分子是滅活的風(fēng)疹病毒的抗原性片段。
24.如權(quán)利要求20所述的分析方法，其特征在于，該分析物抗體是抗-HSV I抗體。
25.如權(quán)利要求24所述的分析方法，其特征在于，結(jié)合分子是滅活的HSV I的抗原性片段。
26.如權(quán)利要求20所述的分析方法，其特征在于，該分析物抗體是抗梅毒抗體。
27.如權(quán)利要求20所述的分析方法，其特征在于，該分析物抗體是抗-巨細(xì)胞病毒抗體。
28.如權(quán)利要求27所述的分析方法，其特征在于，結(jié)合分子是滅活的巨細(xì)胞病毒的抗原性片段。
29.如權(quán)利要求20所述的分析方法，其特征在于，該分析物抗體是抗弓形體抗體。
30.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，該樣品是血液。
31.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，該樣品是血清。
32.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，該樣品是血漿。
33.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，該樣品是唾液。
34.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，該樣品是腦脊液。
35.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，該樣品是尿液。
36.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，該樣品包括從身體器官或組織獲得的細(xì)胞。
37.一種檢測(cè)樣品中至少2種分析物是否存在的分析方法，其特征在于，該方法包括下列步驟(a)將樣品與預(yù)定數(shù)量的第一測(cè)試微粒、第二測(cè)試微粒及參考微?；旌弦孕纬煞磻?yīng)混合物，其中在第一測(cè)試微粒上配置有可結(jié)合第一分析物的結(jié)合分子，在第二測(cè)試微粒上配置有可結(jié)合第二分析物的結(jié)合分子，而參考微粒不與第一和第二分析物以及第一和第二結(jié)合分子發(fā)生反應(yīng)，然后讓第一結(jié)合分子與第一分析物結(jié)合，讓第二結(jié)合分子與第二分析物結(jié)合；(b)計(jì)數(shù)未反應(yīng)的第一測(cè)試微粒、未反應(yīng)的第二測(cè)試微粒和參考微粒的數(shù)目；以及(c)將未反應(yīng)的第一測(cè)試微粒數(shù)目與參考微粒比較，得出第一測(cè)量值，并將未反應(yīng)的第二測(cè)試微粒數(shù)目與參考微粒比較，得出第二測(cè)量值，從而確定樣品中第一和第二分析物的存在與否。
38.一種在檢測(cè)樣品中分析物是否存在的分析法中使用的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括(a)測(cè)試微粒，在測(cè)試微粒上配置有可結(jié)合分析物的結(jié)合分子；和(b)參考微粒，參考微粒不與分析物和結(jié)合分子反應(yīng)；其中測(cè)試微粒和參考微粒以預(yù)定比例存在。
39.如權(quán)利要求38所述的試劑盒，其特征在于，還包括用于將所述測(cè)試微粒和參考微粒與樣品混合的容器。
40.如權(quán)利要求39所述的試劑盒，其特征在于，該測(cè)試微粒和參考微粒被放置于該容器中。
41.如權(quán)利要求39所述的試劑盒，其特征在于，該容器包括用于將測(cè)試微粒和參考微粒密封在該容器中的密封件。
42.如權(quán)利要求38所述的試劑盒，其特征在于，該測(cè)試微粒和參考微粒為干燥形式。
43.一種在檢測(cè)樣品中至少2種分析物是否存在的分析法中使用的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括(a)第一測(cè)試微粒，在第一測(cè)試微粒上配置有可結(jié)合第一分析物的第一結(jié)合分子；(b)第二測(cè)試微粒，在第二測(cè)試微粒上配置有可結(jié)合第二分析物的第二結(jié)合分子；和(c)參考微粒，該參考微粒不與第一和第二分析物以及第一和第二結(jié)合分子反應(yīng)；其中第一和第二測(cè)試微粒及參考微粒以預(yù)定比例存在。
44.一種組合物，它用于檢測(cè)流體樣品中至少一種分析物是否存在的分析法中，其特征在于，它包括下列組份的混合物(a)第一測(cè)試微粒，在第一測(cè)試微粒上配置有可結(jié)合第一分析物的第一結(jié)合分子；和(b)參考微粒，該參考微粒不與第一分析物及第一結(jié)合分子反應(yīng)；其中該第一測(cè)試微粒和參考微粒以預(yù)定數(shù)量存在于該組合物中。
45.如權(quán)利要求44所述的組合物，其特征在于，還包括(c)預(yù)定數(shù)量的第二測(cè)試微粒，在第二測(cè)試微粒上配置有可結(jié)合第二分析物的第二結(jié)合分子，且該參考微粒不與第二分析物及第二結(jié)合分子反應(yīng)。
46.如權(quán)利要求44或45所述的組合物，其特征在于，它為干燥形式。
全文摘要
公開(kāi)了測(cè)定樣品中至少一種分析物是否存在的分析法,它包括步驟:(a)將樣品與預(yù)定數(shù)量的第一測(cè)試微粒及惰性參考微?；旌弦孕纬煞磻?yīng)混合物,其中測(cè)試微粒上配置有可結(jié)合第一分析物的結(jié)合分子,然后讓第一結(jié)合分子與第一分析物結(jié)合;(b)計(jì)數(shù)未反應(yīng)的第一測(cè)試微粒和參考微粒的數(shù)目;和(c)將未反應(yīng)的第一測(cè)試微粒數(shù)目與參考微粒比較,得出測(cè)量值,從而確定樣品中分析物存在與否。在一優(yōu)選例中,將第一測(cè)量值與非反應(yīng)樣品的對(duì)照值進(jìn)行比較,并計(jì)算出變化值。還公開(kāi)了含有微粒的組合物和試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/542GK1207174SQ97191568
公開(kāi)日1999年2月3日 申請(qǐng)日期1997年11月3日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月3日
發(fā)明者J·S·斯蒂爾, A·J·博德納爾, M·S·科克, G·M·福特, J·P·赫夫 申請(qǐng)人:仙娜生物技術(shù)股份有限公司