專(zhuān)利名稱(chēng)：交聯(lián)聚丙烯酰胺類(lèi)涂層毛細(xì)管柱輻照制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于毛細(xì)管電泳分析領(lǐng)域，涉及輻照法制備交聯(lián)聚丙烯酰胺類(lèi)涂層毛細(xì)管電泳柱。毛細(xì)管電泳是八十年代初發(fā)展起來(lái)的一種新型分離技術(shù)，由于電泳是在細(xì)內(nèi)徑(25μm-100μm)的彈性石英毛細(xì)管中進(jìn)行的，不使用柱填料，樣品量和試劑消耗少、在線(xiàn)檢測(cè)和操作簡(jiǎn)便而得到重視。近年來(lái)，這一技術(shù)在理論、儀器、應(yīng)用等方面都取得了很大進(jìn)展，用于離子、藥物、糖、核酸、肽、蛋白質(zhì)、病毒以及細(xì)胞等的分析；分離模式也逐漸多樣化，除毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)、毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)、毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)和膠束電動(dòng)色譜(MECC)外，還有親和毛細(xì)管電泳(ACE)和毛細(xì)管電色譜(CEC)等。它很好地解決了大分子擴(kuò)散系統(tǒng)小、傳質(zhì)阻力大的問(wèn)題，成為同HPLC互補(bǔ)的一種分析技術(shù)；分離系統(tǒng)的多樣性，使其可用于解決生命科學(xué)發(fā)展中的一些重要問(wèn)題。
雖然理論預(yù)測(cè)采用毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)時(shí)可以達(dá)到上百萬(wàn)的理論塔板數(shù)，但實(shí)際上當(dāng)用未處理柱時(shí)很難達(dá)到這樣的目標(biāo)，這主要是由毛細(xì)管的電滲和內(nèi)壁對(duì)蛋白吸附所致，造成遷移時(shí)間的重復(fù)性與回收率變差。因此毛細(xì)管電泳的高效分離，有賴(lài)于對(duì)管壁的吸附和電滲這兩個(gè)相關(guān)問(wèn)題的解決，才能發(fā)揮出它應(yīng)有的優(yōu)勢(shì)。大部分已報(bào)道的工作都是通過(guò)調(diào)節(jié)溶液pH、使用高鹽濃度、添加劑或吸附中性和帶電的大分子、制備化學(xué)鍵合相涂層來(lái)解決這兩個(gè)問(wèn)題。Hjerten(J.Chromatogr.,1984；347:191；USP4680 201,14 July 1987)采用有機(jī)硅烷化試劑鍵合至毛細(xì)管，然后制備非交聯(lián)聚丙烯酰胺涂層并用于毛細(xì)管等電聚焦，Cobb等(Anal Chem,1990；62:2478)采用格氏試劑制備Si-C亞層，然后再同丙烯酰胺共聚，前者線(xiàn)性涂層穩(wěn)定性差，而后者制備要求高，其他柱制備方法(Huang M,et al.Electrophoresis,1995；16:396；Nasabeh W,etal.J.Chromatogr.,1991；559:367)也都存在柱制備時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣等問(wèn)題。
本發(fā)明的目的在于提供一種交聯(lián)聚丙烯酰胺類(lèi)涂層毛細(xì)管電泳柱的輻照制備方法，利用該法制備的柱可對(duì)蛋白質(zhì)、核酸、糖、肽等進(jìn)行高效分離，能夠減小樣品同毛細(xì)管的作用和毛細(xì)管電滲。
本發(fā)明考慮到已有的各種涂層的性能和穩(wěn)定性，并結(jié)合輻照技術(shù)，兩次輻照制備交聯(lián)聚丙烯酰胺類(lèi)涂層毛細(xì)管電泳柱。硅烷偶聯(lián)劑的結(jié)構(gòu)為SiX3(CH2)nY。偶聯(lián)劑分子一端的X基團(tuán)可以是烷氧基(如三甲氧基、三乙氧基)或氯，易水解成有縮聚能力的硅羥基，它與無(wú)機(jī)物表面的羥基發(fā)生縮聚反應(yīng)，形成-Si-O-Si-鍵或氫鍵另一端的官能團(tuán)Y可以是乙烯基、丙烯基、丙烯酰氧基、異丁烯?；?、甲基、氨丙基等，能與有機(jī)化合物中的官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，生成共價(jià)鍵。用于制備丙烯酰胺類(lèi)線(xiàn)性聚合物的單體為丙烯酰胺及其取代的衍生物單體，所用交聯(lián)劑為多官能團(tuán)單體，如甲叉雙丙烯酰胺類(lèi)。
本發(fā)明交聯(lián)聚丙烯酰胺類(lèi)毛細(xì)管電泳涂層柱的輻照聚合制備方法是按下述步驟1．取一定內(nèi)徑的石英或玻璃毛細(xì)管，先進(jìn)行柱清洗，包括用去離子水、堿(NaOH或KOH)、甲醇進(jìn)行洗滌；2．毛細(xì)管內(nèi)壁預(yù)涂硅烷類(lèi)偶聯(lián)劑。毛細(xì)管內(nèi)充入硅烷類(lèi)偶聯(lián)劑溶液，如水、丙酮、二氯甲烷、甲苯，常溫進(jìn)行反應(yīng)，時(shí)間30min～2h，然后分別用去離子水和甲醇沖洗，用惰性氣體吹干；3．毛細(xì)管內(nèi)充入已脫氣的丙烯酰胺類(lèi)溶液后，輻照10min～1h，劑量率為500～3000Gy/h，然后用去離子水洗去吸附的聚合物；4．毛細(xì)管柱內(nèi)通以不同濃度的交聯(lián)劑，保持幾分鐘后，以惰性氣體吹干，輻照10min～1h，劑量率為1000～6000Gy/h。
通過(guò)本發(fā)明制備交聯(lián)聚丙烯酰胺類(lèi)毛細(xì)管柱，所需時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、易于重復(fù)、無(wú)催化劑(或引發(fā)劑)殘留、柱效較高。
下面結(jié)合附圖進(jìn)一步說(shuō)明制備方法的實(shí)施過(guò)程及交聯(lián)聚丙烯酰胺類(lèi)毛細(xì)管柱的應(yīng)用。其中

圖1為交聯(lián)聚丙烯酰胺毛細(xì)管電泳涂層柱分離標(biāo)準(zhǔn)蛋白，譜峰1．細(xì)胞色素C；2．溶菌酶；3．馬肌紅蛋白；4．胰凝乳蛋白酶原A。圖2A為對(duì)卵清蛋白的分離譜圖。圖2B為胰蛋白酶抑制劑的分離譜圖。圖3為毛細(xì)管電泳分離寡核苷酸。
實(shí)例1交聯(lián)聚丙烯觸類(lèi)毛細(xì)管電泳涂層柱的輻照聚合制備石英毛細(xì)管先經(jīng)去離子水洗5min，充入1mol/L NaOH后放置30min，再用去離子水洗10min。在毛細(xì)管內(nèi)充入3％γ-甲基丙烯基氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)/冰醋酸∶水(1∶1)，室溫反應(yīng)1h后，用去離子水洗5min，高純氮吹5min。制備線(xiàn)性涂層時(shí)，毛細(xì)管內(nèi)充入已脫氣的3％丙烯酰胺溶液，在2500Gy/h強(qiáng)度下輻照30min，再用水洗去吸附的聚丙烯酰胺。第二次輻照時(shí)，毛細(xì)管柱內(nèi)通以不同濃度的甲叉雙丙烯酰胺并保持5min，用高純氮吹干后，進(jìn)行輻照交聯(lián)，強(qiáng)度為2500Gy/h，輻照15min。實(shí)例2交聯(lián)聚丙烯酰胺毛細(xì)管電泳涂層柱分離幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白按上述實(shí)例1制備的交聯(lián)聚丙烯酰胺毛細(xì)管電泳涂層柱對(duì)幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白(見(jiàn)表1)進(jìn)行了分離。圖1所示為標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳譜圖。電泳條件為40mmol/LTris-H3PO4緩沖液，pH4.0,16kV×37μA，壓力進(jìn)樣2秒。
表1標(biāo)準(zhǔn)蛋白的等電點(diǎn)及分子量
實(shí)例3涂層柱的電滲測(cè)定制備不同pH 50mmol/L磷酸緩沖液(加入1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH)，來(lái)評(píng)價(jià)未涂層和涂層柱電滲隨pH變化。當(dāng)溶液pH從3升至8時(shí)，涂層柱的電滲流值由0.036×10-8m2/v.s升高到0.6×10-8m2/v.s，有效地抑制了電滲。電泳條件未處理柱，37cm×50μm(I.D.),20kV；涂層柱，27cm×50μmI.D,16kV，中性標(biāo)記物為1％二甲基甲酰胺。實(shí)例4卵清蛋白和胰蛋白酶抑制劑的分離按上述實(shí)例1制備的交聯(lián)聚丙烯酰胺涂層毛細(xì)管電泳柱對(duì)卵清蛋白(如圖2A所示)、胰蛋白酶抑制劑進(jìn)行了分離(如圖2B所示)，電泳條件50mmol/LTris-glycine pH8.4 37cm×50μm(I.D.)，工作電壓16kV，反極性。實(shí)例5毛細(xì)管電泳分離寡核苷酸毛細(xì)管電泳已被用于寡核苷酸、DNA合成產(chǎn)物和酶切片段的分離，按上述實(shí)例1制備的電泳柱用于無(wú)膠篩分電泳分離pBR322/HinfIMK片段，結(jié)果如圖3所示。電泳條件89mmol/LTris-硼酸，羥丙基甲基纖維素濃度0.8％,2mmol/LEDTA緩沖液pH8.3；27cm×50μm(I.D.)，工作電壓8kV，反極性。
權(quán)利要求
1．一種交聯(lián)聚丙烯酰胺類(lèi)涂層毛細(xì)管電泳柱的輻照制備方法，是將交聯(lián)聚丙烯酰胺類(lèi)涂層通過(guò)硅烷偶聯(lián)劑結(jié)合于毛細(xì)管管壁。采用石英或玻璃毛細(xì)管，經(jīng)去離子水、堿(NaOH或KOH)、甲醇先進(jìn)行清洗后，毛細(xì)管內(nèi)充入硅烷類(lèi)偶聯(lián)劑溶液，常溫進(jìn)行反應(yīng)，時(shí)間不少于30分鐘，然后分別用去離子水和甲醇沖洗，吹干，即為具有硅烷類(lèi)偶聯(lián)劑預(yù)涂層的毛細(xì)管柱。其中硅烷偶聯(lián)劑的結(jié)構(gòu)為SiX3(CH2)nY，偶聯(lián)劑分子一端的X基團(tuán)可以是烷氧基(如三甲氧基、三乙氧基)或氯，易水解成有縮聚能力的硅羥基，它與無(wú)機(jī)物表面的羥基發(fā)生縮聚反應(yīng)，形成-Si-O-Si-鍵或氫鍵；另一端的官能團(tuán)Y可以是乙烯基、丙烯基、丙烯酰氧基、異丁烯酰基、甲基、氨丙基等，能與有機(jī)化合物中的官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，生成共價(jià)鍵。交聯(lián)聚丙烯酰胺類(lèi)涂層毛細(xì)管電泳柱的輻照制備方法其特征在于，采用兩次輻照的方法制備交聯(lián)聚丙烯酰胺類(lèi)涂層毛細(xì)管電泳柱。首先在預(yù)涂硅烷類(lèi)偶聯(lián)劑層毛細(xì)管內(nèi)充入已脫氣的丙烯酰胺類(lèi)溶液，用于制備線(xiàn)性聚合物的單體為丙烯酰胺及其取代的衍生物，輻照引發(fā)丙烯酰胺類(lèi)單體與硅烷偶聯(lián)劑的聚合反應(yīng)，輻照時(shí)間10min～1h，劑量率為500～3000Gy/h，用去離子水洗去吸附的聚合物，此為線(xiàn)性聚丙烯酰胺類(lèi)涂層毛細(xì)管柱。然后在線(xiàn)性聚丙烯酰胺類(lèi)涂層毛細(xì)管柱內(nèi)充以多官能團(tuán)單體，可以是甲叉雙丙烯酰胺類(lèi)交聯(lián)劑，保持幾分鐘后，以惰性氣體吹干，輻照時(shí)間為10min～1h，劑量率為1000～6000Gy/h此為交聯(lián)聚丙烯酰胺類(lèi)涂層毛細(xì)管電泳柱。
全文摘要
一種交聯(lián)聚丙烯酰胺類(lèi)毛細(xì)管電泳涂層柱的輻照制備方法,屬于毛細(xì)管電泳分析領(lǐng)域,是先用雙功能團(tuán)硅烷化試劑對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行預(yù)處理,再經(jīng)兩次輻照來(lái)制備交聯(lián)聚丙烯酰胺類(lèi)毛細(xì)管電泳涂層柱,即在毛細(xì)管柱內(nèi)充入丙烯酰胺類(lèi)溶液進(jìn)行輻照聚合,得到線(xiàn)性涂層柱;再經(jīng)動(dòng)態(tài)涂覆甲叉雙丙烯酰胺等交聯(lián)劑,輻照聚合得到交聯(lián)涂層柱。制備方法簡(jiǎn)單、快速,反應(yīng)條件溫和,涂層內(nèi)無(wú)催化劑(或引發(fā)劑)殘余。柱重復(fù)性好,電滲流小,柱效高。所提供的方法可以用作柱的進(jìn)一步改性。
文檔編號(hào)G01N27/447GK1236892SQ9810201
公開(kāi)日1999年12月1日 申請(qǐng)日期1998年5月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月28日
發(fā)明者劉曉達(dá), 王全立, 馬立人 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所