專(zhuān)利名稱：生物測(cè)定器及用其進(jìn)行底物定量的方法
發(fā)明的背景本發(fā)明涉及簡(jiǎn)便地實(shí)施底物高精度定量用的生物測(cè)定器，及使用該生物測(cè)定器的底物定量法。
以往，順利地進(jìn)行試樣液的稀釋和攪拌等、簡(jiǎn)易地將試樣液中的特定成分定量的方法，有將特定成分與以特定成分為底物的氧化還原酶在電子傳遞體的存在下進(jìn)行反應(yīng)，將還原的電子傳遞體進(jìn)行電化學(xué)氧化，從此氧化電流值求出特定成分的濃度的方法。
該方法通常采用第2517153號(hào)公報(bào)揭示的生物測(cè)定器來(lái)進(jìn)行。
該生物測(cè)定器系在絕緣基板上用篩網(wǎng)印刷等方法形成由作用極和對(duì)極組成的電極系，在此電極系上形成含有氧化還原酶和電子傳遞體的試藥層。在此絕緣基板上，蓋板和隔板組合制成生物測(cè)定器。
這樣的生物測(cè)定器通過(guò)使用各種氧化還原酶可定量測(cè)定各種特定成分。
作為生物測(cè)定器的一個(gè)例子，可以葡萄糖測(cè)定器加以說(shuō)明。
葡萄糖的定量方法，通常知道的有將葡萄糖氧化酶和氧化電極或過(guò)氧化氫電極組合的方式(例如，鈴木周一編的“生物測(cè)定器”講習(xí)社)。
葡萄糖氧化酶作為反應(yīng)系統(tǒng)的電子傳遞體，選擇性地將底物β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯。與此反應(yīng)同時(shí)，氧被還原成過(guò)氧化氫。用氧電極測(cè)定此時(shí)的氧耗量，或以用白金電極等的過(guò)氧化氫電極測(cè)定過(guò)氧化氫的生成量，可進(jìn)行葡萄糖的定量。
然而，在上述方法中，因測(cè)定對(duì)象的不同，受溶存氧濃度的影響很大，且在無(wú)氧的條件下不能測(cè)定。
于是，開(kāi)發(fā)了不使用氧作為電子傳遞體而用氰鐵酸鉀(フエリシアン化カリウム)、二茂鐵衍生物、苯醌衍生物等金屬配合物等有機(jī)化合物作為電子傳遞體類(lèi)型的葡萄糖測(cè)定器。
這種類(lèi)型的葡萄糖測(cè)定器可將已知量的葡萄糖氧化酶和電子傳遞體以安定狀態(tài)負(fù)載于電極上，可將電極系和試藥層在接近干燥的狀態(tài)下成為一體。
這樣的葡萄糖測(cè)定器是一次性使用型的，只要在插入測(cè)定器中的測(cè)定頭中加入檢體試樣，即可容易地測(cè)定葡萄糖濃度，因此，近年來(lái)引起了人們的重視。
如上所述，從一系列酶促反應(yīng)結(jié)果生成的電子傳遞體的還原體在電極上氧化所需要的氧化電流值，可定量測(cè)定試樣中的底物。
在試樣中，可含有易氧化物質(zhì)，當(dāng)電子傳遞體的還原體在電極上氧化時(shí)，同時(shí)因氧化而產(chǎn)生氧化電流，使測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生正誤差。在底物濃度高的情況下，在氧化電流值上更可以見(jiàn)到統(tǒng)計(jì)上的離散性。
為了解決這個(gè)問(wèn)題，本發(fā)明者提出從一系列酶促反應(yīng)還原所得電子傳遞體的氧化體在作用極上還原所得的還原電流值來(lái)測(cè)定底物的方法。用這個(gè)方法，即使含有易氧化物質(zhì)，對(duì)測(cè)定結(jié)果也無(wú)不良影響。
然而，用作用極和對(duì)極的二電極式測(cè)定還原電流值的時(shí)候，對(duì)應(yīng)于在作用極上的還原反應(yīng)，必須在對(duì)極上存在還原體。但是，在底物濃度低的時(shí)候，電子傳遞體的還原體不足。其結(jié)果，在對(duì)極上的氧化反應(yīng)成為快速過(guò)程，對(duì)所得的還原電流值產(chǎn)生不良影響。
發(fā)明的概述本發(fā)明的目的在于提供可克服上述不足之處、高精度地定量測(cè)定試樣中的底物濃度的生物測(cè)定器。
本發(fā)明的目的還在于提供用這種生物測(cè)定器快速、簡(jiǎn)便、高精度地定量測(cè)定底物的方法。
本發(fā)明提供的生物測(cè)定器具有絕緣基板、含在上述基板上形成的作用極和對(duì)極的電極系，及在上述電極系上形成的至少含還原酶和電子傳遞體的試藥層，上述對(duì)極至少含一種還原型的氧化還原化合物或可電解氧化的金屬。
本發(fā)明還提供用上述生物測(cè)定器定量測(cè)定底物的方法，包括以下步驟在試藥層上添加試樣，使底物與酶反應(yīng)；將上述步驟中還原所得的電子傳遞體還原的電位外加在作用極上；及測(cè)定在上述作用極和對(duì)極之間流動(dòng)的電流值。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，上述對(duì)極含二茂鐵或其衍生物作為氧化還原化合物。
在本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方案中，上述對(duì)極含銀或銅作為可電解氧化的金屬。
在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，上述對(duì)極由可電解氧化的金屬和碳的混合物構(gòu)成。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中除去試藥層后的葡萄糖測(cè)定器的分解立體圖。
圖2為除去隔板和蓋板后同一葡萄糖測(cè)定器主要部分的縱剖面圖。
發(fā)明的詳細(xì)描述如上所述，本發(fā)明的電位定量法先在試藥層中添加試樣，使底物與酶反應(yīng)。與此酶促反應(yīng)相伴隨的是，試藥層中的電子傳遞體與底物濃度相對(duì)應(yīng)地被還原。然后，不通過(guò)酶促反應(yīng)進(jìn)行還原，而是將還原反應(yīng)系統(tǒng)中殘存電子傳遞體的電位外加到作用極上，通過(guò)測(cè)定其還原電流而求出底物的濃度。
將試藥層中電子傳遞體調(diào)節(jié)在一定量，則上述還原電流對(duì)應(yīng)于試樣中的底物濃度。因此，預(yù)先測(cè)定含一定量底物標(biāo)準(zhǔn)液的還原電流值作成標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可求出試樣中的底物濃度。
這樣，本發(fā)明從還原電流進(jìn)行底物定量，因此，即使試樣中混入易氧化物質(zhì)，也不會(huì)受其影響。
而且，由于對(duì)極上含有還原型的氧化還原化合物或可電解氧化的金屬，因此，在試樣中底物濃度低、從而酶促反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生的還原型電子傳遞體少的情況下，在作用極測(cè)定還原電流時(shí)，對(duì)極上的氧化反應(yīng)也不是規(guī)定速度的過(guò)程。
本發(fā)明的生物測(cè)定器是改良對(duì)極的產(chǎn)物，因此不必?fù)?dān)心對(duì)測(cè)定器保存特性的影響。在試藥層上添加氧化還原化合物時(shí)，氧化還原化合物對(duì)測(cè)定器的保存特性有影響，因此，事先調(diào)節(jié)其影響是不可缺少的。而且，如果采用在對(duì)極上含氧化還原化合物和可電解氧化的金屬的本發(fā)明，與在試藥層上添加相比，其優(yōu)點(diǎn)是量多，可與多量的底物相適應(yīng)。
另一方面，可電解氧化的金屬以銀或銅為佳。也可用鐵和鉛等。
且，上述金屬由于可將其粉末與粘合劑一起制成糊狀等，直接印刷在基板上制成對(duì)極，所以可簡(jiǎn)化測(cè)定器的制作步驟。
從碳粉和粘合劑與上述金屬粉末混合而成的混合物制成對(duì)極，可降低制造成本，是令人滿意的。
另外，較好的是，將電極系表面用親水性高分子層被覆，使在基板上形成的電極系的表面不接觸酶和電子傳遞體等，或電極系表面不吸附蛋白質(zhì)。
形成這種層的親水性高分子，可用聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、多聚賴氨酸等多氨基酸，磺化聚苯乙烯、明膠及其衍生物，丙烯酸或其鹽的聚合物，甲基丙烯酸或其鹽的聚合物，淀粉及其衍生物，馬來(lái)酸酐或其鹽的聚合物；羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、羧甲基乙基纖維素等纖維素衍生物。其中，以羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、羧甲基乙基纖維素為佳。
試藥層中所含的電子傳遞體可用氰鐵酸鉀(フエリシアン化カリウム)、對(duì)苯醌、吩嗪甲硫酸酯、亞甲藍(lán)、二茂鐵衍生物等。
氧化還原酶可用葡萄糖氧化酶、葡萄糖脫氫酶、醇氧化酶、乳酸氧化酶、乳酸脫氫酶、果糖脫氫酶、尿酸酶、膽甾醇氧化酶、膽甾醇酯化酶，黃嘌呤氧化酶、氨基酸氧化酶等。
上述酶可以幾個(gè)組合在一起，如葡萄糖氧化酶和轉(zhuǎn)化酶、葡萄糖氧化酶和轉(zhuǎn)化酶及變旋酶以及果糖脫氫酶和轉(zhuǎn)化酶等。
上述酶和電子傳遞體可溶于試樣液，也可將試藥層固定在基板上等而不溶于試樣液中。在將酶和電子傳遞體固定的情況下，試藥層以含有上述親水性高分子為佳。
而且，試藥層可含有pH緩沖劑。此pH緩沖劑可有磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉、檸檬酸-磷酸氫二鈉、檸檬酸-磷酸氫二鉀、檸檬酸-檸檬酸三鈉、檸檬酸-檸檬酸三鉀、檸檬酸二氫鉀-氫氧化鈉、檸檬酸二氫鈉-氫氧化鈉、馬來(lái)酸氫鈉-氫氧化鈉、富馬酸氫鉀-氫氧化鈉、琥珀酸-四硼酸鈉、馬來(lái)酸-三(羥甲基)氨基甲烷、三(羥甲基)氨基甲烷-三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽、〔N-(2-羥乙基)哌嗪-N＇-2-乙磺酸〕-氫氧化鈉、〔N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸〕-氫氧化鈉、〔哌嗪-N,N’-二(2-乙磺酸)〕-氫氧化鈉。
此外，為了順利供給試樣溶液，也可在試藥層上形成卵磷脂層。
以下用實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。
以下的實(shí)施例中，作用極、對(duì)極和絕緣層的印刷方式例示于具體的實(shí)施例，但并不限于實(shí)施例的內(nèi)容。施加于電極的外加電壓也不限于實(shí)施例的內(nèi)容。
圖1是二電極式葡萄糖測(cè)定器除去試藥層后的分解立體圖。在聚苯乙烯對(duì)苯二酸酯形成的絕緣基板1上，用篩網(wǎng)印刷法印刷銀糊，形成導(dǎo)線2、3。然后，將含樹(shù)脂粘合劑的導(dǎo)電性碳糊印刷到基板1上，形成作用極4。此作用極4與導(dǎo)線2接觸。再在基板1上印刷絕緣糊形成絕緣層6。絕緣層6覆蓋在作用極4的外周部，由此使作用極4的露出部分的面積保持一定。然后，將樹(shù)脂粘合劑與含氧化還原化合物或可電解氧化的金屬的導(dǎo)電性碳糊或?qū)⒑瑯?shù)脂粘合劑的銀、銅等的糊狀物與導(dǎo)線3接觸，進(jìn)行印刷，形成環(huán)狀對(duì)極5。
將此絕緣基板1與具有氣孔11的蓋板9和隔板10保持如圖1中點(diǎn)劃線所示的位置關(guān)系，粘合，制成生物測(cè)定器。在隔板10上設(shè)置形成基板與蓋板間試樣液供給路的縫隙13。12相當(dāng)于此試樣液供給路的開(kāi)口部。
圖2為除去隔板和蓋板后本發(fā)明的生物測(cè)定器主要部分的縱剖面圖。
在如圖1所示形成電極系的電絕緣性基板1上，形成含酶類(lèi)和電子傳遞體的試藥層7，在試藥層7上形成卵磷脂層8。
試藥層7以在電極系上形成的為佳，但在電極系附近如在蓋板側(cè)形成、露出于試樣液供給路也可。
實(shí)施例1如圖1所示，在基板1上，用樹(shù)脂粘合劑與氧化還原化合物-含二茂鐵的導(dǎo)電性碳糊，形成對(duì)極，制成含此對(duì)極的電極系。
在此電極系上，滴加葡萄糖氧化酶(ECl.1.3.4，以下簡(jiǎn)稱GOD)和氰鐵酸鉀的混合水溶液，干燥，形成試藥層7。然后，在試藥層7上滴加卵磷脂的甲苯溶液，干燥，形成卵磷脂層8。
接著，將基板1與蓋板9和隔板10保持如圖1中點(diǎn)劃線所示的位置關(guān)系，粘合，制成葡萄糖測(cè)定器。
從試樣液供給路的開(kāi)口部12供給葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)水溶液3μl。試樣液到達(dá)氣孔11部分，電極系上的試藥層7溶解。試藥層7溶解后，試樣液中的葡萄糖被GOD氧化成葡萄糖酸內(nèi)酯。通過(guò)該酶促反應(yīng)，氰鐵酸離子還原成氰亞鐵酸離子。
供給試樣液一定時(shí)間后，以對(duì)極5為基準(zhǔn)，在作用極4上外加1.0V的電壓。通過(guò)外加此電壓，在作用極上，未還原的殘存氰鐵酸鉀發(fā)生還原反應(yīng)。然后，在對(duì)極上，發(fā)生對(duì)極中所含二茂鐵的氧化反應(yīng)，二茂鐵成為二茂鐵離子。然后，測(cè)定外加電壓5秒后的還原電流值。
所得的電流值隨著葡萄糖濃度的增加而減少?？傊?，由于對(duì)極上含二茂鐵，反應(yīng)系統(tǒng)中還原體充分存在，所得的電流值顯示出取決于作用極上氰鐵酸離子的還原反應(yīng)。所得的電流應(yīng)答值的測(cè)定精度高。
實(shí)施例2在與實(shí)施例1同樣的電極上滴加羧甲基纖維素(以下簡(jiǎn)稱CMC)水溶液，干燥，形成CMC層。在此CMC層上，與實(shí)施例1同樣地形成試藥層和卵磷脂層。
然后，與實(shí)施例1同樣地制作葡萄糖測(cè)定器，測(cè)定對(duì)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的應(yīng)答，與實(shí)施例1同樣地得到離散度小的應(yīng)答特性。
實(shí)施例3除了用含已知量抗壞血酸的葡萄糖水溶液之外，與實(shí)施例2同樣地測(cè)定電流應(yīng)答值。
結(jié)果，得到與用不含抗壞血酸的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)水溶液的實(shí)施例2同樣的應(yīng)答特性。
比較例1用與實(shí)施例3同樣的測(cè)定器和含抗壞血酸的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)水溶液，在以對(duì)極為基準(zhǔn)的作用極上外加0.5V電壓，測(cè)定5秒鐘后的氧化電流值。
結(jié)果，隨著標(biāo)準(zhǔn)水溶液中抗壞血酸量的增加，電流應(yīng)答值也增加。
實(shí)施例4除了用乙烯基二茂鐵作為氧化還原化合物外，與實(shí)施例2同樣地制作葡萄糖測(cè)定器，測(cè)定對(duì)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)水溶液的應(yīng)答，得到與實(shí)施例2同樣的應(yīng)答特性。
實(shí)施例5除了用銀糊形成圖1的對(duì)極5之外，與實(shí)施例1同樣地制作葡萄糖測(cè)定器。
從試樣液供給路的開(kāi)口部12供給葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)水溶液3μl。試樣液到達(dá)氣孔11部分，電極系上的試藥層7溶解。試藥層7溶解后，試樣液中的葡萄糖被GOD氧化成葡萄糖酸內(nèi)酯。通過(guò)該酶促反應(yīng)，氰鐵酸離子還原成氰亞鐵酸離子。
供給試樣液一定時(shí)間后，以對(duì)極5為基準(zhǔn)，在作用極4上外加0.8V的電壓。通過(guò)外加此電壓，在作用極上，通過(guò)酶促反應(yīng)未還原的氰鐵酸鉀發(fā)生還原反應(yīng)。然后，對(duì)極的銀被氧化成銀離子。然后，測(cè)定外加電壓5秒后的還原電流值。所得的電流值隨著葡萄糖濃度的增加而減少?？傊?，因?yàn)橛勉y制作對(duì)極，使反應(yīng)系統(tǒng)中還原體充分存在，所得的電流值顯示出取決于作用極上氰鐵酸離子的還原反應(yīng)。所得的電流應(yīng)答值的測(cè)定精度高。
實(shí)施例6除了用銅糊形成對(duì)極5之外，與實(shí)施例5同樣地制作葡萄糖測(cè)定器。測(cè)定對(duì)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的應(yīng)答，得到與實(shí)施例5同樣的應(yīng)答特性。
實(shí)施例7除了用銀和碳的混合糊形成圖1的對(duì)極5之外，與實(shí)施例5同樣地制作葡萄糖測(cè)定器。測(cè)定對(duì)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的應(yīng)答，得到與實(shí)施例5同樣應(yīng)答特性。
實(shí)施例8除了用含已知量抗壞血酸的葡萄糖水溶液作試樣液之外，與實(shí)施例5同樣地測(cè)定電流應(yīng)答值。
結(jié)果，得到與用不含抗壞血酸的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)水溶液的實(shí)施例5同樣的應(yīng)答特性。
比較例2用與實(shí)施例5同樣的測(cè)定器和含抗壞血酸的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)水溶液，以對(duì)極為基準(zhǔn)，在作用極上外加0.5V電壓，測(cè)定5秒鐘后的電流值。
結(jié)果，隨著標(biāo)準(zhǔn)水溶液中抗壞血酸量的增加，電流應(yīng)答值也增加。
權(quán)利要求
1．生物測(cè)定器，其特征在于具有絕緣基板、含在上述基板上形成的作用極和對(duì)極的電極系，及在上述電極系上或其附近形成的至少含還原酶和電子傳遞體的試藥層，所述對(duì)極至少含一種還原型的氧化還原化合物或可電解氧化的金屬。
2．如權(quán)利要求1所述的生物測(cè)定器，其中所述氧化還原化合物為二茂鐵或其衍生物。
3．如權(quán)利要求1所述的生物測(cè)定器，其中所述對(duì)極由至少一種可電解氧化的金屬和碳的混合物制成。
4．如權(quán)利要求1所述的生物測(cè)定器，其中所述可電解氧化的金屬為銀或銅。
5．如權(quán)利要求1所述的生物測(cè)定器，其中所述試藥層還含有親水性高分子。
6．用生物測(cè)定器定量測(cè)定底物的方法，該生物測(cè)定器具有絕緣基板、在所述基板上形成的作用極和含至少一種還原型氧化還原化合物或可電解氧化的金屬對(duì)極組成的電極系、在所述電極系上或其附近形成的至少含氧化還原酶和電子傳遞體的試藥層，該方法包括以下步驟在所述試藥層上添加試樣，使底物與酶反應(yīng)；將使上述步驟中還原所得的電子傳遞體還原的電位外加在作用極上；及測(cè)定在所述對(duì)極和作用極之間的電流值。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了底物定量測(cè)定法中所用的生物測(cè)定器,所述底物定量法由以下步驟組成:在電子傳遞體的氧化體存在下,將試樣中的底物與對(duì)所述底物起特異性反應(yīng)的氧化還原酶進(jìn)行反應(yīng);將使上述步驟中還原所得的電子傳遞體還原的電位外加在作用極上;及測(cè)定在所述作用極和對(duì)極之間的電流值。該生物測(cè)定器具有絕緣基板、含在所述基板上形成的作用極和對(duì)極的電極系,及在所述電極系上或其附近形成的至少含氧化還原酶和電子傳遞體的試藥層,所述對(duì)極含至少一種還原型氧化還原化合物或可電解氧化的金屬。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1220394SQ98119449
公開(kāi)日1999年6月23日 申請(qǐng)日期1998年9月29日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月29日
發(fā)明者池田信, 吉岡俊彥, 南海史朗 申請(qǐng)人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社