專利名稱：霍亂一步法兩價快診試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種借助膠體金標(biāo)記顯色的免疫層析反應(yīng)，用以檢測霍亂弧菌的快速診斷試劑。
霍亂是由霍亂弧菌引起的急性傳染病，它以發(fā)病急，傳播快，波及范圍廣為特征，給人類生命健康造成極大威脅。從1871年至今的100多年內(nèi)，全球范圍已引發(fā)過7次由O1群霍亂弧菌感染的霍亂大流行，奪去了成千上萬人的生命，特別是1961年開始的第七次大流行，波及五大洲的140多個國家和地區(qū)，歷時30多年，至今勢頭未減。而在1992年，印度和孟加拉國又發(fā)生了由O139群霍亂弧菌引起的霍亂，并于1993年后在十幾個國家和地區(qū)流行或發(fā)生輸入性病例。O139群霍亂弧菌有無引發(fā)新的世界性大流行的可能性，已引起全世界范圍內(nèi)廣泛關(guān)注。常規(guī)的霍亂診斷多采用細(xì)菌分離鑒定法，雖然具有特異、敏感的優(yōu)點，但是需要十幾個小時才能得到結(jié)果。近年來報導(dǎo)的一些快診方法，一般也要4-6小時做出診斷報告，并且需要比較精密的儀器設(shè)備，價格昂貴，不利于在臨床和防疫現(xiàn)場推廣普及。目前，本發(fā)明所涉及的技術(shù)，國內(nèi)外尚未見有報道。
本發(fā)明的目的，旨在發(fā)展一種特異、快速、方便的檢測O1群和O139群霍亂弧菌的方法，為霍亂的疫情報告和防治工作提供便利條件。
本發(fā)明是由一次性紙條、標(biāo)本稀釋液及說明書組成的，可一次性同時檢測O1和O139群霍亂弧菌，其內(nèi)容要點如下1、一次性紙條是一種根據(jù)需要設(shè)計不同規(guī)格的膜片，每片包裝在一個密閉的小塑料袋內(nèi)，里面附有吸水材料以保持干燥。
①生物制劑的制備包括抗O1霍亂弧菌脂多糖(LPS)群特異性因子(A因子)的單克隆抗體、抗O139群霍亂弧菌脂多糖單克隆抗體、兔抗O1及O139霍亂弧菌血清(多抗)及兔抗鼠血清(多抗)的制備，以及單抗和多抗的提純(提取免疫球蛋白IgG)和膠體金制備及標(biāo)記單克隆IgG等。
②試紙條的構(gòu)建根據(jù)功能的不同，可將試紙條分為三個部分(圖1)。上段為手持部位(圖1-Ⅰ)，中斷為實驗反應(yīng)區(qū)(圖1-Ⅱ)下段為吸水區(qū)(圖1-Ⅲ)。試紙條的支持部分(圖2-g)采用硝酸纖維膜(NC)制成。實驗反應(yīng)區(qū)內(nèi)有三條用生物制劑標(biāo)記的條帶，其中a為兔抗鼠IgG,b為兔抗O1群霍亂弧菌多抗IgG,c為兔抗O139群霍亂弧菌多抗IgG。d處于吸水區(qū)的最上端，為膠體金標(biāo)記的抗O1群和抗O139群霍亂弧菌的單抗IgG。e為吸水材料，覆蓋在膠體金標(biāo)記的抗O1群和抗O139群霍亂弧菌的單抗IgG上面。以上抗體的使用濃度均為1∶50u～1∶250u，使用量50～100μl/條帶。在各條帶的標(biāo)記完成后，用1％小牛血清白蛋白封閉硝酸纖維膜。手持部位f為一層不透水的材料覆蓋著。
2、標(biāo)本稀釋液配制它具有稀釋樣品及裂解細(xì)菌的功能，其使用濃度為0.05M Tris(三羥甲基氨基甲烷、緩血酸胺)；0.05MEDTA(乙二胺四乙酸二鈉)；0.1MNaCL(氯化鈉)pH8.23、使用操作步驟①用滅菌牙簽挑取患者的新鮮吐瀉物(大多為糞便)約0.5克(3mm×3mm)，置于滅菌的小杯內(nèi)，加入2ml標(biāo)本稀釋液。
②蓋緊杯蓋，將小杯上下強烈振搖10次以上，讓標(biāo)本內(nèi)的細(xì)菌充分裂解。
③啟開試紙條的包裝袋，將一次性試紙按上面箭頭所指方向浸入小杯內(nèi)，使下段吸水部分完全浸沒在標(biāo)本液中，30秒后取出。
④計時觀察結(jié)果在5～10分鐘內(nèi)，凡試紙中斷實驗反應(yīng)區(qū)出現(xiàn)兩條以上玫瑰紅色反應(yīng)帶的視為陽性結(jié)果。兩條帶表明所測樣品內(nèi)有O1或O139群霍亂弧菌存在；三條帶表明樣品為兩種菌的混合感染，但這種情況臨床上不多見；如僅出現(xiàn)一條反應(yīng)帶，則視為陰性結(jié)果，表明樣品中無霍亂病原菌(或其濃度過低)；如在10分鐘內(nèi)無任何玫瑰紅色帶出現(xiàn)，可能是操作有誤或試劑失效，應(yīng)予重視。整個反應(yīng)過程均應(yīng)避免陽光直接照射。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果在于使用方便，勿需特殊運輸保存條件，操作時直接使用患者吐瀉物做標(biāo)本，不用任何附加儀器設(shè)備；診斷快速，只需10分鐘即可測出O1或O139群霍亂弧菌，使霍亂疫情能得到及時報告處理，尤其對海關(guān)港口檢疫更加行之有效；特異性強，具有單克隆抗體的高度專一性。


圖1兩價霍亂一步法快診試紙條俯視圖其中Ⅰ-手持部位Ⅱ-實驗反應(yīng)區(qū)Ⅲ-吸水區(qū)a-兔抗鼠IgGb-兔抗O1群霍亂弧菌多抗IgGc-兔抗O139霍亂弧菌多抗IgG圖2兩價霍亂一步法快診試紙條側(cè)剖視圖其中d-膠體金標(biāo)記的抗O1群和抗O139群霍亂弧菌的單抗IgGe-吸水材料f-手持部位不透水材料g-硝酸纖維膜制成的支撐部分
權(quán)利要求
1.霍亂一步法兩價快診試劑盒，其特征是它由一次性試紙條、標(biāo)本稀釋液及說明書組成，可一次同時檢測O1和O139群霍亂弧菌。
2.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是一次性試紙條實驗反應(yīng)區(qū)內(nèi)用生物制劑標(biāo)記顯色條帶，其中a為兔抗鼠IgG,b為兔抗O1群霍亂弧菌多抗IgG,c為兔抗O139群霍亂弧菌多抗IgG。
3.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是一次性試紙條吸水區(qū)內(nèi)最上端為標(biāo)體金標(biāo)記的抗O1和抗O139群霍亂弧菌的單抗IgG。
4.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是標(biāo)本稀釋液由三羥甲基氨基甲烷、緩血酸胺、乙二胺四乙酸二鈉和氯化鈉(偏堿條件下)配制而成，用以稀釋樣品和裂解細(xì)菌。
5.按照權(quán)利要求1、2、3、4所述的試劑盒，其特征是判斷檢測結(jié)果應(yīng)按以下步驟進(jìn)行1)將試紙條按箭頭所指方向進(jìn)入經(jīng)標(biāo)本稀釋液稀釋、裂解的標(biāo)本中，30秒種后取出；2)試紙條中段實驗反應(yīng)區(qū)出現(xiàn)兩條以上玫瑰紅色反應(yīng)帶者視為陽性結(jié)果，表明所測樣品內(nèi)有O1或O139群霍亂弧菌存在；3)實驗反應(yīng)區(qū)出現(xiàn)三條帶時，表明所測樣品為兩種菌O1和O139的混合感染；4)如果實驗反應(yīng)區(qū)僅出現(xiàn)一條反應(yīng)帶，則視為陰性結(jié)果，表明所測樣品中無霍亂病原菌或其濃度偏低；5)如在10分鐘內(nèi)無任何玫瑰紅色帶出現(xiàn)，則視為操作有誤或試劑失效。
全文摘要
本發(fā)明涉及的檢測霍亂弧菌的快速診斷試劑,主要由一次性試紙條和標(biāo)本稀釋液組成,前者的實驗反應(yīng)區(qū)內(nèi)有三條用生物制劑標(biāo)記的條帶,吸水區(qū)上端為膠體金標(biāo)記的抗霍亂弧菌的單抗IgG,各條帶的標(biāo)記完成后,用小牛血清白蛋白封閉硝酸纖維膜,使用時將試紙條浸入經(jīng)標(biāo)本稀釋液稀釋并裂解的標(biāo)本中,經(jīng)過一定時間,根據(jù)出現(xiàn)玫瑰紅色條帶的數(shù)目判斷檢測結(jié)果,具有方便、快速、特異性強之優(yōu)點。
文檔編號G01N33/53GK1224165SQ98123359
公開日1999年7月28日 申請日期1998年12月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月15日
發(fā)明者劉端, 張樹波, 孟凡亮 申請人:中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)微生物學(xué)研究所