專利名稱：早期胃癌的診斷的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及胃癌的診斷，還具體涉及通過檢測患者樣品中環(huán)加氧酶-2的表達以診斷惡化前期的胃癌的方法。
背景技術：
胃癌是世界上最常見和致死的惡性腫瘤之一(Coleman等，1993)。胃癌是芬蘭男人中第四常見的惡性腫瘤，是芬蘭女人中第五常見的惡性腫瘤。占芬蘭所有惡性腫瘤的5％(芬蘭1994年癌癥發(fā)病率，芬蘭癌癥登記處，赫爾辛基，1996)。胃癌的早期診斷是困難的，在大多數(shù)西方國家，5年存活率低于20％(Wanebo等，1993)。90％以上的胃癌是腺癌，通過Lauren分類(Lauren，1965)可將它們分成腸型和擴散型。
胃癌的發(fā)病機理復雜，目前尚不完全了解，但在腸型胃癌中，某些預兆性的變化，如慢性萎縮性胃炎，腸轉化和上皮發(fā)育不良與疾病相關(Antonioli，1994)。與之形成對照的是，擴散型胃癌缺乏公知的預兆性損害。由于已在這兩種不同組織學類型的胃癌中發(fā)現(xiàn)不同組合的遺傳變化，它們可具有不同的遺傳背景(Stemmermann等，1994；Tahara等，1996)。然而，這兩種胃腺癌類型共有的與惡性腫瘤相關的遺傳變化似乎已在疾病惡化前期出現(xiàn)(Tahara等，1996)。如阿斯匹林，indomethacin和sulindac的非類固醇的抗炎癥藥物(NSAID)在動物模型中抑制化學誘導的結腸癌(Steele等，1994；Giardiello等，1995)。流行病學研究表明長期使用阿斯匹林會降低胃腸癌，包括胃癌的發(fā)病率和死亡率(Laakso等，1986；Giardiello，1994；Thun，1994；Thun等，1993)。
NSAID最為人熟知的靶是環(huán)加氧酶(Cox)，該酶是將花生四烯酸轉變?yōu)榍傲邢偎仡惖南匏倜浮Ｒ芽寺〕鰞蓚€Cox基因(Cox-1和Cox-2)，它們在氨基酸水平上具有60％同一性，并具有類似的酶活性(Hershman，1996；Smith等，1996)。Cox-1被認為是管家基因，據認為經由Cox-1途徑合成的前列腺素類負責保護胃細胞，使腎臟血管舒張，和通過血小板產生前聚集前列腺素類，凝血烷。與之形成對照的是，Cox-2是可誘導的即早期基因，其病理生理學作用與炎癥，再生和癌的生成相關。
最近的研究表明Cox-2與結腸癌的生成有關，因此可能是NSAID化學防治作用的靶i)Cox-2基因的破壞或用Cox-2特異性藥物治療會抑制FAP小鼠模型中polyp的形成(Oshima等，1996)，ii)Cox-2在大鼠腸上皮細胞中過量表達會改變其細胞凋亡的速率及其與胞外基質的粘附(Tsujii等，1995)，和iii)兩個不同的Cox-2-選擇性抑制劑抑制大鼠結腸上化學誘導的異常隱蔽的病灶(Takahashi等，1996；Reddy等，1996)。另外，在化學誘導的大鼠結腸癌組織(DuBois等，1996)和人結腸癌中發(fā)現(xiàn)Cox-2而不是Cox-1的mRNA和蛋白質水平與正常粘膜相比有所升高(Eberhart等，1994；Kargman等，1995；Sano等，1995)。
Cox-2選擇性化合物抑制由癌基因誘導Cox-2表達的大鼠腸上皮細胞和哺乳動物上皮細胞增殖這一發(fā)現(xiàn)進一步支持NSAID化學防治作用可靶向Cox-2的想法(Sheng等，1997和Subbaramaiah等，1996)。Tsuji等(1996)最近也報道了Cox-2特異性抑制劑可抑制表達高穩(wěn)態(tài)水平的Cox-2 mRNA的胃和結腸癌細胞系的增殖，而在表達低水平Cox-2 mRNA的細胞系中卻不是如此。
正常的胃腸組織幾乎只含有Cox-1同種型，在健康的胃組織中沒發(fā)現(xiàn)有功能性的Cox-2蛋白(Kargman等，1996)。然而，用比傳統(tǒng)的總RNANorthern印跡雜交測定法更敏感的方法，如用RT-PCR(見O’Neill和Ford-Hutchinson，1993和本發(fā)明的圖2和4)，可檢測一些Cox-2 mRNA。
發(fā)明詳述由于不知道Cox-2是存在于體內胃癌組織中，還是存在于胃癌惡化前的損害中，我們研究了它在胃腺癌，以及嚴重的胃發(fā)育不良(高度惡化前的)中的表達。我們發(fā)現(xiàn)在人胃腺癌組織和嚴重的胃發(fā)育不良中Cox-2，而不是Cox-1的mRNA水平升高。然而，在很少轉化為惡性腫瘤的輕度發(fā)育不良中，Cox-2的表達未升高。在胃癌中，Cox-2蛋白主要位于癌細胞中。Cox-2表達的增加不限于腸型胃癌，因為所分析的3個擴散型癌各含有比其各自的對照水平高的Cox-2 mRNA。因此，Cox-2的過量表達是這兩種在組織學和遺傳學上都不相同的疾病的共有特征，這表明Cox-2的過量表達與癌癥發(fā)生的早期有關。實際上，我們發(fā)現(xiàn)Cox-2在嚴重的胃發(fā)育不良中表達，而在輕度發(fā)育不良中表達未增加。這表明Cox-2的表達與胃癌惡化前的損害特異性相關。
總之，當比較成對的不含癌細胞的胃粘膜樣品時，我們證明Cox-2在人胃癌組織中表達。在腸型和擴散型腺癌中都發(fā)現(xiàn)了Cox-2 RNA，通過免疫組化測得Cox-2蛋白位于胃癌細胞上，但周圍基質中沒有該蛋白。重要的是，代表惡化前損害的嚴重胃發(fā)育不良樣品為高度Cox-2陽性，這表明可將Cox-2用作早期胃癌的診斷標記，并可用于測定惡化前損害的嚴重性。
迄今為止，人癌癥中Cox-2的表達看上去至少被局限于胃腸道，然而，由于結腸癌和胃癌是流行病學，形態(tài)學和遺傳學上不相同的疾病，在嚙齒類動物和人結腸癌組織中發(fā)現(xiàn)的Cox-2 mRNA和蛋白質水平升高的事實未給出任何跡象說明它們在胃組織中的作用。一個胃癌細胞系顯示出可表達高穩(wěn)態(tài)水平的Cox-2 mRNA的事實也未給出任何跡象說明其在體內對早期胃癌的作用。
本發(fā)明的目的是開發(fā)早期胃癌的診斷方法，所述方法包括檢測相關患者樣品中的Cox-2 mRNA或Cox-2蛋白。此方法基于這樣一個發(fā)現(xiàn)，即Cox-2在胃癌細胞和惡化前損害中高度表達，但其在正常胃組織中的表達很低或無法測得。
被測的患者樣品是例如在與胃刷技術聯(lián)合的常規(guī)胃鏡檢查或洗胃過程中得到的活檢或胃刷樣品。洗胃和胃刷技術是常規(guī)胃細胞學中眾所周知的方法，這些技術為顯微鏡檢查提供了來自胃粘膜的細胞樣品以包括或排除胃惡性腫瘤的可能性。與僅目測觀察細胞形態(tài)的本方法相比，如Cox-2的標記物可增加試驗的敏感性和特異性。胃鏡活檢樣品是用福爾馬林固定的(用于免疫組化)，或是在液氮中冷凍并儲存于-70℃(用于測定mRNA)。
使用本領域已知的方法可從所述患者樣品中方便地檢測到Cox-2mRNA。例如，我們證明Northern印跡分析具備很好的特異性，當與RT-PCR聯(lián)合時也非常敏感。
使用例如免疫組化可方便地從所述患者樣品中檢測到Cox-2蛋白，該技術除可檢測Cox-2表達外，還可顯示蛋白質的定位。
本發(fā)明也提供了進行本發(fā)明診斷方法的試劑盒，因此，檢測Cox-2mRNA表達的試劑盒含有RNA或polyA+mRNA分離試劑，用于RT-PCR的Cox-2特異性引物和制備DNA或RNA(有義和反義)探針的cDNA片斷。
免疫檢測Cox-2蛋白的試劑盒含有Cox-2特異性的多克隆或單克隆抗體。對于以肽為基礎分析Cox-2蛋白而言，診斷試劑盒被設計為含有對Cox-2具有結合親和性的特定的肽，這種肽可得自例如噬菌體展示文庫。也可使用基于寡核苷酸的試驗，籍此，相應的診斷試劑盒中包括寡核苷酸(經修飾的RNA分子)。
圖的簡述

圖1A.提取自胃癌樣品1-11及其不含癌細胞的成對對照樣品的總RNA的Northern印跡雜交分析(a，竇(antrum)；c，小體(corpus))。用GAPDH作為上樣對照，用人Cox-1和Cox-2的探針進行雜交。
圖1B.顯示出Cox-2 mRNA與GAPDH mRNA的比例，圖中的值(平均值±SEM)表示由任意光密度單位計算出的Cox-2 mRNA與GAPDH mRNA的比例。這表明與對照樣品相比，胃癌組織表達的Cox-2 mRNA水平顯著較高。
圖1C.顯示出Cox-1 mRNA與GAPDH mRNA的比例，圖中的值(平均值±SEM)表示由任意光密度單位計算出的Cox-1 mRNA與GAPDH mRNA的比例。癌組織中Cox-1 mRNA水平未升高。
圖2.通過RT-PCR檢測第1，5，9和10號胃癌樣品(被鑒定為b)及其不含癌細胞的對照樣品中Cox-1和Cox-2 mRNA水平(a，竇；c，小體)。首先逆轉錄總RNA，然后使用人Cox-1和Cox-2同工酶特異性引物，經PCR擴增cDNA樣品，最后，分析并定量PCR產物(見實驗)。圖中顯示出Cox-2 mRNA與Cox-1 mRNA的比例。
圖3A.免疫組織學染色胃癌組織中的Cox-2顯示出癌細胞(黑箭頭)中的胞質染色(紅棕色)，但在周圍基質(白箭頭)中沒有染色。
圖3B.當將正常兔IgG用作第一抗體時，組織切片未表現(xiàn)出染色。
圖3C和圖3D.用Cox-2抗體染色兩個獨立患者的嚴重胃發(fā)育不良切片。發(fā)育不良的腺體(黑箭頭)為Cox-2陽性，而正常腺體(白箭頭)為陰性。
圖4A.通過RT-PCR檢測輕度發(fā)育不良的胃樣品及其發(fā)育正常的對照樣品中Cox-2 mRNA的水平。方法見圖2，圖中顯示了Cox-2的PCR循環(huán)滴定，循環(huán)數(shù)40被用于圖4C。
圖4B.圖中顯示了GAPDH的PCR循環(huán)滴定，循環(huán)數(shù)28被用于圖4C。
圖4C.圖中顯示了Cox-2 mRNA與GAPDH mRNA的比例，輕度發(fā)育不良(發(fā)育不良I)樣品(453±125，平均值±SEM)及其各自的對照(424±90)之間無統(tǒng)計學差異。
實驗縮寫RT-PCR逆轉錄酶-聚合酶鏈反應Cox-1 環(huán)加氧酶1Cox-2 環(huán)加氧酶2NSAID 非類固醇抗炎癥藥物FAP家族性腺瘤息肉病mRNA 信使RNA(核糖核酸)GAPDH 甘油醛-3-磷酸-脫氫酶SDS十二烷基硫酸鈉患者樣品.12個胃腺癌(表1)和12個卵巢癌的粘蛋白組織學樣品得自外科手術切除的組織，將樣品冷凍于液氮中，儲存于-70℃待分析時用。從分析中排除一個胃癌樣品，因為它在組織學檢查中顯示出強烈的自溶。對于胃癌而言，成對的不含肉眼可見的腫瘤組織或組織學可測的癌細胞的胃粘膜樣品得自竇(n＝10)和小體(n＝10)。經病理學家評價，所有胃癌都是原發(fā)性的腺癌，其中8個是腸型，3個是擴散型(Lauren，1965)。
表1鑒定11個胃癌病例病例 年齡 性別 癌癥位點 癌癥類型 癌癥 竇樣品b小體樣品b(歲)％a188男 角 腸型 50 輕度 輕度282男 小體 腸型 100 無樣品 中度c369男 竇 腸型 20 嚴重 輕度467男整個胃擴散型30 輕度(無樣品)566男 竇，幽門腸型 50 輕度 未提供670女 角 腸型 40 中度 未提供785男 幽門 腸型 80 輕度 輕度875男 竇 擴散型90未提供 輕度962男 小體 腸型 60未提供 嚴重10 82男 角 腸型 60 輕度 輕度11 73男 竇，幽門前 擴散型30未提供未提供
a胃癌樣品中腫瘤細胞的百分比。
b不含癌細胞的樣品中萎縮性胃炎和腸轉化的嚴重性。
cRNA的量不足以進行Northem印跡分析。
RNA的分離和Northem印跡分析使用RNAzolTMB試劑(Tel-Test，F(xiàn)riendswood，TX)，通過Chomczynski和Sacchi(1987)的方法分離總RNA，并通過260nm下的光吸收進行定量。50℃，在1M乙二醛，50％二甲基亞砜和10mM磷酸鹽緩沖液中將RNA樣品(15μg)變性60分鐘，在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳，轉移至Hybond-N尼龍膜(Amersham International，Aulesbury，UK)上，然后用Reprostar II UV發(fā)光器(Camag，Muttenz，Switzerland)UV照射6分鐘。用[32P]-α-dCTP(3000Ci/mmol，DuPont，New England Nuclear，Boston，MA)和Prime-a-Gene試劑盒(Promega，Madison，WI)標記人Cox-1 ORF(1.8kb)，Cox-2 ORF(1.8kb)和甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(GAPDH，0.8kb)的純化的cDNA片斷。用切口柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)純化探針，42℃時，以1×106cpm/ml用于雜交溶液中達16小時，所述雜交溶液含有50％甲酰胺，6×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl和0.015M檸檬酸鈉，pH7.0)，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％牛血清白蛋白，100μg/ml鯡精DNA，100μg/ml酵母RNA和0.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)。50℃下，用0.1-1×SSC和0.1％SDS將濾膜洗滌3次。用FujifilmIP-Reader Bio-Imaging Analyzer BAS 1500(Fuji Photo Co.，日本東京)和廠商提供的MacBas軟件定量Nofthern印跡并通過放射自顯影肉眼觀察。
逆轉錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)用含寡-dT(Pharmacia)和隨機六聚體(Life Technologies)的SuperscriptII(Life Technologies，Gaithersburg，MD)將總RNA(1μg)轉變?yōu)閏DNA。為了得到一半量的結果，3個參數(shù)被最優(yōu)化循環(huán)的次數(shù)，引物的濃度和退火的溫度。在100μl反應混合物中PCR擴增cDNA(4μl)，所述反應混合物中含有10mM Tris-Hcl，pH8.8，50mM Kcl，0.2mM dNTP，1.5mM MgCl，0.2μg(Cox-1)或2μg(Cox-2)有義和反義引物(Ristimaki等，1994)和2.5單位Dynazyme II DNA聚合酶(Finnzymes，Espoo，芬蘭)。圖2的實驗中，樣品被擴增了30(Cox-1)或32(Cox-2)個循環(huán)，每次循環(huán)為96℃變性1分鐘，60℃(Cox-1)或46℃(Cox-2)退火1分鐘，和72℃延伸1分鐘。通過2％瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色分析擴增的cDNA。用高效CCD照相機(集成電路塊為一整體的Cohu 4910系列，Cohu公司，San Diego，CA)和Scion Image 1.57軟件(Scion公司，F(xiàn)rederick，MD)在Macintosh個人電腦上定量擴增的產物。
如上所述進行圖4A和圖4B的RT-PCR方案，然而，所示循環(huán)被重新滴定；結果示于圖4C。
免疫組化分析用10％中性緩沖的福爾馬林固定組織樣品，包埋于石蠟中，切片(約5μm)，在0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)中脫石蠟和微波處理15分鐘。然后將玻片浸于0.6％過氧化氫中達30分鐘，再在正常的山羊血清(5％)/牛血清白蛋白(10％)中浸1小時以分別封閉內源性的過氧化物酶活性和非特異性的結合位點。4℃下，用1∶300-1∶600稀釋的針對小鼠Cox-2肽的兔多克隆免疫球蛋白G(Cayman Chemical公司，Ann Arbor，MI)進行免疫染色過夜。然后用1∶200稀釋的生物素化的第二抗體(Vector Laboratories，Burlingame，CA)處理切片，最后，通過親和素-生物素過氧化物酶復合物溶液(ABComplex，Vectastain，Vector Laboratories)和3-氨基-9-乙基芐唑(Sigma Chemical公司，St.Louis，MO)肉眼觀察抗體結合位點。用Mayer hemalaum(Merck，Darmstadt，德國)進行復染。
統(tǒng)計學分析用Wilcoxon Signed Rank試驗計算統(tǒng)計學顯著性，選擇p＜0.05作為統(tǒng)計學顯著性值。所有結果表示為平均值±SEM。
結果如Northern印跡雜交所測，胃癌組織表達的Cox-2 mRNA水平比不含癌細胞的竇或小體樣品所表達的顯著地高(圖1A)。腸型和擴散型腺癌都可表達Cox-2轉錄物。Cox-2 mRNA的水平不與樣品中癌組織的比例相關。圖1B表明胃癌組織表達的Cox-2 mRNA水平比對照樣品顯著地高(p＜0.05)。如圖1C所示，與各自的對照相比，癌組織中Cox-1轉錄物的水平未升高。
如Northern印跡試驗所測，3個胃癌樣品(第5，9，10號)表達低水平的Cox-2 mRNA(圖1A)。為了進一步評估這些樣品中Cox-1和Cox-2的表達水平，我們以第1號樣品作為陽性對照，進行半定量的RT-PCR。如圖2所示，癌樣品中Cox-2 mRNA與Cox-1 mRNA的比例比不含癌細胞的成對竇或小體樣品中的高。
如圖3A所示，用Cox-2特異性多克隆抗體的免疫組織學染色顯示出癌細胞(黑箭頭)中的胞質染色，而周圍基質(白箭頭)中卻沒有染色。當正常的兔IgG被用作第一抗體時，組織切片未表現(xiàn)出染色(圖3B)。重要的是，圖3C和3D顯示出兩個獨立患者的嚴重胃發(fā)育不良樣品被Cox-2抗體染色。發(fā)育不良的腺體(黑箭頭)為Cox-2陽性，而正常腺體(白箭頭)為陰性。正常的兔IgG未顯示出陽性染色(未顯示)。
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權利要求
1.原位檢測組織學測定的惡化前損害的顯著性以作為胃癌之風險的方法，所述方法包括檢測患者樣品中的a)環(huán)加氧酶-2(Cox-2)mRNA表達，或b)Cox-2蛋白或其活性；Cox-2的超量表達表示胃癌的風險增加。
2.權利要求1的方法，其特征在于被檢測的患者樣品是活檢或胃刷樣品。
3.權利要求1或2的方法，其特征在于使用Northern印跡，原位，RNA酶保護，或RT-PCR基的技術或其聯(lián)合進行Cox-2 mRNA表達的檢測。
4.權利要求1或2的方法，其特征在于使用多克隆或單克隆抗體，基于肽的分析或基于寡核苷酸的測定進行Cox-2蛋白的檢測。
5.進行權利要求3的方法的診斷試劑盒，所述試劑盒中包含RNA或polyA+mRNA分離試劑，RT-PCR所用的Cox-2特異性引物和制備DNA或RNA探針所用的cDNA片斷。
6.進行權利要求4的方法的診斷試劑盒，所述試劑盒中包含Cox-2特異性的多克隆或單克隆抗體，對Cox-2具有結合親和力的特定的肽或對Cox-2具有結合親和力的寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及胃癌的診斷,并特別涉及通過檢測患者樣品中環(huán)加氧酶－2的表達以診斷惡化前期的胃癌的方法。
文檔編號G01N33/50GK1250523SQ98803363
公開日2000年4月12日 申請日期1998年3月18日 優(yōu)先權日1997年3月18日
發(fā)明者阿里·里斯蒂梅基, 馬蒂·哈康南, 彭蒂·西龐南 申請人:羅卡斯·詹尼克斯公司