專利名稱：用于用近紅外光診斷和用于治療的酸不穩(wěn)定的及可酶裂解的染料結(jié)構(gòu)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于用近紅外輻射(NIR輻射)體內(nèi)和體外診斷的酸不穩(wěn)定的及可酶裂解的化合物，這些化合物用作光學診斷試劑和治療劑的應用，以及含有這些化合物的診斷試劑。
近紅外光成象是一種非侵入的診斷方法，其利用生物學組織對波長為650-1000nm的光的高通透性。與紫外光和可見光僅能穿透組織最多幾毫米相反，用近紅外光能穿透組織達幾厘米。光的基本穿透深度很小的原因是內(nèi)源性染料主要是血紅蛋白和水的光吸收，而其在近紅外光光譜范圍內(nèi)在650-1000nm具有最小光吸收值。這一最大光學組織透明度范圍也因此被稱為診斷/治療窗口(Boulnois，J.，Lasers Med Sci 1986，147-66)。因此，在現(xiàn)代成象方法如診斷放射學、磁共振層面X線照相術(shù)或超聲診斷之外，為診斷醫(yī)生提供了另一種用于圖示組織顯現(xiàn)的方法(Haller，E.B.，Time-ResolvedTransillumination and Optical Tomography.J.Biomed Optics 1996，17-17)。
通過檢測血紅蛋白/脫氧血紅蛋白的吸收而利用NIR輻射對嬰兒大腦中的血流和氧合程度進行位點依賴性記錄是已知并應用了許多年的方法(Jobsis，F(xiàn).F.，科學1977，1981264-67；Chance，B.；Leigh，J.S.，；Miyake，H.et al.，美國科學院學報1988，854971-75；Benaron，D.A.et al.，科學1993，33396A)。
應用近紅外輻射的基本問題是光的強散射，因此即使在不同的光學物理特性情況下，一個物體也不易與另一個邊緣分明的物體及其周圍區(qū)域區(qū)分開。當將物體從表面增加移動時，這一問題更突出，并可以認為在透照和檢測熒光輻射情況下是最主要的限制因素。作為對比介質(zhì)的染料可以反映組織的光學性質(zhì)并導致被檢測組織的吸收值和熒光度增加，因此即使位點分辨率較差也可以使檢測結(jié)果很明確。在這種情況下，這種染料化合物的吸收性質(zhì)可被用作成象信息。如果染料還具有以熒光輻射的形式發(fā)射所吸收的能量的性質(zhì)，則這一性質(zhì)也可作為成象信息。在這種情況下，單獨檢測相對于激發(fā)輻射具有向紅效應的熒光輻射。這種情況的優(yōu)勢在于組織本身在NIR范圍具有極低的固有熒光，因此背景是最小的。(S.Folli等，癌癥研究54，2643-9(1994)；B.Ballou等，Cancer Immunol.Immunother.41，257-63(1995)；X.Li等，SPIE Vol 2389，789-98(1995))。
在熒光檢測中，這一方面的前提條件是檢測合適的差異即待檢測的組織和周圍組織之間的熒光發(fā)射的差異盡可能地大。原則上這一點可通過在給予物質(zhì)后一定時間達到熒光染料的濃度差異來實現(xiàn)。尤其是在檢測深層組織時，在使用不加限定濃度的物質(zhì)時這一差異通常是不合適的。
本發(fā)明的一個目的在于提供一種克服了現(xiàn)有技術(shù)缺點的新化合物。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的目的通過通式(I)的化合物實現(xiàn)(F-L)m-A(I)其中F代表在600-1200nm間具有至少一個最大吸收的染料分子，L代表連接結(jié)構(gòu)，其含有一個酸不穩(wěn)定的和/或可酶裂解的鍵，m是一個1-80之間的數(shù)，其中若m是一個1-3之間的數(shù)，則A代表在600-1200nm間具有至少一個最大吸收的染料分子，抗生素活性或細胞抑制活性的分子，生物分子，非生物學大分子或者化合物B-(L-W)o或D-(L-W)o，其中D是非生物學大分子，B是生物分子，L具有上述含義，W代表抗生素活性或細胞抑制活性的分子，o是一個1-20之間的數(shù)，并且若m是一個4-80之間的數(shù)，則A代表生物分子，非生物學大分子或者化合物B-(L-W)o或D-(L-W)o，其中D，B，L，W和o具有上述含義。
本發(fā)明的化合物的針對近紅外熒光發(fā)射的體內(nèi)檢測的特殊性質(zhì)在于其具有很少或甚至沒有熒光發(fā)射，只有在靶位點(例如腫瘤，炎癥)這一結(jié)構(gòu)被裂解后或者染料從這一結(jié)構(gòu)中裂解出來之后才發(fā)生熒光信號的增強。因此，在待檢測組織和周圍組織之間熒光信號的有效差異表現(xiàn)在a)基于藥物動力學機制的濃度差異和b)在診斷時的熒光量子產(chǎn)額的差異。
已發(fā)現(xiàn)當染料分子與另一種分子偶聯(lián)時(二聚體)，染料的熒光猝滅而獲得本發(fā)明的化合物，即與相應的未結(jié)合狀態(tài)的染料分子相比具有極低的熒光發(fā)射。另外還發(fā)現(xiàn)當具有芳香結(jié)構(gòu)的其它分子(其可以是染料和活性成分，例如細胞抑制劑或抗生素)與熒光染料偶聯(lián)時可發(fā)生相當?shù)臒晒忖?。令人驚奇的是，當染料與抗體、抗體片段和蛋白質(zhì)偶聯(lián)時也發(fā)生熒光猝滅。
原則上，作為本發(fā)明的化合物的結(jié)構(gòu)成分的染料其單體未綴合形式必須具有高摩爾吸收系數(shù)和高熒光量子產(chǎn)額。
本發(fā)明的優(yōu)選的通式I的化合物是F和/或A代表聚甲炔染料、四吡咯染料、四氮雜吡咯染料、黃嘌呤染料、吩噁嗪染料或吩噻嗪染料。
特別優(yōu)選的是來自聚甲炔類染料的結(jié)構(gòu)，因為其在700-1000nm間的近紅外光譜范圍具有最大吸收值，摩爾吸收系數(shù)非常高(ε高達300000 l mol-1cm-1)，這類染料例如花青染料、squarililium染料和croconium染料，以及部花青和oxonol染料。
本發(fā)明的通式(I)的這些化合物還優(yōu)選F和/或A代表通式II的花青染料
其中R1-R4和R7-R10各自獨立地代表氟、氯、溴、碘原子或硝基或基團-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1、-E1，其中E1和E2各自獨立地代表鹵素原子、飽和或不飽和的支鏈或直鏈C1-C50烷基鏈，其中該鏈或該鏈的部分任選地可以形成一或多個芳香或飽和環(huán)狀C5-C6單位或雙環(huán)C10單位，并且其中C1-C50烷基鏈被0-15個氧原子和/或0-3個羰基基團間斷和/或被0-5個羥基、0-5個酯基、0-3個羧基、0-3個氨基取代，并且在每種情況下相鄰的基團R1-R4和/或R7-R10可以相互連接形成六元芳香碳環(huán)，R5-R6各自獨立地代表具有上述含義的-E1或代表C1-C4磺烷基鏈，和/或R1-R10代表一個與L的鍵合，Q是下列片段
其中R11代表氫、氟、氯、溴或碘原子或硝基或基團-NE1E2、-OE1或-E1，其中E1和E2具有上述含義，或者R11代表一個與L的鍵合，R12代表氫原子或具有上述含義的基團E1，b是數(shù)字0、2或3，X和Y各自獨立地代表O、S、-CH＝CH-或片段
其中R13和R14各自獨立地代表氫原子、飽和或不飽和的支鏈或直鏈C1-C10烷基鏈，其可被至多5個氧原子間斷和/或被至多5個羥基取代，并且R13和R14可以相互連接形成五或六元環(huán)。
本發(fā)明的另一個主題是通式(I)的化合物，其中具有治療活性分子的染料經(jīng)生理學可裂解的鍵與生物分子或非生物學載體分子相連，或者染料和活性成分經(jīng)生理學可裂解的鍵與生物分子或非生物學載體分子偶聯(lián)。
特別優(yōu)選的結(jié)構(gòu)是其中偶聯(lián)狀態(tài)的染料的熒光被猝滅，并且活性分子的治療活性經(jīng)與染料或載體分子的偶聯(lián)而被掩蔽(前體藥物效應)。鍵的裂解導致熒光發(fā)射的增加并同時伴有活性成分的活性的釋放。
在本發(fā)明的通式(I)中的活性成分W和/或A是例如下述化合物抗生素阿克拉希霉素、放線菌素F1、氨茴霉素、重氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C、卡柔比星、嗜癌素、色霉素、更生霉素、道諾紅菌素、阿霉素、表柔比星、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、匹來霉素、普卡霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、鏈黑菌素、殺結(jié)核菌素、佐柔比星；葉酸類似物二甲葉酸、metothrexate、蝶酰三谷氨酸、trimetrexate；嘧啶類似物環(huán)胞苷、氮胞苷、6-氮尿苷、氟己嘧啶、阿糖胞苷、doxifluridine、enocitabine、5-氟脫氧尿苷、5-氟尿嘧啶；嘌呤類似物fludarabine、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫代鳥嘌呤及上述化合物的衍生物；烷基化物質(zhì)烷基磺酸酯、氮丙啶、乙烯亞胺、甲基蜜胺、硝基脲、氮芥化合物；激素活性物質(zhì)如雄激素、抗腎上腺素、抗雄激素、抗雌激素、雌激素、LH-RH類似物和孕激素；以及其它具有抑制細胞活性的物質(zhì)如紫杉醇和紫杉醇衍生物。
其它活性成分是光動力學活性的物質(zhì)，它們可經(jīng)激發(fā)后能引起光敏作用形成胞毒性單重態(tài)氧和自由基的性質(zhì)來辨別。這類化合物主要是四吡咯和四氮雜吡咯，例如卟啉、苯并卟啉、氯、紅紫素、酞菁、naphthalocyanines和上述化合物的衍生物。其它化合物是膨脹卟啉、porphycenes以及噁嗪和吩噁嗪染料。
通式(I)的連接結(jié)構(gòu)L的化學鍵的結(jié)構(gòu)組成方式是使得其在某些生理參數(shù)即能分辨疾病組織(腫瘤)及與正常組織區(qū)域區(qū)分開的生理參數(shù)情況下被裂解。
文獻中描述腫瘤與正常組織相比有低pH。盡管胞內(nèi)pH基本上是相同的(pH7.4)，但是腫瘤的胞外pH降低達0.5pH單位。另外炎癥特別是細菌型炎癥的pH也降低。pH的測定方法為用微電極測量、用pH敏感的熒光樣品進行熒光測量以及用MR探頭測量(R.J.Gillieset al.，美國生理學雜志267，pc195-203(1994)，G.R.Martin and R.K.Jain，微血管研究46，216-230(1993)，L.E.Gerweck and K.Seetharaman，癌癥研究56，1194-1198(1996)，K.Engin et al.，Int.J.Hyperthermia11(1995)211-216，K.Engin et al.，Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.29(1994)125-132，G.Helmlinger et al.，Nature Medicine 3(1997)177-182.)因此，本發(fā)明的另一主題是具有被降低的生理pH裂解的連接結(jié)構(gòu)L的化合物，這些結(jié)構(gòu)是例如相應于下述片段的烷基腙、?；?、芳基腙、磺酰腙、亞胺、肟、縮醛、酮縮醇、原酸酯
其中p代表2-4之間的數(shù)。
除了經(jīng)降低的pH導致的裂解外，本發(fā)明化合物的裂解還可經(jīng)以升高的濃度存在于待檢測組織(例如腫瘤、細菌性炎癥)中的酶作用進行。
因此，本發(fā)明的另一主題是具有可被酶裂解的連接結(jié)構(gòu)L的化合物，這些可被酶裂解的連接結(jié)構(gòu)是例如被組織蛋白酶、肽酶、羧基肽酶、α-和β-葡糖苷酶、脂酶、氧化酶、磷脂酶、磷酸酶、磷酸二酯酶、蛋白酶、彈性蛋白酶、硫酸酶、還原酶、轉(zhuǎn)移酶和細菌酶如青霉素酰胺酶和β-內(nèi)酰胺酶裂解的結(jié)構(gòu)(P.D.Senter et al.，Bioconjugates Chem.6(1995)，389-94)。
優(yōu)選的可酶裂解結(jié)構(gòu)是短鏈肽序列，如含有氨基酸序列Val-Leu-Lys的序列。
在給藥后一定時間導致在待檢測組織中的濃度或相應的濃度梯度的動力學應與本發(fā)明的化合物的裂解的動力學以及釋放的染料分子的清除的動力學相關(guān)并導致一協(xié)同效應。
其它的優(yōu)選的本發(fā)明的通式(I)的化合物是A和/或B代表抗體、其綴合物和片段、特異的肽和蛋白質(zhì)、受體、酶、酶底物、核苷酸、天然或合成的核糖核酸或脫氧核糖核酸或其化學修飾物、如aptamers或反義寡核苷酸、脂蛋白、凝集素、糖類、單糖、二糖或三糖、直鏈或支鏈寡糖或多糖或糖衍生物或葡聚糖。
另外，本發(fā)明的通式(I)的化合物優(yōu)選的是D代表聚乙二醇、聚丙二醇、聚賴氨酸、或聚賴氨酸樹狀物或其衍生物。
結(jié)構(gòu)元件A、D、B、L和W的連接直接進行或通過通用的官能團進行。這種基團是例如酯、醚、仲胺、叔胺、酰胺、硫脲、脲、氨基甲酸酯基團或馬來酰亞胺結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的另一主題是本發(fā)明的通式I的化合物在用NIR輻射體內(nèi)診斷和治療疾病組織中的應用。
本發(fā)明還包括在用NIR輻射體內(nèi)診斷疾病組織區(qū)域中所用的光學診斷試劑，其含有至少一種本發(fā)明的通式(I)的化合物。
這些試劑根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法生產(chǎn)，任選地使用通用的佐劑和/或載體及稀釋劑等，如生理學相容的電解質(zhì)、緩沖劑、去污劑、用于匹配滲透性的物質(zhì)以及用于改善穩(wěn)定性和溶解性的物質(zhì)。制藥中通用的措施保證了生產(chǎn)中尤其是給藥前制劑的無菌性。
染料F和A的合成參照例如下列文獻所述的方法進行F.M.Hamer，花菁染料及相關(guān)化合物，John Wiley and Sons，紐約，1964；J.Fabian et al.，化學綜述92(1992)1197；L.A.Ernst et al.，細胞計量術(shù)10(1989)3-10；P.L.Southwick et al.，細胞計量術(shù)11(1990)418-430；R.B.Mujumdar et al.，生物綴合物化學4(1993)105-11；E.Terpetschnig et al.，分析生物化學217(1994)197-204；J.S.Lindsey et al.，Tetrahedron 45(1989)4845-66，EP-0591820A1；L.Strekowski et al.，J.Heterocycl.Chem.33(1996)1685-1688；S.R.Mujumdar et al.，生物綴合物化學7(1996)356-362；M.Lipowska et al.，Synth.Commun.23(1993)3087-94；E.Terpetschnig et al.，分析化學282(1993)633-641；M.Matsuoka and T.Kitao，Dyes Pigm.10(1988)13-22；以及N.Narayanan and G.Patronay，I.Org.Chem.60(1995)2361-95。
染料合成方法與文獻中的方法類似，其具有含酸不穩(wěn)定的或可酶裂解的鍵的取代基或者在偶聯(lián)后從其產(chǎn)生這種鍵，所述文獻例如B.M.Mueller et al.，生物綴合物化學1(1990)325-330；K.Srinvasachar and D.M.Neville，生物化學28(1989)2501-09；D.M.Neville et al.，生物化學雜志264(1989)14653-61；T.Kaneko et al.，生物綴合物化學2(1991)133-41；B.A.Froesch et al.，癌癥免疫及免疫治療42(1996)55-63；以及J.V.Crivello et al.，聚合物科學雜志A部聚合物化學34(1996)3091-3102。
以下實施例解釋本發(fā)明實施例1.5-(1-氧乙基)-1，1′-(4-硫丁基)-靛三羰花青鈉鹽1(

圖1)的合成經(jīng)重氮化并用SnCl2還原從4-氨基苯基-甲基酮合成4-肼基苯基甲基酮(方法類似于T.Gorecki et al.，J.Heterocyclic chem.33(1996)1871-76)。
將4.8克(32mmol)4-肼基苯基甲基酮，5.4克乙酸鈉和3.9克(45mmol)3-甲基-2-丁酮在40ml乙酸乙酯中于室溫攪拌1小時、在120℃攪拌4小時。反應混合物真空濃縮，加入300ml二氯甲烷，用飽和NaCl溶液洗有機相。在MgSO4上干燥后，獲得7.5g棕色油。將其與6.5g(48mmol)1，4-丁砜(butanesulfone)一起在140℃加熱5小時，冷卻后用丙酮攪拌，然后經(jīng)色譜純化沉淀的固體(RP C-18，流動相溶劑甲醇/水)。收率2.5g(23％)5-(1-氧乙基)-1-(4-硫丁基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚2。
為生產(chǎn)染料1，將0.5g(1.7mmol)1-(4-硫丁基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚3與0.47g(1.6mmol)鹽酸戊烯二醛二縮苯胺在10ml乙酐于120℃攪拌30分鐘。冷卻后與0.6g(1.8mmol)2、10ml乙酐、4ml乙酸和0.5g乙酸鈉混合并加熱至120℃30分鐘。冷卻深藍色溶液，與200ml乙醚攪拌，并過濾掉沉淀的固體。色譜純化(RP C-18，流動相溶劑甲醇/水)并凍干后，獲得0.3g(26％)產(chǎn)物1。
元素分析CldC61.99 H6.33 N3.91 S8.95FndC61.73 H6.49 N3.80 S8.78吸收值λmax(H2O)＝748nm(ε＝14800 l mol-1cm-1)2.用酸不穩(wěn)定的連接結(jié)構(gòu)修飾(圖2)2.1將1與4-羧基苯基磺酰肼反應將0.2g(0.28mmol)1及74mg(0.34mmol)4-羧基苯基磺酰肼溶于20ml甲醇中，與5μl三氟乙酸混合并在室溫攪拌18小時。真空蒸發(fā)溶劑，殘余物用二氯甲烷洗幾次，干燥產(chǎn)物。收率0.21g4。
2.2將1與4-氨基苯甲酸酰肼反應類似于2.1將0.2g(0.28mmol)1及51mg(0.34mmol)4-氨基苯甲酸酰肼反應。收率0.20g5。
2.3將1與4-(氨基甲基)苯甲酸酰肼反應類似于2.1將0.2g(0.28mmol)1及56mg(0.34mmol)4-氨基甲基苯甲酸酰肼反應。收率0.22g6。
3.反應性官能團(N-羥基琥珀酰亞胺酯和異硫氰酸酯)的產(chǎn)生(圖2)為了產(chǎn)生相應的N-羥基琥珀酰亞胺酯化合物7，導入在12ml二甲基甲酰胺(DMF)中的0.1g(0.1mmol)4和14mg(0.12mmol)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)并在室溫與23mg(0.11mmol)二環(huán)己基碳二亞胺在1ml DMF中的溶液混和。攪拌72小時后，用乙醚沉淀產(chǎn)物，過濾并從DMF/乙醚中再沉淀。真空干燥后獲得的產(chǎn)物(12mg)無需進一步純化而使用。
為了產(chǎn)生酸不穩(wěn)定的異硫氰酸酯化合物8，將0.1g(0.11mmol)5，33mg(0.14mmol)N，N’-硫代羰基二-2(1H)-吡啶酮和15mg(0.15mmol)三乙胺在15ml氯仿中于室溫攪拌60分鐘。用乙醚沉淀產(chǎn)物，過濾并用HPLC(RP Select B，Merck，流動相溶劑10mmol磷酸鹽緩沖液pH8/甲醇)純化。凍干后獲得40mg(40％)8，用二氯甲烷/甲醇分離鹽并真空干燥。
4.mAK9.2.27(抗黑素瘤抗體)的標記4.1用酸不穩(wěn)定NHS-酯7標記將在0.5ml 50mmol硼酸鹽緩沖液(pH9.2)中的1mg抗體與33μl7(在DMF中的5mmol/l初始溶液)混和并在室溫攪拌1小時。經(jīng)NAP-5柱(用25mmol磷酸鹽緩沖液pH7.8，+0.01％NaN3洗脫)分離未結(jié)合的染料。將產(chǎn)物mAK9.2.27/4-綴合物在溶液中于4℃保存。
mAK9.2.27/4-綴合物(在磷酸鹽緩沖液pH7.8中)的VIS/NIR吸收光譜見圖5。
熒光量子產(chǎn)額Q＝0.1％(5μmol/l在磷酸鹽緩沖液pH7.8中；相對于作為標準的靛花青綠在DMSO中的Q＝13％，參見R.C.Benson andH.A.Kues，化學及工程學數(shù)據(jù)22(1977)379)。
4.2用酸不穩(wěn)定異硫氰酸酯8標記將在0.5ml 50mmol硼酸鹽緩沖液(pH9.2)中的1mg抗體與6μl8(在DMF中的5mmol/l初始溶液)混和并在室溫攪拌15分鐘。經(jīng)NAP-5柱(用25mmol磷酸鹽緩沖液pH7.4，+0.01％NaN3洗脫)分離未結(jié)合的染料。將產(chǎn)物mAK9.2.27/5-綴合物在溶液中于4℃保存。
5.二聚的靛三羰花青染料的合成5.1對稱螺環(huán)二聚體10的產(chǎn)生(圖3)
將0.1g(0.47mmol)3，9-二亞乙基-2，4，8，10-四氧雜螺環(huán)-[5.5]十一碳烷(根據(jù)M.Crivello et al.，聚合物科學雜志A部分聚合物化學34(1996)3091-3102所述合成)和0.11g(0.94mmol)6-氨基-1-己醇在15ml乙醚中于室溫攪拌24小時，真空蒸發(fā)溶劑。殘余物在油泵上干燥并無需進一步純化直接反應。
將0.2g(0.28mmol)5-羧基-雙-1，1’-(4-硫丁基)-靛三羰花青鈉鹽9在15ml二氯甲烷中與0.09g(0.28mmol)TBTU和30mg三乙胺一起攪拌30分鐘，并與在2ml二氯甲烷中的0.06g(0.14mmol)上述螺環(huán)化合物混和。在室溫攪拌18小時后，用乙醚沉淀產(chǎn)物并色譜純化(RPC-18，流動相溶劑甲醇/10mmol磷酸鹽緩沖液pH8)。凍干后，用甲醇/二氯甲烷沉淀產(chǎn)物，獲得68mg(26％)產(chǎn)物10。
10(5μmol/l在磷酸鹽緩沖液pH8中)的VIS/NIR吸收光譜見圖6。
熒光量子產(chǎn)額Q＝0.2％(5μmol/l在磷酸鹽緩沖液pH8中；相對于作為標準的靛花青綠，見實施例4.1)。
5.2用酸不穩(wěn)定的腙連接結(jié)構(gòu)6產(chǎn)生染料二聚體(11)將0.1g(0.14mmol)5-羧基-雙-1，1’-(4-硫丁基)-靛三羰花青鈉鹽9在10ml DMF中與45mg(0.14mmol)TBTU和15mg三乙胺一起攪拌30分鐘，并與在2ml DMF中的0.14g(0.16mmol)6混和。在室溫攪拌5小時后，加入乙醚結(jié)晶產(chǎn)物、過濾并色譜純化(RP C-18，流動相溶劑甲醇/10mmol磷酸鹽緩沖液pH8)。凍干后，用甲醇/二氯甲烷沉淀鹽，獲得0.13g(59％)產(chǎn)物11。
11(4μmol/l)在磷酸鹽緩沖液pH8.0中及37℃24小時后在磷酸鹽緩沖液pH6.0中的VIS/NIR吸收光譜見圖7。
6.測量作為時間的函數(shù)的不同pH值下11的熒光量子產(chǎn)額在pH為7.4；7.0；6.6；6.0和5.0的50mmol磷酸鹽緩沖液中的濃度為4μmol/l的11的溶液于37℃保溫，在不同的時間取溶液等份，測定熒光量子產(chǎn)額(SPEX Fluorolog Spectral fluorometer，400W Xe燈，PM958探頭，用探頭的波長依賴的敏感性校準，數(shù)值相對于靛花青，見實施例4.1)。
圖8示出了基于作為時間的函數(shù)的不同pH值下熒光量子產(chǎn)額的增加的觀察到的酸不穩(wěn)定二聚體11的裂解。
7.具有酸不穩(wěn)定腙連接結(jié)構(gòu)的阿霉素-靛三羰花青綴合物(13)的合成(圖4)將20mg(34μmol)鹽酸阿霉素和11mg(68μmol)4-(氨基甲基)-苯甲酸酰肼在加入2μl三氟乙酸后在3ml無水甲醇中于室溫攪拌24小時。用乙腈結(jié)晶產(chǎn)物12，離心，用乙腈洗滌并干燥，得18mg(24μmol)粗產(chǎn)物。將14mg(20μmol)5-羧基-雙-1，1’-(4-硫丁基)-靛三羰花青鈉鹽9在0.5ml DMF中與7mg(22μmol)TBTU和20μl三乙胺一起攪拌30分鐘。在0℃將這一反應混合物滴加入上述12的溶液(18mg于0.2ml DMF)中并在0℃攪拌3小時。通過加入乙醚沉淀產(chǎn)物并類似于實施例5色譜純化產(chǎn)物。獲得12mg(47％)13。
權(quán)利要求
1.通式I的化合物(F-L)m-A (I)其中F代表在600-1200nm間具有至少一個最大吸收的染料分子，L代表連接結(jié)構(gòu)，其含有一個酸不穩(wěn)定的和/或可酶裂解的鍵，m是一個1-80之間的數(shù)，其中若m是一個1-3之間的數(shù)，則A代表在600-1200nm間具有至少一個最大吸收的染料分子，抗生素活性或細胞抑制活性的分子，生物分子，非生物學大分子或者化合物B-(L-W)o或D-(L-W)o，其中D是非生物學大分子，B是生物分子，L具有上述含義，W代表抗生素活性或細胞抑制活性的分子，o是一個1-20之間的數(shù)，并且若m是一個4-80之間的數(shù)，則A代表生物分子，非生物學大分子或者化合物B-(L-W)o或D-(L-W)o，其中D，B，L，W和o具有上述含義。
2.權(quán)利要求1的化合物，其特征在于在通式(I)中，F(xiàn)和/或A代表聚甲炔染料、四吡咯染料、四氮雜吡咯染料、黃嘌呤染料、吩口惡嗪染料或吩噻嗪染料。
3.前述任一項權(quán)利要求的化合物，其中在通式(I)中，F(xiàn)和/或A代表花青染料、squarililium染料，croconium染料，部花青染料或oxonol染料。
4.前述任一項權(quán)利要求的化合物，其中在通式(I)中，F(xiàn)和/或A代表代表通式(II)的花青染料
其中R1-R4和R7-R10各自獨立地代表氟、氯、溴、碘原子或硝基或基團-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1、-E1，其中E1和E2各自獨立地代表鹵素原子、飽和或不飽和的支鏈或直鏈C1-C50烷基鏈，其中該鏈或該鏈的部分任選地可以形成一或多個芳香或飽和環(huán)狀C5-C6單位或雙環(huán)C10單位，并且其中C1-C50烷基鏈被0-15個氧原子和/或0-3個羰基基團間斷和/或被0-5個羥基、0-5個酯基、0-3個羧基、0-3個氨基取代，并且在每種情況下相鄰的基團R1-R4和/或R7-R10可以相互連接形成六元芳香碳環(huán)，R5-R6各自獨立地代表具有上述含義的-E1或代表C1-C4磺烷基鏈，和/或R1-R10代表一個與L的鍵合，Q是下列片段
其中R11代表氫、氟、氯、溴或碘原子或硝基或基團-NE1E2、-OE1或-E1，其中E1和E2具有上述含義，或者R11代表一個與L的鍵合，R12代表氫原子或具有上述含義的基團E1，b是數(shù)字0、2或3，X和Y各自獨立地代表O、S、-CH＝CH-或片段
其中R13和R14各自獨立地代表氫原子、飽和或不飽和的支鏈或直鏈C1-C10烷基鏈，其可被至多5個氧原子間斷和/或被至多5個羥基取代，并且R13和R14可以相互連接形成五或六元環(huán)。
5.前述任一項權(quán)利要求的化合物，其中在通式(I)中，W或A代表抗生素、葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物、激素活性物質(zhì)以及其他具有抑制細胞活性的物質(zhì)。
6.前述任一項權(quán)利要求的化合物，其中在通式(I)中，L代表含有下述酸不穩(wěn)定片段的結(jié)構(gòu)
其中p代表2-4之間的數(shù)。
7.前述任一項權(quán)利要求的化合物，其中在通式(I)中，L代表含有可酶裂解的化學鍵的結(jié)構(gòu)。
8.前述任一項權(quán)利要求的化合物，其中在通式(I)中，L代表被組織蛋白酶、肽酶、羧基肽酶、α-和β-葡糖苷酶、脂酶、氧化酶、磷脂酶、磷酸酶、磷酸二酯酶、蛋白酶、彈性蛋白酶、硫酸酶、還原酶、轉(zhuǎn)移酶和細菌酶裂解的結(jié)構(gòu)。
9.前述任一項權(quán)利要求的化合物，其中在通式(I)中，A和/或B代表抗體、其綴合物和片段、特異的肽和蛋白質(zhì)、受體、酶、酶底物、核苷酸、天然或合成的核糖核酸或脫氧核糖核酸或其化學修飾物、如aptamers或反義寡核苷酸、脂蛋白、凝集素、糖類、單糖、二糖或三糖、直鏈或支鏈寡糖或多糖或糖衍生物或葡聚糖。
10.前述任一項權(quán)利要求的化合物，其中在通式(I)中，D代表聚乙二醇、聚丙二醇、聚賴氨酸、或聚賴氨酸樹狀物或其衍生物。
11.權(quán)利要求1的化合物在用于用NIR輻射體內(nèi)診斷疾病組織和用于治療疾病組織中的應用。
12.用于用NIR輻射體內(nèi)診斷疾病組織的光學診斷試劑，其中其含有至少一種權(quán)利要求1的化合物，以及通用的佐劑和/或載體和稀釋劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于用近紅外輻射(NIR－輻射)體內(nèi)和體外診斷的酸不穩(wěn)定的及可酶裂解的化合物,這些化合物用作光學診斷試劑和治療劑的應用,以及含有這些化合物的診斷試劑。
文檔編號G01N33/574GK1253507SQ98804489
公開日2000年5月17日 申請日期1998年4月2日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月23日
發(fā)明者凱·利哈, 比約恩·里夫科, 沃爾夫哈特·澤姆勒, 沃爾夫?qū)じヌm西德洛 申請人:柏林自由大學診斷研究所有限公司