專利名稱:同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)抗原純化新工藝的制作方法
本發(fā)明屬生物化學(xué)領(lǐng)域，是放射免疫測(cè)定藥盒制備中，同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)抗原純化的新工藝。
在制備放射免疫測(cè)定(RIA)藥盒時(shí)，使用125I等同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)抗原常會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生降解，使標(biāo)記后的蛋白質(zhì)抗原純度下降，達(dá)不到較高的純度，直接影響RIA的質(zhì)量和測(cè)定的準(zhǔn)確性。如果標(biāo)記抗原與過(guò)量抗體的結(jié)合率低于80%，RIA則不能建立。
本發(fā)明的目的是建立一種使標(biāo)記后的蛋白質(zhì)抗原純度增高，而且簡(jiǎn)便，快速純化蛋白質(zhì)抗原的新工藝方法。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思特點(diǎn)是首先采用常規(guī)的聚丙烯酰胺凝膠平板電泳技術(shù)，使標(biāo)記蛋白質(zhì)抗原純化到電泳純水平。然后用放射自顯影技術(shù)在平板凝膠上準(zhǔn)確地顯示標(biāo)記蛋白質(zhì)的位置。並把相當(dāng)位置的凝膠裁割下來(lái)備用。最后用電泳法將凝膠上標(biāo)記的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)，收集、分裝。
本發(fā)明的工藝分三步一、同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)抗原的平板電泳使用常規(guī)的垂直或水平聚丙烯酰胺凝膠平板電泳，也可以使用十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠平板電泳和等電聚焦平板電泳。樣品(如白細(xì)胞三烯A4水解酶)與2-3倍體積的樣品緩沖液混合，然后將樣品分為3-10份，每份量在50微升以下，把每份樣品分別加入凝膠的加樣井中。使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳時(shí)，應(yīng)使用雙層膠技術(shù)，即在7-15%凝膠(分離膠)的上面加一層1-2cm高的2.0-4.0%凝膠(樣品膠)，以使樣品濃縮后進(jìn)入分離膠，可提高分辯率，提高蛋白質(zhì)抗原純化程度。加入樣品后，通直流電2毫安;當(dāng)指示色帶進(jìn)入分離膠后，電流提高至4毫安;當(dāng)指示色帶到達(dá)凝膠底端時(shí)，停止電泳。電泳時(shí)間約4小時(shí)。
二、標(biāo)記抗原的放射自顯影定位將電泳后的平板凝膠取下，包一層保護(hù)膜，在暗室內(nèi)取相應(yīng)尺寸的χ光底片一塊，放在凝膠下面，固定在暗盒中曝光(曝光時(shí)間隨同位素種類和使用劑量而異)。底片經(jīng)顯影、定影、清晰地顯示標(biāo)記蛋白質(zhì)的位置。圖1是放射自顯影的定位凝膠圖。〔1〕為所需要的蛋白質(zhì)在凝膠上顯示的條帶。〔2〕為降解蛋白質(zhì)和雜質(zhì)的條帶。將所需要的蛋白質(zhì)條帶〔1〕裁割下來(lái)，置于冰箱中備用。
三、標(biāo)記蛋白質(zhì)抗原的電泳洗脫圖2是同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)抗原的電泳洗脫圖?！?〕為電泳槽，(20×10×5cm)，〔2〕電極，〔3〕緩沖液Ⅰ〔5毫克分子，三羥甲氨基甲烷(triS)〕，(2.5毫克分子醋酸，PH8.6)，〔4〕為透析袋，〔5〕緩沖液Ⅱ(緩沖劑Ⅰ+0.05%牛血清白蛋白)，〔6〕為凝膠塊。
電泳槽內(nèi)盛滿緩沖液Ⅰ，取直徑為1-2cm的透析袋一段，于緩沖液Ⅰ中浸泡3-10分鐘，將透析袋內(nèi)裝滿緩沖液Ⅱ，同時(shí)裝入含有同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)抗原的凝膠塊，扎緊透析袋，以系帶固定于電泳槽上，使透析袋與電極平行。通過(guò)穩(wěn)壓直流電200伏，電泳1小時(shí)左右，電泳后將透析袋中含有同位素標(biāo)記抗原的緩沖液Ⅱ，吸出、分裝，純化過(guò)程即完成。
以白細(xì)胞三烯A4水解酶(LTA4H)放射免疫測(cè)定藥盒制備中用1125Ⅰ標(biāo)記LTA4H的純化為例
取125I-LTA4H5微克，100微升，比放射強(qiáng)度120微居里/微克。樣品分子量70，000道爾頓，125I標(biāo)記前，樣品純度為90%以上，標(biāo)記后與過(guò)量抗體的結(jié)合率為68%，(使用抗LTA4H兔抗血清，1∶10稀釋，培育48小時(shí)，4℃，加入1∶5羊抗兔免疫球蛋白抗血清，培育24小時(shí)，4℃，離心后分別測(cè)上清液與沉渣的放射活性，計(jì)算出結(jié)合率)。
1、采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳125I-LTA4H100微升，混入300微升樣品緩沖液，將樣品分為10份，加入凝膠的樣品井中。樣品膠為3.0%聚丙烯酰胺，分離膠為10%，采用陰離子電泳系統(tǒng)，電極緩沖液為三羥甲氨基甲烷(triS)3.0克，甘氨酸14.4克，SDS1.0克，加水至1升，pH8.8，加入樣品后，電泳槽的上槽接負(fù)極，下槽接正極，通直流電2毫安1小時(shí)，樣品色帶進(jìn)入分離膠后，電流加至4毫安，2-3小時(shí)，色帶到達(dá)凝膠底端，停止電泳。
2、將電泳后的平板凝膠取下，用塑料薄膜包好，在暗室內(nèi)將凝膠放在30×20厘米的χ光底片上，放入暗盒固定。曝光5分鐘將底片取出，經(jīng)顯影、定影，底片上清晰地顯示出標(biāo)記蛋白質(zhì)的位置。圖1中的〔1〕最寬，著色最重的條帶為125I-LTA4H。把凝膠重新放在底片上，對(duì)準(zhǔn)原來(lái)的位置，按照底片上的顯影位置，將125I-LTA4H凝膠帶裁割下來(lái)，置冰箱中保存、備用。
3、取直徑1.5厘米的透析袋，長(zhǎng)20厘米。在緩沖液Ⅰ中浸泡后，裝滿緩沖液Ⅱ，將125I-LTA4H凝膠塊數(shù)塊，放入透析袋中，扎口，以系帶固定于電泳槽上，使透析袋大致于與電極平行，置于盛滿緩沖液Ⅰ的電泳槽中，直流電200伏，電泳1小時(shí)，然后，將袋內(nèi)含有125I-LTA4H的緩沖液Ⅱ取出，分裝，100微升/瓶。
效果純化后的125I-LTA4H與過(guò)量抗體結(jié)合率達(dá)90%以上，達(dá)到放射免疫測(cè)定藥盒的標(biāo)準(zhǔn)。用r-計(jì)數(shù)器測(cè)得純化后的總計(jì)數(shù)為純化前的65-70%?；厥章矢哂?0%。
本工藝方法也可用于放置時(shí)間較長(zhǎng)的標(biāo)記蛋白質(zhì)抗原的再純化和用于14C、3H和131I標(biāo)記蛋白質(zhì)抗原的純化。具有回收率高，操作簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)抗原的純化工藝，其特征在于連續(xù)采用同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)抗原的平板電泳，包括聚丙烯酰胺凝膠平板電泳和等電聚焦平板電泳。將電泳后的平板凝膠取下，用放射自顯影的方法定位，顯示標(biāo)記蛋白質(zhì)的位置，最后將所需的蛋白質(zhì)用電泳洗脫的辦法洗脫下來(lái)。
2.如權(quán)利要求
1所述的工藝，其特征在于使用十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳時(shí)，使用雙層膠技術(shù)，即在7-15%的凝膠上面加一層1-2cm高的2.0-4.0%的凝膠，能提高分辨率，提高抗原純化程度。
3.如權(quán)利要求
2所述的工藝，其特征在于將平板電泳后的凝膠用放射自顯影的方法定位，顯示出標(biāo)記蛋白質(zhì)的位置，將所需的蛋白質(zhì)的凝膠裁割下來(lái)，進(jìn)行洗脫。
4.如權(quán)利要求
3所述的工藝，其特征在于用電泳洗脫法，將蛋白質(zhì)凝膠塊置于透析袋中進(jìn)行電泳洗脫，所需蛋白質(zhì)剛好洗脫于透析袋中，進(jìn)行分裝。
專利摘要
本發(fā)明建立一種使標(biāo)記后的蛋白質(zhì)抗原純度增高的純化蛋白質(zhì)的新工藝。
文檔編號(hào)G01N33/534GK87102688SQ87102688
公開(kāi)日1988年10月26日 申請(qǐng)日期1987年4月8日
發(fā)明者富繼義 申請(qǐng)人:白求恩醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan