專利名稱：粘膜炎莫拉氏菌蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及來自粘膜炎布蘭漢氏球菌的新型蛋白質(zhì)、編碼這類蛋白質(zhì)的DNA序列、及其在診斷和作為疫苗主要成分中的用途。
粘膜炎布蘭漢氏球菌(Branhamella catarrhalis)(也稱作粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis))是一種可導致人呼吸道感染的革蘭氏陰性需氧菌。粘膜炎布蘭漢氏球菌可以作為人、特別是兒童呼吸道微生物區(qū)系中的一部分存在。這種細菌可導致成年人的下呼吸道感染和兒童的中耳炎(Klein J.O.,《臨床感染性疾病》(Clin.Infect.Dis.)19:823-833(1994)；Murphy T.F.《微生物學回顧》(Microbial.Rev.)60:267-279(1996)；Nicotra等《國際藥物檔案》(Arch.Intern.Med.)146:890-893)。在一項研究中發(fā)現(xiàn)在患有慢性阻塞性肺病的成年人中約30％的化膿性惡化是由粘膜炎布蘭漢氏球菌導致的(Verghese等《抗菌劑化療》(Antimicrob.Agents Chemother.)34:1041-1044(1990))。使用中耳液體培養(yǎng)物進行的研究顯示15-20％的中耳炎發(fā)作是由粘膜炎布蘭漢氏球菌導致的(Klein,1994,文獻同上)。
由粘膜炎布蘭漢氏球菌導致的感染可誘發(fā)對細菌外膜抗原的免疫反應(Chapman等《感染性疾病雜志》(J.Infect.Dis.)151:878-882(1985)；Faden等《感染性免疫》(Infect.Immun.)60:3824-3829(1992)；Sethi等《感染性免疫》(Infect.Immun.)63:1516-1520(1995))。對粘膜炎布蘭漢氏球菌的抗體存在于上呼吸道中的分泌物中(Fadden(1992)，文獻同上；Stenfors,L.E.和Raisanen,S.《耳鼻喉學誌》(Acta.Otolaryngol.)113:191-195(1993))。菌株特異性粘膜免疫反應對預防由粘膜炎布蘭漢氏球菌導致的中耳炎來說是重要的(Faden(1992),文獻同上；和Stenfors與Raisanen(1993),文獻同上)。
大量專利公開文獻已經(jīng)公開了來源于粘膜炎布蘭漢氏球菌的分離的蛋白質(zhì)及其作為抗原的潛在用途。實例包括WO90/12591、WO93/03761、WO95/09025、WO95/31215、WO96/12733和WO97/41731。
然而，例如對提供一定范圍的來自粘膜炎布蘭漢氏球菌的抗原存在持續(xù)的需求以便產(chǎn)生更好和更為有效的疫苗。目前我們已經(jīng)分離了可用于引起免疫反應的一定范圍的這類蛋白質(zhì)以及作為診斷工具的用途。
因此，在第一個方面中，本發(fā)明提供了一種屬于粘膜炎布蘭漢氏球菌抗原且具有的由SDS-PAGE測定的表觀分子量約為14-約71kDa的蛋白質(zhì)。
在優(yōu)選的實施方案中，所述的蛋白質(zhì)是一種下列分離自粘膜炎布蘭漢氏球菌的蛋白質(zhì)(ⅰ)具有由SDS-PAGE測定的表觀分子量約為14kDa的蛋白質(zhì)；(ⅱ)具有由SDS-PAGE測定的表觀分子量約為14.5kDa的蛋白質(zhì)；(ⅲ)具有由SDS-PAGE測定的表觀分子量約為15kDa的蛋白質(zhì)；(ⅳ)具有由SDS-PAGE測定的表觀分子量約為20kDa并具有下列N-末端序列的蛋白質(zhì)AISYGNSADAQPYVGAKIGQVDAKQINNKNT；(ⅴ)具有由SDS-PAGE測定的表觀分子量約為30kDa并具有下列N-末端序列的蛋白質(zhì)NVVTNTGATVVDGTRTIFSTLVKPAAVVAAV；(ⅵ)具有由SDS-PAGE測定的表觀分子量約為35kDa并具有下列N-末端序列的蛋白質(zhì)TPTVYGKAFLTIDANNTDXTY；(ⅶ)具有由SDS-PAGE測定的表觀分子量約為44kDa并具有下列N-末端序列的蛋白質(zhì)AGLDRSGQDVTASLQDGTYA；
(ⅷ)具有由SDS-PAGE測定的表觀分子量約為71kDa并具有下列內(nèi)部肽序列的蛋白質(zhì)殘基350-361GELSSNLQDRHK殘基366-380ADIHGNRFRGSAAIAS殘基528-533NFEYLK殘基542-556FGELSVGDSHSVFLQ殘基665-682DADVTGGFYGPNATEMGG。
如上所述，將本發(fā)明的蛋白質(zhì)和多肽類用作抗原物質(zhì)。這類物質(zhì)可以是“抗原的”和/或“免疫原性的”。一般來說，“抗原的”指的是能夠用于產(chǎn)生抗體或?qū)嶋H上能夠在受治療者體內(nèi)誘發(fā)抗體反應的蛋白質(zhì)或多肽?！懊庖咴缘摹敝傅氖悄軌蛟谑苤委熣唧w內(nèi)引起保護性免疫反應的蛋白質(zhì)或多肽。因此，在后一種情況中，所述的蛋白質(zhì)或多肽不僅可以產(chǎn)生抗體反應而且可以產(chǎn)生以非抗體為基礎的免疫反應。
本領域技術(shù)人員認識到本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽類的同系物或衍生物也應用于本發(fā)明的上下文中，即作為抗原/免疫原性物質(zhì)。因此，例如包括一種或多種附加、缺失、置換等在內(nèi)的蛋白質(zhì)或多肽類也包括在本發(fā)明中。此外，能夠?qū)⒁环N氨基酸用另一種相似“類型”的氨基酸來取代。例如，將一種疏水氨基酸用另一種疏水氨基酸來取代。可以使用一種諸如CLUSTAL程序這樣的程序以比較氨基酸序列。該程序可比較氨基酸序列且如果合適通過在各序列中插入間隔來發(fā)現(xiàn)最佳排列。能夠計算最佳排列的氨基酸同一性或相似性(氨基酸類型的同一性+保守性)。類似于BLASTx這樣的程序可排列最長的一段類似序列并給予其適宜的值。因此能夠獲得發(fā)現(xiàn)具有相似性的幾個區(qū)域的比較結(jié)果，它們各自具有不同的評分。兩類分析均是本發(fā)明中所關(guān)注的。
在同系物和衍生物的情況中，本文所述與蛋白質(zhì)或多肽的同一性程度的重要性低于所述同系物或衍生物應保持其對肺炎鏈球菌的抗原性或免疫原性的重要性。然而，合適的是提供與本文所述的蛋白質(zhì)或多肽類具有至少60％相似性的同系物或衍生物(如上所述)。優(yōu)選提供具有至少70％相似性的同系物或衍生物、更優(yōu)選提供具有至少80％相似性的同系物或衍生物。最優(yōu)選提供具有至少90％乃至95％相似性的同系物或衍生物。
在一種可選擇的手段中，所述的同系物或衍生物可以是融合蛋白即例如通過有效標記所需蛋白質(zhì)或多肽而引入方便進行純化的部分。必須除去“標記”或在這種情況中所述的融合蛋白自身應保持足夠的抗原性是有用的。
可以將基因克隆技術(shù)用于提供基本上純的形式的本發(fā)明蛋白質(zhì)。例如，在J.Sambrook等在《分子克隆》(Molecular Cloning)第2版，Cold Spring Harbor laboratory Press(1989)中公開了這些技術(shù)。因此，也可以將本文公開的蛋白質(zhì)N-末端序列用作分離編碼各個蛋白質(zhì)的基因的探針的基礎。因此，在本發(fā)明的另一個方面中，提供了包括如下序列或由如下序列組成的核酸分子(ⅰ)編碼本文所述的蛋白質(zhì)或多肽的DNA序列或其RNA等價物；(ⅱ)與(ⅰ)的任意序列互補的序列；(ⅲ)與(ⅰ)和(ⅱ)的那些序列具有基本上同一性的序列；(ⅳ)編碼本文所述蛋白的同系物、衍生物或片段的序列。
本發(fā)明的核酸分子可以包括大量這類序列和/或片段。本領域技術(shù)人員會認識到本發(fā)明可以包括在本文中列舉的那些特殊新型核酸分子的新型變體。這類變體也包括在本發(fā)明中。例如，由于菌株的變異，實際上存在這些變體。例如，包括附加、置換和/或缺失。另外和特別地，當使用微生物表達系統(tǒng)時，希望通過在用于表達的特定生物體中利用公知優(yōu)選密碼子用途來工程化所述的核酸序列。因此，合成或非天然出現(xiàn)的變體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
當使用上述術(shù)語“RNA等價物”時，它指的是一種給定的RNA分子，該分子具有與給定DNA分子序列互補的序列(實際上滿足RNA的“U”取代遺傳密碼中的“T”)。
當為了測定同源性或同一性程度的目的而比較核酸序列時，可以使用諸如BESTFIT和GAP(兩者均來自Wisconsin Genetics ComputerGroup(GCG)軟件包)這樣的程序。例如，BESTFIT比較兩種序列并產(chǎn)生大多數(shù)相似片段的最佳排列。GAP能夠使序列延其全長排列且如果合適通過在序列中插入間隔來發(fā)現(xiàn)最佳排列。在本發(fā)明上下文中，當討論核酸序列的同一性時，適當進行比較，使所述序列延其全長排列來進行比較。
優(yōu)選的情況是，具有基本上同一性的序列與所述序列具有至少50％的序列同一性、理想的是具有至少75％的序列同一性且更優(yōu)選具有至少90％或至少95％的序列同一性。在某些情況中，序列同一性可以為99％或99％以上。
理想的情況是，術(shù)語“基本上同一性”指的是所述序列與本文所述的任意序列具有同一性的程度比與現(xiàn)有技術(shù)的核酸序列的同一性的程度更高。
然而，應注意如果本發(fā)明的核酸序列編碼至少部分新型基因產(chǎn)物，那么本發(fā)明在其范圍內(nèi)包括可編碼所述基因產(chǎn)物或其新型部分的所有可能的序列。
所述的核酸分子可以是分離型或重組型?？梢詫⑺胼d體且可以將所述載體引入宿主。這類載體和合適的宿主也構(gòu)成本發(fā)明的另外的方面。
因此，例如通過使用以本文所述N-末端氨基酸序列為基礎設計的探針可以鑒定粘膜炎布蘭漢氏球菌中的基因。然后可以使用限制酶切下它們并將其克隆入載體?？梢詫⒃撦d體引入合適的宿主用于表達。
通過使用與所述核酸分子部分序列互補的合適的探針可以從粘膜炎布蘭漢氏球菌中獲得本發(fā)明的核酸分子?？梢詫⑾拗泼富虺曁幚砑夹g(shù)用于獲得用于探測的合適大小的片段。
或者可以將PCR技術(shù)用于擴增所需的核酸序列。因此，可以將本文提供的序列數(shù)據(jù)用于設計進行PCR的兩種引物，使得可以靶向包括完整基因或其片段在內(nèi)的所需序列且然后將它們擴增至較高的程度。一種引物通常表現(xiàn)出對位于一種DNA分子鏈上的第一種序列的高度特異性，而另一種引物通常表現(xiàn)出對位于DNA序列互補鏈上并且從互補序列到第一種序列之間存在間隔的第二種序列的高度特異性。
典型的引物至少有15-25個核苷酸長。
作為一種進一步的選擇，可以使用化學合成方法。該方法可以自動進行?？梢曰瘜W合成相對較短的序列并將它們彼此連接以產(chǎn)生較長的序列。
本領域技術(shù)人員會認識到對分子量進行SDS-PAGE測定可使結(jié)果產(chǎn)生±10％誤差范圍。因此，已經(jīng)如此測定的本文所述的任何表觀分子量均會有這樣的誤差。
本領域技術(shù)人員會認識到也可以使用本發(fā)明的抗原性蛋白質(zhì)片段，當然條件是這類片段可保持有效的充分的抗原性。用于篩選這類片段的技術(shù)對于本領域技術(shù)人員來說是眾所周知的。因此，在第二個方面中，本發(fā)明提供了一種或多種本文所述的蛋白質(zhì)抗原性片段。
如上所述，本發(fā)明抗原(包括抗原性片段)的初級用途是引起免疫反應。因此，在第三個方面中，本發(fā)明提供了一種免疫原性組合物，優(yōu)選一種疫苗組合物，它包括一種或多種本發(fā)明的抗原(包括抗原性片段)?？梢杂脴藴实乃幬镙d體、賦形劑、稀釋劑等來配制該組合物。此外，它可以包括一種或多種佐劑用于促進任何免疫反應。本發(fā)明的疫苗組合物可以包括一種或多種佐劑。在本領域中眾所周知的佐劑的實例包括諸如氫氧化鋁這樣的無機凝膠或諸如弗氏不完全佐劑這樣的油包水乳劑。其它有用的佐劑對于本領域技術(shù)人員來說是眾所周知的。
在第四個方面中，本發(fā)明提供了本文所述的一種或多種蛋白質(zhì)或一種或多種其抗原性片段在制備免疫原性組合物中的用途。優(yōu)選的情況是，該免疫原性組合物是一種疫苗。在優(yōu)選的實施方案中，該疫苗用于預防或治療呼吸感染或者預防或治療中耳炎。
特別地，將一種或多種下列蛋白質(zhì)、同系物、衍生物或一種或多種其抗原性片段用于/一起用于制備所述的免疫原性組合物(ⅰ)具有由SDS-PAGE測定的表觀分子量約為14kDa的蛋白質(zhì)；(ⅱ)具有由SDS-PAGE測定的表觀分子量約為14.5kDa的蛋白質(zhì)；(ⅲ)具有由SDS-PAGE測定的表觀分子量約為15kDa的蛋白質(zhì)；(ⅳ)具有由SDS-PAGE測定的表觀分子量約為20kDa并具有下列N-末端序列的蛋白質(zhì)AISYGNSADAQPYVGAKIGQVDAKQINNKNT；(ⅴ)具有由SDS-PAGE測定的表觀分子量約為30kDa并具有下列N-末端序列的蛋白質(zhì)NVVTNTGATVVDGTRTIFSTLVKPAAVVAAV；(ⅵ)具有由SDS-PAGE測定的表觀分子量約為35kDa并具有下列N-末端序列的蛋白質(zhì)TPTVYGKAFLTIDANNTDXTY；(ⅶ)具有由SDS-PAGE測定的表觀分子量約為44kDa并具有下列N-末端序列的蛋白質(zhì)AGLDRSGQDVTASLQDGTYA；(ⅷ)具有由SDS-PAGE測定的表觀分子量約為71kDa并具有下列內(nèi)部肽序列的蛋白質(zhì)殘基350-361GELSSNLQDRHK殘基366-380ADIHGNRFRGSAAIAS殘基528-533NFEYLK殘基542-556
FGELSVGDSHSVFLQ殘基665-682DADVTGGFYGPNATEMGG。
本文所述的抗原性蛋白質(zhì)、衍生物、同系物或其片段可以單獨提供、作為純化或分離的制劑提供或作為與其它粘膜炎布蘭漢氏球菌抗原性蛋白質(zhì)的混合物的一部分來提供。
因此，在第五個方面中，本發(fā)明提供了一種抗原組合物，它包括一種或多種本發(fā)明的蛋白質(zhì)、一種或多種其同系物或衍生物或一種或多種其抗原性片段、可選擇性地混合于至少一種其它粘膜炎布蘭漢氏球菌抗原或一種或多種其抗原性片段。
另外，可以將本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其抗原性片段用于產(chǎn)生或篩選抗體。
因此，在進一步的方面中，本發(fā)明提供了對至少一種本發(fā)明蛋白質(zhì)或?qū)σ环N或多種其抗原性片段產(chǎn)生的抗體。優(yōu)選的抗體特異性地與本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合并由此可以將其用于純化這類蛋白質(zhì)(例如可以將它們固定并用于結(jié)合本發(fā)明的蛋白質(zhì)。然后可以通過用合適的洗脫劑在合適的條件下進行洗滌來洗脫所述的蛋白質(zhì))。
本發(fā)明范圍內(nèi)的抗體可以是單克隆的或多克隆的。
當將本發(fā)明的蛋白質(zhì)注入動物體內(nèi)時，多克隆抗體可以通過刺激其在合適的動物宿主(例如小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、綿羊、山羊或猴)中的產(chǎn)生而得到增加。如果需要，可以與本發(fā)明的蛋白質(zhì)一起給予一種佐劑?？梢允褂弥T如如上所述的那些眾所周知的佐劑。然后通過它們與本發(fā)明蛋白質(zhì)的結(jié)合來純化所述的抗體。
單克隆抗體可以從雜交瘤中產(chǎn)生。通過使產(chǎn)生所需抗體的骨髓瘤細胞和脾細胞融合以便形成無限增殖細胞系來產(chǎn)生這些單克隆抗體。因此，可以使用眾所周知的Kohler & Milstein技術(shù)(《自然》(Nature)256(1975))或在該技術(shù)基礎上進行的改進技術(shù)。
用于生產(chǎn)與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的單克隆抗體和多克隆抗體的技術(shù)目前在本領域中得到了充分的開發(fā)。在標準的免疫學教科書、例如Roitt等在《免疫學》(Immunology)第二版(1989)，Churchill Livingstone,London中討論了這些技術(shù)。
除全部抗體外，本發(fā)明還包括能夠結(jié)合本發(fā)明蛋白質(zhì)的其衍生物。因此，本發(fā)明包括了抗體片段和合成的構(gòu)建體。抗體片段和合成構(gòu)建體的實例由Dougall等在Tibtech 12 372-379(1994年9月)中給出。
例如，抗體片段包括Roitt等在上述文獻中所述的Fab、F(ab)2和FV片段。可以修飾Fv片段以便產(chǎn)生稱作單鏈Fv(scFv)分子的合成構(gòu)建體。它包括共價結(jié)合Vh和Vl區(qū)的肽接頭，該接頭有利于分子的穩(wěn)定性?？梢允褂玫钠渌铣蓸?gòu)建體包括CDR肽類。它們是含有抗原結(jié)合決定簇的合成肽類。還可以使用肽的模擬物。這些分子通常是構(gòu)象上限制的模擬CDR環(huán)狀結(jié)構(gòu)的有機環(huán)并且它們包括抗原相互作用側(cè)鏈。
合成構(gòu)建體包括嵌合分子。因此，例如，人源化(或靈長源化)的抗體或其衍生物屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。人源化抗體的一個實例是具有人構(gòu)架區(qū)而不是嚙齒類超變區(qū)的抗體。Morrison等在PNAS,81,6851-6855(1984)和Takeda等在《自然》(Nature)314,452-454(1985)中討論了生產(chǎn)嵌合抗體的方式。
合成構(gòu)建體還包括含有可向分子提供具有除抗原結(jié)合特性以外的某些所需特性的附加部分的分子。例如所述的部分可以是一種標記(例如熒光或放射性標記)。
本發(fā)明的抗體或其衍生物還應用于檢測/診斷粘膜炎布蘭漢氏球菌。
在本發(fā)明的第七個方面中，提供了一種檢測和/或診斷粘膜炎布蘭漢氏球菌的方法，該方法包括下列步驟(a)使一種或多種本發(fā)明的抗體與所檢測的樣品接觸；和(b)檢測一種或多種本發(fā)明的抗原性蛋白質(zhì)或一種或多種其抗原性片段的存在。
另一方面，可以將本發(fā)明的抗原性蛋白質(zhì)用于檢測抗粘膜炎布蘭漢氏球菌的抗體，它們可以存在于獲自受治療者的生物樣品中。因此，在進一步的方面中，本發(fā)明提供了一種檢測和/或診斷粘膜炎布蘭漢氏球菌的方法，該方法包括下列步驟(a)使本文所定義的一種或多種本發(fā)明的抗原性蛋白質(zhì)或一種或多種其抗原性片段或以本發(fā)明免疫原性組合物的形式與所檢測的樣品進行接觸；和(b)檢測存在的對粘膜炎布蘭漢氏球菌的抗體。
在另一方面中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗原性蛋白質(zhì)、其抗原性片段或免疫原性組合物在檢測和/或診斷粘膜炎布蘭漢氏球菌中的用途。所述的檢測和/或診斷優(yōu)選在體外進行。
本發(fā)明的抗原性蛋白質(zhì)、其抗原性片段或抗原組合物可以作為用于體外檢測和/或診斷粘膜炎布蘭漢氏球菌的試劑盒的組成部分來提供。因此，在另一個方面中，本發(fā)明提供了一種用于檢測和/或診斷粘膜炎布蘭漢氏球菌的試劑盒，該試劑盒中包括至少一種本發(fā)明的抗原性蛋白質(zhì)、其抗原性片段或抗原組合物或至少一種本發(fā)明的抗體。
如上所述，可以將所述的抗原性蛋白質(zhì)或其抗原性片段用于誘發(fā)對粘膜炎布蘭漢氏球菌的免疫反應。因此，在進一步的方面中，本發(fā)明提供了本發(fā)明抗原、其片段或抗原性組合物在藥物中的用途。
在另一方面中，本發(fā)明提供了(a)本文所述的抗原性蛋白質(zhì)、其抗原性片段或免疫原性組合物在誘發(fā)受治療者體內(nèi)免疫反應中的用途；(b)一種用于治療或預防受治療者呼吸感染的方法，該方法包括對受治療者給予有效量的本發(fā)明的至少一種蛋白質(zhì)、至少一種其抗原性片段或一種免疫原性組合物(優(yōu)選作為一種疫苗給予)的步驟；和(c)一種用于治療或預防受治療者中耳炎的方法，該方法包括對受治療者給予有效量的本發(fā)明的至少一種蛋白質(zhì)、至少一種其抗原性片段或一種免疫原性組合物(優(yōu)選作為一種疫苗給予)的步驟。
用于生產(chǎn)本文所述抗原性蛋白質(zhì)(或?qū)嶋H上是其片段)的一種便利的方法，它是通過使用重組DNA技術(shù)來進行。
現(xiàn)在參照下列實施例來描述本發(fā)明，這些實施例不應以任何方式來限定本發(fā)明。這些實施例涉及附圖，其中附

圖1表示用于分離本文所述30kDa和71kDa蛋白質(zhì)的流程圖解；附圖2表示用于分離本文所述14kDa、14.5kDa和15kDa蛋白質(zhì)的流程圖解；附圖3表示顯示銀染色后純化蛋白質(zhì)的SDS-PAGE凝膠；且附圖4表示使用或不使用本發(fā)明抗原進行免疫接種的粘膜炎布蘭漢氏球菌感染的小鼠的清除速率數(shù)據(jù)。
實施例1蛋白質(zhì)的純化(ⅰ)30kDa和71kDa給20ml腦心浸液(BHZ)肉湯接種4-5個克隆的粘膜炎布蘭漢氏球菌K65菌株(來自在Sir Charles Gardinar Hospital,Perth,Australia回收的痰的臨床分離物；菌株K65產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶)并在37℃下在振動培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將2ml的培養(yǎng)物加入到4×500ml燒瓶中的BHI肉湯中并在37℃下在振動培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。使細菌沉淀并在4℃下在PBS中使用應用JA-14轉(zhuǎn)子的Beckman JA-2離心機以10,000rpm洗滌3次、每次持續(xù)15分鐘。除在添加乙酸鈉/β-巰基乙醇后不調(diào)節(jié)pH外，使用兼性離子提取法和乙醇沉淀法提取蛋白質(zhì)。將終產(chǎn)物對蒸餾水透析，從而產(chǎn)生40ml、15.35mg/ml的總計為614mg的蛋白質(zhì)。將該制備物凍干。
在上BioRad Q2離子交換柱前，將蛋白質(zhì)提取物重新懸浮于約60mg/ml緩沖液A(25mM tris-HCl,pH8.1)中。將1ml等分試樣各自走柱。將該柱用緩沖液A以1ml/分鐘洗滌5分鐘。使用連續(xù)和從100％緩沖液A至100％緩沖液B(25mM Tris-HCl+0.5M NaCl,pH8.1)的逐步梯度相結(jié)合的方法在5-10分鐘內(nèi)洗脫蛋白質(zhì)。隨后的梯度是用100％緩沖液B洗滌4分鐘、接著用100％緩沖液A洗滌1分鐘。合并級分2、3和4；在PD-10柱上脫鹽改變成稀釋的Tris緩沖液；然后凍干。
用蒸餾水將體積調(diào)節(jié)至600μl、與2.4ml還原緩沖液(62.5mM Tris,pH6.8、10％v/v甘油、2％w/v SDS、5％v/v β-巰基乙醇、1.2×10-3％w/v溴酚藍)混合并在37℃下保溫30分鐘。使用Bio-Rad Model 491Prep Cell、應用40ml9％T-1.42％C丙烯酰胺/BIS(N,N’-亞甲雙丙烯酰胺)分離凝膠與在37mm(內(nèi)徑[i.d.])柱上聚合的10ml 4％t-0.36％C丙烯酰胺/BIS積層凝膠進行用于純化蛋白質(zhì)的制備型SDS-PAGE。用0.025M Tris-HCl從該柱上洗脫下級分、通過凍干濃縮并通過分析型SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)含量。在級分57-80中有71kDa的蛋白質(zhì)。將其合并，凍干并加至25ml蒸餾水中。通過使用稀釋的PBS的緩沖液更換使制備物脫鹽并再濃縮以便緩沖蛋白質(zhì)的PBS的濃度是等滲的。
從這種相同的制備性細胞流出物中并合含有55-65kDa蛋白質(zhì)的級分26-34和含有20-35kDa蛋白質(zhì)的級分4-17。使用145T-1.42％C丙烯酰胺/BIS分離凝膠與4％T-0.36％C丙烯酰胺/BIS積層凝膠進一步純化級分4-17(參見附圖1的流程圖)。如上所述估計級分的蛋白質(zhì)含量、合并合適范圍的級分并使純化的蛋白質(zhì)脫鹽和濃縮。
(ⅱ)其它蛋白質(zhì)的純化給20ml腦心浸液肉湯接種4-5個克隆的粘膜炎布蘭漢氏球菌K65菌株并在37℃下在振動培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將2ml的培養(yǎng)物加入到4×500ml燒瓶中的BHI肉湯中并在37℃下在振動培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。使細菌沉淀并在4℃下在PBS中使用應用JA-14轉(zhuǎn)子的Beckman JA-2離心機以10,000rpm洗滌3次、每次持續(xù)15分鐘。使用兼性離子提取法和乙醇沉淀法提取蛋白質(zhì)，同時用乙酸鈉/β-巰基乙醇將pH調(diào)節(jié)至pH為4。
在上BioRad Q2離子交換柱前，使用如上所述的方案將蛋白質(zhì)提取物重新懸浮于約60mg/ml緩沖液A中。從該柱的峰中估計蛋白質(zhì)含量、合并合適的級分并使用制備型凝膠電泳進行進一步純化(使用如附圖2中所示的柱和如上所述的方案)。涉及使用SDS的制備型電泳的所有蛋白質(zhì)純化均通過用磷酸鉀沉淀而使洗滌劑被除去。結(jié)果從來自單一提取過程的10μg-300μg范圍量的粘膜炎布蘭漢氏球菌的其它膜提取物中純化幾種蛋白質(zhì)。附圖3表示對23kDa-71kDa蛋白質(zhì)進行的分析型SDS-PAGE分析。氨基酸序列的鑒定N-末端測序根據(jù)Applied Biosystems法提供的方案進行本過程。然而，此外，本領域技術(shù)人員還可以根據(jù)Matsudaira在《生物化學雜志》(J.Biol.Chem.)262:10035-10038(1997)中所述的方法來進行這類測序。內(nèi)部肽測序使用SDS-PAGE兼容性S-2-酰胺化(carboxamidothylation)法進行測序。對溶于由10％甘油(體積/體積)、5％(重量/體積)SDS、0.025M Tris HCl、100mM 1,4-DTT、pH8.3組成的溶液的蛋白質(zhì)進行烷基化反應。最初通過在90℃下將該混合物保溫15分鐘來還原蛋白質(zhì)。然后將樣品冷卻至37℃、將丙烯酰胺加入至終濃度為2M并在無光照的氬氣中將該混合物培養(yǎng)30分鐘-60分鐘。加入SDS還原緩沖液、使樣品進行SDS-PAGE、通過考馬斯染色使蛋白質(zhì)顯色并將其從凝膠中切下。對不能夠進行N-末端測序的71kDa的蛋白質(zhì)進行該過程。實施例2免疫接種方案Intra-Peyer’s斑貼(IPP)免疫接種法是一種針對大鼠所述的改進方法(Kyd等《感染性免疫》(Infect.Immun.)63:2931-2940(1995))。通過將蛋白質(zhì)與弗氏不完全佐劑(IFA)(Sigma,St Louis,MI)按1∶1的比例乳化以使劑量在2.5μg-10μg的范圍來制備免疫接種的接種物。通過皮下注射0.25ml的氯胺酮/甲苯噻嗪的PBS溶液(5mg/ml的鹽酸氯胺酮[Troy Laboratories,Smithfield,NSW,Austrialia]；2mg/ml的鹽酸甲苯噻嗪[Bayer,Pymble,NSW,Austrialia])使6-8周齡、維持在SPF條件下的不含特異性病原體(SPF)的雄性BALB/c小鼠麻醉。通過在腹部壁上的1cm中線切口使小腸暴露并使用26G針頭將約1μl體積的接種物經(jīng)漿膜下層輸送到各Peyer’s斑貼。用無菌PBS沖洗小腸并縫合腹腔。通過注射IFA和PBS乳劑給假擬接種的小鼠進行同樣的外科手術(shù)。
在IPP后的第14天進行氣管內(nèi)加強注射。通過靜脈二羥孕烷二酮-21-醋酸酯-羥-5α-孕烷二酮復合劑麻醉法給小鼠使用鎮(zhèn)靜劑(0.15ml；20mg溶于PBS的阿法雙酮(alphadone)/kg體重；Pitman-Moore,Nth Ryde,NSW,Australia)。將20μl體積的蛋白質(zhì)PBS溶液(給予的相同量的IPP)通過經(jīng)口腔插入氣管的22.5G導管(Terumo,Tokyo,Japan)輸送入肺。用兩個0.3ml體積的空氣分散接種物。細菌攻擊使粘膜炎布蘭漢氏球菌在用50ml/升去纖維蛋白的馬血(AmadeusInternational,Brooklyn,Vic,Australia)補充的腦心浸液(BHI)瓊脂平板上生長過夜。將平板在37℃和5％CO2條件下培養(yǎng)過夜、收集細菌并用PBS洗滌3次。通過測定405nm處的光密度來估計濃度并通過對系列稀釋的接種物過夜鋪平板的菌落形成單位(CFU)進行計數(shù)來證明。經(jīng)靜脈給予二羥孕烷二酮-21-醋酸酯-羥-5α-孕烷二酮復合劑給小鼠使用鎮(zhèn)靜劑。將20μl的活粘膜炎布蘭漢氏球菌的濃接種物如上所述導入肺用于強化IT。在感染后4小時或如上所述通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉來處死小鼠。通過心臟穿刺取血并使之凝塊以用于收集血清。通過頸暴露氣管且通過經(jīng)插管將0.5ml的PBS滴注入肺并回收來獲得支氣管肺泡灌洗物(BAL)。在獲得BAL后，將完整的肺切下、置于2ml體積的PBS中并在組織勻漿器中勻化(9500rpm；Heidolph DIAX600,Electro GmbH & Co,Kelheim,Germany)。通過將用于CFU測定的系列稀釋物鋪平板估計BAL和肺勻化物的細菌清除率。通過在4℃和450×g下離心10分鐘(Juoan BR3.11,St Nazaire,France)來分離血清并將其保存在-80℃下。結(jié)果給小鼠免疫接種IPP并用純化的蛋白質(zhì)進行強化IT。附圖4中所示的數(shù)據(jù)表明了與非免疫細菌回收率相比支氣管肺泡灌洗物(BAL)或肺組織中細菌清除率增加的百分比。
表觀分子量為71kDa的蛋白質(zhì)可最有效地提高從BAL中的清除率，而對該蛋白質(zhì)的免疫反應在從肺組織中的清除方面幾乎無效。
在用表觀分子量為44kDa的蛋白質(zhì)免疫接種后的免疫反應可有效地使從BAL和肺組織中清除細菌。用15和30kDa蛋白質(zhì)進行的免疫接種表明在BAL和肺中增加的清除率為50％以上，而表現(xiàn)出這種BAL清除率的14.5kDa蛋白質(zhì)沒有在肺中達到相同的預防作用。14kDa蛋白質(zhì)在BAL中清除細菌方面不是有效的，但能夠輕度提高從肺中的清除率。
序列表<110>Cortecs(UK)LimitedCripps,Allan WKyd,Jennelle<120>蛋白質(zhì)<130>PWC/P20695WO<140>PCT/GB99/01473<141>1999-05-11<150>GB9810084.5<151>1998-05-11<160>9<170>Patentln版本2.1<210>1<211>31<212>PRT<213>粘膜炎布蘭漢氏球菌<400>1Ala Ile Ser Tyr Gly Asn Ser Ala Asp Ala Gln Pro Tyr Val Gly Ala1 5 10 15Lys Ile Gly Gln Val Asp Ala Lys Gln Ile Asn Asn Lys Asn Thr20 25 30<210>2<211>31<212>PRT<213>粘膜炎布蘭漢氏球菌<400>2Asn Val Val Thr Asn Thr Gly Ala Thr Val Val Asp Gly Thr Arg Thr1 5 10 15Ile Phe Ser Thr Leu Val Lys Pro Ala Ala Val Val Ala Ala Val20 25 30<210>3<211>21<212>PRT<213>粘膜炎布蘭漢氏球菌<220><221>SITE<222>(19)<223>Xaa是任意的氨基酸<400>3Thr Pro Thr Val Tyr Gly Lys Ala Phe Leu Thr Ile Asp Ala Asn ASn1 5 10 15Thr Asp Xaa Thr Tyr20<210>4<211>20<212>PRT<213>粘膜炎布蘭漢氏球菌<400>4Ala Gly Leu Asp Arg Ser Gly Gln Asp Val Thr Ala Ser Leu Gln Asp1 5 10 15Gly Thr Tyr Ala20<210>5<211>12<212>PRT<213>粘膜炎布蘭漢氏球菌<400>5Gly Glu Leu Ser Ser Asn Leu Gln Asp Arg His Lys1 5 10<210>6<211>16<212>PRT<213>粘膜炎布蘭漢氏球菌<400>6Ala Asp Ile His Gly Asn Arg Phe Arg Gly Ser Ala Ala Ile Ala Ser1 5 10 15<210>7<211>6<212>PRT<213>粘膜炎布蘭漢氏球菌<400>7Asn Phe Glu Tyr Leu Lys1 5<210>8<211>15<212>PRT<213>粘膜炎布蘭漢氏球菌<400>8Phe Gly Glu Leu Ser Val Gly Asp Ser His Ser Val Phe Leu Gln1 5 10 15<210>9<211>18<212>PRT<213>粘膜炎布蘭漢氏球菌<400>9Asp Ala Asp Val Thr Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Asn Ala Thr Glu Met1 5 10 15Gly Gly
權(quán)利要求
1．一種屬于粘膜炎布蘭漢氏球菌(B.catarrhalis)抗原并具有由SDS-PAGE測定的表觀分子量約為14-約17kDa的蛋白質(zhì)；
2．一種如權(quán)利要求1中所述的蛋白質(zhì)，它具有由SDS-PAGE測定的約為14kDa的表觀分子量。
3．一種如權(quán)利要求1中所述的蛋白質(zhì)，它具有由SDS-PAGE測定的約為14.5kDa的表觀分子量。
4．一種如權(quán)利要求1中所述的蛋白質(zhì)，它具有由SDS-PAGE測定的約為15kDa的表觀分子量。
5．一種如權(quán)利要求1中所述的蛋白質(zhì)，它具有由SDS-PAGE測定的約為20kDa的表觀分子量并具有下列N-末端序列AISYGNSADAQPYVGAKIGQVDAKQINNKNT。
6．一種如權(quán)利要求1中所述的蛋白質(zhì)，它具有由SDS-PAGE測定的約為30kDa的表觀分子量并具有下列N-末端序列NVVTNTGATVVDGTRTIFSTLVKPAAVVAAV。
7．一種如權(quán)利要求1中所述的蛋白質(zhì)，它具有由SDS-PAGE測定的約為35kDa的表觀分子量并具有下列N-末端序列TPTVYGKAFLTIDANNTDXTY。
8．一種如權(quán)利要求1中所述的蛋白質(zhì)，它具有由SDS-PAGE測定的約為44kDa的表觀分子量并具有下列N-末端序列AGLDRSGQDVTASLQDGTYA。
9．一種如權(quán)利要求1中所述的蛋白質(zhì)，它具有由SDS-PAGE測定的約為71kDa的表觀分子量并具有下列內(nèi)部肽序列殘基350-361GELSSNLQDRHK殘基366-380ADIHGNRFRGSAAIAS殘基528-533NFEYLK殘基542-556FGELSVGDSHSVFLQ殘基665-682DADVTGGFYGPNATEMGG。
10．一種如權(quán)利要求1-9中任意一項所定義的蛋白質(zhì)的同系物或衍生物。
11．一種或多種如權(quán)利要求1-9中任意一項所定義的蛋白質(zhì)的抗原性片段。
12．一種包括如下序列或由如下序列組成的核酸分子(ⅰ)編碼如權(quán)利要求1-9中任意一項所定義的蛋白質(zhì)的DNA序列或其RNA等價物；(ⅱ)與(ⅰ)的任意序列互補的序列；(ⅲ)與(ⅰ)和(ⅱ)的那些任意序列具有基本上同一性的序列；(ⅳ)編碼權(quán)利要求1-9中任意一項所定義的蛋白質(zhì)同系物、衍生物或片段的序列。
13．一種包括如權(quán)利要求12中所定義的核酸序列的載體。
14．一種用如權(quán)利要求13中所定義的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。
15．一種免疫原性組合物，它包括一種或多種如權(quán)利要求1-9中任意一項所定義的蛋白質(zhì)、一種或多種如權(quán)利要求10中所定義的同系物或衍生物或一種或多種如權(quán)利要求11中所定義的抗原性片段。
16．一種如權(quán)利要求15中所述的免疫原性組合物，它是一種疫苗。
17．一種或多種如權(quán)利要求1-9中任意一項所定義的蛋白質(zhì)、一種如權(quán)利要求10中所定義的同系物或衍生物或一種或多種如權(quán)利要求11中所定義的抗原性片段在制備免疫原性組合物中的用途。
18．權(quán)利要求17中所述的用途，其中所述的免疫原性組合物是一種用于預防或治療呼吸感染的疫苗組合物。
19．權(quán)利要求17中所述的用途，其中所述的免疫原性組合物是一種用于預防或治療中耳炎的疫苗。
20．一種抗原組合物，它包括一種或多種如權(quán)利要求1-9中任意一項所定義的蛋白質(zhì)和/或一種或多種如權(quán)利要求10中所定義的同系物或衍生物和/或一種或多種如權(quán)利要求11中所定義的抗原性片段；可選擇性地與至少一種其它粘膜炎布蘭漢氏球菌抗原或其片段相混合。
21．一種對如權(quán)利要求1-9中任意一項所定義的蛋白質(zhì)、如權(quán)利要求10中所定義的同系物或衍生物或如權(quán)利要求11中所定義的抗原性片段產(chǎn)生的抗體。
22．一種檢測和/或診斷粘膜炎布蘭漢氏球菌的方法，該方法包括下列步驟(a)使一種或多種如權(quán)利要求21中所定義的抗體與所檢測的樣品接觸；和(b)檢測一種或多種如權(quán)利要求1-9中任意一項所定義的抗原的存在。
23．一種檢測和/或診斷粘膜炎布蘭漢氏球菌的方法，該方法包括下列步驟使一種或多種如權(quán)利要求1-9中任意一項所定義的抗原性蛋白質(zhì)、一種或多種如權(quán)利要求10中所定義的同系物或衍生物、一種或多種如權(quán)利要求11中所定義的抗原性片段或一種如權(quán)利要求20中所定義的抗原組合物與所檢測的樣品接觸；和(b)檢測對粘膜炎布蘭漢氏球菌的抗體的存在。
24．如權(quán)利要求1-9中任意一項所定義的蛋白質(zhì)、如權(quán)利要求10中所定義的同系物或衍生物、如權(quán)利要求11中所定義的片段或如權(quán)利要求20中所定義的抗原組合物在檢測/診斷粘膜炎布蘭漢氏球菌中的用途。
25．一種用于檢測/診斷粘膜炎布蘭漢氏球菌的試劑盒，它包括至少一種如權(quán)利要求1-9中任意一項所定義的抗原性蛋白質(zhì)、至少一種如權(quán)利要求10中所定義的同系物或衍生物、至少一種如權(quán)利要求11中所定義的抗原性片段、一種如權(quán)利要求20中所定義的抗原組合物或一種如權(quán)利要求21中所定義的抗體。
26．如權(quán)利要求1-9中任意一項所定義的蛋白質(zhì)、如權(quán)利要求10中所定義的同系物或衍生物、如權(quán)利要求11中所定義的片段或如權(quán)利要求15中所定義的免疫原性組合物在藥物中的用途。
27．如權(quán)利要求1-9中任意一項所定義的蛋白質(zhì)、如權(quán)利要求10中所定義的同系物或衍生物、如權(quán)利要求11中所定義的抗原性片段或如權(quán)利要求15中所定義的免疫原性組合物在誘發(fā)受治療者免疫反應中的用途。
28．一種用于治療或預防受治療者呼吸感染的方法，該方法包括下列步驟對受治療者給予有效量的至少一種如權(quán)利要求1-9中任意一項所定義的蛋白質(zhì)、至少一種如權(quán)利要求10中所定義的同系物或衍生物、至少一種如權(quán)利要求11中所定義的抗原性片段或一種如權(quán)利要求15中所定義的免疫原性組合物。
29．一種用于治療或預防受治療者中耳炎的方法，該方法包括下列步驟對受治療者給予有效量的至少一種如權(quán)利要求1-9中任意一項所定義的蛋白質(zhì)、至少一種如權(quán)利要求10中所定義的同系物或衍生物、至少一種如權(quán)利要求11中所定義的抗原性片段或一種如權(quán)利要求15中所定義的免疫原性組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了粘膜炎布蘭漢氏球菌的新型抗原、及其在疫苗中的用途以及診斷和/或檢測方法。
文檔編號G01N33/569GK1306542SQ99807588
公開日2001年8月1日 申請日期1999年5月11日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月11日
發(fā)明者A·W·克里普斯, J·基德 申請人:科特克斯(Om)有限公司