專利名稱：鑒定藥物作用途徑的方法
1.發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明的領(lǐng)域涉及用于鑒定藥物在細胞內(nèi)作用的方法，特別是用于尋找受藥物作用影響的細胞內(nèi)生物途徑的方法，以及應(yīng)用這些方法發(fā)現(xiàn)藥物。
2.背景鑒別藥物或候選藥物作用的生物途徑是一個具有巨大經(jīng)濟價值的課題，并對人類有重大意義。雖然常常可知道或推測一種藥物影響的主要靶分子和細胞途徑，因為最初是通過特定的藥物篩選方法選擇了這種藥物，但是重要的是要證明它對這種主要途徑的作用，并定量它常常以未預(yù)料的方式沿著其它可能是有害的或者有利的次要途徑的作用。在另一些情況下，藥物作用的主要途徑是未知的，必須對確定這些途徑。
對于許多應(yīng)用研究領(lǐng)域，例如藥物的發(fā)現(xiàn)，這種信息是重要的，藥物的發(fā)現(xiàn)是一個借助它對生物活性化合物進行鑒定和初步描述特征的過程。在對人類疾病治療的進程中藥物的發(fā)現(xiàn)是一個關(guān)鍵性步驟。目前，二種途徑支配著新藥尋找過程。首先是以特定的生物檢測法進行測定，開始篩選對細胞或機體具有所需作用的化合物(例如，誘發(fā)細胞凋亡或抑制血管形成)。然后可對具有所需活性的化合物進行修飾，以便增強其效力，增加穩(wěn)定性或其它特性，并以此生物測定法再次測試這種經(jīng)修飾的化合物。這樣，當(dāng)以小鼠腫瘤模型進行測試時，就可能鑒定具有血管形成抑制劑作用的化合物，然后合成結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物，并用同樣的測定法再次測試。這種方法的一個局限性是，通過篩選常常不知道也不能測定其作用機制，例如受此化合物影響的靶分子的細胞途徑。此外，這種測定方法僅能提供很少有關(guān)藥物作用特性的信息，不論是有關(guān)作用的靶標(biāo)或作用途徑。最后，所需要花費的實驗努力限制了通過測試對細胞或動物生物作用可篩選的化合物數(shù)量。
相比之下，藥物篩選的第二種途徑包括測試大批化合物對已知靶分子的特異性作用，典型的靶分子是克隆的基因序列或者分離出的酶或蛋白質(zhì)。例如，可用于測試大批化合物改變來自特定啟動子轉(zhuǎn)錄水平的能力，或者改變對已鑒定蛋白質(zhì)結(jié)合能力的方法，可以發(fā)展成為高通量的測定方法。雖然使用高通量的篩選是鑒定候選藥物的強有力的方法，但也具有局限性。主要的缺點是這種測定方法僅能提供很少，或者不能提供有關(guān)化合物在細胞或機體水平作用的信息，特別是涉及受影響的真正細胞途徑的信息。為了測定在體內(nèi)的毒性或副作用，必須通過將藥物用于一系列生物細胞和整體動物試驗來測試這些作用。實際上，對候選藥物特性和毒性研究的分析可能耗費藥物開發(fā)過程的大部分時間(參見例如Oliff等1997，“藥物開發(fā)的靶分子”，in Devite等，癌腫瘤學(xué)的原理與實踐，第五版，1997 Lippincott-Raven出版公司，Philadelphia)。
幾種基因表達的測定方法現(xiàn)在已可實際應(yīng)用于在細胞培養(yǎng)中定量測定藥物對大部分基因和蛋白質(zhì)的作用(參見例如Schena等，1995，對具有互補DNA微陣列的基因表達模型的定量監(jiān)測，科學(xué)270467-470；Lockhort等，1996，通過對高濃度寡核苷酸序列的雜交進行表達監(jiān)測，自然生物技術(shù)學(xué)141675-1680；Blanchqrd等，1996，排列順序探測基因組的奧密，自然生物技術(shù)學(xué)14，1649；1996，US專利5,569,588，Ashby等1996.10.29公開，標(biāo)題為“藥物篩選的方法”)。來自這些基因表達測定法的原始數(shù)據(jù)常常難以協(xié)調(diào)一致地加以解釋。這種測定技術(shù)一般可報告在應(yīng)答藥物時具有改變表達的許多基因，典型地是50-100，可能達到1000，或者少至10。在一般情況下，不作進一步分析，僅根據(jù)這些數(shù)據(jù)不可能辨別其原因和作用。在一對相關(guān)的生物狀態(tài)下許多基因中的一個或幾個也具有改變表達的事實，導(dǎo)致幾乎不能理解是什么引起了這種改變以及這種改變的作用是什么。這些數(shù)據(jù)本身并不告訴研究者關(guān)于受影響的途徑或作用機制。它們并不指示哪些作用起因于對主要途徑的作用，以及哪些作用是受藥物影響的其它次要途徑的結(jié)果。所有這些受影響途徑一個一個單獨的知識，對于理解藥效，副作用，毒性，可能的失效，以及對代謝應(yīng)答的激活等等都是有用的。進而，鑒定藥物作用的所有途徑可以導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)適合于達到原先治療目的的另外一些途徑。
基因表達研究者必須進一步實驗。至少在藥物靶標(biāo)篩選的情況的基因表達研究者必須進一步實驗。至少在藥物靶標(biāo)篩選的情況下，需要用于指導(dǎo)分析整理這些數(shù)據(jù)和這種進一步實驗的系統(tǒng)方法。
因此，需要有改進的方法(例如，更快速和較少花費的方法)用于根據(jù)對這些數(shù)據(jù)如基因表達數(shù)據(jù)的有效分析整理，鑒定藥物的活性特征和受藥物影響的細胞途徑的特征。本發(fā)明提供了用于快速鑒定受候選藥物影響的靶分子和途徑以及描述它們特性的方法。還進一步提供了基于不同于基因表達分析的測定方法的一些方法。
3.發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于測定通過它藥物對細胞起作用的主要和次要生物途徑的方法，以及鑒定通過每種途徑被影響的蛋白質(zhì)和基因的方法。這種方法包括將在應(yīng)答藥物暴露時RNA或蛋白質(zhì)豐度或者活性的測定量與在應(yīng)答對每種途徑受控的已知擾動時可能受藥物影響的途徑中RNA或蛋白質(zhì)豐度或者活性的測定量進行比較。在不同強度的藥物暴露下測定RNA或蛋白質(zhì)的豐度或者活性。將已知的途徑擾動控制在不同的強度，跨越從途徑抑制直至途徑飽和范圍內(nèi)的主要區(qū)域。另外，本發(fā)明提供了通過比較在應(yīng)答同時的藥物處理和受控的途徑擾動時RNA或蛋白質(zhì)豐度或者活性的測定量，證實受藥物影響的可能途徑的方法。進而本發(fā)明提供了比較二種不同藥物作用的方法，是通過將在應(yīng)答暴露于第一種藥物時RNA或蛋白質(zhì)豐度的測定量與在應(yīng)答暴露于另一種或幾種藥物時RNA或蛋白質(zhì)豐度的測定量進行比較。
本發(fā)明的方法是基于如下發(fā)現(xiàn)，通過應(yīng)用涵蓋一系列途徑擾動強度和藥物暴露水平的數(shù)據(jù)，可以使對藥物作用生物途徑的分析堅實可靠。一般來說，生物途徑的擾動和藥物暴露水平優(yōu)選地包括從對整個途徑?jīng)]有作用至飽和狀態(tài)的范圍。在以前的方法中，這種分析常常僅基于這些范圍內(nèi)的二個點，即不暴露或擾動和充分飽和的暴露或擾動。這種局限的信息導(dǎo)致了較少堅實可靠的結(jié)果。
例如，這些方法具有顯著的優(yōu)點和改進，優(yōu)于僅僅基于應(yīng)用遺傳缺失或過度表達的分析方法，這種方法一般僅能給出對固定飽和狀態(tài)的數(shù)據(jù)。首先，遺傳缺失或過度表達的細胞株未必可用于所需的生物系統(tǒng)。其次，應(yīng)用來自一系列生物途徑擾動強度和藥物暴露水平的應(yīng)答數(shù)據(jù)，大大提高了區(qū)別沿不同途徑所介導(dǎo)作用的能力。例如，一種所研究的藥物可能沿二條途徑具有不同的效力，這二條途徑會聚影響一組重疊的基因?？缭揭幌盗型緩綌_動強度和藥物暴露水平的實驗可以表明，這些途徑在不同的藥物暴露水平變得有效。另一方面，來自完全中斷每條途徑的遺傳缺失突變的數(shù)據(jù)，不能分辨這種效力差異。
更詳細地說，本發(fā)明提供了用于通過如下步驟鑒定和表現(xiàn)藥物對細胞作用的生物途徑的方法(i)測定細胞成分對細胞分級暴露于所研究藥物的應(yīng)答；(ii)測定細胞成分對一種或幾種細胞生物途徑擾動的應(yīng)答；以及(iii)定標(biāo)一組所測定的途徑應(yīng)答，以便使所測定的藥物應(yīng)答最好地符合于客觀的測定。在另一些實施方案中，本發(fā)明還提供用于檢驗所鑒定表現(xiàn)的顯著性，以及用于驗證所鑒定途徑是藥物作用的真實途徑。在一些不同的實施方案中，可以通過測定基因表達(即RNA水平)，蛋白質(zhì)豐度，蛋白質(zhì)活性，或一組這樣的測定量來檢定細胞成分的應(yīng)答。在不同的實施方案中，通過使用可滴定的表達系統(tǒng)，使用轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，改變途徑RNAs的豐度，改變途徑蛋白質(zhì)的豐度，或者改變途徑蛋白質(zhì)的活性，可以形成對細胞內(nèi)生物途徑的擾動。本發(fā)明還提供了基于鑒定藥物作用生物途徑的方法用于藥物開發(fā)的方法。
在第一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，用于表現(xiàn)包含在一種細胞類型藥物作用中的生物途徑，此方法包括(a)提供該藥物在此細胞類型中的藥物應(yīng)答，該藥物應(yīng)答已通過包括在對該藥物的多種暴露水平下，測定此細胞類型的細胞中許多細胞成分的方法獲得；(b)提供一種作為該細胞類型中一種或幾種生物途徑應(yīng)答組合的模式藥物應(yīng)答，其中該細胞類型中的生物途徑應(yīng)答是一種方法的結(jié)果，此方法包括在對該生物途徑的多種擾動水平測定該細胞類型細胞中該生物途徑的細胞成分，并且其中該組合中所述一種或幾種生物途徑應(yīng)答的每一種須經(jīng)單獨的定標(biāo)轉(zhuǎn)換；以及(c)確定該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換，它可最小化該藥物應(yīng)答與所述模式藥物應(yīng)答之間差異的目標(biāo)函數(shù)值，從而該一種或幾種生物途徑應(yīng)答組合在最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換條件下可表現(xiàn)包含在該細胞類型藥物作用中的生物途徑。
在第一實施方案的第一方面中，本發(fā)明進一步提供，這種確定步驟還包括確定該目標(biāo)函數(shù)的“真實”最小化值，以及在該確定步驟(即上面的步驟c)之后，通過一種方法評價此一種或幾種生物途徑的所述最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換的統(tǒng)計學(xué)顯著性的步驟，此方法包括(a)獲得該目標(biāo)函數(shù)最小化值的預(yù)期概率分布；以及(b)依據(jù)該目標(biāo)函數(shù)最小化值的預(yù)期概率分布，評價所述目標(biāo)函數(shù)真實最小值的統(tǒng)計學(xué)顯著性，其中該目標(biāo)函數(shù)真實的最小化值是從所提供的藥物應(yīng)答和所述模型藥物應(yīng)答確定的目標(biāo)函數(shù)最小化值。在第一實施方案的這方面，本發(fā)明進一步提供，獲得所述目標(biāo)函數(shù)最小值預(yù)期概率分布的步驟進一步包括如下步驟(a)通過隨機化相對于所述一種或多種生物途徑的多種擾動水平的一種或幾種生物途徑應(yīng)答，隨機化所述相對于多種藥物暴露水平的藥物應(yīng)答和隨機化所述模式藥物應(yīng)答；(b)通過尋找該一種或幾種隨機化的生物途徑應(yīng)答的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換，確定該目標(biāo)函數(shù)的“理論”最小化值，此最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換可最小化所述隨機化的藥物應(yīng)答與隨機化的模式藥物應(yīng)答之間差異的目標(biāo)函數(shù)；以及(c)重復(fù)前面的二個步驟，以便確定多個理論最小值，該多個理論最小化值形成所述最小化值的預(yù)期概率分布。
在第一實施方案的第三方面，本發(fā)明進一步提供了在所述的確定步驟之后通過一種方法驗證所述一種或幾種生物途徑是真實地包含在該細胞類型該藥物作用中的生物途徑的步驟，此方法包括(a)通過一種方法提供在該細胞類型中組合的藥物-擾動應(yīng)答，此方法包括測定同時暴露于一種或幾種對該藥物的暴露水平和一種或幾種對所述一種或幾種生物途徑的擾動水平的該細胞類型中的多種細胞成分；以及(b)選擇如下模式應(yīng)答中行為最類似于所述組合的藥物-擾動應(yīng)答的模式應(yīng)答(i)第一種模式應(yīng)答在最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換的條件下包含一種或幾種生物途徑應(yīng)答的組合，此最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換是按一個或幾個第一總數(shù)估算的，每個第一總數(shù)是一個或幾個藥物暴露水平中的一個在定標(biāo)轉(zhuǎn)換的條件下與一個或幾個對生物途徑擾動水平中一個的總和，(ii)第二種模式應(yīng)答包含一個或幾個第二總數(shù)，每個第二總數(shù)在按一個或幾個對生物途徑擾動水平中一個估算的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換條件下，是按一個或幾個藥物暴露水平中一個計算的藥物應(yīng)答與一個或幾個生物途徑應(yīng)答組合的總和，從而如果選擇第一種模式應(yīng)答則可驗證所述一個或幾個生物途徑為真實包含在該細胞類型該藥物作用中的生物途徑。
在第一實施方案的第四方面，本發(fā)明進一步提供，在所述的確定步驟之后，將存在于藥物應(yīng)答中的細胞成分指定屬于所述一種或幾種生物途徑中一種的步驟，其中該細胞成分的生物途徑應(yīng)答在其最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)化的條件下具有與該細胞成分的藥物應(yīng)答最大的相關(guān)性。
在第二實施方案，本發(fā)明提供了一種從最初的候選藥物中確定更具途徑-特異性的候選藥物的方法，包括(a)通過第一實施方案的方法表現(xiàn)與最初候選藥物作用有關(guān)的生物途徑；(b)修飾最初候選藥物的結(jié)構(gòu)；(c)通過第一實施方案的方法表現(xiàn)與所修飾的最初候選藥物作用有關(guān)的生物途徑；以及(d)如果所修飾的最初候選藥物具有比最初候選藥物更少的與其作用有關(guān)的生物途徑，則確定該修飾的最初候選藥物比最初候選藥物是更具途徑-特異性的候選藥物。
在第三實施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，用于鑒定一種或幾種與藥物的作用有關(guān)并介導(dǎo)此藥物的副作用的特異性生物途徑，該方法包括(a)對第一種藥物實行第一實施方案的方法；(b)對第二種藥物實行第一實施方案的方法，其中第一和第二種藥物是不同的，并且對相同的疾病或障礙表現(xiàn)出治療效果；以及(c)鑒定那些與第一種藥物作用有關(guān)并與第二種藥物作用的生物途徑不同的特異性生物途徑，從而鑒定出一種或幾種與第一種藥物作用有關(guān)并且介導(dǎo)第一種藥物的副作用的特異性生物途徑。
在第四實施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，用于鑒定參與介導(dǎo)一種疾病或障礙治療效果的一種或幾種特異性生物途徑，該方法包括(a)對第一種藥物實行第一實施方案的方法；(b)對第二種藥物實行第一實施方案的方法，其中第一和第二種藥物不同并表現(xiàn)出對相同的疾病或障礙有治療效果；以及(c)鑒定那些與第一種藥物和第二種藥物作用有關(guān)的特異性生物途徑，從而鑒定出與第一種藥物作用有關(guān)并介導(dǎo)對該疾病或障礙治療效果的一種或幾種特異性生物途徑。
在第五實施方案，本發(fā)明提供了一種方法，用于通過如下步驟比較在一種細胞類型上來自二種不同藥物的藥物應(yīng)答，并從而測定此二種不同的藥物對該細胞類型作用的相似性(a)對在該細胞類型所研究的第一種藥物提供第一種藥物應(yīng)答，已通過一種方法獲得了這種藥物應(yīng)答，此方法包括在對第一種藥物多種暴露水平測定該細胞類型細胞中的多種細胞成分；(b)對在一種細胞類型所研究的第二種藥物提供第二種藥物應(yīng)答，已通過一種方法獲得了第二種藥物應(yīng)答，此方法包括在對第二藥物多種暴露水平測定該細胞類型中的多種細胞成分；以及(c)確定第二種藥物應(yīng)答的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換，它可最小化第一種與第二種藥物應(yīng)答之間差異的目標(biāo)函數(shù)數(shù)值。
在第六實施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，用于表現(xiàn)與環(huán)境改變對一種細胞類型作用有關(guān)的生物途徑，此方法包括(a)提供該細胞類型中對此環(huán)境改變的環(huán)境應(yīng)答，已通過一種方法獲得了這種環(huán)境應(yīng)答，此方法包括在該環(huán)境改變的多種嚴重程度下測定該細胞類型細胞中的多種細胞成分；(b)提供一種模式環(huán)境應(yīng)答作為該細胞類型中一種或幾種生物途徑應(yīng)答組合的模式環(huán)境應(yīng)答，其中該細胞類型中的生物途徑應(yīng)答是一種方法的結(jié)果，此方法包括在對該生物途徑的多種擾動水平測定該細胞類型細胞中該生物途徑的細胞成分，并且其中該組合中所述一種或幾種生物途徑應(yīng)答的每一種須經(jīng)單獨的定標(biāo)轉(zhuǎn)換；以及(c)確定該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換，它可最小化該環(huán)境應(yīng)答與模型環(huán)境應(yīng)答之間差異的目標(biāo)函數(shù)值，從而該一種或幾種生物途徑應(yīng)答組合在最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換條件下可表現(xiàn)與此環(huán)境改變對該細胞類型作用有關(guān)的生物途徑。
在第七實施方案，本發(fā)明提供了一個計算機系統(tǒng)，用于表現(xiàn)參與一種細胞類型藥物作用的生物途徑，此系統(tǒng)包括處理器和偶聯(lián)于該處理器的存儲器，該存儲器編碼一種或幾種程序，該一種或幾種程序?qū)е绿幚砥鲌?zhí)行包括如下步驟的方法(a)接收該細胞類型中該藥物的藥物應(yīng)答，該藥物應(yīng)答包括在多個藥物暴露水平的該細胞類型細胞中多種細胞成分的測定量；(b)接收一種或幾種生物途徑應(yīng)答，該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的每一種都包括在對該生物途徑多個擾動水平的該細胞類型細胞中該生物途徑細胞成分的測定量；(c)形成一個作為該一種或多種生物途徑組合的模式藥物應(yīng)答，該組合中所述一種或幾種生物途徑應(yīng)答的每一種須經(jīng)單獨的定標(biāo)轉(zhuǎn)換；(d)確定該藥物應(yīng)答與模式藥物應(yīng)答之間差異的目標(biāo)函數(shù)值；以及(e)通過改變所述一種或幾種生物途徑應(yīng)答的定標(biāo)轉(zhuǎn)換以便獲得可最小化所確定的目標(biāo)函數(shù)值的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換，用于最小化所確定的目標(biāo)函數(shù)值；從而，所述一種或幾種生物途徑應(yīng)答組合在最佳標(biāo)定轉(zhuǎn)換的條件下可表現(xiàn)參與該細胞類型該藥物作用的生物途徑。
4.附圖簡述

圖1圖解說明假定藥物D對生物系統(tǒng)作用的示范性途徑。
圖2A圖示說明在暴露于藥物D的圖1生物系統(tǒng)中，基因G1，G2和G3表達的示范性應(yīng)答(數(shù)值被標(biāo)準化成未處理值)；圖2B圖示說明發(fā)生在蛋白質(zhì)P1對P1分級擾動的途徑中基因G1，G2和G3的示范性應(yīng)答；圖2C圖示說明在圖2A-B中說明的應(yīng)答之間的示范性相關(guān)性。
圖3圖示說明來自大約6000個所測定的酵母基因30個酵母基因的應(yīng)答曲線，這些基因?qū)τ诎奔奏┻仕幬锉┞毒哂凶畲蟮谋磉_率改變；氨甲喋呤暴露水平是3，6，25，50，100和200μm；100μm滴度導(dǎo)致了50％生長缺乏；在任意橫座標(biāo)的-0.5應(yīng)答已被設(shè)置于0。
圖4圖示說明Hill函數(shù)對圖3中所示基因YOLO31C應(yīng)答的擬合。
圖5圖解說明本發(fā)明方法實施方案的操作流程圖。
圖6圖示說明藥物D對基因Gk作用可能的另外途徑。
圖7A-B圖示說明等式10和11的表面透視圖。
圖8A-C圖示說明對分別暴露于藥物環(huán)孢菌素A，氨甲喋呤和FK506具有最大表達率改變的酵母基因的應(yīng)答曲線；圖8D圖示說明圖8C中所示的應(yīng)答對圖8A-B中所示應(yīng)答總和的相關(guān)性。
圖9圖解說明本發(fā)明計算機系統(tǒng)的示范性實施方案。
5.詳述此部分對本發(fā)明及其對藥物發(fā)現(xiàn)的應(yīng)用給予了詳細的描述。是通過幾個對本發(fā)明一般性方法的示范性圖解說明，以逐漸增加的詳細程度和特殊性進行這種描述。這些實施例不是限制性的，并且對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可見的相關(guān)變化形式將被包含在所附的權(quán)利要求中，下面這些實施例是對伴隨這些一般性方法的數(shù)據(jù)匯集步驟實施方案的描述。
5.1引言本發(fā)明包括用于確定生物途徑的方法，通過這種生物途徑藥物對生物系統(tǒng)(例如細胞，細菌或病人)發(fā)揮作用。這些方法包括將應(yīng)答分級藥物暴露時細胞生物狀態(tài)改變的測定量，與很可能參與此藥物作用的生物途徑的生物狀態(tài)改變測定量進行比較，并且后者的改變是應(yīng)答對這些途徑已知的分級擾動。從這種比較得出的結(jié)果是作為該藥物對每個生物途徑單獨作用組合的該藥物對此細胞作用的表現(xiàn)。
此部分首先提供了某些基本概念，包括藥物作用，細胞生物狀態(tài)，以及生物途徑的概念，根據(jù)本發(fā)明，這些概念可代表藥物在細胞內(nèi)的作用。其次，提供了本發(fā)明方法的示意性和非限制性的概述。下面的章節(jié)更加詳細地提供了本發(fā)明的方法。
雖然為簡便起見，本公開內(nèi)容常常提到單細胞(例如，從在單個基因受干擾的細胞中分離RNA)，但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解到，更通常是使用許多起源類似的細胞，例如來自培養(yǎng)的細胞系來實施本發(fā)明的任何特定步驟。在此這些類似的細胞被稱為“細胞類型”。這些細胞或者來自天然的單細胞生物，或者從多細胞高等生物得到。
具體地說，5.1節(jié)描述了對進一步說明本發(fā)明有用的某些基本概念。5.2節(jié)概括地描述了本發(fā)明的方法。5.3節(jié)描述了本發(fā)明方法的優(yōu)選分析實施方案。5.4節(jié)描述了干擾生物途徑的方法。5.5節(jié)描述了測定細胞成分的方法，最后5.6節(jié)描述了本發(fā)明對藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的某些示范性應(yīng)用。
藥物作用和生物狀態(tài)根據(jù)本發(fā)明，藥物是可干擾生物系統(tǒng)的具有任何復(fù)雜程度的任何化合物，不論是通過已知的還是未知的機制，以及是否將它們用于治療。因此藥物包括具有研究或治療價值的典型的小分子；天然存在的因子如內(nèi)分泌因子，旁分泌因子或自動分泌因子，或者與任何類型細胞受體相互作用的因子；細胞內(nèi)因子如細胞內(nèi)信號傳輸途徑的成分；以及從其它天然來源分離出的因子等等。藥物的生物作用可能特別是藥物介導(dǎo)的如下改變的結(jié)果對一種或幾種RNA轉(zhuǎn)錄或降解速度的改變，對一種或幾種多肽翻譯或翻譯后加工速度和程度的改變，對一種或幾種蛋白質(zhì)降解速度和程序的改變，以及對一種或幾種蛋白質(zhì)的作用或者活性抑制或刺激作用的改變等等。事實上，絕大多數(shù)藥物是通過與蛋白質(zhì)相互作用行使它們的影響。增加速度或刺激蛋白質(zhì)活性的藥物在此被稱為“激活性藥物”，而降低速度或抑制蛋白質(zhì)活性的藥物在此被稱為“抑制性藥物”。
除藥物之外，本發(fā)明還同樣適用于那些以靶定的方式干擾生物系統(tǒng)的物理環(huán)境或物理環(huán)境狀況的改變。這種環(huán)境改變可以包括適度的溫度改變(例如溫度升高10℃)或者暴露于適度劑量的放射性作用。其它一些環(huán)境狀況包括營養(yǎng)環(huán)境如存在唯一的特種糖類，氨基酸等等。
在本發(fā)明是通過觀察細胞生物狀態(tài)改變來測定藥物(或物理環(huán)境改變)的生物作用。以如在此使用的細胞生物狀態(tài)意指一群細胞成分的狀態(tài)，它足以滿足鑒定細胞的預(yù)定目的，如表示藥物作用的特征。對這些成分所作的測定和/或觀察，可以是它們的豐度(即細胞中的含量或濃度)，或它們的活性，或它們的修飾狀況(例如磷酸化)，或其它與藥物作用特征的測定。在不同的實施方案中，本發(fā)明包括對不同的細胞成分群進行這些測定和/或觀察。在此也將這些不同的細胞成分群稱為細胞生物狀態(tài)形式(如在此使用的術(shù)語“細胞成分”不打算指已知的細胞器如線粒體，溶酶體等)。
在本發(fā)明通常測定的細胞生物狀態(tài)的一種形式是它的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。細胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)包括細胞在給定的一組條件下RNA組成種類，特別是mRNAs的同一性和豐度。優(yōu)選地是對細胞中所有RNA組成種類的基本組分都進行測定，但是，至少應(yīng)測定表現(xiàn)所研究藥物作用特征的基本組分。轉(zhuǎn)錄狀態(tài)是本發(fā)明測定的生物狀態(tài)目前優(yōu)選的方面。通過例如以幾種現(xiàn)有的基因表達技術(shù)中的任何一種測定cDNA豐度，它可以被方便地確定。
在本發(fā)明通常測定的細胞生物狀態(tài)的另一種形式是它的翻譯狀態(tài)。細胞的翻譯狀態(tài)包括在給定的一組條件下細胞中蛋白質(zhì)組成種類的同一性和豐度。優(yōu)選地是測定細胞中所有蛋白質(zhì)組成種類的基本組分，但是，至少應(yīng)測定表現(xiàn)所研究藥物作用特征的基本組分。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員都知道，轉(zhuǎn)錄狀態(tài)常常足以表現(xiàn)出翻譯狀態(tài)的特征。
細胞生物狀態(tài)的其它形式方面也可用于本發(fā)明。例如，細胞的活性狀態(tài)，如在此使用的術(shù)語包括在給定的一組條件下細胞中蛋白質(zhì)組成種類的活性(以及還有任選地催化活性的核酸種類)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的，翻譯狀態(tài)常常足以表現(xiàn)活性狀態(tài)的特征。
在相關(guān)處本發(fā)明還可適用于細胞生物狀態(tài)的“復(fù)合”形式，細胞生物狀態(tài)不同形式的測定量被組合在其中。例如在一種復(fù)合形式中，是將某些RNA種類和某些蛋白質(zhì)種類的豐度與某些其它蛋白質(zhì)種類活性的測定量組合在一起。進而從下面所述還將理解到，本發(fā)明還適用于可測定的細胞生物狀態(tài)的其它形式。
藥物暴露典型地將影響在本發(fā)明特定實施方案中被測定和/或觀察的細胞生物狀態(tài)任何一種形式的許多成分。例如，由于已知存在于細胞中的調(diào)節(jié)、體內(nèi)平衡和代償性網(wǎng)絡(luò)及系統(tǒng)，即使一種“理想的藥物”，即只直接影響細胞內(nèi)單一成分而不直接作用于任何其它成分的藥物，也將具有復(fù)雜的，并且常常是不可預(yù)料的間接作用。設(shè)想例如有一種可特異性和完全抑制假定的單一蛋白質(zhì)即蛋白質(zhì)P活性的藥物。雖然這種藥物本身將直接改變僅僅蛋白質(zhì)P的活性，但是，受蛋白質(zhì)P抑制或刺激的，或者被增加或減少以及代償?shù)鞍踪|(zhì)P活性損失的另一些細胞成分也將受到影響。還有其它一些細胞成分也將受第二層次成分的水平或活性改變的影響等等。因此，藥物對其靶標(biāo)蛋白質(zhì)P的直接作用被隱藏在從蛋白質(zhì)P向下游方向的大量間接作用中。這種向蛋白質(zhì)P下游方向的作用在此被稱為起源于蛋白質(zhì)P的生物途徑(見下面)。
因此，一個不理想的藥物，例如直接影響一個以上靶分子的藥物，可能還具有更復(fù)雜的向下游方向的作用。一方面根據(jù)本發(fā)明，分析這些作用可提供關(guān)于藥物的相當(dāng)多的信息，包括例如，對受該藥物影響的生物途徑的鑒別，并可解釋它在細胞中的作用和毒性副作用。在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了用于實現(xiàn)這種分析的方法。
在本發(fā)明，測定細胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)是優(yōu)選的，不僅因為它比較容易測定，而且因為，雖然藥物可能通過轉(zhuǎn)錄后機制(如，抑制蛋白質(zhì)的活性或改變它的降解速度)起作用，但是，給藥對于細胞幾乎總會通過直接或間接的作用導(dǎo)致可測定的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)改變。藥物暴露改變細胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的原因是因為以前所提到的反饋系統(tǒng)或網(wǎng)絡(luò)，它們以代償性方式對感染，基因修飾，環(huán)境改變包括給藥等等起反應(yīng)，首先就通過改變基因表達或轉(zhuǎn)錄的模式起反應(yīng)。由于內(nèi)部的代償作用，對生物系統(tǒng)的許多擾動雖然對系統(tǒng)的外部行為僅有沉默的作用，但是仍然可以深刻地影響細胞中個別成分的內(nèi)部應(yīng)答，例如基因表達。
生物途徑在本發(fā)明，藥物對細胞的作用，不論是理想的還是不理想的藥物以及無論在特定的儀器內(nèi)如何測定，都是通過組合藥物對單個生物途徑的作用來表示。例如，圖1圖示說明藥物D通過與生物途徑101，102和103相互作用對細胞發(fā)揮作用(未顯示出途徑103的細節(jié))。藥物D與這些途徑之間的弧線表示藥物D對這些途徑的可能作用。假定藥物D對該細胞總的作用可表示為藥物對這三條途徑中的一條或一條以上作用的組合。在下面的章節(jié)中，首先描述如根據(jù)本發(fā)明一般使用的生物途徑，隨之描述便于將本發(fā)明應(yīng)用于它的特定生物途徑。
如在此使用的，生物途徑一般被理解為一群相關(guān)的細胞成分，其中此群集中的每一細胞成分，按照某種生物機制，受此群集中一種或幾種其它細胞成分的影響。可以從細胞生物狀態(tài)的任一方面引導(dǎo)出構(gòu)成特定途徑的細胞成分，例如從轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，或翻譯狀態(tài)，或活性狀態(tài)，或者生物狀態(tài)的復(fù)雜形式。因此，一種途徑的細胞成分可以包括mRNA水平，蛋白質(zhì)豐度，蛋白質(zhì)活性，蛋白質(zhì)或核酸修飾的程度(例如磷酸化或甲基化)，以及這些類型細胞成分的組合等等。此群集中的每種細胞成分，通過某種不需詳細說明或者甚至不需理解的生物機制，受此群集中至少一個其它細胞成分的影響。在此提供的圖解說明中，一種細胞成分對另一種細胞成分的影響，不論是直接的或是間接的，都被顯示為二種細胞成分之間的弧線，并且總的途徑被顯示為連接該途徑細胞成分的弧線網(wǎng)絡(luò)。因此，生物途徑被認為是從生物狀態(tài)某一方面引出的細胞成分的群集，連同這些成分之間影響的網(wǎng)絡(luò)。
例如圖1中，生物途徑101包括蛋白質(zhì)P1(例如P1的豐度或者活性)以及基因G1，G2和G3(例如，它們所轉(zhuǎn)錄的mRNA水平)，連同蛋白質(zhì)P1對此三個基因的直接或間接影響，這種影響被顯示為從P1引向這三個基因的弧線。這些影響機制的發(fā)生可能因為例如，蛋白質(zhì)P1可結(jié)合于這些基因的啟動子，并提高它們轉(zhuǎn)錄的豐度。
如在此所理解的，生物途徑的具體實例對于本領(lǐng)域是熟知的。它們依賴于不同的生物機制，借此細胞成分相互影響。例如，生物途徑包括熟知的生物合成途徑，在其中例如分子被降解以便提供細胞能量，或者構(gòu)成分子以便提供細胞能量貯存，或者其中蛋白質(zhì)或核酸前體物被合成。合成途徑的細胞成分包括酶和合成的中間產(chǎn)物，并且，前體分子對后續(xù)分子的影響是通過直接的酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化作用。生物途徑還包括信號傳輸和控制途徑，它們的許多例子也是熟知的。這些途徑的細胞成分典型地包括起始的或中間信號傳輸分子，以及通常賦予這些途徑特征的，參與此信號或控制級聯(lián)的蛋白質(zhì)。在信號傳輸途徑中，信號分子對受體的結(jié)合通常直接影響中間信號傳輸分子的豐度，并間接影響途徑蛋白質(zhì)的磷酸化(或其它的修飾)的程度。這二種作用本身又影響細胞蛋白質(zhì)的活性，這些細胞蛋白質(zhì)是由信號啟動的細胞過程的關(guān)鍵性作用因子，例如通過影響細胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)?？刂仆緩饺缈刂萍毎芷跁r間和發(fā)生的途徑也是類似的。在這里，多重并常常是不間斷的細胞過程暫被協(xié)調(diào)，常常是通過反饋控制，達到一種穩(wěn)定的結(jié)果，例如細胞分裂與染色體分離的協(xié)調(diào)。這種協(xié)調(diào)是該途徑發(fā)揮功能的結(jié)果，常常是由蛋白質(zhì)對其它各種分子磷酸化(或其它的修飾)程度的影響所介導(dǎo)的。還有一些熟知的控制途徑，在波動的環(huán)境面前設(shè)法保持最佳的細胞代謝水平。另一些按照已被理解的機制運行的細胞途徑的例子對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員也是熟知的。
在本發(fā)明中特別感興趣的途徑被定義為“起源”在特定細胞成分的途徑，特別是起源在特定細胞成分的分級途徑。起源在特定細胞成分的途徑包括那些特定的細胞成分，受此特定細胞成分直接影響的第二類細胞成分，受第二類細胞成分直接影響的第三類細胞成分，等等以及在各類細胞成分之間發(fā)生影響的網(wǎng)絡(luò)。細胞成分之間的影響可以是按照任何一種生物機制，例如信號傳輸機制，或者調(diào)節(jié)或體內(nèi)平衡控制機制，或者合成機制。在圖1中包括一種蛋白質(zhì)和幾種基因的途徑101起源在蛋白質(zhì)P1。包括二種蛋白質(zhì)和幾種基因的途徑102起源在蛋白質(zhì)P2和P3。
生物途徑也可以是分級的或非分極的。一般來說，分級的生物途徑不具有反饋環(huán)路。更詳細地說，分級途徑是一種在其中它的細胞成分可以被排列成限定數(shù)水平層次的途徑，致使屬于特定的限定數(shù)水平的細胞成分可以只受到屬于較低限定數(shù)水平的細胞成分影響。分級途徑起源于最低限定數(shù)的細胞成分。圖1中途徑101和102是分級的。途徑101是明顯分級的。在途徑102，在最低層次數(shù)水平上的蛋白質(zhì)P2和P3二者都(直接)影響在中間層次水平上的基因G?；騁本身又(可能是間接地)影響均處于最高層次數(shù)水平上的基因G4，G5和G6。不同的是，非分級的途徑具有一個或幾個反饋環(huán)路。生物途徑中的反饋環(huán)路是該途徑細胞成分的子系統(tǒng)，反饋環(huán)路的每種成分既影響反饋環(huán)路中的其它成分，也受這些成分影響。例如，在圖1的途徑102中，如果基因G6(可能是間接地)影響了蛋白質(zhì)P3，那么將形成一個包括基因G和G6以及蛋白質(zhì)P3的反饋環(huán)路。
因此概括地說，如在此使用的，生物途徑包括一群細胞成分，它們通過任何一種已知的或未知的生物機理相互影響，例如通過細胞的合成，調(diào)節(jié)，體內(nèi)平衡或控制網(wǎng)絡(luò)。一種細胞成分對另一種細胞成分的影響可以特別是通過一種細胞成分合成轉(zhuǎn)換成其它細胞成分，通過二種細胞成分直接的物理相互作用，通過由中間生物過程介導(dǎo)的二種細胞成分的間接相互作用，或者通過其它一些機制。進而，某些對本發(fā)明特別感興趣的途徑可以被認為起源于特定的細胞成分，它們影響該途徑中的其它細胞成分，但是本身不受該途徑中其它細胞成分影響，而在這些途徑中沒有反饋環(huán)路的途徑被認為是分級的。
因為本發(fā)明涉及通過生物途組合表示藥物的作用，所以某些類型的途徑特別有價值。藥物典型地是通過與一種細胞成分直接相互作用而對細胞起作用，并且更通常是與5-10-50或更多的許多細胞成分直接相互作用。在此將這些細胞成分稱為藥物的“靶標(biāo)”。藥物對細胞的另一些作用來自直接或間接地受藥物直接靶標(biāo)影響的其它細胞成分。因此，本發(fā)明用于表示藥物作用有價值的途徑包括起源于特定細胞成分的途徑，并且特別是分級的途徑。并且該起源性細胞成分優(yōu)選地是潛在性藥物靶標(biāo)的細胞成分。因為大多數(shù)藥物靶標(biāo)是蛋白質(zhì)，所以特別是起源于細胞蛋白質(zhì)的途徑對表現(xiàn)藥物作用特別有價值。在表現(xiàn)藥物作用中分級途徑是優(yōu)越的，因為存在于非分級途徑中的反饋環(huán)路可以通過在減弱藥物影響的細胞成分中引起代償性影響而掩蓋藥物的作用。
下面對本發(fā)明不同實施方案的描述，僅為了節(jié)省文字并且不帶任何限制，主要是針對途徑，并且常常只是針對起源于特寫蛋白質(zhì)的分級途徑。鑒于后面的敘述，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員如何將本發(fā)明應(yīng)用于包括起源于其它細胞成分如mRNA豐度的非分級途徑在內(nèi)的途徑將是顯而易見的。
對生物途徑的鑒定和擾動為了用于本發(fā)明，可通過幾種方式對生物途徑，特別是起源于蛋白質(zhì)的或分級的生物途徑進行鑒定，包括通過應(yīng)用已知的途徑以及借助于細胞生物狀態(tài)方面的測定量。已知的途徑如上述的示范型途徑通常包括可能是藥物靶標(biāo)的已知活性蛋白(或其它類型的細胞成分)。這種完全已知的途徑可以被用于表示藥物的作用。另外，可以將這種已知途徑的一些部分(在此也被稱為“亞-途徑”)用于本發(fā)明。例如，從這些已知蛋白質(zhì)(或很可能是藥物靶標(biāo)的其它細胞成分)中任何一種或幾種起源的亞-途徑，包括受一種或幾種已知蛋白質(zhì)(并排除影響此一種或幾種蛋白質(zhì)的途徑成分)直接或間接影響的途徑成分。可以從單一已知途徑得出許多亞-途徑。按照本發(fā)明的方法，這些亞-途徑中的一種或幾種可被用于表示藥物的作用。
借助于細胞生物狀態(tài)方面的測定量，例如借助于轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，或翻譯狀態(tài)，或活性狀態(tài)，或生物狀態(tài)復(fù)合形式的測定量，也可以足夠詳細地對用于本發(fā)明的生物途徑進行鑒定。借助于細胞生物狀態(tài)方面的測定量，在不同干擾狀態(tài)的條件下，如由暴露于不同藥物或由不同的基因操作引起的狀態(tài)，可對以相互關(guān)聯(lián)方式變化的細胞成分群進行鑒定。相互關(guān)聯(lián)的變化在此意指在此群集中細胞成分的相關(guān)變化，換句話說，細胞成分變化的式樣在不同狀態(tài)下是類似的。可以從不同狀態(tài)中這種類似的變化式樣推導(dǎo)出一個將這些成分的群集連接成生物途徑的相互影響的網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)測定過程中這些不同的狀態(tài)作用在此生物途徑上，此途徑的成分以由它們相互影響的類型和方向決定的相似變化式樣表示應(yīng)答。即使對這種影響的確切網(wǎng)絡(luò)和它們作用的機制都還不了解，也可以將這種成分的群集用作本發(fā)明中的一種生物途徑。
例如，已知作用于單一明確靶標(biāo)的藥物可以被用于測定以這種靶標(biāo)起源的途徑。將細胞暴露于不同濃度的這種藥物，可測定生物狀態(tài)方面的細胞成分，例如轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。那些改變藥物濃度時以相互關(guān)聯(lián)式樣變化的細胞成分可以被鑒定為起源在那些藥物的一種途徑。
另外，在已經(jīng)知道途徑的情況下，如果在暴露于另外一些環(huán)境的過程中測定顯示出原來途徑的亞-群集按照不同的式樣變化，則可以確定被測定途徑的亞-途徑。然后這些不同變化的亞-群集構(gòu)成可用于本發(fā)明的亞途徑?？梢愿鶕?jù)它們借以受到最大影響的亞途徑將所測定途徑的細胞成分進行分類。
例如，在一種途徑通過測定暴露于變化濃度藥物的細胞已被鑒定的情況下，可通過對此細胞進行基因敲除來鑒定亞途徑。通過對例如暴露于此藥物并具有某些基因敲除的細胞測定其轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，可以鑒定起源于此缺失基因的藥物途徑的亞途徑。
圖3圖示說明通過測定所鑒定的一個途徑的例子。此圖顯示，釀酒酵母30個基因的mRNA表達水平在應(yīng)答藥物氨甲喋呤六個不同的滴度時具有最大的表達改變，此30個基因是來自此酵母基因組內(nèi)大約6000個基因中。如在5.4部分所述，以基因轉(zhuǎn)錄陣列構(gòu)成了這些基因表達水平的測定量。這20個基因中的每一個都表現(xiàn)出對暴露于不同濃度氨甲喋呤相互關(guān)聯(lián)的應(yīng)答改變，其中每個基因在應(yīng)答逐漸增加濃度的氨甲喋呤時，都表現(xiàn)出從自然豐度到飽和豐度的一致增加或降低。因此，這30個基因可以在本發(fā)明被用作一種途徑，它包含受氨甲喋呤影響的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)細胞成分。另外，如果暴露于另外一些環(huán)境如不同的藥物或藥物敲除物(Knockouts)，可顯示出另一些行為式樣，那么可將這30個基因的組再分成另一些亞途徑。
本發(fā)明的方法可使用對生物途徑分級擾動的測定量，這種方法將很可能與藥物作用相關(guān)的途徑分級擾動的測定量同細胞分級暴露于該藥物的測定量進行比較，以便鑒定確實包含在該藥物作用中的途徑?？梢园磶追N方式實施分級的途徑擾動。在起源于已知蛋白質(zhì)(或其它細胞成分)的已知或已測定途徑的情況下，可以通過如突變，轉(zhuǎn)染，可控制的啟動子系統(tǒng)，或已知特異性作用的其它藥物等方法，以分級的方式干擾這些蛋白質(zhì)(或其它細胞成分)的豐度或者活性。在5.4節(jié)中更詳細地描述了這些方法。
借助于確定此途徑的影響網(wǎng)絡(luò)，對起源細胞成分的分級擾動將被傳播至該途徑的其它細胞成分。這種應(yīng)答數(shù)據(jù)特別由對該受影響途徑中基因或基因產(chǎn)物的基因轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)豐度測定量組成。借助于隨后在5.5節(jié)詳細論述的方法可以測定應(yīng)答數(shù)據(jù)。
在通過測定確定途徑的情況下，如果鑒定該途徑起源于這些成分是特別有益的。在那時，如對已知途徑所述的，可以干擾這些起源成分。如果該起源成分沒有被鑒定，則可以按分級的方式操作確定該途徑的條件。例如，在其確定條件之一是藥物暴露的途徑中，可將此藥物暴露分級，并觀察其細胞成分。如果該確定條件包括基因操作，則可以按照5.4節(jié)中所述的方法以分級的方式實施基因操作。
5.2將藥物應(yīng)答分解成途徑作用此部分首先提供本發(fā)明方法的概述，其次提供這些方法主要構(gòu)架的延伸說明實施例。
本發(fā)明方法的概述通過將一種細胞在應(yīng)答分級藥物暴露時生物狀態(tài)改變測定量與很可能是參與該藥物作用的生物途徑的生物狀態(tài)改變測定量進行比較，本發(fā)明的方法可確定通過它藥物對生物系統(tǒng)起作用的生物途徑，后者的改變是應(yīng)答對這些途徑的分級擾動。
在應(yīng)答多種強度的藥物暴露中，優(yōu)選地是在從沒有藥物至充分的藥物作用中，測定(如在5.6節(jié)中所述的)細胞生物狀態(tài)的一些方面，例如轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，翻譯狀態(tài)或者活性狀態(tài)。在此將這些測定量的集合稱為“藥物應(yīng)答”，并任選地以圖解方式提供。可以在從完全途徑抑制直至充分途徑飽和范圍內(nèi)的主要部分，按照變化的強度分級對本發(fā)明有用的途徑擾動。在應(yīng)答多種分級的途徑擾動強度時，測定類似于在藥物應(yīng)答時所測定的細胞生物狀態(tài)的一些方面，例如轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。在此將這些測定量的集合稱為“途徑應(yīng)答”或“途徑特征”，并任選地以圖解方式提供。優(yōu)選地是在改變該途徑中主要蛋白質(zhì)或基因的活性或者豐度的實驗中測定這些途徑應(yīng)答。
將在藥物暴露中變化的細胞成分與在途徑應(yīng)答中變化的細胞成分相比較，以便發(fā)現(xiàn)與全部或基本上全部藥物應(yīng)答相匹配的生物途徑或生物途徑的組合。當(dāng)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)在藥物應(yīng)答中變化的細胞成分在一種或幾種途徑應(yīng)答中以類似的方式變化時，基本上所有的藥物應(yīng)答與途徑應(yīng)答相匹配。優(yōu)選地至少75％在藥物應(yīng)答中變化的細胞成分可以被匹配，更優(yōu)選地至少90％可以被如此匹配。鑒于實驗誤差，當(dāng)二種狀態(tài)的數(shù)據(jù)很可能是相同數(shù)據(jù)時，細胞成分在二種應(yīng)答中以類似的方式變化。
在優(yōu)選的實施方案中，通過一種方法實施將藥物應(yīng)答與一種或幾種途徑應(yīng)答進行比較，按此方法所測定的藥物應(yīng)答與模式藥物應(yīng)答之間差異的客觀測定被減至最小。通過組合被認為很可能包含在此藥物作用中的那些途徑的途徑應(yīng)答來構(gòu)建模式藥物應(yīng)答。如果一種特殊的細胞成分在唯一的途徑應(yīng)答中發(fā)生變化，那么在模式藥物應(yīng)答中那種細胞成分的變化是那一種途徑應(yīng)答中的變化。如果一種特殊的細胞成分在二種或更多途徑應(yīng)答中發(fā)生變化，那么在此模式藥物應(yīng)答中那種細胞成分的變化是一組此途徑應(yīng)答中的變化?？梢酝ㄟ^疊加或者通過另一種數(shù)量組合法進行這種組合(見5.3節(jié))。因為對該藥物的強度(例如由描述其作用的動力常數(shù)所描述的)與分級途徑擾動效率(例如任意測定的擾動控制參考所描述的)的關(guān)系還不知道，所以可在對被組合在模式藥物應(yīng)答中的每種途徑應(yīng)答分級擾動強度與分級藥物暴露之間形成一個可調(diào)整的定標(biāo)。以可調(diào)整的定標(biāo)將這些細胞成分的變化組合在一起成為其模式藥物應(yīng)答。對于一種途徑的可調(diào)整的定標(biāo)通常與對于其它途徑的定標(biāo)無關(guān)。
在一個實施方案中，通過調(diào)整其模式藥物應(yīng)答中每種途徑應(yīng)答的定標(biāo)和/或通過改變組合在此模式藥物應(yīng)答中的生物途徑的數(shù)目或同一性，可使客觀測定最小化。通過在不希望的生物途徑中設(shè)置可調(diào)整的定標(biāo)，可簡便地達到改變組合于模式藥物應(yīng)答中的途徑的目的，以致使細胞成分不發(fā)生改變。在優(yōu)選的實施方案中，在此是通過在其途徑擾動參數(shù)與藥物暴露之間的線性轉(zhuǎn)換實施這種可調(diào)整的定標(biāo)，通過標(biāo)準的數(shù)值分析技術(shù)可實現(xiàn)使客觀測定最小化。見例如，Press等，1996，C中的數(shù)字訣竅，第二版，劍橋大學(xué)出版，Ch.10；Branch等，1996，Matlab最佳工具當(dāng)使用者指南，Mathworks(Natick，MA)。還有，可以改變來自不同途徑的相同細胞成分數(shù)值組合變化的方法。例如，可包括相乘的向量積項，此項將特別提供來自多轉(zhuǎn)錄因子的倍增應(yīng)答，這種多轉(zhuǎn)錄因子是從不同集合途徑會集的，以便形成一個轉(zhuǎn)錄復(fù)合體。
為了在最小化目標(biāo)函數(shù)之前提供所測定的藥物應(yīng)答，可以按不同的方式選擇組合在模式藥物應(yīng)答中的途徑。最簡便地是，可以將包括許多細胞功能的一大批生物途徑同如下數(shù)據(jù)組合在一起獨立可調(diào)整的定標(biāo)；最小化的客觀測定；以及最佳表現(xiàn)所確定藥物應(yīng)答的生物途徑的組合。生物途徑的“綱要”是用于檢測的生物系統(tǒng)中的一組途徑，這些途徑基本上完全地，或者至少基本上完全地包括所有很可能與藥物作用有關(guān)的途徑。優(yōu)選地，如果可以將這批途徑縮小至很可能包含在藥物作用中的途徑，那么這種最小化作用變得更有效。例如，以前對藥物作用生物途徑重要性的認識可以成為這種縮小的根據(jù)。
更優(yōu)選地是，選擇起源于特定細胞成分的途徑，并且優(yōu)越地還是分級的(最小化負反饋環(huán)路的減弱作用或正反饋的放大作用)。最優(yōu)選地是，這些起源性細胞成分很可能是所研究藥物的靶標(biāo)，通常是功能性活性蛋白質(zhì)。例如，給定一種所研究的藥物和在細胞中選擇一種可能的靶標(biāo)，那么首先可以測定起源于每種可能靶標(biāo)的生物途徑(如以前在5.1節(jié)所述的方法)。第二步，將這些途徑與獨立的定標(biāo)因子，最小化的客觀測定以及所確定的最佳表現(xiàn)此藥物作用的途徑組合相組合。從而，在確定包含在藥物作用中的真實途徑的同時，此藥物的真實靶標(biāo)也被鑒定為真實途徑起源于它的細胞成分。
在確定包含在藥物作用中的途徑之后，可借助于如下本發(fā)明的補充方法來證實它們。按照第一種證實方法，基于統(tǒng)計學(xué)檢驗所確定途徑的顯著性是無疑的，此統(tǒng)計學(xué)檢驗是參照從客觀測定由電腦計算的最小值進行的。一個優(yōu)選的檢驗如上所述以許多隨機化的藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)由電腦計算途徑表現(xiàn)，以便確定客觀測定最小值的分布。對比此分布，可以判斷確實從未隨機化的藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)得到的客觀測定最小值的統(tǒng)計學(xué)顯著性。
按照第二種證實方法，借助于對同時既暴露于藥物和也具有受干擾的一種或幾種確定途徑的細胞所作的測定，可以證實所確定的途徑。通過干擾藥物暴露的細胞(或給藥干擾的細胞)，可以得到證據(jù)證明此途徑實際上是包含在特異性的下游基因和蛋白質(zhì)的應(yīng)答中。如果受干擾的生物途徑不是包含在此藥物的作用中，那此藥物和這些擾動將對細胞成分的變化產(chǎn)生獨立的，通?；旧鲜歉郊拥淖饔?。如果受干擾的生物途徑確實包含在此藥物的作用中，那么此藥物和擾動的作用將不是獨立的。這些作用將干擾對藥物暴露或途徑擾動單獨觀察到的數(shù)值，細胞成分的變化也將在這些值達到飽和。
對本發(fā)明方法的圖解說明下面的章節(jié)將參照圖1和圖2A-C概括地說明本發(fā)明的幾個方法。圖1圖解說明藥物D可能通過三條可能的途徑對細胞起作用。途徑101和102分別起源于蛋白質(zhì)P1以及P2和P3，最后影響所指示基因的表達水平，可能是通過影響附加的介導(dǎo)性細胞成分。途徑103的細節(jié)沒有被顯示出。本發(fā)明的方法確定這三條途徑中哪條途徑可單獨地或以某種組合形式解釋藥物D對細胞的真實作用。
為了作出這種確定，本發(fā)明的方法試圖通過途徑101，102和103的一組途徑應(yīng)答來表現(xiàn)藥物D對細胞的作用，即它的藥物應(yīng)答。對于那種藥物D真實影響的途徑組合這種表現(xiàn)將是成功的，并且藥物D的應(yīng)答也將被充分地表現(xiàn)。如果通過這些途徑應(yīng)答中的僅僅一種就可以充分地表現(xiàn)所觀察到的藥物D應(yīng)答，那么鑒定此途徑為藥物D作用的唯一途徑。
在分別起源于蛋白質(zhì)P1以及P2和P3的途徑101和102的情況下，通過對起源蛋白質(zhì)豐度、或者活性、或者與藥物D作用相關(guān)的某種其它特征的已知擾動，可以直接確定這些途徑應(yīng)答。例如，應(yīng)用可變的擾動104改變蛋白質(zhì)P1的相關(guān)特征，從而影響途徑101中其它細胞成分的特征，例如基因G1，G2和G3的表達水平。能夠以分級的方式應(yīng)用擾動104以便在許多擾動控制值產(chǎn)生途徑應(yīng)答，從被干擾蛋白質(zhì)P1特征的自然水平至那些特征的充分飽和或抑制?？蓪Φ鞍踪|(zhì)P2形成類似的已知擾動，并且測定基因G4，G5和G6的表達水平。
另一種方法是，如果可以將藥物D在細胞上的應(yīng)答表現(xiàn)為通過干擾P1或P2產(chǎn)生的途徑應(yīng)答，那么本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解到，從而這些P1或P2將被鑒定為藥物D的蛋白質(zhì)靶標(biāo)。
圖2A圖示說明細胞對藥物D的一種可能轉(zhuǎn)錄應(yīng)答。橫座標(biāo)指示藥物暴露的程度，例如在細胞環(huán)境中藥物的濃度，范圍從為0數(shù)值的未暴露至為數(shù)值5的飽和暴露?？v座標(biāo)指示在暴露于藥物D時基因的表達對不存在藥物D時基因表達比率的對數(shù)。因此，這些藥物應(yīng)答曲線都是在沒有藥物D時以0開始，對應(yīng)于表達率1。假定為了此實施例，僅細胞的基因G1、G2和G3以由所標(biāo)明的應(yīng)答曲線指示的應(yīng)答明顯地應(yīng)答對藥物的暴露。
雖然為了圖示說明，此基因應(yīng)答曲線被表示為連續(xù)的曲線，但是在真正實驗確定的藥物應(yīng)答中，僅對有限的一組不連續(xù)的藥物暴露水平測定了表達率。在真實情況下，曲線圖表示的藥物應(yīng)答將由僅在這些不連續(xù)的藥物暴露水平進行選擇和定位，以致使藥物應(yīng)答曲線的陡峭區(qū)被充分地取樣。優(yōu)選地使至少5和5以上，更優(yōu)選地10或10以上的暴露水平位于應(yīng)答曲線的這些區(qū)域，在這些區(qū)域藥物應(yīng)答以未暴露水平變化至飽和水平。
借助于5.5節(jié)的方法可以制作和測定這種應(yīng)答曲線。特別是通過應(yīng)用基因表達分析技術(shù)，配合釀酒酵母的基因組序列，可以對這種酵母的幾乎全部基因?qū)嶒炛谱鬟@種應(yīng)答曲線。雖然本發(fā)明的許多描述是針對測定和模擬基因表達數(shù)據(jù)，但是本發(fā)明同樣可用于細胞生物狀態(tài)其它方面的測定量，如蛋白質(zhì)豐度或者活性。
圖2B圖示說明對途徑101(圖1中)的可能途徑應(yīng)答，途徑101以蛋白質(zhì)P1起源，并在應(yīng)答對起源蛋白質(zhì)P1的擾動104時包含基因G1，G2和G3的表達水平。此圖中的橫座標(biāo)指示施加于P1的擾動104的強度，范圍從在0數(shù)值的對P1沒有擾動至在數(shù)值5的對P1飽和擾動。視情況而定擾動104可以是抑制或激活蛋白質(zhì)P1。如在5.4節(jié)中更詳細描述的，特別是通過以不同量表達P1的基因轉(zhuǎn)染以便增加P1的豐度，或者通過在其本身被藥物或小分子控制的可控制啟動子的控制下表達P1，或者通過暴露于對P1具有已知特異性作用的不同藥物而抑制P1的活性，可以實現(xiàn)這種擾動作用。類似于圖2A，圖2B中的縱座標(biāo)指示暴露于擾動104時基因表達對不存在擾動104時基因表達比率的對數(shù)。通過所標(biāo)明的曲線圖示說明了基因G1，G2和G3表達水平的應(yīng)答，這些基因是受蛋白質(zhì)P1影響(不論直接或間接地)的途徑101的組成成分。
也類似于圖2A的是，雖然這些途徑應(yīng)答曲線被表示為連續(xù)的曲線，但是，事實上是以有限的一組不連續(xù)值對蛋白質(zhì)P1施加擾動104，此“曲線”確切地是在這些不連續(xù)的擾動控制參數(shù)值的表達比率數(shù)值。同樣優(yōu)選地是，對這些不連續(xù)的擾動值進行選擇和定位，以致使途徑應(yīng)答曲線的陡峭區(qū)被充分地取樣，使至少5和5以上，優(yōu)選地10或10以上的擾動控制參數(shù)值位于應(yīng)答曲線的這些區(qū)域，在這些區(qū)域應(yīng)答從未暴露水平變化至飽和水平。
圖2A和2B中的藥物應(yīng)答曲線的途徑應(yīng)答曲線顯示了這種曲線的一般預(yù)期的形狀。這種預(yù)期的形狀包括在低藥物暴露或擾動控制參數(shù)的閾下區(qū)，在此區(qū)域?qū)嶋H上不存在此途徑中細胞成分的應(yīng)答。在此閾下區(qū)之后，藥物或擾動開始達到有效，細胞成分的特征數(shù)值受到干擾。預(yù)期這種干擾值的曲線通常具有一個指向飽和漸近水平的單調(diào)上升或下降，超過此水平未見進一步的改變。應(yīng)答曲線終止于此飽和區(qū)。
事實上，在某些情況下，被預(yù)期的可能是更復(fù)雜的，非單調(diào)的應(yīng)答曲線形狀。例如，在藥物或擾動具有毒性作用的情況下，當(dāng)毒性出現(xiàn)，上升的細胞成分豐度可能開始下降，而下降的豐度可能開始更快地下降。已知存在于生物系統(tǒng)中的非線性和反饋機制也可能導(dǎo)致非單調(diào)的多相應(yīng)答。這樣一種應(yīng)答可能隨著不斷增加的擾動幅度或藥物暴露先上升然后下降。例如，一種藥物或擾動可能通過二種途徑對某些細胞成分起作用，以不同閾值，并且以相反的作用產(chǎn)生先上升然后下降(或者相反)的應(yīng)答。雖然根據(jù)單調(diào)應(yīng)答曲線如圖2A-B圖示說明的，對本發(fā)明的方法進行了圖解說明和初步描述，但是如根據(jù)隨后的描述本領(lǐng)域技術(shù)人員將發(fā)現(xiàn)，這些方法同樣適用于非單調(diào)的應(yīng)答曲線。
有了被測定的藥物和途徑應(yīng)答，要確定通過它(圖1的)藥物D對細胞起作用的途徑，此問題需要把這種藥物應(yīng)答匹配為一組途徑應(yīng)答。圖2A圖解說明在對藥物D的藥物應(yīng)答中，基因G1，G2，G3，G4，G5和G6的豐度如何變化。因為這些相同的基因在起源于P1和P2的分立途徑中發(fā)生變化，所以按照本發(fā)明的方法可以確定，是否這二種途徑都確實參與對藥物D的應(yīng)答中。
根據(jù)本發(fā)明的方法，是通過調(diào)查是否可以將起源于P1和P2途徑的途徑應(yīng)答曲線轉(zhuǎn)換匹配圖2A的藥物應(yīng)答曲線來作出這些確定。對于起源于P1的唯一途徑，是通過嘗試將圖2B中所顯示的此途徑的途徑應(yīng)答曲線轉(zhuǎn)換成圖2A中所顯示的對于G1，G2和G3的藥物應(yīng)答曲線，來獲得是否此途徑確實包含在藥物D作用中的確定。在此不需要考慮對于G4，G5和G6的藥物應(yīng)答曲線，因為起源于P1的途徑不影響這些基因。
圖2B的途徑應(yīng)答曲線轉(zhuǎn)換成圖2A的藥物應(yīng)答曲線一直可以既有縱向分量又有橫向分量。在此實例中沒有預(yù)期到這些曲線的縱向轉(zhuǎn)換。二組應(yīng)答曲線的幅度將是相等的，因為它們二者都在相同的范圍變化，從沒有擾動或藥物暴露的靜態(tài)(0)至飽和，藥物和擾動已最大程度地影響了途徑101的狀態(tài)。但是，橫向轉(zhuǎn)換很可能是必須。因為沒有理由認為限定擾動控制的數(shù)值，如表達P1的病毒轉(zhuǎn)染載體的暴露數(shù)值，或已知特異性作用于P1的其它藥物，是與限定暴露于所研究藥物D的數(shù)值相同的數(shù)值，所以這些藥物和途徑應(yīng)答曲線必須被橫向轉(zhuǎn)換，以便確定任何可能的匹配。因為圖2B中對于G1，G2和G3的曲線具有與圖2A中相應(yīng)曲線相同的一般形狀，所以在些情況下，這樣一種橫向轉(zhuǎn)換多半是可能的。
按照本發(fā)明尋找一種橫向轉(zhuǎn)換法，通過參數(shù)化一組可能的轉(zhuǎn)換進行處理。然后，尋找此參數(shù)的最佳值，這將使途徑應(yīng)答盡可能確切地說明藥物應(yīng)答。一組更可取的和簡單的轉(zhuǎn)換是從振動控制參數(shù)值至藥物暴露值的線性定標(biāo)，以延伸或收縮的程度將它們簡單地參數(shù)化。然后可以借助于標(biāo)準的方法找到線性延伸的最佳值，例如借助于最小化對途徑和藥物應(yīng)答曲線差異的客觀測定。
圖2C提供了尋找最佳線性定標(biāo)參數(shù)的示范性圖解說明。此曲線圖的縱座標(biāo)指示平均相關(guān)數(shù)，是在圖2B的途徑應(yīng)答曲線G1，G2和G3與分別是圖2A的藥物應(yīng)答曲線G1，G2和G3之間計算的數(shù)值。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，當(dāng)二組曲線相同時，它們將具有理想的相關(guān)數(shù)1.0。橫座標(biāo)指示從0至10的可能線性定標(biāo)參數(shù)。在此實例中，理想的相關(guān)數(shù)1.0出現(xiàn)在定標(biāo)數(shù)參2。以上的線性定標(biāo)可以將圖2B的途徑應(yīng)答曲線轉(zhuǎn)換成完全匹配圖2A的藥物應(yīng)答曲線。因此，可以得出結(jié)論，起源于P1的途徑是藥物D作用的途徑之一。
為了確定以起源于P1和P2的途徑是否可以說明藥物D的全部作用，按照本發(fā)明可以將這二種途徑應(yīng)答(起源于P2的途徑應(yīng)答未被顯示)的總和(這些途徑是分立的)轉(zhuǎn)換成所有六個基因?qū)λ幬顳的應(yīng)答曲線。
5.3分析實施方案本發(fā)明方法的分析實施例包括第一，用于將藥物應(yīng)答表現(xiàn)為一組途徑應(yīng)答的實施方案，以及第二，用于評估統(tǒng)計學(xué)顯著性和驗證所找到的表現(xiàn)結(jié)果。
圖5對本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案提供了一操作流程圖。此實施方案對一種特定藥物依據(jù)途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)511，確定了表現(xiàn)的藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)510，用于一種或幾種途徑以及對所確定的表現(xiàn)法作顯著性評估和驗證。
在本發(fā)明的其它實施方案中，圖5中所顯示的某些步驟可能被省去或者按不同于所顯示的順序進行。例如，在某些實施方案中，候選途徑選擇步驟501和定標(biāo)參數(shù)化選擇步驟502可以被實施一次，用于分析來自幾個優(yōu)選相關(guān)藥物的應(yīng)答數(shù)據(jù)，并且不需要對每個藥物分析分別進行。在特定的實施例中，也可以不進行途徑顯著性賦值和驗證，并且因此可以省去步驟505和506，步驟507或步驟508中的一步或一步以上。
5.3.1藥物應(yīng)答的表現(xiàn)表現(xiàn)依據(jù)途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)的藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)優(yōu)選地以對一種或幾種候選生物途徑的選擇，開始于步驟501，通過這種選擇以便對所研究的藥物提供藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)。如所論述的，被優(yōu)選采用的途徑是起源于一種或幾種細胞成分的途徑，更優(yōu)選地是起源于很可能是所研究藥物靶標(biāo)的蛋白質(zhì)成分。最優(yōu)選地是，此候選途徑起源于很可能是所研究藥物靶標(biāo)的單一細胞成分。
在不知道候選藥物靶標(biāo)時，可以從現(xiàn)有的途徑中，也許是儲存于途徑一覽表中選擇單一的途徑，并按照圖5中所示的如下步驟檢驗它在表現(xiàn)此藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)中的顯著。然后可以采用那些被單獨發(fā)現(xiàn)在表現(xiàn)藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)中具有顯著性的途徑，組合在一起，并實施圖5的步驟，以便確定用于表現(xiàn)藥物作用的最佳途徑組合。途徑一覽表對于用于檢測的生物系統(tǒng)優(yōu)選地是基本完整的(其中它包括那系統(tǒng)中基本上所有的生物途徑)，或者至少包括很可能是包含在藥物作用中的基本上所有的途徑。
按步驟511，對在步驟501中選擇的途徑測定途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)。在許多情況下，例如，在已通過測定確定了途徑時，將已經(jīng)測定了用于擾動所選擇途徑的應(yīng)答數(shù)據(jù)。在另一些情況下必須在本發(fā)明的后續(xù)步驟之前測定這些應(yīng)答數(shù)據(jù)。如上面所述，一種途徑的應(yīng)答數(shù)據(jù)，包括存在于該途徑中的細胞成分相關(guān)特征，對于多種擾動該途徑的控制水平，相對改變的測定量。例如，在通過起源于一種蛋白質(zhì)成分的基因表達水平確定了該途徑時，可以按分級的方式干擾此起源蛋白質(zhì)的活性，并且測定所構(gòu)成的自然基因表達水平對被干擾的基因表達水平的比率(或這些比率的對數(shù))。擇優(yōu)選擇擾動控制水平，以致使5或5以上，或者更優(yōu)選地10或10以上的擾動控制水平存在于細胞成分的特征從自然水平至飽和水平迅速改變的區(qū)域內(nèi)。
在下面，變量“p”一般指擾動控制水平，可變量“R”一般指途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)。詳細地說，在第i生物途徑中的第l擾動控制水平被稱為“pi，l”。第i途徑中對于第k細胞成分的途徑應(yīng)答是Ri，k。因此，Ri，k(pi，l)是在第l擾動控制參數(shù)水平，第i途徑中第k細胞成分的應(yīng)答。
同樣，按步驟510可獲得藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)，并且如果不是已經(jīng)現(xiàn)存的就必須測定。如上面所述，通過在多個藥物暴露水平(在此也稱為“藥物滴定水平”)測定細胞成分特征的改變可獲得這些數(shù)據(jù)。同途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)一樣，擇優(yōu)選選擇藥物暴露水平(或“藥物滴定量”)，以致使5或5以上，或者更優(yōu)選地10或10以上的暴露水平存在于細胞成分的特征從自然水平至飽和暴露水平迅速改變的區(qū)域內(nèi)。
在下面，變量“t”一般被用于指藥物暴露(或“滴定”)水平，變量“D”一般指藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)。更詳細地，第l測定的藥物暴露水平被稱為“t1”。第k細胞成分的藥物應(yīng)答是DK。因此，DK(t1)是在第l藥物暴露水平第k細胞成分的藥物應(yīng)答。
在這些方法的隨后步驟中，特別是在步驟504，在可能還未測定的藥物暴露值或擾動控制參數(shù)值時，可能需要藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)值和途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)值。此結(jié)果是根據(jù)如下事實得出的測定的藥物暴露水平與途徑擾動控制參數(shù)不一定相關(guān)。也就是說，對于特定L的變量t1與對于不同途徑i的pi，l沒有既定的關(guān)系。因此，在步驟502必須提供插入不同的應(yīng)答數(shù)據(jù)，以便得到所需的值。通過仿樣擬合或通過模式擬合可優(yōu)選地實現(xiàn)這種插入法。在步驟502可實現(xiàn)對插入法和任何必要參數(shù)的選擇。
在仿樣擬合中，通過相加適當(dāng)仿樣插入函數(shù)S乘以所測定數(shù)據(jù)值的乘積可插入藥物和途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)，如由如下公式所示的。 變量“u”意指藥物暴露水平或擾動控制參數(shù)的任意值，在此值分別計算藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)和途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)。一般地，S可以是具有在應(yīng)答函數(shù)中預(yù)期結(jié)構(gòu)寬度特征的有限載體的任何平滑(至少以片段方式連續(xù)的)函數(shù)。可以選擇具有特定距離的示范性寬度，在此距離被插入的應(yīng)答函數(shù)其漸近值從10％上升至90％。對于藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)和途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)，以及甚至對于不同途徑的應(yīng)答數(shù)據(jù)，不同的S函數(shù)都可能是適合的。示范性S函數(shù)包括線性插入和高斯插入。
對于模式擬合，藥物應(yīng)答和途徑應(yīng)答各自以單一參數(shù)化函數(shù)通過近似法被插入。適合于近似轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的示范性模式擬合函數(shù)是Hill函數(shù)，此函數(shù)具有可調(diào)整的參數(shù)a，uo和n。H(u)=a(u/uo)n1+(u/uo)n----(2)]]>對于藥物應(yīng)答的每種細胞成分和對于途徑應(yīng)答的每種細胞成分，單獨地選擇可調(diào)節(jié)的參數(shù)。擇優(yōu)選擇可調(diào)整的參數(shù)，以致對于每種途徑應(yīng)答的每種細胞成分，從Ri，k(pi，l)至H(pi，l)的距離平方和被最小化，并且對于藥物應(yīng)答的每種細胞成分，從DK(t1)至H(t1)的距離平方和被最小化。這種優(yōu)選的參數(shù)調(diào)整法在本領(lǐng)域被稱為H()對Ri，k()或?qū)k()的最小平方擬合。另一些可能的模式函數(shù)是基于多項式擬合，例如借助于不同的已知類型多項式。
根據(jù)圖3和4可圖示說明以Hill函數(shù)的模式擬合。如所論述的，圖3顯示被氨甲喋呤干擾和通過測定鑒別的一種途徑的實例。此圖顯示，釀酒酵母基因組內(nèi)大約6000個基因中，在應(yīng)答六個不同的氨甲喋呤暴露水平時具有最大表達改變的此酵母菌30個基因的mRNA表達水平。圖4顯示，借助于Hill函數(shù)，這些基因表達水平之一的途徑應(yīng)答的擬合。特別是，通過Hill函數(shù)使此酵母菌的基因YOLO31C與借助于以前所述的最小平方法選擇的參數(shù)n＝2，a＝-0.61和lob10(uo)＝1.26相擬合。
因為具有最大應(yīng)答的所有30個基因都表現(xiàn)出單調(diào)的行為，即沒有一個應(yīng)答隨藥物暴露增加從其最大幅度顯著地降低(或者從其最小的幅度顯著地提高)，所以Hill函數(shù)是一種適合的模式擬合函數(shù)。對于非單調(diào)表現(xiàn)的將不是這樣。
在選擇應(yīng)答數(shù)據(jù)插入法之后，藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)擬合前的最后步驟503是選擇一種定標(biāo)轉(zhuǎn)換以及任何一些必要的參數(shù)，這些參數(shù)將使生物途徑應(yīng)答與藥物應(yīng)答相關(guān)聯(lián)。一般來說，一種定標(biāo)轉(zhuǎn)換可能需要垂直定標(biāo)以及水平定標(biāo)。為了使在獲得這些應(yīng)答數(shù)據(jù)時所形成的每種細胞成分相關(guān)特征的不同測定量相關(guān)聯(lián)，垂直定標(biāo)可能是必不可少的。例如，這些測定量可能是mRNA的豐度或蛋白質(zhì)的活性。在按相應(yīng)單位形成這些測定量的情況下，僅為了使不同的測定單位相關(guān)聯(lián)而需要垂直定標(biāo)。另外，在跨越從自然水平至充分飽和的參數(shù)范圍形成藥物以及途徑測定量的情況下，這通常是優(yōu)選的，可以例如通過飽和值定標(biāo)這些測量值。這種定標(biāo)可避免需要任何垂直定標(biāo)。在此情況下，例如，當(dāng)通過與Hill函數(shù)擬合插入途徑應(yīng)答時，對于所有應(yīng)答數(shù)據(jù)參數(shù)“a”的值都基本上等于1。在下面，將假定已通過飽和值進行了任何必要的垂直定標(biāo)，并且所有的途徑數(shù)據(jù)在普通的自然水平與飽和值之間變化。
一般來說，預(yù)料水平定標(biāo)是必不可少的。如上面在5.2節(jié)所論述的，這種定標(biāo)是必不可少的，因為對于不同的候選生物途徑，擾動控制參數(shù)值在相同數(shù)量的擾動控制值很可能不引起飽和應(yīng)答，在與藥物暴露的飽和應(yīng)答相同的數(shù)量值也不引起飽和應(yīng)答。例如，途徑擾動可能按照像如下這樣一些完全不同的機制起作用表達一種途徑起源性蛋白質(zhì)的病毒轉(zhuǎn)染載體的滴定度；或一種控制起源性蛋白質(zhì)表達的可控制啟動子的控制參量；或已知特異性作用于起源性蛋白質(zhì)的藥物暴露水平。這些機制的飽和控制值，以及它們確實的動力學(xué)特征，很可能是完全不相關(guān)的。所有這些機制可能都不同于所研究藥物的作用。例如，在對一種途徑起源性細胞成分的擾動作用可以作為Hill函數(shù)被模擬的情況下，沒有理由認為不同的“uo”參數(shù)將是相同的。
優(yōu)選的水平定標(biāo)轉(zhuǎn)換是藥物暴露水平線性轉(zhuǎn)換成為相應(yīng)的擾動控制參量。這樣一種轉(zhuǎn)換的示范性表達式為如下。
pi，l＝αit1+βi(3)等式(3)提供了在相應(yīng)于第l藥物暴露水平的第i途徑中的擾動控制值。其線性定標(biāo)常數(shù)是αi和βi。以一組定標(biāo)參數(shù)表示每種途徑的特征。一般地，βi將是0，因為藥物暴露和擾動控制值都是以0開始。實質(zhì)上αi代表特定的途徑擾動強度對所研究藥物強度的比率。例如，當(dāng)此應(yīng)答數(shù)據(jù)可以以Hill函數(shù)建立模型時，αi是所研究藥物的uo參數(shù)對此特定途徑的uo參數(shù)的比率。
更通用的水平定標(biāo)轉(zhuǎn)換可能以一些補充的參數(shù)表示特征。以若干足夠小的，即使是非線性的參數(shù)，靈活的定標(biāo)轉(zhuǎn)換有可能被有效地應(yīng)用于步驟504的最小化程序。在此用“αi”代表對于第i途徑的多重定標(biāo)參數(shù)。定標(biāo)轉(zhuǎn)換的另一個實例是一般化線性轉(zhuǎn)換等式(3)的多項式展開。更一般性定標(biāo)轉(zhuǎn)換的一個簡單實例是按照下面等式使用的以前所述的Hill函數(shù)。pi,1=αi(t1/μi)ni1+(t1/μi)ni----(4)]]>等式(3)再次提供了在相應(yīng)于第l藥物暴露水平的第i途徑中的擾動控制值，并且通過3個參數(shù)αi，μi和ni對于每種途徑參數(shù)化此等式。Hill函數(shù)定標(biāo)是更通用的，至少其中當(dāng)ni是1，并且t1比ui小很多時它降低為線性定標(biāo)。
步驟504是本發(fā)明方法的中心步驟，其中藥物應(yīng)答被表現(xiàn)為一組適當(dāng)定標(biāo)的途徑應(yīng)答。藥物應(yīng)答的優(yōu)選表現(xiàn)是作為途徑應(yīng)答的一個定標(biāo)的線性組合。當(dāng)受一種途徑影響的細胞成分或者不受其它途徑的影響，或者如果多種途徑會集于相同的細胞成分如mRNA或蛋白質(zhì)豐度而具有線性附加作用時，這種表現(xiàn)法特別有用。因為途徑的會聚或重疊最可能在遠離初始靶標(biāo)的下游，在此影響已經(jīng)分支包括許多基因，所以多種途徑的作用更可能作為無關(guān)的和附加的影響偶然起作用。如果這些作用通過一種新的細胞成分會聚在二種途徑中，那么無關(guān)性和附加性就不大可能。在這種情況下，可包括相乘的叉積項，此項可特別表示一種細胞成分的倍增應(yīng)答，這種應(yīng)答是起因于多種途徑在那種細胞成分的會聚。即使在后一種情況下以及在其它情況下，在這些情況下不保持有線性相加性，可以使線性相加性導(dǎo)入的誤差與5.3.1節(jié)的技術(shù)相關(guān)聯(lián)。
因此，優(yōu)選地是按照如下等式將藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)通過途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)表示。Dk(t1)=ΣiRi,k(αi,t1);k=1,K;l=1,L----(5)]]>等式(5)對于按照由αi參數(shù)化的所選擇轉(zhuǎn)換定標(biāo)的第k細胞成分，用途徑應(yīng)答的和表示在藥物暴露的第l水平第k細胞成分的模式藥物應(yīng)答。在此和隨后一般都應(yīng)理解到，按照步驟502的方法可插入Ri，k()，因為很少有如下情況，按由所定標(biāo)的藥物暴露水平給定的擾動控制值將獲得這些測定量。在包括相乘的叉積項的情況下(例如，以前所述的情況)，等式5也包括如Ri，k(αi，t1)Ri，k(αit1)項。
通過本領(lǐng)域熟知的數(shù)值近似法可以獲得此后一等式的足夠精確的解。這些解確定最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)化，以致使模式藥物應(yīng)答與藥物應(yīng)答盡可能密切地匹配。優(yōu)選的方法提供了一個程度的數(shù)值指示(在此被稱為“殘數(shù)”)，達到此程度等式5則不能被充分滿足。按照一種優(yōu)選的方法，由相關(guān)的最小二乘方近似問題的最小化可以確定途徑定標(biāo)參數(shù)。 在等式(6)中，Ri，k的內(nèi)部和包括所有插入的途徑應(yīng)答，這些途徑應(yīng)答是按照相應(yīng)于藥物暴露水平t1的參數(shù)αi定標(biāo)的。對于每種生物途徑參數(shù)αi一般是確定定標(biāo)轉(zhuǎn)換的一組幾個參數(shù)，如從1至5的參數(shù)。在ti此和與藥物應(yīng)答差的絕對值的平方本身又對被‘l’標(biāo)記的所有的藥物暴露水平，以及被‘k’標(biāo)記的藥物應(yīng)答中或生物途徑中所有的細胞成分相加。以對此后一個總和的最小化處理可確實依據(jù)生物途徑對藥物應(yīng)答的表示法，此總和是相對于每種途徑定標(biāo)轉(zhuǎn)換參數(shù){αi}的總和。此總和的最小值提供了一個程度的數(shù)值指示，即“殘數(shù)”，達到此程度等式5將被滿足。
對于線性定標(biāo)轉(zhuǎn)換，等式6具有如下較簡單的形式。 在等式7，每個αi是對每種生物途徑的單獨定標(biāo)常數(shù)。自然地，每個αi取決于藥物暴露所選擇的單位，以及對擾動控制值所選擇的單位，并且取決于藥物的效力與擾動方法的效力之間確實的物理相關(guān)性。
應(yīng)用許多現(xiàn)有數(shù)值方法中的任何一種方法可實施對最小二乘方等式6或7的最小化。參見例如Press等1996，C中的數(shù)據(jù)訣竅，第二版劍橋大學(xué)出版，第10，14章；Branch等，1996，Matlab最佳化工具書，用戶指南，Mathworks(Natick，MA)。一種優(yōu)選的方法是Levenbery-Mar-quant法(在Press等的著作中，14.4節(jié))。因為有K基因和藥物暴露的水平L，所以等式6或7代表KL的單獨等式。未知數(shù)等于假設(shè)的途徑數(shù)目乘以每種途徑定標(biāo)參數(shù)的數(shù)目。在線性定標(biāo)的情況下，定標(biāo)參數(shù)的數(shù)目等于途徑的數(shù)目。典型地是，數(shù)目KL比定標(biāo)參數(shù)的數(shù)目大很多，此致使此最小二乘方問題是相當(dāng)超定的。超定法是優(yōu)越的方法，按此方法可使此解法準確，那在單個細胞成分的應(yīng)答中對測定誤差遲鈍。
一種代替在等式6和7中所簡述的用于解等式5的最小二乘方程序的方法，是最大化在模式藥物應(yīng)答與所測定的藥物應(yīng)答之間的標(biāo)準化相關(guān)性。此程序在數(shù)學(xué)上與最小二乘方程序密切相關(guān)。按照此程序是從求解等式8來確定αi。 在此等式中，ρk(αi)是對于第k細胞成分的藥物應(yīng)答與對于第k細胞成分的模式途徑應(yīng)答之間的相關(guān)系數(shù)。詳細地說，此相關(guān)系數(shù)可由等式9給出。ρk(αi)=Σ1Dk(t1)(ΣiRi,k(αit1))(Σm(Dk(tm))2ΣnΣi(Rik(αitn))2)1/2----(9)]]>在等式9，內(nèi)部總和(對i)表示對第k細胞成分的模式藥物應(yīng)答。對所有的藥物暴露水平相加模式藥物應(yīng)答與測定藥物應(yīng)答的積，并通過這些應(yīng)答的平方根(在此也稱為“RMS”)值標(biāo)準化此總和，以便給出相關(guān)系數(shù)。返回到等式8，優(yōu)選地可通過幅度ADK和ARK標(biāo)準化此相關(guān)系數(shù)的值，此幅度ADK和ARK是對于第k細胞成分測定的和模式藥物應(yīng)答的應(yīng)答幅度。這些幅度被選擇為在所有的藥物暴露水平測定的和模式藥物應(yīng)答的RMS值。這種標(biāo)準化對具有較大幅度的應(yīng)答給予較大的加權(quán)值，同時確保充分的相關(guān)性給出整數(shù)值。
另一方面并較少優(yōu)選的是，可以將這些相關(guān)系數(shù)非標(biāo)準化，在這種情況下，等式(8)中的幅度被取作單一值。還可以用此相關(guān)系數(shù)的負數(shù)代替此相關(guān)系數(shù)，在此情況下，等式(8)的表達式被最小化(而不是被最大化)，以便找到最佳定標(biāo)參數(shù)。
通過在最小二乘方法的情況下所述的方法可以求解等式8和9。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將明了，上述擬合法與最小化等式8的負數(shù)值是等價的。
不論對于最小二乘方法和相關(guān)法，對此轉(zhuǎn)換的藥物暴露水平相加這些途徑應(yīng)答可能導(dǎo)致超過擾動控制參數(shù)測定區(qū)間范圍的值。這是因為此定標(biāo)參數(shù)αi可以是基本上大于或小于整數(shù)。為了避免測定值的外延，在此二種情況下(等式6和8)的總和僅在具有測定數(shù)據(jù)的間隔內(nèi)被延伸。
當(dāng)將來自二種不同藥物的藥物應(yīng)答進行比較時，可以進行此節(jié)前面所述的步驟，以便獲得一個相關(guān)系數(shù)，或者按另一種方法得到一個最小二乘方殘數(shù)，它是二種藥物作用相似性的一個測定量。在此實施方案中，僅一種應(yīng)答途徑被定標(biāo)，以便擬合藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)。因此，在此特定的實施方案中，是按照前述的等式5，在此K＝1，將第二“擾動”藥物的應(yīng)答R與第一種藥物D的應(yīng)答數(shù)據(jù)相比較。
5.3.2途徑確證在確定了將藥物應(yīng)答表示為一組途徑應(yīng)答之后，優(yōu)選地，雖然是任選的是，對在步驟506中確定的途徑組合賦予統(tǒng)計學(xué)顯著性，并且確證所確定的途徑在步驟507中是顯著性的。
檢驗統(tǒng)計學(xué)顯著性對于步驟506，是通過將從求解等式5確定的最小殘數(shù)值與預(yù)期的殘數(shù)機率分布相比較，確定途徑組合的統(tǒng)計學(xué)顯著性。最小殘數(shù)按照這種分布表示的可能性越小，所測定的途徑組合越具顯著性。在相關(guān)最大化法的情況下，可以將相同的方法用于等式8中找到的最大值。特別是，可以發(fā)現(xiàn)此最大值的預(yù)期分布，并且可從此分布確定真實獲得的最大值的顯著性。
借助于本領(lǐng)域已知的任何一種方法可以評估殘數(shù)的預(yù)期機率分布。典型地是，根據(jù)有效輸入機率分布的某一事先的假設(shè)，分析性地估算這種分布。因為在此情況下這種分析性估算是困難的，所以優(yōu)選地是根據(jù)Fisher所述的方法，通過模擬估算此殘數(shù)分布。參閱Conover第二版1980，實用非參量統(tǒng)計學(xué)，John wiley。此方法通過對輸入的數(shù)據(jù)采取重排列或隨機的正集提供經(jīng)驗性殘數(shù)分布。詳細地說，在此可相對于藥物暴露水平改變輸入。
按照這種優(yōu)選的方法，通過以隨機化的輸入數(shù)據(jù)重復(fù)地求解等式5和累加此殘數(shù)，構(gòu)建殘數(shù)分布圖，以便形成經(jīng)驗性殘數(shù)分布。從而，此構(gòu)建的經(jīng)驗性殘數(shù)分布圖由隨機數(shù)據(jù)產(chǎn)生，這些隨機數(shù)據(jù)具有與真實數(shù)據(jù)相同的統(tǒng)計學(xué)總體。詳細地說，首先在步驟505使藥物暴露水平或擾動控制參數(shù)，或者是藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)，或者是途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)(但不是二者)被隨機化。通過如下轉(zhuǎn)換可表示這種隨機化轉(zhuǎn)換。
Dk(tl)-Dk(tn(l)) (10)Ri，k(pi，l)-Ri，k(pi，n(l))在等式(10)，∏表示對每種細胞成分獨立選擇的擾動。按照等式10，或者藥物應(yīng)答，或者每種途徑應(yīng)答(但不是二者)被隨機化。因此，隨機化的藥物或途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)是通過測定點的獨立擾動從測定的數(shù)據(jù)得到。第二，然后通過在步驟504中所選用的數(shù)值近似技術(shù)求解等式5，并且省去形成殘數(shù)的值。為了足夠地隨機化，重復(fù)這些步驟，以便構(gòu)建一個充分顯著性的，預(yù)期的殘數(shù)分布。為了獲得99％或更好的置信度水平(即P值小于0.01)，需要大于100的隨機化。
在步驟506已構(gòu)建經(jīng)驗性殘數(shù)分布圖之后，將真實確定的殘數(shù)與所構(gòu)建的分布和根據(jù)此分布確定的其機率相比較。此機率是被賦予此途徑的顯著性。換句話說，在此優(yōu)選的實施方案中，是通過機率值的微小度對一組途徑與藥物應(yīng)答的任何擬合給出統(tǒng)計學(xué)顯著性，此機率值使隨機化數(shù)據(jù)比真實數(shù)據(jù)通過假定的途徑組合較好地被擬合。
在某些情況下，起初在步驟501中選擇的途徑組合具有適合的顯著性。例如，如果此途徑組合具有普通用于醫(yī)學(xué)科學(xué)的至少標(biāo)準的95％機率閾值時情況就是這樣。如果這樣，那么在步驟507中可以證實此起始的途徑組合，并且可以在步驟508中確定一些細胞成分具有單獨的生物途徑。在另一些情況下，最初不能發(fā)現(xiàn)可接受的顯著性閾值。如果是這樣，那么如箭頭512所指示的有利的情況可以是返回至步驟501并選擇一組新的候選途徑，以便找到一組符合此選擇的顯著性閾值標(biāo)準。
因此，所賦予的顯著性為賦予顯著性值并在途徑組合之間進行選擇提供了一種客觀的方法。這種賦予顯著性的客觀方法使有可能從一大批很可能包含在所研究藥物作用中的可能途徑有目的地鑒定這些途徑，并且當(dāng)模式藥物應(yīng)答(可能組合了多種途徑)充分客觀的顯著性時，為停止尋找另外的途徑提供了客觀的依據(jù)。
在如上面確定的顯著性的另一種用途中，可按照二種不同的方法檢驗單一候選途徑的顯著性。按第一種方法，選取只包含此候選途徑的模式藥物應(yīng)答，并通過相關(guān)性或最小二乘方殘數(shù)(如在5.3.1節(jié)中所述的)將隨此途徑的途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)與藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)相比較。將通過上述隨機化法確定的擬合顯著性與一個閾值如醫(yī)學(xué)科學(xué)中的95％閾值標(biāo)準相比較，并且如果此顯著性大于閾值，則此候選途徑被認為是藥物作用途徑。
按第二種方法，假定此模式藥物應(yīng)答參與包括所研究的候選途徑在內(nèi)的多種途徑。然后按照等式10，對于此候選途徑通過隨機作此唯一的途徑數(shù)據(jù)選擇性地隨機化途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)，借助于以前的方法評估模式藥物應(yīng)答對此選擇性隨機化數(shù)據(jù)的顯著性。如果此后者的顯著性顯著地小于此真實數(shù)據(jù)前者的顯著性，那么選取已顯著地改善了此模式藥物應(yīng)答的候選途徑。在此情況下，該途徑很可能是所研究藥物作用的途徑。
證實途徑組合關(guān)于下一步驟507，通過在此節(jié)所述的優(yōu)選的，但是任選的步驟可以獨立地驗證按照途徑應(yīng)答對藥物應(yīng)答的表示法。在本發(fā)明前面的步驟中(步驟510和511)，生物系統(tǒng)通過藥物暴露或通過對所選擇途徑的擾動而受干擾，但是不該受藥物暴露又受途徑擾動的干擾。在步驟504和506，先通過一組所選擇途徑擾動的結(jié)果擬合藥物暴露的結(jié)果，然后檢驗此擬合的統(tǒng)計學(xué)顯著性?，F(xiàn)在在步驟507中，是將在步驟504中所確定的對此顯著性途徑同時的藥物暴露和擾動，用于證實這些途徑確實是藥物作用的真實途徑。
在論述途徑證實的分析細節(jié)之前，先根據(jù)圖6中所示的情形示范性說明同時的藥物暴露和途徑擾動的優(yōu)越性。在圖6中，基因Gk的表達(例如轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的mRNA豐度測定量)受二種途徑影響，一種起源于蛋白質(zhì)P1，另一種起源于蛋白質(zhì)Px。假定藥物D通過抑制P1或通過抑制Px對基因Gk起作用。如果對此二種途徑的抑制性擾動在基因Gk產(chǎn)生相似的應(yīng)答，那么即使藥物D僅通過抑制Px起作用，它的藥物應(yīng)答在步驟504中也將通過抑制性擾動601很好地擬合于起源于P1的途徑，并且此途徑可能被錯誤地鑒定為藥物D作用的很可能途徑。通過同時暴露于藥物D和抑制P1或Px可以補救這種誤差。暴露于藥物D和抑制P1將不會導(dǎo)致藥物應(yīng)答改變，因為藥物應(yīng)答實際上是由Px介導(dǎo)的。但是，暴露于藥物D和抑制Px將會導(dǎo)致藥物應(yīng)答改變，因為現(xiàn)在藥物和擾動都作用于Px。在這二種情況中對同時的藥物暴露和途徑擾動不同的應(yīng)答，使之能夠?qū)λ幬顳作用的正確途徑進行明確的鑒定。
開始概述驗證步驟507時，首先考慮只有一種途徑被參與表現(xiàn)藥物應(yīng)答的情況，隨后考慮多種途徑的一般情況。在下面如同以前，Dk(t1)表示第k細胞成分對第l水平藥物暴露的應(yīng)答，Ri，k(Ri，l)表示在應(yīng)答時第i途徑中第k細胞成分對第l水平的適當(dāng)擾動控制參數(shù)的應(yīng)答。另外，變量DR表示生物系統(tǒng)組合暴露于藥物和途徑擾動的結(jié)果。詳細地說，DRi，k(Ri，l，tm)表示在應(yīng)答時第i途徑中第k細胞成分對第l水平的適當(dāng)擾動控制參數(shù)和對第m水平的藥物暴露的應(yīng)答。
在單一途徑藥物作用的情況下，如果藥物確實作用在那種途徑，那么可用如下等式給出組合應(yīng)答DR。
DRi，k(pi，l，tm)＝Ri，k(pi，l+αitm)(11)在此αi是對此途徑確定的最佳定標(biāo)參數(shù)。在此假定是線性定標(biāo)；根據(jù)前面的描述顯然適合于更一般的定標(biāo)轉(zhuǎn)換。DR具有上述形式是因為在這種情況下藥物和擾動都對途徑的相同成分起作用，特別是對它們的起源成分起作用，并且這種途徑應(yīng)答是由于其相加的作用。
等式(11)的狀態(tài)被圖解顯示在圖7A中，在此只是作為例子，D和R已被Hill函數(shù)模擬。特征上，在此情況下函數(shù)DR在基本上相同的值飽和，對于大的藥物暴露(藥物“滴定量”)接近星號701，對于大的擾動接近星號702，而對于大藥物暴露和大擾動的組合接近圓圈703。
如果不是那樣，藥物對不同的途徑起作用，而不是對第i途徑起作用，那么可由如下等式給出組合的應(yīng)答DR。
DRi，k(pi，l，tm)＝Ri，k(pi，l)+Dk(tm) (12)在此情況下應(yīng)答具有這種形式是因為藥物只對第i途徑之外的細胞成分起作用。因為途徑擾動被限制于第i途徑中的細胞成分，所以它獨立地起此藥物的作用。因而，藥物的作用和擾動是獨立的，并且它們的作用是附加在細胞成分上。(需要時按照在5.2節(jié)中所論述的另一些組合函數(shù)這些作用可以被組合)。
圖7B圖解顯示了等式12的狀態(tài)(假設(shè)αi等于1)，在此僅為了作為例子D和R同樣已被Hill函數(shù)模擬。在此情況下，函數(shù)DR在基本上相同的值飽和，對于大的藥物暴露(藥物“滴定量”)接近于星號704，而對于大的擾動接近于星號705。但是對于大藥物暴露和大擾動的組合，此函數(shù)基本上達到比在星號704或705高的值，接近于圓圈706，在此只是藥物暴露或擾動單獨處于飽和中。
顯然，通過對藥物暴露和途徑擾動都同時存在的驗證條件進行實驗，有可能區(qū)分由圖7A和7B表示的情況。這些實驗優(yōu)選地是在由圖7A和7B中圓圈所表示的藥物暴露和擾動值，而最優(yōu)選地是在圓圈703和706表示的值。較少優(yōu)選地是這些實驗在這些圖中顯示的表面內(nèi)部的數(shù)值下進行，特別是在由圖7A中星號701和702與圓圈703之間的線條所限定的區(qū)域內(nèi)，以及在由圖7B中星號703和704與圓圈705之間的線條所限定的區(qū)域內(nèi)。同樣明顯的是，僅僅通過進行其中只有一個藥物暴露值或擾動控制值是非0的實驗是不可能區(qū)分這些情況。圖7A中星號710與星號701或星號702之間的曲線，基本上與圖7B中星號711與星號704或星號705之間的曲線相同。
總之，如果與圖7B相比實驗結(jié)果更密切地相似于圖7A，則可證實第i途徑為此藥物作用途徑的鑒定。
考慮到一般是多種途徑的情況，TRk(Ri，L，tm)表示在應(yīng)答第i途徑中第l水平的適當(dāng)擾動控制參數(shù)以及應(yīng)答第m水平的藥物暴露時，第k細胞成分的總應(yīng)答。如果此藥物通過所指出的途徑起作用，則可用如下等式給出TR。TRk(pi,1,tm)=ΣiDRi,k(pi,1,tm)=ΣiRi,k(pi,1+αitm)----(13)]]>如此此藥物不通過所指出的途徑起作用，則可用如下等式給出TR。TR(pi,1,tm)=ΣiDRi,k(pi,1,tm)=Σi(Ri,k(pi,1)+Dk(tm))----(14)]]>按照類似于前面小節(jié)中所描述的統(tǒng)計學(xué)系數(shù)評估法的方式，可以在這二種可能性之間作出客觀的選擇。等式13和14左邊TRk(Ri，l，tm)的值可對不同優(yōu)選驗證條件通過實驗確定，而等式右邊的值可根據(jù)步驟510和511中藥物應(yīng)答和途徑應(yīng)答的測定量，以及根據(jù)步驟504中對最佳定標(biāo)參數(shù)的確定來計算。然后計算對于這二個等式的殘數(shù)，即左邊與右邊差的平方和。沒有更多時，具有較少殘數(shù)的二者之一是此客觀的選擇。
可首先通過評估殘數(shù)的機率分布來評估此殘數(shù)的統(tǒng)計學(xué)顯著性。通過相對于擾動控制參數(shù)的指數(shù)和藥物暴露的指數(shù)重復(fù)隨機化等式13和14的右邊，然后重新計算此殘數(shù)可確定所評估的殘數(shù)機率分布。然后相對于此模式機率分布確定真實殘數(shù)的統(tǒng)計學(xué)顯著性。
典型地是，以顯著性證實存在步驟506中被確定的具有顯著性的途徑，只需要小數(shù)目的驗證條件。
在最后任選的步驟508中，在步驟504藥物應(yīng)答已被表示為一組途徑應(yīng)答，并且最佳擬合定標(biāo)參數(shù)已被相應(yīng)地確定之后，可以將每種受影響的細胞成分分配給與它的藥物應(yīng)答最相關(guān)的途徑。任選地還可在步驟506中基于一個顯著性閾值如通常用于醫(yī)學(xué)科學(xué)的標(biāo)準的95％機率閾值，判斷此途徑是顯著性的。在每種途徑的應(yīng)答數(shù)據(jù)中對于第K細胞成分，它的藥物應(yīng)答Dk(tl)與該成分的單個應(yīng)答相關(guān)聯(lián)。
ρi，k＝corr(Dk(tl)Ri，k(αitl))=Σ1Dk(t1)Ri,k(αit1)(Σm(Dk(tm))2Σn(RJk(αJtn))2)1/2----(15)]]>在等式15中，ρi，k是第k細胞成分的藥物應(yīng)答與在第i途徑中其應(yīng)答的相關(guān)性。第K細胞成分被分配給第i途徑，在此由于所有的l都不等于i，ρi，k大于ρL，k。類似于前面的顯著性評估法，可以通過隨機化等式15中的藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)來確定此相關(guān)性的統(tǒng)計學(xué)顯著性。
5.3.3執(zhí)行系統(tǒng)和方法通過使用如下計算機系統(tǒng)并按照如下的程序和方法，可優(yōu)選地執(zhí)行在前面各小節(jié)中所述的分析方法。圖9顯示了一個適合于執(zhí)行本發(fā)明分析方法的示范性計算機系統(tǒng)。計算機系統(tǒng)901被顯示包括內(nèi)部組件，并被連接于外部組件，此計算機系統(tǒng)的內(nèi)部組件包括處理器元件902，與內(nèi)存903相互連接。例如，計算機系統(tǒng)901可以是IntelPentium為基礎(chǔ)的200兆或更大時鐘頻率的處理器，并具32MB或更多的內(nèi)存。
外部組件包括大容量存儲器904。這種大容量存儲器可以是一個或幾個硬盤(它通常與處理器和內(nèi)存包裝在一起)。這種硬盤一般具有1GB或更大的存儲容量。其它的外部組件包括使用者界面裝置905，它可以是一套監(jiān)視器和鍵盤，以及可以是鼠標(biāo)的點擊裝置906，或者其它的圖形輸入裝置(未顯示出)。典型地，計算系統(tǒng)901還連接于網(wǎng)絡(luò)鏈路907，此網(wǎng)絡(luò)鏈路可以是Ethernet連接于其它局部計算機系統(tǒng)的一部分，遠程計算機系統(tǒng)，或者廣域通信網(wǎng)絡(luò)如Internet。此網(wǎng)絡(luò)鏈路可使計算機系統(tǒng)901與其它計算機一起分享資料和處理任務(wù)。
操作此系統(tǒng)時，先將幾種軟件成分裝入內(nèi)存，這些軟件成分既是本領(lǐng)域標(biāo)準的，又是本發(fā)明將有的。這些軟件成分共同地導(dǎo)致此計算機系統(tǒng)按照本發(fā)明的方法運行。這些軟件成分通常存儲在大容量存儲器904上。軟件成分910提供操作系統(tǒng)，負責(zé)管理計算機系統(tǒng)901和它的網(wǎng)絡(luò)互相連接。此操作系統(tǒng)可以是Microfoft WindowsTM家族如Windows 95，Windows 98或Windows NT。軟件成分911提供通用語言和功能，方便地存在于此系統(tǒng)上，以便促進程序執(zhí)行對本發(fā)明特定的方法。可用于編程本發(fā)明分析方法的語言包括C和C++，或較差點的JAVA。最優(yōu)選地是，以數(shù)學(xué)軟件包編程本發(fā)明的方法，使之可以應(yīng)用方程式的符號入口和包括算法的高水平處理規(guī)程，從而使用戶不需要從程序上編程單個的方程式或算法。這種軟件包包括來自Mathworks(natick.MA)的Matlab，來自Wolfram Ragearch(Champaign，Illinois)的Mathematica，或來自Math soft(Seattle，Washington)的S-plus。
因此，軟件成分912和913提供本發(fā)明的分析方法，如在程序語言或符號包中所編程的。成分912提供一種程序執(zhí)行用于在5.3.1節(jié)中所述的藥物應(yīng)答表示的方法，以及成分913提供一種程序，執(zhí)行用于在5.3.2節(jié)中所述的評估藥物應(yīng)答表示的顯著性。
在示范性的執(zhí)行過程中，為了實行本發(fā)明的方法，使用者首先將藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)和途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)輸入計算機系統(tǒng)901。這些數(shù)據(jù)可被使用者從監(jiān)視器和鍵盤905直接輸入，或者從由網(wǎng)絡(luò)連接907連接的，或在可移動存儲介質(zhì)(示顯示出)上的其它計算機系統(tǒng)輸入。下一步使用者引起執(zhí)行藥物應(yīng)答表示軟件912，在任選地供給所研究的起始途徑之后，隨之執(zhí)行顯著性評估軟件913。從而，使用者可獲得一個模式藥物應(yīng)答和它的統(tǒng)計學(xué)顯著性。最后如在5.3.2節(jié)中所述，使用者可以通過引起重復(fù)和迭代執(zhí)行藥物應(yīng)答表示軟件和統(tǒng)計學(xué)顯著性評估軟件，根據(jù)幾個選擇方案對第一個模式藥物應(yīng)答反復(fù)地改進提高。
對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，用于執(zhí)行本發(fā)明分析方法的另一些系統(tǒng)和方法將是顯而易見的，并打算將它們包括在所伴隨的權(quán)利要求中。特別是打算使伴隨的權(quán)利要求包括用于執(zhí)行本發(fā)明方法的另一些程序結(jié)構(gòu)，這對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是容易實現(xiàn)的。
5.4途徑擾動方法用于在不同的細胞水平定向擾動生物途徑的方法在本領(lǐng)域逐漸被廣泛地認識和應(yīng)用。任何能夠特異性地靶向和可控制地修飾(例如通過分級的增加或激活或者通過分級的減少或抑制)特定細胞成分(例如基因表達，RNA濃度，蛋白質(zhì)豐度，或蛋白質(zhì)活性等)的這樣一些方法，都可被用于實施途徑擾動。對細胞成分的可控制性修飾因而可控制性干擾起源于所修飾細胞成分的途徑。起源于特定細胞成分的這些途徑被優(yōu)選地用于在本發(fā)明表示藥物作用。優(yōu)選的修飾方法能夠單獨靶向多種細胞成分中的每一種，而最優(yōu)選地是靶向這些細胞成分的主要部分。
下面的方法是可被用于修飾細胞成分，并從而產(chǎn)生途徑擾動的示范性方法。這些途徑擾動可產(chǎn)生途徑應(yīng)答，用于前述本發(fā)明方法的步驟中。本發(fā)明可合適于用于對途徑形成可控制性擾動的其它方法，特別是對途徑起源的細胞成分的可控制擾動。
優(yōu)選地可在從如下任何生物體獲得的細胞類型中形成途徑擾動，對于這些生物體其基因組信息和表達序列信息是現(xiàn)在可利用的，并且也有對于這些生物體允許可控制性地修飾特定基因表達的方法。目前正在對幾種真核生物進行基因組測序，包括人，線蟲，擬南芥和蠅。在優(yōu)選的實施方案中，是用一種酵母菌實施本發(fā)明，釀酒酵母(S.Cerevisiae)是最優(yōu)選的，因為已經(jīng)確定了釀酒酵母菌株的全部基因組序列。此外，用于可控制性修飾酵母菌基因表達的方法已充分地建立或被利用。優(yōu)選的酵母菌株是已知基因組序列的釀酒酵母菌株，如S288C株或它的同源衍生株(參見例如，自然369，371-8(1994)；P.N.A.S.923809-13(1995)；E.M.B.O.J.135795-5809(1994)；科學(xué)2652077-2082(1994)；E.M.B.O.J.152031-49(1996)，全部被引入作為參考。但是，其它菌株也可能同樣良好地被使用。酵母菌株可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville.MD20852)得到。在如下文獻中描述了用于操作酵母菌的標(biāo)準技術(shù)C.Kaiser，S.Michaelis d A.Mitchell，1994，酵母菌遺傳學(xué)方法冷泉港實驗室運行手冊，冷泉港實驗室出版，紐約；和Sherman等，1986，酵母菌遺傳學(xué)方法實驗室手冊，冷泉港實驗室出版，紐約冷泉港，它們二者全部被引入作為參考。
下述的示范性方法包括使用可滴定的表達系統(tǒng)，使用轉(zhuǎn)染或病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，包括使用具有已知特定作用的藥物(或一般的化合物)直接修飾RNA豐度或活性，直接修飾蛋白質(zhì)豐度，以及直接修飾蛋白質(zhì)活性。
可滴定的表達系統(tǒng)幾種可用于芽殖酵母釀酒酵母的已知可滴定或同樣可控制的表達系統(tǒng)中的任何一種都適用于本發(fā)明(Mumberg等，1994，釀酒酵母菌的可調(diào)節(jié)啟動子轉(zhuǎn)錄活性比較及它們對異源性表達的用途。核酸研究225767-5768)。通常是通過轉(zhuǎn)錄控制，以將受控制基因的啟動子被一個可控制的外源性啟動子代替來控制此基因的表達。酵母中最常用的可控制性啟動子是GAL1啟動子(Johnston等，1984，釀酒酵母菌中調(diào)節(jié)趨異性GAL1-GAL10啟動子的序列，分子細胞生物學(xué)81440-1448)。培養(yǎng)基中存在葡萄糖可強烈地抑制GAL1啟動子。通過逐漸降低葡萄糖的濃度并存在半乳糖，可逐漸以分級的方式開啟GAL1啟動子使之達到高水平的表達。GAL1啟動子通常對所研究的基因可達到在5-100倍范圍內(nèi)的表達控制。
其它常用的啟動子系統(tǒng)包括MET 25啟動子(Kerjan等1986，釀酒酵母菌MET25基因的核苷酸序列，核酸研究147861-7871)和Cup1啟動子(Mascorro-Gllardo等，1996，構(gòu)建調(diào)整釀酒酵母菌內(nèi)基因表達的基于Cup1啟動子的載體，基因172169-170)，培養(yǎng)基中不存在甲硫氨酸可誘導(dǎo)MET 25啟動子，而銅離子可誘導(dǎo)Cup1啟動子。所有這些啟動子系統(tǒng)都是可控制的，其中可通過生長培養(yǎng)基中可控制部分濃度的遞增性改變使基因表達受到遞增性控制。
上面所列舉表達系統(tǒng)的一個缺點是，控制啟動子的活性(例如受碳源改變的影響，除去某些氨基酸)，常常會引起細胞生理學(xué)的其它一些改變，這些改變可獨立地改變其它基因的表達水平。最近對酵母菌建立的一個系統(tǒng)Tet系統(tǒng)在很大程度上解決了這個問題(Gari等1977，用于調(diào)整釀酒酵母菌基因表達，具有四環(huán)素調(diào)節(jié)性啟動子系統(tǒng)的一組載體，酵母菌13837-848)。采自哺乳動物表達系統(tǒng)的Tet啟動子(Gossen等，1995，四環(huán)素對哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)錄激活作用，美國國家科學(xué)院學(xué)報895547-5551)受抗菌素四環(huán)素或結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物強力霉素濃度的調(diào)節(jié)。因此，不存強力霉素時此啟動子誘導(dǎo)高水平的表達，加入逐漸提高濃度的強力霉素，導(dǎo)致增加對啟動子活性的抑制作用。通過加入中等濃度的藥物，可使中等水平的基因表達達到穩(wěn)定狀態(tài)。而且，給予最大的啟動子活性抑制作用的強力霉素濃度(10μg/ml)，對于野生型酵母細胞的生長速度沒有明顯的作用(Gari等1997，用于調(diào)整釀酒酵母基因表達，具有四環(huán)素可調(diào)節(jié)性啟動子系統(tǒng)的一組載體，酵母13837-848)。
對于哺乳動物細胞，有幾種滴定基因表達的方法是現(xiàn)存可利用的(Spencer，1996，對哺乳動物引起條件性突變，遺傳學(xué)動向12181-187)。如上所述，Tet系統(tǒng)正廣泛地被使用，它的原來形式，“正向”系統(tǒng)，對其中加入強力霉素可抑制轉(zhuǎn)錄作用，面對于新型的“反向”系統(tǒng)，對其中加入強力霉素可刺激轉(zhuǎn)錄作用(Gossen等，1995，美國國家科學(xué)院學(xué)報895547-5551；Hoffanarm等1997，核酸研究251078-1079；Hofmann等1996，美國國家科學(xué)院學(xué)報835185-5190；Panlus等，1996，病毒學(xué)雜志7062-67)。另一個在哺乳動物細胞中常用的可控制性啟動子系統(tǒng)是由Evans及其同事建立的蛻皮激素-誘導(dǎo)性系統(tǒng)(No等1996，在哺乳動物細胞中蛻皮激素-誘導(dǎo)的基因表達和轉(zhuǎn)基因小鼠，美國國家科學(xué)院學(xué)報933340-3351)，在此，表達受加入到培養(yǎng)細胞中的muristerone濃度控制。最后，應(yīng)用由Schreibe.Crabtree及其同事建立的“化學(xué)劑”誘導(dǎo)的二聚體形成(CID)系統(tǒng)(Belshaw等1996，用誘導(dǎo)蛋白質(zhì)異二聚體形成的合成配體控制蛋白質(zhì)的結(jié)合和亞細胞定位，美國國家科學(xué)院學(xué)報934604-4607；Spencer 1996，對哺乳動物引起的條件性突變，遺傳學(xué)動向12181-187)及酵母菌中類似的系統(tǒng)也可以調(diào)節(jié)表達。在此系統(tǒng)中，是將所研究的基因置于CID-應(yīng)答啟動子的控制之下，并被轉(zhuǎn)染進入表達二個不同的雜合蛋白質(zhì)的細胞，一個雜合蛋白質(zhì)由融合于FKBP12的DNA-結(jié)合功能域組成，此功能域可結(jié)合FK506。另一個雜合蛋白質(zhì)包含也融合于FKBP12的轉(zhuǎn)錄激活功能域。CID誘導(dǎo)分子是FK1012，這是FK506的同型二聚體形式，它能夠同時結(jié)合DNA結(jié)合性雜合蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄激活性雜合蛋白。對于分級存在的FK1012，可激活受控制基因的分級轉(zhuǎn)錄作用。
對于上述的每種哺乳動物表達系統(tǒng)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛知道的，是將所研究的基因置于可控制性啟動子的控制之下，并將包含這種構(gòu)建體以及抗菌素抗性基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入培養(yǎng)的哺乳動物細胞內(nèi)。一般地說，此質(zhì)粒DNA整合進入基因組，選擇出藥物活性集落，并對調(diào)節(jié)基因的適當(dāng)表達進行篩選。另外，還可以將此受調(diào)節(jié)基因插入一個游離基因質(zhì)粒如PCEP4(Invitrogen公司)中，此質(zhì)粒包含質(zhì)粒復(fù)制所必需的EB病毒成分。
在優(yōu)選的實施方案中，是將如上述的可滴定的表達系統(tǒng)導(dǎo)入缺乏相應(yīng)內(nèi)源性基因和/或此內(nèi)源性基因活性的細胞或細菌中，例如其中該內(nèi)源性基因已被破壞或刪除的細菌。產(chǎn)生這種“敲除”的方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的，參見如Pettitt等1996，發(fā)育1224149-4157；Spradling等1995，美國國家科學(xué)院學(xué)報9210824-10830；Ramires-Sdis等1993，酶學(xué)方法，225855-878，和Thomas等1987細胞51503-512。
用于哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)染或病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)可以將可控制性擾動導(dǎo)入哺乳動物細胞內(nèi)的生物途徑中。優(yōu)選地可對天然不表達所研究靶標(biāo)基因的細胞使用靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)?？梢詮恼Ｇ闆r下不表達此靶標(biāo)基因的組織，或者可使此靶標(biāo)基因在細胞中特異性地突變的組織中獲得這種非表達性細胞。此所研究的靶標(biāo)基因可以被克隆進入許多哺乳動物表達質(zhì)粒的一種，例如PCENA3.1+/-系統(tǒng)(Invitrogen公司)或反轉(zhuǎn)錄病毒載體，以及被導(dǎo)入非表達性宿主細胞。通過對由此表達載體編碼的藥物抗性標(biāo)記進行選擇，可分離出表達此靶標(biāo)基因的被轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞?；蜣D(zhuǎn)錄水平僅與轉(zhuǎn)染劑量相關(guān)聯(lián)。因此，可以檢查靶標(biāo)基因水平變化的作用。
應(yīng)用這種方法的一個特殊例子是尋找靶向src-家族蛋白胰蛋白酶激酶lck的藥物，lck是T細胞受體激活途徑的關(guān)鍵性成分(Anderson等，1994，在T細胞信號傳輸和胸腺細胞發(fā)育中包含蛋白質(zhì)胰蛋白酶激酶P56(lck)，免疫學(xué)進展56171-178)。這種酶的抑制劑作為可能的免疫抑制藥物正在研究中(HankeJH.1996，一種新型、強有力的src-家族選擇性胰蛋白酶激酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)，生物化學(xué)雜志271(2)695-701)。Jurkat T細胞系(JcaM1)的特異性突變體是可利用的，它不表達lck激酶(Straus等，1992，關(guān)于在通過T細胞抗原受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中包含lck胰蛋白酶激酶的遺傳學(xué)進展，細胞70585-593)。因此，通過轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)將lck基因?qū)隞CaM1使之有可能特異性地擾動由lck激酶調(diào)節(jié)的T細胞激活途徑。轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率與這種擾動水平確實有關(guān)。這種方法一般可用于對正常情況下不表達受干擾基因的細胞提供基因表達或蛋白質(zhì)豐度擾動。
修飾RNA豐度或活性的方法目前修飾RNA豐度和活性的方法有下三類核酶，反義物質(zhì)和RNA銜接子法(Good等，1997，基因治療445-54)。可控制地對細胞使用或?qū)⒓毎┞队谶@些物質(zhì)則能夠可控制地擾動RNA豐度。
核酶是能夠催化RNA裂解反應(yīng)的RNA。(Cech 1987，科學(xué)2361532-1539；PCT國際公開WO 90/11364，1990年10月4日公布；Sarver等1990，科學(xué)2471222-1225)?？梢栽O(shè)計“發(fā)夾”型和“錘頭”型RNA核酶用于特異性地裂解特定的靶標(biāo)mRNA。已經(jīng)確立了設(shè)計具有核酶活性的短RNA分子的準則，也就是能夠以高度的序列特異性方式裂解其它RNA分子，并且可以靶向?qū)嶋H上所有種類的RNA(Haseloff等，1988，自然334585-591；Koizumi等1988 REBS通訊228228-230；Koizumi等，1988，F(xiàn)EBS通訊239285-288)。核酶法包括將細胞暴露于這種RNA核酶小分子，還包括在細胞等內(nèi)表達這種小分子。(Grassi和Merini，1996，醫(yī)學(xué)年鑒28499-510；Gibson，1996，癌及轉(zhuǎn)移述評15287-299)。
可以在體內(nèi)以對裂解mRNA催化有效的足夠數(shù)量常規(guī)地表達核酶，并且從而改變細胞內(nèi)mRNA的豐度(Cotten等1989，核酶介導(dǎo)的體內(nèi)RNA破壞，EMBO雜志83861-3866)。特別是，可以將按照前述準則設(shè)計、并通過例如亞磷酰胺化學(xué)法合成的，編碼DNA序列的核酶連接進入編碼tRNA基因的反密碼子莖和環(huán)中的限制性酶位點，然后可以借助于本領(lǐng)域常規(guī)的方法將它轉(zhuǎn)化進入所研究的細胞，并在此細胞內(nèi)表達。優(yōu)選地還將一個可誘導(dǎo)性啟動子(例如糖皮質(zhì)激素或四環(huán)素應(yīng)答成分)轉(zhuǎn)導(dǎo)進入這種構(gòu)建體，以致可以選擇性地控制核酶的表達。tDNA基因(即編碼tRNA的基因)可用于本申請，因為它體積小，轉(zhuǎn)錄速度快，以及在不同種組織內(nèi)普遍存在表達作用。因此，可以按常規(guī)設(shè)計實際上可裂解任何mRNA序列的核酶，并且可按常規(guī)以編碼這種核酶的DNA轉(zhuǎn)化細胞，以致表達可控制的、催化有效量的核酶。因此可以干擾實際上任何RNA種類的豐度。
在另一個實施方案中，可以通過可控制地使用反義核酸可控制地抑制靶標(biāo)RNA(優(yōu)選地是mRNA)的活性，特別是它的翻譯速度。如在此使用的“反義”核酸是指能夠借助于與編碼區(qū)和/或非編碼區(qū)互補的某一序列與靶標(biāo)RNA的序列-特異性(例如非-聚腺苷酸)部分雜交的核酸。本發(fā)明的反義核酸可以是雙鏈或單鏈的寡核苷酸，RNA或DNA，它的修飾物或衍生物，可以將這種反義核酸以可控制的方式直接對細胞給藥，或者可通過以足夠干擾靶標(biāo)RNA翻譯的可控制量轉(zhuǎn)錄外源性導(dǎo)入的序列，在細胞內(nèi)產(chǎn)生這種反義核酸。
優(yōu)選的反義核酸至少有6個核苷酸，而優(yōu)選地是寡核苷酸(在6-大約200個寡核苷酸的范圍內(nèi))。在特殊情況下，此寡核苷酸至少有10個核苷酸，或至少15個核苷酸，或至少100個核苷酸，或至少200個核苷酸。此寡核苷酸可以是DNA或RNA，或者它們的嵌合混合物、衍生物或修飾的形式，單鏈或雙鏈的?？梢栽趬A基部分，糖基部分或磷酸骨架修飾此寡核苷酸。此寡核苷酸還可能包括其它的添加部分如肽或促進跨細胞膜轉(zhuǎn)運的作用劑(參見例如Letsinger等1989，美國國家科學(xué)院學(xué)報866553-6556；Lemaitre等1987，國家科學(xué)院學(xué)報84648-652；PCT公布號WO/88/09810，1988、12、15公布)，雜交觸發(fā)的裂解劑(見例如Krol等1988。生物技術(shù)6958-976)或嵌入劑(見例如Zon，1988，藥學(xué)研究5539-549)。
在本發(fā)明優(yōu)選的方面是提供了一種反義寡核苷酸，優(yōu)選地是單鏈DNA。可在其結(jié)構(gòu)的任何部位以本領(lǐng)域一般已知的組成成分修飾此寡核苷酸。
此反義寡核苷酸可能包括至少一個選自如下種類的被修飾的堿基部分，包括但不局限于5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黃嘌呤，黃嘌呤，4-乙?；奏?，5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶，5-羧基甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧基甲基氨甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，β-D-半乳糖基queosine，次黃苷，N6-異戊烯基腺嘌呤，1-甲基鳥嘌呤，1-甲基次黃苷2，2-二甲基鳥嘌呤，α-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘌呤，N6-腺嘌呤，7-甲基鳥嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-甘露糖基queosine，5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(V)，Wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯，尿嘧啶-5-氧乙酸(V)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)W，以及2，6-二氨基嘌呤。
在另一實施方案中，此寡核苷酸包含至少一個選自但不局限于如下種類的修飾的糖基部分阿拉伯糖，2-氟阿拉伯糖，木酮糖和已糖。
在還有一個實施方案中，此寡核苷酸包含至少一個選自如下種類的修飾的磷酸骨架硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，酰胺硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，二氨基磷酸酯，甲基膦酸酯，烷基磷酸三酯，以及formacetal或其類似物。
在再一個實施方案中，此寡核苷酸是2-α-異頭寡核苷酸。α-異頭寡核苷酸與互補RNA形成特異性雙鏈雜合體，其中與通常的β-單位相反，二條鏈相互平行存在(Gantier等1987，核酸研究156625-6641)。
此寡核苷酸還可能與另一分子偶聯(lián)，例如肽，雜交觸發(fā)的交連劑，轉(zhuǎn)運劑，雜交觸發(fā)的裂解劑等。
本發(fā)明的反義核酸包含與靶RNA的至少一部分互補的序列。但是，也不需完全互補，雖然優(yōu)選地是完全互補。這里所指的與“某一RNA的至少一部分互補”的序列意指一種具有能夠與此RNA雜交，形成穩(wěn)定雙螺旋的足夠互補性的序列；在雙鏈反義核酸的情況下，因此可以測定此雙螺旋DNA的一條單鏈，或者可能測試三鏈體形式。雜交的能力將取決于互補性的程度和此反義核酸的長度。一般是，雜交的核酸越長，它可能包含與靶標(biāo)RNA越多的錯配，并仍可形成穩(wěn)定的雙螺旋(或三鏈體，視情況而定)。通過應(yīng)用標(biāo)準的程序測定此雜交復(fù)合體的熔點，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定可允許的錯配程度。借助于標(biāo)準的測試技術(shù)還可以確定對抑制靶標(biāo)RNA翻譯有效的反義核酸的量。
可以借助于本領(lǐng)域已知的標(biāo)準方法合成本發(fā)明的寡核苷酸，例如通過使用自動DNA合成儀(如可以從Biosearch，Applied Biosystems等購買到)。作為例子，可借用于Stein等(1988，核酸研究163209)的方法合成硫代磷酸酯寡核苷酸，通過使用控制孔徑的玻璃聚合物支持體可以制備甲基膦酸酯寡核苷酸(Sarin等1988，美國國家科學(xué)院學(xué)報857448-7451)，等等。在另一實施方案中，此寡核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，核酸研究156131-6148)，或者是一個嵌合的RNA-DNA類似物(Inoue等1987，F(xiàn)EBS通訊215327-330)。
然后可以將此合成的反義寡核苷酸以可控制的方式對細胞給藥。例如，可以將此反義寡核苷酸以可控制的濃度加入到此細胞生長的環(huán)境中，在此細胞可以吸收它們。通過應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法可以檢測對此反義寡核苷酸的吸收。
在另一實施方案中，本發(fā)明的反義核酸通過從一個外源性序列的轉(zhuǎn)錄，可控制地在細胞內(nèi)被表達。例如，可將一個載體導(dǎo)入體內(nèi)，以致它被細胞吸收，在該細胞內(nèi)此載體或它的一部分被轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生本發(fā)明的反義核酸(RNA)。這種載體含有編碼此反義核酸的序列。這種載體可以仍然是游離基因或者被染色體整合，只要它能夠被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生所需要的反義RNA?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域標(biāo)準的重組DNA技術(shù)構(gòu)建這種載體。載體可以是質(zhì)粒，病毒或本領(lǐng)域已知的，用于在哺乳動物中復(fù)制和表達的其它載體?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的在所研究細胞中起作用的任何一種啟動子表達編碼此反義RNAs的序列。這種啟動子可以是誘導(dǎo)的或組成型的。最優(yōu)選地是，通過給予外源性部分啟動子可被控制或誘導(dǎo)，以便實現(xiàn)對此反義寡核苷酸的受控制性表達。這種可控制的啟動子包括Tet啟動子?？捎糜诓溉閯游锛毎鄬Σ粌?yōu)選的啟動子包括，但不局限于SV40早期啟動子區(qū)(Bernoist和Chambon，1981，自然290304-310)，包含在Rows肉瘤病毒3’長末端重復(fù)序列中的啟動子(Yamamoto等，1980細胞22787-797)，皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner等，1981，美國國家科學(xué)院學(xué)報781441-1445)，金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等1982，自然29639-42)等。
因此，反義核酸可以被常規(guī)地設(shè)計靶向?qū)嶋H上任何一種mRNA序列，并且可以用編碼這種反義序列的核酸常規(guī)地轉(zhuǎn)化細胞，或者使細胞暴露于這種核酸，以致能表達有效的可控制量反義核酸。因此，實際上可以控制性地干擾任何一種RNA的翻譯。
最后，在另一個實施方案中，可以將RNA銜接子導(dǎo)入細胞，或者在細胞中被表達。RNA銜接子是對蛋白質(zhì)的特異性RNA配體，例如對于Tat和Rev特異的RNA(Good等，1997，基因治療445-54)，此配體可以特異性地抑制它們的翻譯。
修飾蛋白質(zhì)豐度的方法修飾蛋白質(zhì)豐度的方法包括，特別是改變蛋白質(zhì)降解速度的方法和應(yīng)用抗體的方法(此抗體結(jié)合于影響天然靶標(biāo)蛋白質(zhì)豐度或活性的蛋白質(zhì))。增加(或降低)某種蛋白質(zhì)的降解速度，可降低(或增加)這種蛋白質(zhì)的豐度。本領(lǐng)域已知的用于在應(yīng)答提高溫度和/或暴露于特定藥物中可控制地增加靶標(biāo)蛋白質(zhì)降解速度的方法可被用于本發(fā)明。例如，這樣一種方法可利用熱誘導(dǎo)的或藥物誘導(dǎo)的N-末端降解決定子，它是N-末端蛋白質(zhì)的一個片段，在較高溫度(例如37℃)時它暴露出啟動蛋白質(zhì)迅速降解的降解信號，而在較低溫度時(例如23℃)它被隱藏以便防止蛋白質(zhì)迅速降解(Dohmen等，1994，科學(xué)2631273-1276)。范例性的這樣一種降解決定子是Arg-DHFRts，這是鼠二氫葉酸還原酶的變異體，其中N-末端Val被Arg取代了，并且位置66的Pro被Leu取代了。按照這種方法，例如借助于本領(lǐng)域已知的標(biāo)準的基因打靶法(Lodish等，1995，細胞分子生物學(xué)，W.H.Freeman and Co.紐約，特別是第8章)用編碼融合蛋白Vb-Arg-DHFRts-P(“Vb”代表遍在蛋白)的基因代替編碼靶標(biāo)蛋白P的基因。在暴露N-末端降解決定子的翻譯之后，N-末端遍在蛋白被迅速裂解。在較低溫度時，Arg-DHFRts內(nèi)部的賴氨酸不被暴露，此融合蛋白的遍在蛋白化不發(fā)生，降解緩慢，活性靶標(biāo)蛋白濃度高。在較高濃度(不存在氨中喋呤)時，Arg-DHFRts內(nèi)部的賴氨酸被暴露，此融合蛋白的遍在蛋白化發(fā)生，降解迅速，活性靶標(biāo)蛋白濃度低。通過氨甲喋呤暴露可控制地阻斷降解的熱激活作用。此方法適合于對其它誘導(dǎo)因子如藥物和溫度改變敏感的其它N-末端降解決定子。
還可以通過(中和)抗體降低靶標(biāo)蛋白質(zhì)的豐度，并且也直接或間接地降低它的活性。通過提供受控制的暴露于這種抗體，可以可控制地改變蛋白質(zhì)的豐度/活性。例如，針對蛋白質(zhì)表面適合抗原表位的抗體，通過主動結(jié)合靶標(biāo)蛋白的野生型活性形式，成為與未結(jié)合的野生型形式相比較具有較小或最小活性的復(fù)合物，可以降低此野生型活性形式的豐度，從而間接地降低它的活性。另外，通過例如，與活性位點直接相互作用，或者通過阻斷底物接近活性位點，抗體也可以直接降低蛋白質(zhì)的活性。相反地，在某些情況下，(激活的)抗體帶可以與蛋白質(zhì)和它的活性位點相互作用，而增加由此引起的活性。在這二種情況下都可以(通過將要論述的方法)產(chǎn)生針對特異性種類蛋白質(zhì)的(將要描述的不同類型的)抗體，并篩選它們的作用?？梢詸z測這種抗體的作用，并可選擇提高或降低靶標(biāo)蛋白濃度和/或活性的適合的抗體。這種檢測包括將抗體導(dǎo)入細胞(見下面)，并借助于本領(lǐng)域已知的標(biāo)準方法(如免疫測定法)檢測野生型數(shù)量的濃度或靶標(biāo)蛋白質(zhì)的活性。借助于適合于靶標(biāo)蛋白已知活性的檢測方法可測定野生形式的凈活性。
可以用多種方式將抗體導(dǎo)入細胞，包括例如將抗體顯微注射進入細胞(Morgan等1988，今日免疫學(xué)984-86)，或者使編碼所需抗體的雜交瘤mRNA轉(zhuǎn)化進入細胞(BurkeTFFU，1984，細胞36847-858)。按照進一步的技術(shù)，重組抗體可以是工程構(gòu)建的，并在廣泛多種非淋巴細胞中被表達，以便結(jié)合于靶標(biāo)蛋白以及阻斷靶標(biāo)蛋白的活性(Bioccn等1995，細胞生物學(xué)動向5248-252)。優(yōu)選地此抗體的表達是在可控制性啟動子如Tet啟動子的控制之下。第一步是選擇對此靶標(biāo)蛋白具有適當(dāng)特異性的特定的單克隆抗體(見下面)。然后可以將編碼所選擇抗體可變區(qū)的序列克隆成為不同的工程構(gòu)建抗體形式，包括例如，全抗體，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)v片段，單鏈Fv片段(以肽接頭結(jié)合的VH和VL區(qū))(“ScFv”片段)，雙抗體(二個具有不同特異性的結(jié)合的ScFv片段)，等等(Hayden等1997，免疫學(xué)的當(dāng)前觀點9210-212)。通過將它們表達為與不同已知細胞內(nèi)引導(dǎo)序列的融合體，可以使細胞內(nèi)表達的不同形式抗體靶向進入細胞內(nèi)的區(qū)室(例如細胞質(zhì)，核，線粒體等)(Bradbury等，1995，抗體的工程構(gòu)建(第二卷)(Borrebaeck編輯)PP295-361，IRL出版)。特別是ScFv形式似乎特別適合于靶向細胞質(zhì)。
抗體類型包括，但不限于，多克隆抗體，單克隆抗體，嵌合抗體，單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，以及Fab表達文庫。本領(lǐng)域已知的不同程序都可以用于產(chǎn)生針對一個靶標(biāo)蛋白質(zhì)的多克隆抗體。為了產(chǎn)生這種抗體，可以通過以此靶標(biāo)蛋白質(zhì)注射來免疫不同的宿主動物，這種宿主動物包括但不限于兔，小鼠，大鼠等。取決于宿主動物的種類，可使用不同的佐劑以理增強免疫應(yīng)答，包括但不限于福氏(完全和不完全)佐劑，礦物凝膠如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)如溶血卵磷酸，Pluronic多元醇，聚陰離子，肽，油乳劑，二硝基酚，以及潛在地可用于人的佐劑如卡介苗(BCG)和小棒桿菌。
為了制備針對一種靶標(biāo)蛋白的單克隆抗體，可以應(yīng)用提供通過培養(yǎng)中的連續(xù)細胞系產(chǎn)生抗體分子的任何一種技術(shù)。這些技術(shù)包括但不限于，最初由Kohler和Milstein(1975，自然256495-497)建立的雜交瘤技術(shù)，三瘤技術(shù)，人B細胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，今日免疫學(xué)472)，以及產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等1985，在單克隆抗體和癌治療中，Alan R.Liss.公司PP.77-96)。在本發(fā)明的補充實施方案中，單克隆抗體可以利用最新技術(shù)在無菌動物中產(chǎn)生(PCT/US90/02545)。根據(jù)本發(fā)明可以使用人抗體，并可以通過應(yīng)用人雜交瘤(Cote等，1983，美國國家科學(xué)院學(xué)報802026-2030)，或者通過在體外以EBV病毒轉(zhuǎn)化人B細胞(Cole等，1985，在單克隆抗體和癌治療中，Alan R.Liss公司PP.77-96)可以獲得人抗體。實際上，根據(jù)本發(fā)明還可以應(yīng)用通過如下方法產(chǎn)生“嵌合抗體”(Morrison等，1984，美國國家科學(xué)院學(xué)報816851-6855；Nenberger等，1984，自然312604-608；Takeda等，1985，自然314452-454)的技術(shù)將來自小鼠的，對靶標(biāo)蛋白質(zhì)特異性的抗體分子的基因與來自人的，具有適當(dāng)生物活性的抗體分子的基因拼接在一起；這種抗體包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
此外，如果單克隆抗體較有利，也可以應(yīng)用噬菌體顯示技術(shù)從大抗體文庫中將它們挑選出(Marks等，1992，生物化學(xué)雜志26716007-16010)。應(yīng)用這種技術(shù)，已使達到1012不同抗體的文庫表達在fd絲狀噬菌體表面，在體外形成一個“單容器”(“Single pot”)抗體免疫系統(tǒng)，可用于選擇單克隆抗體(Griffiths等，1994，EMBO雜志133245-3260)。借助于本領(lǐng)域已知的技術(shù)可以從這文庫中選擇抗體，包括使此噬菌體與固定化的靶標(biāo)蛋白質(zhì)觸，選擇和克隆結(jié)合于此靶標(biāo)的噬菌體，并且將編碼此抗體可變區(qū)的序列亞克隆進入表達所需抗體形式的適當(dāng)載體內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明，產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778)可適合于產(chǎn)生對該靶標(biāo)蛋白質(zhì)特異性的單鏈抗體。本發(fā)明的另一個實施方案應(yīng)用構(gòu)建Fab表達文庫的技術(shù)(Huse等1989，科學(xué)2461275-1281)，使之能夠快速簡便地鑒定對該靶標(biāo)蛋白質(zhì)具有所需特異性的單克隆Fab片段。
應(yīng)用本領(lǐng)域已知的技術(shù)可以產(chǎn)生包含該靶標(biāo)蛋白質(zhì)獨特型的抗體片段。例如，這類片段包括，但不限于可以通過胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab’)2片段；可通過還原F(ab’)2片段二硫橋產(chǎn)生的Fab’片段；可通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的Fab片段，以及Fv片段。
在產(chǎn)生抗體時，借助于本領(lǐng)域已知的技術(shù)例如ELISA(酶連免疫吸附檢測法)，可以實現(xiàn)對所需抗體的篩選。為了選擇對靶標(biāo)蛋白質(zhì)特異性的抗體，可以對產(chǎn)生的雜交瘤或噬菌體顯示抗體文庫檢測結(jié)合于該靶標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體。
修飾蛋白質(zhì)活性的方法直接修飾蛋白質(zhì)活性的方法包括特別是，優(yōu)勢負突變，特異性藥物(在本申請的意義上使用的)或一般的化合物，以及使用前面所述的抗體。
優(yōu)勢負突變是對內(nèi)源性基因或突變體外源性基因的突變，當(dāng)這些基因在細胞內(nèi)表達時會破壞所靶向蛋白質(zhì)種類的活性。取決于所靶向蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性，存在一般性規(guī)則來指導(dǎo)選擇適當(dāng)?shù)姆桨福糜跇?gòu)建破壞靶標(biāo)活性的優(yōu)勢負突變(Hershkowits，1987，自然329219-222)。在活性單體形式的情況下，無活性形式的過度表達可引起對天然底物或配體的競爭，足以顯著地降低靶標(biāo)蛋白質(zhì)的活性。通過例如結(jié)合突變基因和增加活性的啟動子，優(yōu)選地是可控制的或可誘導(dǎo)的啟動子，可以實現(xiàn)這種過度表達。按另一種方法，可以使活性位點的殘基發(fā)生改變，以致發(fā)生與靶標(biāo)配體實際上不可逆的結(jié)合。以某種胰蛋白酶激酶，通過小心地取代活性位點絲氨酸殘基可達到此目的(Perlmntter等，1996，免疫學(xué)現(xiàn)代觀點8285-290)。
在活性多聚體形式的情況下，有幾種方案可以指導(dǎo)選擇優(yōu)勢負突變體。通過編碼外源性蛋白質(zhì)片段的基因表達，可以可控制地降低多聚體的活性，這種外源性蛋白質(zhì)片段結(jié)合于多聚體的結(jié)合功能區(qū)，而阻止多聚體形成。另一方面，可控制地過度表達特定類型的無活性蛋白單位，可以阻礙無活性多聚體中的野生型活性單位，從而降低多聚體的活性(Nocka等，1990，EMBO雜志91805-1813)。例如，在二聚體DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的情況下，可以從DNA結(jié)合位點刪去DNA結(jié)合功能區(qū)，或者從激活單位中刪去激活功能區(qū)。在這種情況下，還可以使DNA結(jié)合功能區(qū)在沒有引起與激活單位結(jié)合的功能區(qū)的情況下被表達。從而，DNA結(jié)合位點被阻礙，沒有任何可能的表達活性。在特定類型的單位在活性期間正常地經(jīng)受構(gòu)象改變的情況下，剛性單位的表達可以使形成的復(fù)合物失活。如一個例子是，與細胞機制有關(guān)的蛋白質(zhì)一般是由少數(shù)類型的許多亞單位結(jié)合組成，這些細胞機制包括例如細胞運動，有絲分裂過程，細胞構(gòu)建等。這些結(jié)構(gòu)對于包含幾個具有結(jié)構(gòu)缺損的單聚體單位的損壞通常高度敏感。這種突變單位會破壞相關(guān)蛋白質(zhì)的活性，并可以在細胞內(nèi)可控制地被表達。
除了優(yōu)勢負突變之外，借助于本領(lǐng)域熟知的誘變和篩選步驟，可以找到對溫度(或其它外源性因素)敏感的突變靶蛋白。
本發(fā)明的技術(shù)人員還將理解到，還可以將結(jié)合和抑制靶標(biāo)蛋白的抗體的表達用作另一種優(yōu)勢負突變策略。
已知特異性作用的藥物最后，通過暴露于藥物或配體可以可控制地改變某些靶標(biāo)蛋白質(zhì)的活性。在優(yōu)選的情況是，已知某藥物僅與細胞內(nèi)一個靶標(biāo)蛋白相互作用，并且僅僅改變這一個靶標(biāo)蛋白的活性。將細胞分級地暴露于不同量的藥物，從而引起對起源于此蛋白質(zhì)的途徑分級的擾動。這種改變可以是降低活性或者增加活性。次優(yōu)選情況是，已知所使用的某藥物以單獨的，不同的和非重疊的作用僅改變幾個(例如2-5個)靶標(biāo)蛋白質(zhì)的活性。分級暴露于這種藥物引起對起源于該靶蛋白質(zhì)的幾種途徑的分級擾動。
5.5測定方法通過測定被藥物暴露或被途徑擾動改變的細胞成分獲得用于本發(fā)明的藥物應(yīng)答和途徑應(yīng)答。這些細胞特征可以是細胞生物狀態(tài)的任何方面。它們可以是測定其中RNA豐度的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，測定其中蛋白質(zhì)豐度的翻譯狀態(tài)，測定其中蛋白質(zhì)活性的活性狀態(tài)。這種細胞特征還可以是混合形式，例如其中起始特定生物途徑的一種或幾種蛋白質(zhì)的活性，與在該起源蛋白質(zhì)的途徑下游中細胞成分的RNA豐度(基因表達)一起被測定。此部分將描述用于測定藥物或途徑應(yīng)答中細胞成分的方法。本發(fā)明也適應(yīng)這種測定的其它方法。
基于測定藥物和途徑應(yīng)答轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的本發(fā)明實施方案是優(yōu)選的。借助于將在下一小節(jié)中描述的與核酸或核酸模擬探針的序列雜交的技術(shù)，或者借助于在隨后的小節(jié)中描述的其它基因表達技術(shù)，可以測定這種轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。但是所測定的結(jié)果是包括表示RNA豐度比率值的應(yīng)答數(shù)據(jù)，它通常反映DNA的表達比率(在不存在RNA降解速度差異時)。這種測定方法在5.5.1節(jié)中被描述。
在本發(fā)明另一些不同的實施方案中，可測定不同于轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的其它生物狀態(tài)方面，例如翻譯狀態(tài)，活性狀態(tài)，或混合形式。在此部分將描述這些實施方案的細節(jié)。在5.5.2節(jié)中描述這些測定方法。
5.5.1轉(zhuǎn)錄狀態(tài)測定優(yōu)選地，通過與轉(zhuǎn)錄物陣列雜交構(gòu)成了對轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的測定，在本小節(jié)將對它進行描述。在本小節(jié)的后面描述了轉(zhuǎn)錄狀態(tài)測定的某些其它方法。
轉(zhuǎn)錄物陣列概述在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用了“轉(zhuǎn)錄物陣列”(在此也被稱為“微陣列”(“microarrays”))。轉(zhuǎn)錄物陣列可被用于分析細胞中的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，特別是用于測定暴露于分級水平的待研究藥物或暴露于對所研究生物途徑分級擾動的細胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。
在一個實施方案中，是通過使存在于細胞中，代表mRNA轉(zhuǎn)錄物的可測定標(biāo)記的多核苷酸(例如從細胞總的mRNA合成的熒光標(biāo)記的cDNA)與一個微陣列雜交來產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物陣列。微陣列是具有有序排列的結(jié)合(例如雜交)位點的表面，這些結(jié)合位點是對細胞或細菌基因組中許多基因，優(yōu)選地是絕大多數(shù)或幾乎全部基因產(chǎn)物的結(jié)合位點?？梢酝ㄟ^多種方式形成微陣列，下面將描述其中的幾種方法。但所產(chǎn)生的微陣列具有某些共同特征這些陣列是可以再生的，有可能對給定的陣列產(chǎn)生多拷貝，并容易互相比較。優(yōu)選地此微陣列較小，通常小于5cm2，它們由在結(jié)合(例如核酸雜交)條件下穩(wěn)定的材料制成。微陣列中某一給定的結(jié)合位點或獨特的一組結(jié)合位點將特異性地結(jié)合細胞中的單一基因產(chǎn)物。雖然每個特定的mRNA可能存在一個以上物理結(jié)合位點(此后稱位點)，但是為了敘述清楚，下面將假定存在單一位點。
應(yīng)該理解到，當(dāng)形成了與細胞RNA互補的cDNA，并在適當(dāng)?shù)碾s交條件下與微陣列雜交時，對在相應(yīng)于任何特定基因的陣列中位點的雜交水平，將反映細胞中從該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的優(yōu)勢。例如，當(dāng)將與細胞總mRNA互補的可測定標(biāo)記(例如以熒光團標(biāo)記)的cDNA對微陣列雜交時，對應(yīng)于不是在此細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的基因(即能夠特異性結(jié)合該基因產(chǎn)物的)的陣列上的位點將具有少量信號或沒有信號(例如熒光信號)，并且對于它所編碼的mRNA具有優(yōu)勢的基因?qū)⒕哂斜容^強的信號。
在優(yōu)選的實施方案中，是將來自二種不同細胞的cDNAs對此陣列的結(jié)合位點雜交。在藥物應(yīng)答的情況下，使一種細胞暴露于藥物，而另一種相同類型的細胞不暴露于藥。在途徑應(yīng)答的情況下，使一種細胞暴露于途徑擾動，而另一種相同類型的細胞不暴露于途徑擾動。在途徑應(yīng)答的情況下，使一種細胞暴露于途徑擾動，而另一種相同類型的細胞不暴露于途徑擾動。對來自這二種類型細胞每一種的cDNA作不同的標(biāo)記，以致可以區(qū)分它們。在一個實施方案中，例如應(yīng)用熒光素標(biāo)記的dNTP合成了來自以藥物處理的(或暴露于途徑擾動的)細胞的cDNA，并且應(yīng)用若丹明標(biāo)記的dNTP合成了來自未作藥物暴露的第二種細胞的cDNA。當(dāng)將這二種cDNA混合，并對微陣列雜交時，可對陣列上每個位點測定來自每組cDNA信號的相對強度，并且可檢測特定mRNA豐度的任何相對差異。
在上述的實例中，當(dāng)熒光團被激發(fā)時，來自藥物處理(或途徑干擾)細胞的cDNA將發(fā)綠色熒光，而來自未處理細胞的cDNA將發(fā)紅色熒光。結(jié)果，當(dāng)藥物處理對細胞中特定mRNA的相對豐度沒有直接或間接的作用時，mRNA在二種細胞中都同樣占優(yōu)勢，對于逆轉(zhuǎn)錄，紅色標(biāo)記的和綠色標(biāo)記的cDNA也同樣占優(yōu)勢。當(dāng)對微陣列雜交時，對于各種RNA的結(jié)合位點將發(fā)出二種熒光團的波長特征(組合顯示出棕色)。對比之下，當(dāng)以一種直接或間接增加細胞中mRNA優(yōu)勢的藥物處理藥物暴露的細胞時，綠色熒光對紅色熒光的比率將增加。當(dāng)藥物降低mRNA的優(yōu)勢時，此比率將降低。
對于使用二種顏色的熒光標(biāo)記和檢測以便確定基因表達改變的方案已有論述，例如Shena等1995，用互補性DNA微陣列定量監(jiān)測基因表達的方式，科學(xué)270467-470，此文獻在所有場合下全部被引入作為參考。應(yīng)用以二種不同熒光團標(biāo)記cDNA的優(yōu)點是，可以對二種細胞狀態(tài)中對應(yīng)于每種陣列基因的mRNA水平進行直接的和內(nèi)部控制的比較，由于實驗條件(如雜交條件)微小差異引起的改變將不會影響隨后的分析。但是還應(yīng)承認，也可能使用來自單一細胞的cDNA，并且比較例如在藥物處理的或途徑干擾的細胞和未處理的細胞中特定mRNA的絕對量。
微陣列的制備微陣列是本領(lǐng)域已知的由一種表面組成，序列上與基因產(chǎn)物(例如cDNAs，mRNAs，cRNAs，多肽和它們片段)相對應(yīng)的探針可以在已知的位置特異性地對此表面雜交或結(jié)合于此表面。在一個實施方案中，此微陣列是一種陣列(即矩陣)，其中每個位置代表對于一種由基因編碼產(chǎn)物(例如一種蛋白質(zhì)或RNA)的一個分立的結(jié)合位點，并且對于該生物體基因組中絕大多數(shù)或幾乎全部基因產(chǎn)物的結(jié)合位點都存在于其中。在優(yōu)選的實施方案，該“結(jié)合位點”(此后稱為“位點”)是一種核酸或核酸相似物，特定的同源cDNA可以特異性地對它們雜交。此結(jié)合位點的核酸或相似物可以是例如合成的寡聚體，全長度cDNA，比全長度稍短的cDNA，或基因片段。
雖然在優(yōu)選的實施方案中，這種微陣列包含對于靶標(biāo)生物體基因組中幾乎全部基因產(chǎn)物的結(jié)合位點，但是這種全面的包含不是必需的。通常該微陣列具有相當(dāng)于基因組中至少大約50％基因的結(jié)合位點，常常是至少約75％，較通常的是至少約85％，更通常的是大于約90％，而最通常的是最少約99％。優(yōu)選地，此微陣列具有對于與所研究藥物的作用相關(guān)的，或者在所研究生物途徑中的基因的結(jié)合位點?！盎颉北昏b定為優(yōu)選地至少是50，75或90個氨基酸的一個開放讀框(ORF)，在生物體(例如如果是單細胞生物體)或在多細胞生物體的某一細胞中信使RNA從此讀框被轉(zhuǎn)錄。從由生物體表達的mRNA的數(shù)目，或者通過從良好特征化的基因組部分推斷，可以估算出基因組中的基因數(shù)量。研究中的有機體的基因組被測序時，就可以確定ORFs的數(shù)目，并可通過分析其DNA序列對mRNA編碼區(qū)進行鑒定。例如，已經(jīng)對釀酒酵母基因組進行了完整地測序，并報告具有長度多于99個氨基酸的大約6275個開放讀框(ORFs)。對這些ORFs的分析表明，有588個ORFs很可能是規(guī)定蛋白質(zhì)產(chǎn)物的(Goffean等，1996，具有6000個基因的生命，科學(xué)274546-567，此文獻全部被引入作為參考)。對比之下，估計人基因組包含大約105個基因。
制備用于微陣列的核酸如上面指出的，特定的同源cDNA與之特異性雜交的“結(jié)合位點”通常是附著于此結(jié)合部位的核酸或核酸相似物。在一個實施方案中，此微陣列的結(jié)合位點是對應(yīng)于某生物體基因組中每個基因至少一部分的DNA多核苷酸。借助于例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增來自基因組DNA，cDNA(例如借助于RT-PCR)，或克隆序列的基因區(qū)段可以獲得這些DNAs。根據(jù)已知的基因或cDNA序列選擇可導(dǎo)致獨特片段(即不與微陣列上任何其它片段共有相同鄰接序列的10個以上堿基的片段)擴增的PCR引物。計算機程序可用于設(shè)計具有所需特異性和最佳擴增特性的引物。參見例如Oligo版本5.0(國家生物科學(xué))。在對應(yīng)于非常長基因的結(jié)合位點的情況下，有時理想的是擴增靠近基因3’末端的區(qū)段，以致當(dāng)使寡-dT觸發(fā)的cDNA探針對微陣列雜交時，比全長度短的探針將能夠有效地結(jié)合。微陣列上每個基因片段的長度典型地應(yīng)在大約50bp與大約2000bp之間，更典型的是大約100bp-1000bp，而通常是大約300bp-800bp。PCR法是熟知的，已在例如如下文獻中被論述Innis等編輯，1990 PCR方案方法及應(yīng)用指南，Academic出版公司SanDiego.CA，被全部引入作為參考。顯然，計算機控制的機器人系統(tǒng)對分離和擴增核酸是有用的。
產(chǎn)生用于微陣列核酸的另一種方法是通過應(yīng)用N-膦酸或氨基磷酸化學(xué)過程人工合成多核苷酸或寡核苷酸(Froehler等，1996，核酸研究145399-5407；McBride等1983，四面體通訊24245-248)。合成的序列長度約15-500個堿基，更典型的是約20-50個堿基。在某些實施方案中，合成的核酸包括非天然堿基，例如次黃嘌呤核苷。如上所述，可用核酸相似物作為雜交的結(jié)合位點。適合的核酸相似物的一個例子是肽核酸(參見例如Fgholm等1993，服從Watson-Crick氫鍵原則的PNA對互補寡核苷酸的雜交，自然365566-568；還見美國專利No 5,539,083)。
在另一實施方案中，此結(jié)合(雜交)位點是由質(zhì)?；蚧虻氖删w克隆(例如被表達的序列標(biāo)志)，或者來自其的插入片段構(gòu)成的(Nguyen等，1995，在鼠胸腺中通過陣列cDNA克隆的定量雜交檢測的差示基因表達，基因組29207-209)。在再一個實施方案中，結(jié)合位點的多核苷酸是RNA。
使核酸附著于固體表面將核酸或相似物附著于固體支持物，它可能是由玻璃，塑料(例如聚丙烯，尼龍)，聚丙烯酰胺，硝酸纖維素或其它材料。用于將核酸附著于一種表面的優(yōu)選方法是印制在玻璃板上，如由Schena等在1995，用互補的DNA微陣列定量監(jiān)測基因表達的式樣，科學(xué)270467-470中所概述的。這種方法特別適用于剝離cDNA微陣列。還參見Derisi等1996，用cDNA微陣列分析人癌中的基因表達式樣，自然遺傳學(xué)14457-460；Shalon等，1996，應(yīng)用二種顏色熒光探針的雜交分析復(fù)合DNA樣品的DNA微陣列系統(tǒng)，基因組研究6639-645；以及Schena等1995，人基因組平行分析法；基于微陣列的1000個基因的表達。美國國家科學(xué)院學(xué)報9310539-11286。上述每篇文獻均被全部引入作為參考。
用于制備微陣列的第二種優(yōu)選方法是通過制備高密度的寡核苷酸陣列。技術(shù)是已知用于產(chǎn)生包含幾千個互補于限定序列的寡核苷酸陣列的技術(shù)，在一種表面的限定位置，將光刻技術(shù)用于原位合成(參見Fodor等1991，光定向的可空間尋址的平行化學(xué)合成法，科學(xué)251767-773；Pease等1994，用于快速DNA序列分析的光定向的寡核苷酸陣列，美國國家科學(xué)院學(xué)報915022-5026；Lochhart等1996，通過對高密度寡核苷酸陣列的雜交監(jiān)測表達，天然生物技術(shù)141675；美國專利No.5,578,832，5,556,752，和5,510,270，每篇文獻均全部引入人微言輕參考)，或者用于快速合成并沉積限定寡核苷酸的其它方法(Blanchard等1996，高密度的寡核苷酸陣列，生物傳感器和生物電子學(xué)11687-90)。當(dāng)應(yīng)用這些方法時，是直接在一種表面，如衍生化處理的載波電表面合成已知序列的寡核苷酸(例如20個基體)。通過所產(chǎn)生的陣列是冗余的，每個RNA可有幾個寡核苷酸分子?？梢赃x擇寡核苷酸探針交替地檢測拼接的mRNA。制備微陣列的另一種優(yōu)選方法是應(yīng)用噴墨印制法直接在一種固相表面合成寡核苷酸，如在如下專利中所描述的共同未決的申請美國專利申請?zhí)?9/008,120，1998，1，16由Blanchard提交，標(biāo)題是“應(yīng)用溶劑微滴的化學(xué)合成”，在此全部被引入作為參考。
還可以應(yīng)用其它一些方法制備微陣列，例如通過掩蓋法(Maskosand Sonthern，1992，核酸研究201679-1684)。主要是將任何形式的陣列，例如斑點印跡在尼龍雜交膜上(見Sambrook等，分子克隆-實驗室手冊(第二版)，1-3卷，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989，全部被引入作為參考)，雖然也可以使用并且也得到本領(lǐng)域技術(shù)人員的認可，但是制備的陣列將非常小，因為雜交容量比較小。
產(chǎn)生標(biāo)記探針制備總RNA和Poly(A)+RNA的方法是已知的，已被概述在Sambrook等，同上中。在一種實施方案中，應(yīng)用硫氰酸胍鹽裂解，隨后通過CsCl離心(Chirgwin等1979，生物化學(xué)185294-5299)，從本發(fā)明研究的不同類型細胞中提取RNA。借助于以寡-dT纖維素的選擇法(見Sambrood等，同上)選擇出Poly(A)+腺苷酸RNA。所研究的細胞包括野生型細胞，藥物暴露的野生型細胞，修飾的細胞和藥物暴露的修飾細胞。
通過寡dT引物或隨機引物逆轉(zhuǎn)錄從mRNA制備標(biāo)記的cDNA，這二種方法都是本領(lǐng)域熟知的(見例如Klug和Berger 1987，酶學(xué)方法，152316-325)?？稍谟信悸?lián)于可檢測標(biāo)記的dNTP存在時進行逆轉(zhuǎn)錄，最優(yōu)選的是用熒光標(biāo)記的dNTP。按另一種方法，可以通過在有標(biāo)記的dNTPs存在時體外轉(zhuǎn)錄雙鏈cDNA將分離出的mRNA轉(zhuǎn)變成所合成的標(biāo)記反義RNA(Lockhart等1996，通過對高密度寡核苷酸陣列雜交監(jiān)測表達，天然生物技術(shù)141675，被全部引入作為參考)。在另一些實施方案中，可以在沒有可檢測標(biāo)記存在時合成cDNA或RNA探針，并隨后進行標(biāo)記，例如通過摻入生物素化的dNTP，或rNTP，或者某些類似的方法(例如生物素與RNAs的光交連的psoralen衍生物)，隨后加入標(biāo)記的鏈親和素(例如藻紅素偶聯(lián)的鏈親和素)或等效果的物質(zhì)。
當(dāng)使用熒光探記探針時，許多適合的熒光團是已知的，包括熒光素，麗絲胺，藻紅素，若丹明(Perkin Elmer cetns)，Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5，Cy7，F(xiàn)lnorx(Amershem)和其它一些(見例如Kricka，1992，非同位素DNA探針技術(shù)，Academic出版，San Diego.CA)。選擇具有不同發(fā)射光譜的幾對熒光團，以致可以方便地區(qū)分它們將有更高的價值。
在另一個實施方案中，使用了不同于熒光的標(biāo)記。例如，可以使用放射活性標(biāo)記，或一對具有不發(fā)射光譜的放射活性標(biāo)記(見Zhao等，1995，高密度cDNA濾器分析法用于大批量，定量分析基因表達的新穎方法，基因156207；Pietu等1996，由高密度cDNA陣列定量雜交揭示的人肌肉內(nèi)優(yōu)選表達的新型基因轉(zhuǎn)錄，基因組研究，6492)。但是，因為放射活性微粒的分數(shù)，并隨之需要寬大空間的結(jié)合位點，所以使用放射性同位素是不大優(yōu)選的實施方案。
在一個實施方案中，是通過在42℃將一個混合物與逆轉(zhuǎn)錄酶(例如Super SeriptTMII，LTI公司)共溫育60分鐘來合成標(biāo)記的CDNA，此混合物包含0.5mM dGTP，dATP和dCTP加0.1mM dTTP加熒光脫氧核糖核苷酸(例如0.1mM若丹明110 UTP(Perken Elmer Cetus)或0.1mM Cy3 dUTP(Amersham))。
對微陣列雜交選擇核酸雜交和漂洗的條件，以致探針能夠特異性地結(jié)合于或者特異性地雜交于特定的陣列位點，也就是說，探針能夠雜交、雙螺旋化或結(jié)合于具有互補核酸序列的陣列序列位點，但是不雜交于具有非互補核酸序列的位點。如在此所使用的，如果當(dāng)此較短的多核苷酸是小于或等于25個堿基，應(yīng)用標(biāo)準的堿基配對原則而沒有錯配，或者如果此較短的多核苷酸是大于25個堿基，面存在的錯配不大于5％，則認為一個多核苷酸序列與另一個多核苷酸序列是互補的。優(yōu)選地此多核苷酸是完美地互補(沒有錯配)。通過進行一個包括陰性對照的雜交試驗可容易地證明，特異性的雜交條件可導(dǎo)致特異性的雜交(見例如Shalon等，同上，和Chee等，同上)。
最佳的雜交條件取決于標(biāo)記探針以及固定化多核苷酸或寡核苷酸的長度(例如寡聚體對多核苷酸大于200個堿基)和類型(例如RNA，DNA，PNA)。對于核酸特異性(即嚴格的)雜交條件的一般參數(shù)被描述在如下文獻中Sambrook等，同上，以及Ausabel等1987，分子生物學(xué)現(xiàn)代方法，Green Publishing和Wiley-Interseience，紐約，被全部引入作為參考。當(dāng)使用Schena等的cDNA微陣列，典型的雜交條件是在5×SSC加0.2％ SDS中65℃雜交4小時，隨后在低嚴格漂洗緩沖液(1×SSC加0.2％ SDS)中25℃漂洗，隨之在高嚴格漂洗緩沖液(0.1×SSC加0.2％ SDS)中25℃漂洗10分鐘(Shena等1996美國國家科學(xué)院學(xué)報9310 614)。例如在如下文獻中也提供了有用的雜交條件Tijessen 1993與核酸探針雜交Elsevier科學(xué)出版社，B.V，以及Kricka，1992，非同位素DNA探針技術(shù)，Academic出版，San Diego.CA。
信號檢測和數(shù)據(jù)分析當(dāng)使用熒光標(biāo)記探針時，優(yōu)選地可借助于掃描共焦激光顯微鏡檢測每個轉(zhuǎn)錄陣列位點的熒光發(fā)射。在一個實施方案中，應(yīng)用適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)線路對所使用的二種熒光團的每一種實施了單獨的掃描。按另一種方法，可以使用的激光是，它有可能在對二種熒光團特異的波長進行同時試樣顯示，并且可以同時分析來自二種熒光團的發(fā)射(見Shalon等1996，一種應(yīng)用二色熒光探針雜交，用于分析復(fù)合DNA樣品的DNA微陣列系統(tǒng)，基因組研究6639-645，全部被引入作為參考)。在優(yōu)選的實施方案中，是用具有計算機控制的X-Y級和顯微鏡物鏡的激光熒光掃描器掃描此陣列。以復(fù)線路混合氣體激光可達到連續(xù)激發(fā)二種熒光團的目的，借助于波長可使發(fā)射光分開，并用二個光電倍增管檢測。在Schena等1996，基因組研究6639-645和在此引用的其它一些文獻中描述了熒光激光掃描裝置。另外，F(xiàn)erguson等1996，自然生物技術(shù)141681-1684描述的光纖維束也可用于同時監(jiān)測在大量位點的mRNA豐度水平。
在優(yōu)選的實施方案中，借助于計算機，例如應(yīng)用對數(shù)字板的12位模擬量，記錄信號并進行分析。在一個實施方案中，先應(yīng)用繪圖程序(例如Itijaak Graphics Suite)使掃描圖像去點綴，然后應(yīng)用圖像網(wǎng)格化程序進行分析，對每個位點在每個波長形成一個平均雜交作用的電子數(shù)據(jù)表。如果必要，可以通過實驗確定二種熒光頻道之間對“串話干擾”(或重疊)的相關(guān)性。對于轉(zhuǎn)錄陣列上任何一個特寫的雜交位點，可以計算出二種熒光團發(fā)射的比率。此比率與同源基因的絕對表達水平無關(guān)，但是可用于其表達明顯地受給藥，基因缺失或任何其它試驗過程調(diào)制的基因。
根據(jù)本發(fā)明的方法，對二種細胞或細胞系mRNA的相對豐度被計分表示為所確定的擾動和它的大小(即對于被測試的二種來源的mRNA其豐度是不同的)，或者表示為沒有受干擾(即相對豐度相同)。如在此使用的，在二種來源的RNA之間至少有大約25％的差異(從一種來源的RNA比另一種來源的RNA豐度多25％)被記分為擾動，而比較通常是大約50％，甚至常常多大約2倍(2倍的豐度差異)，3倍(3倍的豐度差異)，或5倍(5倍的豐度差異)。目前的檢測方法能夠可靠地檢測大約3倍-5倍數(shù)量級的差異，但是預(yù)期將發(fā)展更靈敏的方法。
優(yōu)選地除了鑒定擾動是陽性或陰性之外，最好還能確定擾動的大小。如上所述，通過計算用于不同標(biāo)記的二種熒光團的發(fā)射比率，或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的類似方法可以實現(xiàn)此目的。
對途徑應(yīng)答的測定在本發(fā)明的一個實施方案中，通過將各對應(yīng)(即互補)于所研究的不同細胞mRNA的二種不同標(biāo)記探針的混合物對微陣列雜交，形成了可反映所研究細胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄陣列。根據(jù)本發(fā)明，這二種細胞是相同類型的，即相同的種或株，但是少數(shù)基因座(例如一個，二個，三個或五個，優(yōu)選地是一個)可能在遺傳上有差別。另一種情況是，它們是同源的，而它們的環(huán)境歷史不同(例如暴露于藥物與沒有暴露比較)。
為了測定途徑應(yīng)答，可在對所研究的途徑存在分級擾動時制備或培養(yǎng)細胞。暴露于擾動的細胞和未暴露于擾動的細胞被用于構(gòu)建轉(zhuǎn)錄陣列，測定此陣列，以便發(fā)現(xiàn)由于暴露于藥物具有表達改變的mRNA及改變的程度。因此，得到了途徑應(yīng)答。
分級藥物暴露和分級擾動控制參數(shù)水平的密度受單個基因應(yīng)答的鮮明度和結(jié)構(gòu)控制-應(yīng)答的一部分越急劇、最急劇時，為了適當(dāng)?shù)胤直娲藨?yīng)答需要越濃密的水平。通過圖3的實例大致地指示了此示范性密度。在此，對氨甲喋呤100倍濃度范圍的6種暴露正好是以分辨基因表達應(yīng)答。但是，對這種途徑更精細的應(yīng)答有更多的暴露是優(yōu)選的。
進而，為了減少實驗誤差，在二種顏色的差異性雜交實驗中交換熒光標(biāo)記是優(yōu)選的，這樣可以減少為單個基因或陣列點位置所特有的偏差。換句話說，優(yōu)選地是，首先測定來自二種被測定細胞中具有一種標(biāo)記的mRNA基因表達(例如以第一種熒光染料標(biāo)記受干擾的細胞，以第二種熒光染料標(biāo)記未受干擾的細胞)，然后測定來自具有相反標(biāo)記細胞的基因表達(例如以第二種熒光涂料標(biāo)記的受干擾細胞，以第一種熒光染料標(biāo)記的未受干擾的細胞)。在暴露水平和擾動控制參數(shù)水平內(nèi)進行多次測定，可提供附加的實驗誤差控制。當(dāng)在應(yīng)答函數(shù)中選擇用于在均衡誤差和喪失結(jié)構(gòu)之間插入應(yīng)答數(shù)據(jù)的仿樣函數(shù)S寬度時，以適當(dāng)?shù)娜涌赡苄纬梢粋€折衷選擇。在藥物暴露和擾動控制參數(shù)間隔內(nèi)作大約10次測定，以相反的熒光標(biāo)記重復(fù)一遍，二者合起來，每個藥物應(yīng)答或擾動應(yīng)答需要大約20次雜交實驗，這樣可對途徑以及它們的成員基因和蛋白質(zhì)得到可靠的鑒定。
對藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)的測定為了測定藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)，將細胞暴露于分級濃度的所研究的藥物或候選藥物。當(dāng)在體外培養(yǎng)細胞時，通常是將此化合物加到它們的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，對于酵母菌，優(yōu)選地是在對數(shù)生長早期收獲酵母細胞，因為表達式樣對那里的收獲時間相對不敏感。以分級的含量加入藥物，取決于藥物的特征，但通常是大約1ng/ml-100ng/ml。在某些情況下是將藥物溶解于溶劑中，如DMSO。
將暴露于藥物的細胞和不暴露于藥物的細胞用于構(gòu)成轉(zhuǎn)錄陣列，對它們進行測定，以便發(fā)現(xiàn)由于暴露于藥物具有改變表達的mRNA。從而獲得藥物應(yīng)答。
類似于對途徑應(yīng)答的測定，在二色差異性雜交的情況下，也以相反的標(biāo)記進行測定，對于藥物應(yīng)答也是優(yōu)選的。同樣優(yōu)選的是，所用的藥物暴露水平對藥物應(yīng)答的快速改變區(qū)提供了足夠的分辨能力(例如通過應(yīng)用大約10個藥物暴露水平)。
轉(zhuǎn)錄狀態(tài)測定的其它方法還可借助于本領(lǐng)域已知的其它基因表達技術(shù)測定細胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。這樣的幾種技術(shù)可產(chǎn)生被限定復(fù)雜性的限制性片段混合物，用于電泳分析，例如，雙限制性酶消化與定相引物結(jié)合的方法(見例如歐洲專利0 534858 A1，1992年9月24日由Zabean等提交的)，或者選擇具有最靠近所確定mRNA末端位點的限制性片段的方法(見例如Prashar等1996，美國國家科學(xué)院學(xué)報93659-663)。另一些方法是對cDNA混合物進行統(tǒng)計學(xué)取樣，例如通過對每個多cDNA測序足夠的堿基(例如20-50個堿基)，以便鑒定每個cDNA，或者通過測序在相對于所確定mRNA未端已知位置產(chǎn)生的短標(biāo)志(例如9-10個堿基)(見例如，Velculescu，1995，科學(xué)270484-487)。
5.5.2對生物狀態(tài)其它方面的測定在本發(fā)明不同的實施方案中，為了得到藥物應(yīng)答和途徑應(yīng)答，可以測定除了轉(zhuǎn)錄狀態(tài)以外的另一些生物狀態(tài)，例如翻譯狀態(tài)，活性狀態(tài)，或混合的形式。在此節(jié)將描述這些實施方案的細節(jié)。
基于翻譯狀態(tài)測定的實施方案可以按照幾種方法實施對翻譯狀態(tài)的測定。例如，通過構(gòu)建一個微陣列可實施蛋白質(zhì)的全基因組監(jiān)測(即，“Proteome”，Goffeau等，同上)，此微陣列中其結(jié)合位點包含對該細胞基因組編碼的多種蛋白質(zhì)特異性的固定化抗體，優(yōu)選的是單克隆抗體。優(yōu)選地，存在的抗體是針對所編碼蛋白質(zhì)的基本組分，或者至少是針對與所研究的藥物作用相關(guān)的那些蛋白質(zhì)。制備單克隆抗體的方法是熟知的(見例如Harlow和Lane，1988，抗體實驗室手冊，冷泉港，紐約，全部被引入作為參考)。在優(yōu)選的實施方案中，是針對根據(jù)該細胞基因組序列設(shè)計的合成肽片段產(chǎn)生單克隆抗體。以這樣一種抗體陣列，使來自該細胞的蛋白質(zhì)與此陣列接觸。
按另一種方法，可借助于雙向凝膠電泳系統(tǒng)使蛋白質(zhì)分離。雙向凝膠電泳是本領(lǐng)域熟知的，典型地包括沿著第一向的等電聚焦，隨之沿著第二向的SDS-PAGE電泳。見例如Hames等1990，蛋白質(zhì)凝膠電泳實踐入門，IRL出版，紐約，Shevchenko等1996，美國國家科學(xué)院學(xué)報931440-1445；Sagliocco等1996，酵母菌121519-1533；Lander，1996，科學(xué)274536-539。所形成的電泳圖譜可借助于多種技術(shù)進行分析，包括質(zhì)譜技術(shù)，應(yīng)用多克隆抗體和單克隆抗體的蛋白質(zhì)印跡分析和免疫印跡分析，以及內(nèi)部和N-端微測序。應(yīng)用這些技術(shù)，有可能鑒定在給定生理狀態(tài)下產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì)的基本組分，包括暴露于藥物的細胞中(例如酵母菌中)，或者由例如特定基因缺失或過度表達所改變的細胞中的生理狀態(tài)。
基于生物狀態(tài)其它方面的實施方案雖然監(jiān)測除mRNA豐度以外的細胞成分目前還存在某些在監(jiān)測mRNAs中未遇到的技術(shù)困難，但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員都明了，本發(fā)明方法的用途，包括途徑擾動不同的已知方法的應(yīng)用，也適用于可被監(jiān)測的任何一種細胞成分。
特別是，在與藥物作用特征有關(guān)的蛋白質(zhì)活性可以被測定的情況下，本發(fā)明的一些實施方案可以基于這些測定。通過適合于被特征化的特定活性的任何功能性的，生物化學(xué)的，或物理的手段，可以實現(xiàn)這些活性測定。在此活性包括化學(xué)轉(zhuǎn)變的情況下，可以使此細胞蛋白質(zhì)與天然底物接觸，并測定這種轉(zhuǎn)變速度。在此活性包括多聚體單位中的締合時，例如激活的DNA結(jié)合復(fù)合體與DNA的締合，可以測定締合蛋白質(zhì)的含量或此締合作用的繼發(fā)性結(jié)果，如被轉(zhuǎn)錄的mRNA含量。還有，在已知唯一的功能活性時，例如在細胞周期控制中，可以觀測這種功能的表現(xiàn)。然而蛋白質(zhì)活性中的這些已知的和被測定的改變可構(gòu)成借助于本發(fā)明前述方法分析的應(yīng)答數(shù)據(jù)。
在另一個非限制性實施方案中，應(yīng)答數(shù)據(jù)可由細胞生物狀態(tài)的混合形式構(gòu)成。例如生物應(yīng)答數(shù)據(jù)可以由某些mRNA豐度的改變，某些蛋白質(zhì)豐度的改變，以及某些蛋白質(zhì)活性的改變構(gòu)成。
5.6對藥物發(fā)現(xiàn)的應(yīng)用本發(fā)明在藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域具有多種用途，在這里將提供一些用途。在一種應(yīng)用中，本發(fā)明提供了一種方法，用于確定其推定的作用途徑已經(jīng)被鑒別確定的候選藥物作用的其它生物途徑。如前面指出的，藥物開發(fā)常常包括試驗許多化合物對已知生物途徑的特殊作用，例如起源于一克隆的基因序列或者分離的鹽或蛋白質(zhì)的途徑。在此方法中，雖然鑒定了明顯影響此假定途徑的候選藥物，但是只得到了很少或沒有得到關(guān)于該藥物作用特異性(例如受影響的其它生物途徑是什么)的信息，或者關(guān)于該藥物對受影響途徑的特定作用的信息。本發(fā)明的方法可提供這種信息。
例如，倘若有一個似乎影響某假定生物途徑的候選藥物，可以應(yīng)用本發(fā)明的方法證實此假定途徑確實是藥物作用的途徑，以及用于開發(fā)對此假定途徑更特異性的(即，更途徑特異性的)藥物(例如理想的藥物)，此藥物幾乎不影響除了所希望的假定途徑以外的生物途徑。通過直接采用在5.2節(jié)概述的，在5.3節(jié)具體描述的方法(特別是參照圖5)可以達到此應(yīng)用目的。因此，一方面通過如下步驟可達到此目的(i)對于所研究的藥物或候選藥物測定藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)；(ii)對于藥物作用的假定生物途徑測定擾動應(yīng)答(例如，如果此生物途徑起源于基因，那么可以按分級的方式控制此基因的表達)；(iii)盡可能最佳地將假定的藥物作用途徑的途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)表示為藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)；以及(iv)評估這種表示法的顯著性，以便確定是否已充分地表現(xiàn)了藥物的顯著作用，并證實此假定的途徑確實是此藥物作用的途徑。
如在上面關(guān)于步驟507中所詳述的，如果使細胞暴露于藥物同時暴露于對假定途徑的擾動可導(dǎo)致對此途徑細胞成分應(yīng)答的干擾作用，那么表示此途徑確實是該藥物作用的途徑。換句話說，可評估這種組合應(yīng)答以便確定與圖7B中顯示的相比較是否它更象圖7A中顯示的。另一方面，如果這種組合暴露的作用主要是附加性的(如在圖7B顯示的)，那么表明此假定的途徑不是藥物作用的途徑，如果發(fā)現(xiàn)通過途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)對藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)的最佳表示法是高度顯著性的，例如具有95％的顯著性閾限，那么表明此候選藥物對假定的生物途徑是高度特異性的(對其它的生物途徑，如起源于其它基因或基因產(chǎn)物，或者基因產(chǎn)物活性的生物途徑很少或沒有直接的作用)。另一方面，如果發(fā)現(xiàn)這種表示法沒有足夠的顯著性，那么表明其它的生物途徑受到了所研究藥物或候選藥物的影響。
在細胞中的其它生物途徑受到影響的后一種情況下，可對候選藥物的結(jié)構(gòu)進行修飾(例如應(yīng)用制藥學(xué)或藥物化學(xué)領(lǐng)域熟知的有機合成法)，或者可以對密切相關(guān)的化合物進行鑒定，等，并按照本發(fā)明進行試驗，直到鑒定出對于假定的途徑更具途徑特異性的(即幾乎不影響除假定途徑以外的途徑)藥物(或者甚至是只影響假定途徑的理想藥物)。
在另一種應(yīng)用中，可應(yīng)用本發(fā)明的方法，通過對一批化合物的所有的細胞生物途徑進行鑒定，從一組候選的化合物中挑選出具有最高途徑特異性的一個或幾個藥物。通常，具有最高途徑特異性的藥物將是只直接影響其預(yù)期途徑的藥物。當(dāng)不知道預(yù)期的途徑時，那么與影響較多途徑的藥物相比較，影響最少途徑的藥物就很可能是更具途徑特異性的，而是優(yōu)選的候選藥物。具有高特異性(即高途徑特異性)的藥物是所希望的藥物，因為這種藥物在對病人給藥時將很可能具有較少的副作用。
在進一步的應(yīng)用中，對于一種對細胞(或?qū)Σ∪?具有已知生物作用，但不知道其作用機制或途徑的藥物，可以應(yīng)用本發(fā)明鑒定它的作用途徑。通過鑒定具有理想治療活性的藥物作用途徑，有可能鑒定具有類似治療活性的化合物。在這種應(yīng)用中，使藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)與很可能受此藥物影響的一組途徑擬合，或者與從途徑一覽表中簡單地抽出的途徑擬合，并確定最佳擬合藥物應(yīng)答的途徑組合。相反地，可以用本發(fā)明的方法鑒定影響細胞中以前確定的特定生物途徑的，或者影響特定途徑組合的化合物。在這種應(yīng)用中，需確定藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)對途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)(或途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)的組合)最佳擬合的顯著性，以便觀察它是否符合一定的顯著性閾限。
在還有另一種應(yīng)用中，該方法用于鑒定“第二級藥物座位”。第二級藥物座位是間接受給藥影響的任何類型的細胞成分(如基因或基因產(chǎn)物或者基因產(chǎn)物的活性)。是根據(jù)如下事實對它們進行鑒定，它們相當(dāng)于對途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)具有正或負擾動的細胞成分，但是不直接受藥物的影響。例如，第二級藥物座位包括起源于直接受影響藥物靶標(biāo)的生物途徑中的細胞成分(排除直接受影響的起源性靶標(biāo)細胞成分)。鑒定第二藥物座位對藥物設(shè)計是有用的。如上面所述，細胞的適應(yīng)性機制通?？纱_保一種細胞成分的改變(例如基因或基因產(chǎn)生，或者基因產(chǎn)物的活性改變)，將通過其它細胞成分的表達和/或活性改變受到補償。
承認這種代償性改變提供了一種藥物介入的新方法，如下所述通常認為疾病是由于起源該途徑的細胞成分(如宿主或病源體的基因)的異常表達引起此生物途徑異常激活的結(jié)果。傳統(tǒng)的藥物介入方法尋求通過在此主要的起源性細胞成分起作用來調(diào)整異常的途徑活性。但是，本方法鑒定作為細胞成分的第二級藥物座位，如基因或基因產(chǎn)物，當(dāng)某一途徑直接受影響時，藥物間接地影響第二級藥物座位(例如通過作為受影響生物途徑的一部分)。應(yīng)用這種信息，有可能發(fā)現(xiàn)影響第二級細胞成分的藥物，提供治療疾病的另一種方法(以及更大的一批潛在性藥物作用途徑)。
例如，如果疾病狀態(tài)中細胞成分X被表達不足，那么傳統(tǒng)的治療目標(biāo)是恢復(fù)X的表達，并且可能會認同通過直接影響X表達實現(xiàn)此結(jié)果的藥物。但是，本發(fā)明的方法使有可能鑒定具有X作為第二級藥物座位的其它細胞成分，正是這些其它的細胞成分起源了包括X的途徑，它們也受到藥物作用的影響。成分X的正確表達從而將由藥物對這些途徑的作用引起。因此，可以鑒定如果被抑制或激活將產(chǎn)生所需治療效果的第二級途徑(例如起源于蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)活性的途徑)，并且可以鑒定不同于通過直接作用于X，而是影響這些其它的途徑以便達到所需治療效果(例如恢復(fù)對X的表達)的藥物。
在另外的一些應(yīng)用中，本發(fā)明可被用于通過將所研究的藥物與具有相似治療作用的其它藥物相比較，鑒定介導(dǎo)所研究藥物治療作用或副作用的生物途徑，如果二種藥物對病人或動物疾病模型的相同疾病或障礙表現(xiàn)出類似的治療效果，則可認為它們二者具有類似的治療作用。常常發(fā)現(xiàn)已知具有相似或密切相關(guān)治療效果的藥物對相同的生物途徑起作用。因此，可以將本發(fā)明的方法用于確定受所研究藥物影響的，并且也受具有類似治療作用的第二種藥物影響的途徑。對二種藥物共同的途徑是很可能介導(dǎo)所研究藥物(并且也是第二種藥物的)治療作用的那些途徑。通過比較對具有類似治療作用的補充藥物確定的共同途徑，可以進一步限定或發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)所研究藥物治療作用的途徑。
類似地，通過本發(fā)明的方法可以確定受藥物影響的，介導(dǎo)副作用的途徑。按照本發(fā)明，可以確定受所研究藥物影響的，和受具有類似治療作用的第二藥物影響的途徑。還不是第二藥物途徑的所研究藥物的途徑，很可能是介導(dǎo)所研究藥物副作用的途徑。通過比較對具有類似治療作用的補充藥物確定的共同途徑，可以更肯定地鑒定介導(dǎo)所研究藥物副作用的途徑。任選地，通過下一步應(yīng)用前述的步驟，改進所研究藥物的特異性以便刪除介導(dǎo)作用的途徑，可以鑒定出更具途徑特異性的所研究藥物的衍生物。
當(dāng)用于本發(fā)明方法的細胞是非人類的真核生物細胞，例如酵母細胞時，常?？赡芨鶕?jù)藥物對非人類細胞的作用推測對人細胞的作用。這部分地是由于如下事實，在絕大多數(shù)真核生物中大部分基因都具有相似功能的同源物。如上面所指出的，在人類遺傳性疾病人，被鑒定為有缺損的幾乎半數(shù)蛋白質(zhì)顯示出與酵母菌蛋白質(zhì)的氨基酸相似性。還有報導(dǎo)，已知引起人類疾病的所有基因的大約80％在新桿秀麗線蟲中具有同源物(“討論用于功能基因分析技術(shù)的專家推測”，基因工程新聞16、1996，11，15)。
還有另一些應(yīng)用，是可以將本發(fā)明的方法用于確定不同藥物作用的相似性。這種應(yīng)用適合于特殊情況，其中被定標(biāo)擬合藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)的途徑數(shù)目等于單數(shù)，即等于1。因此，在特定的實施方案中，R表示在此被稱為藥物R的“擾動”藥物的應(yīng)答，將此應(yīng)答與由在此被稱為藥物D產(chǎn)生的應(yīng)答D相比較。從等式8和9得到的相關(guān)系數(shù)，或者按另一種方式，從等式6得到的最小二乘方殘數(shù)提供了此二個藥物作用相似性的定量測定。
由于如下原因，比較藥物應(yīng)答的本方法顯著優(yōu)于根據(jù)單濃度測定的相關(guān)方法。研究的二個藥物，藥物D和R可能具有相同的作用途徑，但是具有不同的效力。在一個濃度的測定因此只能在一個滴定水平取樣試驗藥物應(yīng)答曲線，如在圖2A中顯示的曲線。一般地說，對應(yīng)于藥物D給定濃度的滴定水平將不同于對應(yīng)于藥物R相同濃度的滴定水平。例如，對藥物D的測定可能相當(dāng)于圖2A中的滴定水平1，而對藥物R的測定可能相當(dāng)于滴定水平4。因此對于藥物D僅觀察到基因G1和G2的改變，面對于藥物R將觀察到所有基因G1-G6的改變。結(jié)果是，藥物D和R應(yīng)答的相似性將不像下述情況那樣很明顯如果對于藥物D和藥物R都從0濃度至飽和取樣試驗整個應(yīng)答曲線，并且借助于如上面5.3.1節(jié)所述的定標(biāo)轉(zhuǎn)換發(fā)現(xiàn)了最佳相關(guān)性。
這種對藥物相似性的優(yōu)越測定法可能作為一種基礎(chǔ)，例如用于將新化合物歸類于由現(xiàn)存化合物所確定的種類中，包括基于這種分類識別可能的治療作用或毒性作用。這種對藥物相似性的優(yōu)越測定法還可能作為基礎(chǔ)用于對新的或現(xiàn)有的化合物進行分類，以便減少冗長的化合物文庫或列表，或者支持對如下問題作出決定篩選什么化合物，或者對于特定化合物將選取其它什么作用。
6實施例作為對上面所述發(fā)明的說明而不是對前面所述內(nèi)容的限制，將提供如下通過已知特定作用藥物的途徑擾動實施例。在此實施例中，通過將細胞分級暴露于環(huán)孢菌素A(“CyA”)和氨甲喋呤(“Mtx”)限定了途徑，并且確定了“未知”藥物，在此是FK506的作用途徑。
作為背景材料，CyA的作用是直接抑制鈣神經(jīng)素，可以被用于限定起源于鈣神經(jīng)素的途徑。Mtx的作用是直接抑制DHFR(二氫葉酸還原酶)蛋白，也可以被用于限定起源于這種蛋白質(zhì)的途徑。FK506也是鈣神經(jīng)素蛋白的特異性調(diào)節(jié)劑，它通過一個具有FK506結(jié)合蛋白的復(fù)合物對此蛋白質(zhì)起作用(Cardenas等，1994，作為模擬T細胞的酵母菌，藥物發(fā)現(xiàn)和設(shè)計的前景2103-126)。
按如下詳述實施了在圖8A-C中顯示的基因表達測定。為了制作環(huán)孢菌素劑量應(yīng)答曲線，將釀酒酵母R506株(基因型Mat a ura3-52 lys 2-801 ade 2-101 trp 1-Δ63 his 3-Δ200 leu 2-Δ1 his3∷HIS3)培養(yǎng)過夜的起始培養(yǎng)物以YAPD加10mM CaCl2的培養(yǎng)基稀釋至200ml(見例如，Ausubel等編著，1996，分子生物學(xué)現(xiàn)代方法，John Wiley & Sons公司，特別是第13章)，形成DO600為0.1并在30℃以300rpm速度振搖培養(yǎng)。30分鐘之后對培養(yǎng)物加入溶于乙醇的環(huán)孢菌素A，達到60，30，15，6和3μg/ml的最終濃度。對照培養(yǎng)物以正好相同體積的乙醇處理。通過OD600監(jiān)測細胞培養(yǎng)，在OD600＝1.4±0.1時收獲細胞，借助于在Sorvall Rc5C+離心機SLA-1500轉(zhuǎn)子中室溫下離心2分鐘。棄去上清液，并吸去殘留的液體，將細胞再懸浮于4ml RNA提取緩沖液(0.2M Tris HClpH7.6，0.5M NaCl，10mM EDTA，1％ SDS)中。放置攪拌3秒鐘使細胞沉淀再懸浮，然后立即轉(zhuǎn)移至其中加有2.5g烘干玻璃微珠(425-600μm)和4ml苯酚∶氯仿(50∶50 v/v)的50ml圓錐形離心管中。先將此離心管在VWR多管渦旋器中，設(shè)定8檔攪拌2分鐘，然后在Sorvall T600D型臺式離心機中，3000rpm室溫下離心5分鐘進行相分離。以等體積苯酚∶氯仿(50∶50 v/v)。通過設(shè)定6檔攪拌30種，隨后同上離心，對水相作再提取。對水相加入2.5倍體積乙醇，并將此樣品貯存于-80℃等待分離polyA+mRNA。
為了制作FK506劑量應(yīng)答曲線，再仿效上述程序，不同的是溶解于乙醇中的FK506被加到培養(yǎng)物中，最后的濃度是10，3.1，1.0，0.31，0.10μg/ml。
為了制作氨甲喋呤劑量應(yīng)答曲線，將釀酒酵母By 4741株(基因型Mat a his3ΔO len2DO ura3Δ0 met15Δ0)培養(yǎng)過夜的起始培養(yǎng)物以SC培養(yǎng)基稀釋至200ml(見例如Ausubel等，第13章)，形成OD600為0.1，并在30℃以300rpm速度振搖培養(yǎng)。30分鐘之后，對培養(yǎng)物加入溶于水中的氨甲喋呤，達到最后濃度200，100，50，25，6.2和3.1μM。對照培養(yǎng)物以相同體積的水處理。其余的步驟同上。
對于所有的上述情況，都是借助于標(biāo)準的方案(見例如Sambrook等1989，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室出版)通過寡-dT纖維素層析法應(yīng)用兩次選擇分離出poly A+RNA。如前面5.5.1節(jié)中所述的，將2μg poly A+RNA用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。也如前面5.5.1節(jié)中所述的將cDNA純化，并對聚賴氨酸玻片雜交。通過使用AppliedPrecision公司生產(chǎn)的標(biāo)準型多框架CCD攝像機滑動裝置掃描確定雜交的程序。對圖象進行信息學(xué)處理，并輸入至Inpharma數(shù)據(jù)庫中，應(yīng)用Mat Lab數(shù)據(jù)分析包進行分析。
圖8C顯示通過一系列FK506暴露得到的藥物應(yīng)答數(shù)據(jù)。此圖的橫座標(biāo)是藥物暴露數(shù)值，縱座標(biāo)是受FK506影響的大多數(shù)基因表達率的對數(shù)值。圖8A顯示對于起源于鈣神經(jīng)素的途徑，由一系列CyA暴露得到的途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)。此圖和圖8B具有途徑擾動控制參數(shù)值，在此情況下它是橫座標(biāo)上的藥物暴露水平，在縱座標(biāo)上具有受這些藥物影響的大多數(shù)基因表達率的對數(shù)值。圖8B顯示對于起源于DHFR(二氫葉酸還原酶)蛋白的途徑，由一系列Mtx暴露得到的途徑應(yīng)答數(shù)據(jù)。
以所測定的由分級暴露于CyA或Mtx(分別暴露)引起的途徑應(yīng)答的線性總和模擬了“未知”藥物FK506，形成了包括起源于鈣神經(jīng)素和起源于DHFR的最少途徑的組合應(yīng)答。圖8D顯示相關(guān)系數(shù)曲線，通過以FK506應(yīng)答與CyA和氨甲喋呤組合途徑應(yīng)答的全基因組相關(guān)性對用于FK506數(shù)據(jù)的定標(biāo)參數(shù)的不同值作圖得到此曲線。按照5.3.1節(jié)描述的方法，特別是根據(jù)等式8和9得到了此相關(guān)系數(shù)?；厥盏酱蠹s是63的FK506和Cyc A近似相對效力，如圖8D中顯示的相關(guān)性峰值位置。
表I列出了FK506和CyC A應(yīng)答共同的一批基因。這些基因被鑒定為具有在藥物和途徑應(yīng)答曲線之間的相關(guān)系數(shù)的基因，對于這種基因至少0.9位于定標(biāo)參數(shù)(63)的值，給出最大的全基因組相關(guān)性。按照等式9將這些相關(guān)系數(shù)計算為ρk(63)，在此下標(biāo)‘k’對應(yīng)于一個特定基因。無論Mtx途徑應(yīng)答是否被加到求最小值的過程中，這些相關(guān)的基因都是相同的，表明在組合應(yīng)答中鑒定一種途徑的能力。
表1
此實施例表明本發(fā)明方法的有效性，其中可容易地鑒定了定標(biāo)參數(shù)的最大值和恒定的一批被鑒定的基因。
在此實驗中，對于數(shù)值分析線性地加入了Cyc A和氨甲喋呤應(yīng)答(如前面所述)，在同時暴露于二個藥物的真實情況下，可能需要對此模式藥物應(yīng)答加入非線性項。
7.被引用的參考文獻在此引用的所有參考文獻均以其完整形式全部同樣程度地被引入作為參考，如同每單一刊物或?qū)＠蛘邔＠暾埍惶貏e地和單獨指出將以其完整形式全部被引入作為參考。
按照本發(fā)明的構(gòu)思和范圍可以作出本發(fā)明的許多修改和變化的形式，這對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。在此所述的特定實施方案僅作為實例被提供，并且，本發(fā)明將僅僅通過所附的權(quán)利要求加以限制，除此之外還有這些權(quán)利要求的等效形式的全部范圍。
權(quán)利要求
1.一種鑒定參與一種細胞類型中藥物作用的生物途徑的方法，包括(a)提供該藥物在此細胞類型中的藥物應(yīng)答，該藥物應(yīng)答已通過包括在對該藥物的多種暴露水平下測定此細胞類型中多種細胞成分的方法獲得；(b)將一種模式藥物應(yīng)答表示為該細胞類型中一種或幾種生物途徑應(yīng)答的組合，其中該細胞類型中的生物途徑應(yīng)答是一種方法的結(jié)果，此方法包括在對該生物途徑的多種擾動水平測定所述細胞類型細胞中生物途徑的細胞成分，并且其中該組合中所述一種或幾種生物途徑應(yīng)答的每一種須經(jīng)單獨的定標(biāo)轉(zhuǎn)換；以及(c)確定該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換，它可使所提供的藥物應(yīng)答與所述模式藥物應(yīng)答之間差異的目標(biāo)函數(shù)值最小化，其中該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的組合，在最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換條件下可鑒定參與該細胞類型中此藥物作用的生物途徑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的確定步驟(c)進一步包括確定該目標(biāo)函數(shù)的真實最小化值，該目標(biāo)函數(shù)的真實最小化值是從所提供的藥物應(yīng)答和該模式藥物應(yīng)答確定的目標(biāo)函數(shù)的最小化值，并且其中所述的方法進一步包括在步驟(c)之后，通過一種方法檢驗此一種或幾種生物途徑的所述最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換的統(tǒng)計學(xué)顯著性的步驟，此方法包括(d)獲得該目標(biāo)函數(shù)最小化值的預(yù)期概率分布，以及(e)依據(jù)該目標(biāo)函數(shù)真實最小值的預(yù)期概率分布，評價該目標(biāo)函數(shù)其實最小化值統(tǒng)計學(xué)顯著性。
3.一種鑒定參與一種細胞類型中藥物作用的生物途徑的方法，該方法包括確定一種或幾種生物途徑應(yīng)答的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換，它可使所提供的藥物與應(yīng)答與模式藥物應(yīng)答之間差異的目標(biāo)函數(shù)值最小化，其中(a)所述一種或幾種生物途徑是一種方法的結(jié)果，此方法包括在對該生物途徑的多種擾動水平測定該細胞類型細胞中一種或幾種生物途徑的細胞成分；(b)通過一種方法提供這種所提供的藥物應(yīng)答，此方法包括在對該藥物的多種暴露水平測定該細胞類型細胞中的多種細胞成分；以及(c)將所述模式藥物應(yīng)答表示為該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的組合，該組合中所述一種或幾種生物途徑應(yīng)答的每一種須經(jīng)單獨的定標(biāo)轉(zhuǎn)換，其中該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的組合，在最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換條件下可鑒定參與該細胞類型中此藥物作用的生物途徑。
4.權(quán)利要求2的方法，其中獲得所述目標(biāo)函數(shù)最小值預(yù)期概率分布的步驟包括(i)通過相對于對所述一種或幾種生物途徑的所述多種擾動水平隨機化一種或幾種生物途徑應(yīng)答，而相對于所述多種藥物暴露水平隨機化藥物應(yīng)答，并隨機化所述模式藥物應(yīng)答；(ii)通過尋找到該一種或幾種隨機化的生物途徑應(yīng)答的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換，確定該目標(biāo)函數(shù)的理論最小值，此最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換可使所述隨機化的藥物應(yīng)答與隨機化的模式藥物應(yīng)答之間差異的目標(biāo)函數(shù)最小化；以及(iii)重復(fù)步驟(i)和(ii)，以便確定多個理論最小值，此多個最小值形成所述最小化值的預(yù)期概率分布。
5.權(quán)利要求1或3的方法，進一步包括通過一種方法驗證所述一種或幾種生物途徑確實是參與在該細胞類型中藥物作用的生物途徑的步驟，此方法包括從第一模式應(yīng)答和第二模式應(yīng)答中選擇一種行為與組合的藥物-擾動應(yīng)答最相似的模式應(yīng)答，其中(i)通過一種方法提供所述組合的藥物-擾動應(yīng)答，此方法包括測定同時暴露于一種或幾種該藥物的暴露水平和一種或幾種所述一種或幾種生物途徑擾動水平的該細胞類型細胞中的多種細胞成分；(ii)該第一模式應(yīng)答包括在最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換下所述一種或幾種生物途徑應(yīng)答的組合，此最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換是按一個或幾個第一總數(shù)估算的，每個第一總數(shù)是最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換下一個或幾個藥物暴露水平中的一個，與一個或幾個對該生物途徑擾動水平中一個的總和，(iii)該第二模式應(yīng)答包括一個或幾個第二總數(shù)，每個第二總數(shù)在按一個或幾個對該生物途徑擾動水平中的一個估算的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換條件下，是按一個或幾個藥物暴露水平中一個估算的藥物應(yīng)答與該一個或幾個生物途徑應(yīng)答組合的總和，其中如果選擇第一模式應(yīng)答，則可驗證所述一個或幾個生物途徑為確實參與該細胞類型中藥物作用的生物途徑。
6.權(quán)利要求1或3的方法，進一步包括將存在于藥物應(yīng)答中的細胞成分指定屬于所述一種或幾種生物途徑中一種的步驟，其中該細胞成分的生物途徑應(yīng)答在其最佳定標(biāo)的條件下具有與該細胞成分的藥物應(yīng)答最大的相關(guān)性。
7.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述定標(biāo)轉(zhuǎn)換包括將所述的藥物暴露水平轉(zhuǎn)換成對所述生物途徑相應(yīng)的擾動水平。
8.權(quán)利要求7的方法，其中的轉(zhuǎn)換是通過線性作圖完成的。
9.權(quán)利要求1或3的方法，其中是通過選擇對所述定標(biāo)轉(zhuǎn)換最佳的一組參數(shù)將所述目標(biāo)函數(shù)最小化。
10.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述目標(biāo)函數(shù)包含在對該藥物暴露水平的藥物應(yīng)答與在該藥物暴露水平的模式藥物應(yīng)答差的平方和，并進一步須經(jīng)所述定標(biāo)轉(zhuǎn)換。
11.權(quán)利要求1或3的方法，其中的目標(biāo)函數(shù)包含該藥物應(yīng)答和模式藥物應(yīng)答相關(guān)數(shù)的負值。
12.權(quán)利要求1或3的方法，其中是在對所述生物途徑的擾動水平，通過包括插入所測定值的方法提供所述生物途徑應(yīng)答。
13.權(quán)利要求12的方法，在此所述的插入包括通過仿樣函數(shù)和的近似法。
14.權(quán)利要求12的方法，在此所述的插入包括通過Hill函數(shù)的近似法。
15.權(quán)利要求1或3的方法，其中該細胞類型中的一種或幾種生物途徑被選擇作為很可能參與該細胞類型中藥物作用的生物途徑。
16.權(quán)利要求1或3的方法，其中的一種或幾種生物途徑是選自該細胞類型存在的生物途徑一覽表。
17.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述的細胞類型是基本上與釀酒酵母等基因的細胞類型。
18.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述細胞成分包括存在于該細胞類型中的多種RNA的豐度。
19.權(quán)利要求18的方法，其中是通過一種方法測定該多種RNA的豐度，此方法包括使一個基因轉(zhuǎn)錄陣列與來自該細胞類型細胞的RNA，或者與由其得到的cDNA接觸，其中的基因轉(zhuǎn)錄陣列包括一個具有所附著核酸或核酸相似物的表面，該核酸或核酸相似物能夠與所述多種RNA，或者與由其得到的cDNA雜交。
20.權(quán)利要求19的方法，其中是通過一種方法實施步驟(a)中對細胞成分的測定，此方法包括使一種或幾種基因轉(zhuǎn)錄陣列(i)與RNA，或者與由其得到的cDNA接觸，此RNA是來自被暴露于該藥物的所述細胞類型的細胞，以及(ii)與RNA，或者與由其得到的cDNA接觸，而此RNA是來自未被暴露于該藥物的所述細胞類型的細胞，并且其中是通過一種方法實施步驟(b)中對細胞成分的測定，此方法包括使一種或幾種基因轉(zhuǎn)錄陣列(i)與RNA，或者與由其得到的cDNA接觸，此RNA是來自被暴露于對所述一種或幾種生物途徑擾動的該細胞類型的細胞，以及(ii)與RNA，或者與由其得到的cDNA接觸，而此RNA是來自未被暴露于所述擾動的該細胞類型的細胞。
21.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述的細胞成分包括存在于該細胞類型中多種蛋白質(zhì)的豐度。
22.權(quán)利要求21的方法，其中是通過一種方法測定該多種蛋白質(zhì)的豐度，此方法包括使一種抗體陣列與來自該細胞類型細胞的蛋白質(zhì)接觸，其中所述的抗體陣列包括具有附著抗體的表面，該抗體能夠與所述多種蛋白質(zhì)結(jié)合。
23.權(quán)利要求21的方法，其中是通過一種方法測定該多種蛋白質(zhì)的豐度，此方法包括對來自該細胞類型細胞的蛋白質(zhì)實施雙向電泳。
24.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述的細胞成分包括存在于該細胞類型中的多種蛋白質(zhì)的活性。
25.權(quán)利要求1或3的方法，其中該細胞類型中的所述一種或幾種生物途徑包括起源于一種或幾種特定細胞成分的生物途徑，并且其中是通過包括修飾所述一種或幾種特定細胞成分的方法實施對該生物途徑的擾動。
26.權(quán)利要求25的方法，其中是通過一種方法修飾所述一種或幾種特定的細胞成分，此方法包括在可控制表達系統(tǒng)的控制之下引起該一種或幾種特定細胞成分表達。
27.權(quán)利要求25的方法，其中是通過一種方法修飾所述一種或幾種特定的細胞成分，此方法包括可控制地轉(zhuǎn)染表達該一種或幾種特定細胞成分的基因。
28.權(quán)利要求25的方法，其中是通過一種方法修飾所述一種或幾種特定的細胞成分，此方法包括可控制地降低該細胞類型細胞中編碼該一種或幾種特定細胞成分的RNA種類的豐度。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述可控制地降低該RNA種類豐度的方法包括將該細胞類型的細胞暴露于定向斷裂該RNA種類的核酶。
30.權(quán)利要求25的方法，其中是通過一種方法修飾所述一種或幾種特定的細胞成分，此方法包括可控制地降低該細胞類型細胞中編碼該一種或幾種特定細胞成分的RNA種類的翻譯速度。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述可控制地降低RNA種類翻譯速度的方法，包括將該細胞類型的細胞暴露于可對該RNA種類或?qū)幋a此RNA種類的DNA雜交的反義核酸或反義核酸模擬物。
32.權(quán)利要求25的方法，其中所述一種或幾種特定的細胞成分是蛋白質(zhì)種類的豐度或蛋白質(zhì)種類的活性，并且其中是通過包括可控制地降低該細胞類型細胞中這些豐度的方法修飾該一種或幾種特定的細胞成分。
33.權(quán)利要求32的方法，其中可控制地降低所述豐度的方法，包括在該細胞類型細胞中引起將所述一種或幾種蛋白質(zhì)種類表達為包含該蛋白質(zhì)種類和一個降解決定子的融合蛋白，其中該降解決定子可控制地增加該蛋白質(zhì)種類的降解速度。
34.權(quán)利要求32的方法，其中可控制地降低所述豐度的方法包括將該細胞類型的細胞暴露于抗體，其中該抗體可結(jié)合所述蛋白質(zhì)種類。
35.權(quán)利要求25的方法，其中所述一種或幾種特定細胞成分是蛋白質(zhì)的活性，并且其中是通過包括可控制地降低該細胞類型細胞中所述活性的方法修飾該一種或幾種特定細胞成分。
36.權(quán)利要求35的方法，其中可控制地降低所述活性的方法，包括將該細胞類型細胞暴露于可直接和特異性地抑制所述蛋白質(zhì)種類活性的藥物。
37.權(quán)利要求35的方法，其中可控制地降低所述活性的方法，包括將該細胞類型細胞暴露于優(yōu)勢負突變蛋白質(zhì)種類，其中該優(yōu)勢負突變蛋白質(zhì)種類是抑制所述活性的蛋白質(zhì)。
38.一種從最初的候選藥物中確定更具途徑-特異性的候選藥物的方法，包括(a)通過一種方法鑒定參與最初候選藥物作用的生物途徑，此方法包括確定一種或幾種生物途徑應(yīng)答的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換，此生物途徑應(yīng)答是一種方法的結(jié)果，此方法包括在對該生物途徑的多種擾動水平測定一種細胞類型細胞中一種或幾種生物途徑的細胞成分，其中(i)該最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換可使對于該最初候選藥所提供的藥物應(yīng)答與對于該最初候選藥物的模式藥物應(yīng)答之間差異的目標(biāo)函數(shù)值最小化，(ii)是通過一種方法提供了對于該最初候選藥物所提供的藥物應(yīng)答，此方法包括在暴露于該最初候選藥物的多種水平測定此細胞類型細胞中的多種細胞成分，以及(iii)將對于該最初候選藥物的模式藥物應(yīng)答表示為該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的組合，該組合中的一種或幾種生物途徑應(yīng)答的每一種須經(jīng)單獨的定標(biāo)轉(zhuǎn)換；(b)修飾此最初候選藥物的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生修飾的候選藥物；以及(c)通過一種方法鑒定參與此修飾的候選藥物作用的生物途徑，此方法包括確定該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換，其中(i)該最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換可使對于修飾的候選藥物所提供的藥物應(yīng)答與對修飾的候選藥物模式藥物應(yīng)答之間差異的目標(biāo)函數(shù)值最小化；(ii)是通過一種方法提供了對于修飾的候選藥物所提供的藥物應(yīng)答，此方法包括在暴露于修飾的候選藥物的多種水平測定此細胞類型細胞中的多種細胞成分，以及(iii)將對于修飾的候選藥物的模式藥物應(yīng)答表示為該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的組合，該組合中的一種或幾種生物途徑應(yīng)答的每一種須經(jīng)單獨的定標(biāo)轉(zhuǎn)換；其中如果鑒定表明修飾的候選藥物作用中具有比最初候選藥物作用中更少的生物途徑，則該修飾的候選藥物是比最初候選藥物更具途徑特異性的候選藥物。
39.一種用于鑒定參與藥物作用并介導(dǎo)此藥物副作用的一種或多種特異性生物途徑的方法，此方法包括(a)通過確定一種或幾種生物途徑應(yīng)答的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換，鑒定參與第一種藥物作用的一種或幾種生物途徑，此生物途徑應(yīng)答是一種方法的結(jié)果，此方法包括在對該生物途徑的多種擾動水平測定一種細胞類型細胞中一種或幾種生物途徑的細胞成分，其中(i)該最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換可使對于第一種藥物所提供的藥物應(yīng)答與對于第一種藥物的模式藥物應(yīng)答之間差異的目標(biāo)函數(shù)值最小化，(ii)是通過一種方法提供對于第一種藥物所提供的藥物應(yīng)答，此方法包括在暴露于第一種藥物的多種水平測定此細胞類型細胞中的多種細胞成分，以及(iii)將對于第一種藥物的模式藥物應(yīng)答表示為該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的組合，該組合中的一種或幾種生物途徑應(yīng)答的每一種須經(jīng)單獨的定標(biāo)轉(zhuǎn)換；(b)通過確定該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換，鑒定參與第二種藥物作用的一種或幾種生物途徑，其中該第一種和第二種藥物是不同的，并表現(xiàn)對相同的疾病或障礙具有治療效果，并且其中(i)該最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換可使對于第二種藥物所提供的藥物應(yīng)答與對于第二種藥物的模式藥物應(yīng)答之間差異的目標(biāo)函數(shù)值最小化，(ii)是通過一種方法提供對于第二種藥物所提供的藥物應(yīng)答，此方法包括在暴露于第二種藥物的多種水平測定此細胞類型細胞中的多種細胞成分，以及(iii)將對于第二種藥物的模式藥物應(yīng)答表示為該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的組合，該組合中的一種或幾種生物途徑應(yīng)答的每一種須經(jīng)單獨的定標(biāo)轉(zhuǎn)換；以及(c)鑒定參與第一種藥物作用的特異性生物途徑，它們不同于參與第二種藥物作用的生物途徑，從而鑒定參與第一種藥物的作用并且介導(dǎo)第一種藥物的副作用的一種或多種特異性生物途徑。
40.一種用于鑒定參與介導(dǎo)對于疾病或障礙的治療效果的一種或多種特異性生物途徑，該方法包括(a)通過確定一種或幾種生物途徑應(yīng)答的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換，鑒定參與第一種藥物作用的一種或幾種生物途徑，此最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換是一種方法的結(jié)果，此方法包括在對該生物途徑的多種擾動水平測定一種細胞類細胞中一種或幾種生物途徑的細胞成分，其中(i)該最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換可使對于第一種藥物所提供的藥物應(yīng)答與對于第一種藥物的模式藥物應(yīng)答之間差異的目標(biāo)函數(shù)值最小化，(ii)是通過一種方法提供對于第一種藥物所提供的藥物應(yīng)答，此方法包括在暴露于第一種藥物的多種水平測定此細胞類型細胞中的多種細胞成分，以及(iii)將對于第一種藥物的模式藥物應(yīng)答表示為該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的組合，該組合中的一種或幾種生物途徑應(yīng)答的每一種須經(jīng)單獨的定標(biāo)轉(zhuǎn)換；(b)通過確定該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換，鑒定參與第二種藥物作用的生物途徑，其中該第一種和第二種藥物是不同的，并表明對相同的疾病或障礙具有治療效果，并且其中(i)該最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換可使對于第二種藥物所提供的藥物應(yīng)答與對于第二種藥物的模式藥物應(yīng)答之間差異的目標(biāo)函數(shù)值最小化，(ii)是通過一種方法提供對于第二種藥物所提供的藥物應(yīng)答，此方法包括在暴露于第二種藥物的多種水平測定此細胞類型細胞中的多種細胞成分，以及(iii)將對于第二種藥物的模式藥物應(yīng)答表示為該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的組合，該組合中的一種或幾種生物途徑應(yīng)答的每一種須經(jīng)單獨的定標(biāo)轉(zhuǎn)換；以及(c)鑒定參與第一種藥物和第二種藥物作用的特異性生物途徑，從而鑒定參與第一種藥物的作用并且介導(dǎo)對于該疾病的障礙的治療效果的一種或幾種特異性生物途徑。
41.一個用于鑒定參與一種細胞類型藥物作用的生物途徑的計算機系統(tǒng)，包括處理器和偶聯(lián)于該處理器的內(nèi)存，該內(nèi)存編碼一種或幾種程序，該一種或幾種程序?qū)е绿幚砥鲌?zhí)行包括如下步驟的方法(a)接收該細胞類型中該藥物的藥物應(yīng)答，該藥物應(yīng)答包括在多個藥物暴露水平的該細胞類型細胞中多種細胞成分的測定量；(b)接收一種或幾種生物途徑應(yīng)答，該一種或幾種途徑應(yīng)答的每一種都包括在對該生物途徑多個擾動水平的該細胞類型細胞中該生物途徑細胞成分的測定量；(c)形成一個模式藥物應(yīng)答作為該一種或幾種生物途徑的組合，其中該組合中所述一種或幾種生物途徑應(yīng)答的每一種須經(jīng)單獨的定標(biāo)轉(zhuǎn)換；(d)確定該藥物應(yīng)答與模式藥物應(yīng)答之間差異的目標(biāo)函數(shù)值；以及(e)通過改變所述一種或幾種生物途徑應(yīng)答的定標(biāo)轉(zhuǎn)換，以便獲得可使所確定的該目標(biāo)函數(shù)值最小化的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換，用于使所確定的該目標(biāo)函數(shù)值最小化；其中該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的組合在所述最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換的條件下可鑒定參與該細胞類型藥物作用中的生物途徑。
42.權(quán)利要求41的計算機系統(tǒng)，在此所述的接收步驟包括形成從內(nèi)存中可獲得的該藥物應(yīng)答測定量和生物途徑應(yīng)答測定量。
43.權(quán)利要求41的計算機系統(tǒng)，其中所述形成一個模式藥物應(yīng)答包括加入該一種或幾種生物途徑應(yīng)答。
44.權(quán)利要求41的計算機系統(tǒng)，其中所述的目標(biāo)函數(shù)包括在所述藥物暴露水平下該藥物應(yīng)答與模式藥物應(yīng)答差的平方和，在所述藥物暴露水平通過借助于所述定標(biāo)轉(zhuǎn)換將所述藥物暴露水平轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的對每個所述生物途徑的擾動水平，并且通過將所述生物途徑應(yīng)答插入成所述相應(yīng)的擾動水平，形成了所述模式藥物應(yīng)答。
45.權(quán)利要求41的計算機系統(tǒng)，其中所述最小化包括實施Levenherg-Marquandt法。
46.一種測定二種藥物對某一細胞類型作用相似性的方法，包括(a)提供該細胞類型中第一種藥物的第一種藥物應(yīng)答，已通過一種方法獲得了這種藥物應(yīng)答，此方法包括在對第一種藥物的多種暴露水平測定該細胞類型細胞中的多種細胞成分；(b)對在某一細胞類型中的第二種藥物提供第二種藥物應(yīng)答，已通過一種方法獲得了第二種藥物應(yīng)答，此方法包括在對第二種藥物的多種暴露水平測定該細胞類型細胞中的多種細胞成分；以及(c)確定該生物途徑應(yīng)答的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換，它可使第一種藥物應(yīng)答與第二種藥物應(yīng)答之間差異的目標(biāo)函數(shù)值最小化，其中該目標(biāo)函數(shù)的最小化值構(gòu)成了對第一種藥物和第二種藥物在該細胞類型中作用相似性的測定。
47.一種用于鑒定參與環(huán)境改變對某一細胞類型作用的生物途徑的方法，包括(a)提供該細胞類型對此環(huán)境改變的環(huán)境應(yīng)答，已通過一種方法獲得了這種環(huán)境應(yīng)答，此方法包括在該環(huán)境改變的多種嚴格程度下測定該細胞類型細胞中的多種細胞成分；(b)將一種模式環(huán)境應(yīng)答表示為該細胞類型中一種或幾種生物途徑應(yīng)答的組合，其中該細胞類型中的生物途徑應(yīng)答是一種方法的結(jié)果，此方法包括在對該生物途徑的多種擾動水平測定該細胞類型細胞中該生物途徑的細胞成分，并且其中該組合中所述一種或幾種生物途徑應(yīng)答的每一種須經(jīng)單獨的定標(biāo)轉(zhuǎn)換；以及(c)確定該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換，它可使該環(huán)境應(yīng)答與模式環(huán)境應(yīng)答之間差異的目標(biāo)函數(shù)值最小化，其中該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的組合，在最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換條件下可鑒定為參與此環(huán)境改變對該細胞類型作用的生物途徑。
48.權(quán)利要求3的方法，其中對在最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換條件下的該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的組合作了統(tǒng)計學(xué)顯著性檢驗，其中是通過一種方法進行此統(tǒng)計學(xué)顯著性檢驗，此方法包括(a)獲得該目標(biāo)函數(shù)最小化值的預(yù)期概率分布；以及(b)依據(jù)此預(yù)期的概率分布評價該目標(biāo)函數(shù)真實最小化值的統(tǒng)計學(xué)顯著性，其中該目標(biāo)函數(shù)的真實最小化值是從所提供的藥物應(yīng)答和此模式藥物應(yīng)答確定的。
49.權(quán)利要求48的方法，其中是通過一種方法獲得所述預(yù)期概率分布，此方法包括(a)相對于所述多種藥物暴露水平隨機化該藥物應(yīng)答，(b)通過一種方法隨機化該模式藥物應(yīng)答，此方法包括相對于對所述一種或幾種生物途徑的多種擾動水平隨機化所述一種或幾種生物途徑應(yīng)答；(c)通過確定該一種或幾種隨機化生物途徑應(yīng)答的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換來確定該目標(biāo)函數(shù)的理論最小值，此最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換可使所述隨機化的藥物應(yīng)答與隨機化的模式藥物應(yīng)答之間差異的目標(biāo)函數(shù)最小化；以及(d)重復(fù)步驟(a)-(c)，從而可確定多個理論最小值，其中此多個理論最小值形成所述預(yù)期概率分布。
50.一種用于鑒定參與環(huán)境改變對某一細胞類型作用的生物途徑的方法，此方法包括確定一種或幾種生物途徑應(yīng)答的最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換，它可使所提供的環(huán)境應(yīng)答與模式環(huán)境應(yīng)答之間差異的目標(biāo)函數(shù)值最小化，其中(a)該一種或幾種生物途徑應(yīng)答是一種方法的結(jié)果，此方法包括在對該生物途徑的多種擾動水平測定該細胞類型細胞中一種或幾種生物途徑的細胞成分；(b)通過一種方法獲得該所提供的環(huán)境應(yīng)答，此方法包括在對該環(huán)境改變的多種暴露水平測定此細胞類型細胞中的多種細胞成分；以及(c)將該模式環(huán)境應(yīng)答表示為該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的組合，此組合中該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的每一種須經(jīng)單獨的定標(biāo)轉(zhuǎn)換，其中該一種或幾種生物途徑應(yīng)答的組合，在所述最佳定標(biāo)轉(zhuǎn)換條件下可鑒定為參與所述環(huán)境改變對該細胞類型作用的生物途徑。
全文摘要
本發(fā)明提供了幾種方法,用于通過如下步驟鑒定和表現(xiàn)藥物對細胞作用的生物途徑:(ⅰ)測定對于細胞分級暴露于所研究藥物細胞成分的應(yīng)答;(ⅱ)測定對于該細胞一種或幾種生物途徑中擾動的細胞成分的應(yīng)答,以及(ⅲ)定標(biāo)一組所測定的途徑應(yīng)答,以便根據(jù)客觀的測定最佳地擬合所測定的藥物應(yīng)答。在另一些實施方案中,本發(fā)明還對所鑒定的表現(xiàn)提供顯著性檢驗,并證實所鑒定的途徑是真實的藥物作用途徑。在不同的實施方案中,可通過測定基因表達,蛋白質(zhì)豐度,蛋白質(zhì)活性,或者這些測定量的組合來確定對細胞的作用。在另一些不同的實施方案中,通過使用可滴定的表達系統(tǒng),使用轉(zhuǎn)染系統(tǒng),改變途徑RNAs的豐度,改變途徑蛋白質(zhì)的豐度,或者改變途徑蛋白質(zhì)的活性,可以形成對細胞內(nèi)生物途徑的擾動。本發(fā)明還提供了根據(jù)鑒定藥物作用生物途徑的方法用于藥物開發(fā)的方法,并且提供了一些方法,用于表現(xiàn)參與環(huán)境改變對細胞作用的生物途徑。
文檔編號G01N33/53GK1308684SQ99808348
公開日2001年8月15日 申請日期1999年5月7日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月8日
發(fā)明者S·H·弗里恩德, R·斯托頓 申請人:羅斯塔英法美蒂克斯公司