專利名稱：含治療和診斷結(jié)構(gòu)域1的β2GP1多肽及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于診斷和治療抗磷脂抗體相關(guān)病理狀況的多肽和方法，尤其是那些與β2GPI-依賴型抗磷脂抗體相關(guān)的病理狀況。更具體地說，本發(fā)明涉及含結(jié)構(gòu)域1的β2GPI多肽、含結(jié)構(gòu)域1的β2GPI多肽模擬物、含結(jié)構(gòu)域1的β2GPI多核苷酸以及使用這些多肽的方法，尤其是用于檢測(cè)及作為耐受原使用。
背景抗磷脂抗體(aPL)抗體是通常用于描述與血栓形成、反復(fù)流產(chǎn)和作為初級(jí)抗磷脂綜合癥(APS)之血小板減少以及諸如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)之類自身免疫疾病相關(guān)的自身抗體的術(shù)語。Harris等(1983)Lancet2:1211-1214；和Lockshin等(1985)N.Engl.J.Med.313:152-156。APS可能是初級(jí)的或次級(jí)的，意思是它與其他狀況，主要是SLE相關(guān)。磷脂結(jié)合抗體(Harris等，編輯，CRC出版社，BocaRaton,FL,1991；McNeil等，免疫學(xué)進(jìn)展，第49卷，193-281頁(Austen等，編輯，學(xué)術(shù)出版社，圣地哥，CA,1991))。aPL抗體包括所謂的抗心磷脂(aCL)自身抗體，描述如下。在許多狀況中檢測(cè)到aPL抗體(包括aCL抗體)，只有與自身免疫疾病相關(guān)的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體需要磷脂結(jié)合血清蛋白β2GPI的存在。Vaarala等(1986)臨床免疫病理學(xué)(Clin.Immunol.Immunopathol.)41:8-15。
約30％具持久aPL抗體的病人患有凝血性疾病。APL抗體的存在限定了患SLE的病人中呈血栓形成、血小板減少(TCP)和流產(chǎn)等一種或多種臨床癥狀綜合癥的一組病人。SLE病人中患此綜合癥的風(fēng)險(xiǎn)在25％左右；存在aPL抗體時(shí)此風(fēng)險(xiǎn)提高至40％，而缺乏它們時(shí)則減少至15％。因?yàn)閍PL抗體被認(rèn)為針對(duì)的是質(zhì)膜中的磷脂，所以推測(cè)通過干預(yù)發(fā)生于血小板或內(nèi)皮之類細(xì)胞磷脂膜上的止血過程，它們可能在體內(nèi)產(chǎn)生直接的致病作用。在呈APS的病人中，aPL(包括aCL)抗體看來是存在的唯一風(fēng)險(xiǎn)因素，這一事實(shí)進(jìn)一步證實(shí)了這些抗體具有直接的致病作用。用人aPL抗體被動(dòng)轉(zhuǎn)移小鼠可誘發(fā)APS是aPL抗體為直接病原的最好證據(jù)。Bakimer等(1992)J.Clin.Invest.89:1558-1563；Blank等(1991)美國國家科學(xué)院院報(bào)883069-3073。雖然估計(jì)值有所變化，但認(rèn)為在約15％的中風(fēng)病人中，aPL抗體是重要因素。
這些抗體的存在與許多失調(diào)疾病之間明確的相互關(guān)系可用于它們的檢測(cè)和檢查。不過，臨床上aPL抗體的檢查仍然是一個(gè)不完善的領(lǐng)域，因而存在重大的問題。在許多實(shí)驗(yàn)室中可用購買到的標(biāo)準(zhǔn)抗血清(APL Diagnostics,Inc.,Louisville,KY)作為比較實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。不過，在這些實(shí)驗(yàn)室所獲關(guān)于確切GPL和MPL的結(jié)果之間存在許多不一致，即分別用于IgG和IgM抗磷脂抗體的檢測(cè)單位、所給血清額定值以及劃分為高(80或更高)、中等(20-80)、低(10-20)或正常(0-10)的GPL和MPL水平。購買到的試劑盒在商用標(biāo)準(zhǔn)指定值方面變化很大。Reber等(1995)血栓形成和止血?jiǎng)?3:444-452。
aPL自身抗體抗原特異性的確切性質(zhì)是有爭議的，反映在用于這些抗體的發(fā)展術(shù)語上。首先這些自身抗體被認(rèn)為定向于陰離子磷脂，由此稱為“抗心磷脂抗體”Gharavi等(1987)Ann.Rheum.Dis.46m:1-6。然后明顯可見β2GPI在aPL(包括aCL)抗體的抗原特異性中起重要作用。Vermylen等(1992)J.Lab.Clin.Med.120:10；McNeil(1990)美國國家科學(xué)院院報(bào)87:4120-4124。這些觀察表明這些抗體更適于被稱為“β2GPI-依賴型抗磷脂自身抗體，”這是用于本發(fā)明書的術(shù)語。
β2GPI作為輔助因子在β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的結(jié)合中起作用的報(bào)道與β2GPI-依賴型抗磷脂抗體可結(jié)合β2GPI自身的報(bào)道相結(jié)合，造成關(guān)于這些抗體所識(shí)別之抗原識(shí)別位點(diǎn)性質(zhì)的互相抵觸的解釋。不過，β2GPI所起的作用仍未清楚，已提出的解釋有數(shù)種。一些人斷定β2GPI-依賴型抗磷脂抗體識(shí)別含β2GPI和陰離子磷脂的復(fù)合抗原，而其他人已觀察到在缺乏磷脂的情況下與β2GPI結(jié)合的β2GPI-依賴型抗磷脂。McNeil等(1990)美國國家科學(xué)院院報(bào)87:4120-4124；Galli等(1990)Lancet335:1544；Roubey等(1995)免疫學(xué)雜志154(2):954-960；Arvieux等(1991)免疫學(xué)方法雜志143:323。已提出許多說明來解釋這些不同。Galli等推測(cè)由于β2GPI依賴型抗磷脂抗體是β2GPI的低親和性抗體，因此它們要求在所給IgG分子上通過多價(jià)固相抗原的兩結(jié)合位點(diǎn)的吻合。Galli等(1990)。他們進(jìn)一步認(rèn)為，在某些條件下，例如對(duì)微量滴定孔進(jìn)行γ輻射，可固定足夠的β2GPI以使這些低親和抗體能結(jié)合。其他人則認(rèn)為當(dāng)β2GPI與γ輻射的孔或心磷脂包被的孔結(jié)合時(shí)產(chǎn)生β2GPI-依賴型抗磷脂抗體識(shí)別的隱藏表位。Matsuura等(1994)J.Exp.Med.179:457。
β2GPI是呈現(xiàn)抗凝血?jiǎng)?shù)種特性的50kDa的血漿糖蛋白，這些特性有，諸如內(nèi)在凝血途徑接觸激活、血小板凝血酶原酶活性和ADP-誘發(fā)的血小板激活的抑制之類。Roubey(1996)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Arthritis Rheum.)39:1444；Valesinit等(1992)Automimmunity14:105。β2GPI的氨基酸序列已測(cè)定。Lozier等(1984)美國國家科學(xué)院院報(bào)81:3640；Steinkasserer等(1991)生物化學(xué)雜志277:387。β2GPI由5個(gè)同源的結(jié)構(gòu)域組成。其中4個(gè)由含高度保守之胱氨酸、脯氨酸和色氨酸的約60個(gè)氨基酸組成。Lozier等(1984)美國國家科學(xué)院院報(bào)81:3640；Steinkasserer等(1991)生物化學(xué)雜志277:387-391。首先在β2GPI中描述了此蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基元，其特征在于它的長度、自主折疊和具有兩內(nèi)部二硫橋形成中涉及的4個(gè)半胱氨酸殘基同源定位的構(gòu)架；兩個(gè)脯氨酸；兩個(gè)苯丙氨酸、酪氨酸或組氨酸殘基；兩個(gè)甘氨酸；以及一個(gè)亮氨酸或纈氨酸。這些重復(fù)基元由于其形狀而被稱為sushi結(jié)構(gòu)，或有時(shí)稱為短的共有序列重復(fù)片段。Reid等(1989)今日免疫學(xué)10:177；Ichinose等(1990)生物化學(xué)雜志265:13411-14。第五個(gè)結(jié)構(gòu)域包含82個(gè)氨基酸殘基和6個(gè)半胱氨酸。
除上述圍繞β2GPI-依賴型抗磷脂抗體之抗原特異性性質(zhì)的爭論外，還有許多關(guān)于β2GPI中β2GPI-依賴型抗磷脂抗體所識(shí)別表位之性質(zhì)和定位的重要爭論。現(xiàn)已提出β2GPI的磷脂結(jié)合位點(diǎn)在第五個(gè)結(jié)構(gòu)域內(nèi)。Hunt等(1993)美國國家科學(xué)院院報(bào)90:2141。Hunt等還報(bào)道了β2GPI的活性形式及缺乏β2GPI-依賴型抗磷脂輔因子活性的β2GPI失活形式之間的結(jié)構(gòu)差異，認(rèn)為推測(cè)的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體表位最可能在β2GPI的第五個(gè)結(jié)構(gòu)域內(nèi)。Hunt等(1994)免疫學(xué)雜志152:653-659。其他研究小組已嘗試使用重組β2GPI蛋白質(zhì)定位β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的抗原性表位。其中兩個(gè)小組在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)了已缺失多個(gè)結(jié)構(gòu)域的β2GPI突變蛋白質(zhì)。兩小組均推斷β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的表位是隱藏性的，而結(jié)構(gòu)域4可能是表位暴露中所主要涉及的。Igarashi等(1996)血液87:3262-3270；George等(1998)免疫學(xué)雜志160:3917-3923。另有一組在大腸桿菌中表達(dá)了多個(gè)結(jié)構(gòu)域已缺失的β2GPI突變蛋白質(zhì)，推斷結(jié)構(gòu)域5包含β2GPI-依賴型抗磷脂抗體所識(shí)別的表位。Yang等(1997)APLARJ.Rheumatol.1:96-100。
現(xiàn)在很需要有對(duì)于β2GPI-依賴型抗磷脂抗體所介導(dǎo)疾病的改良檢測(cè)系統(tǒng)和耐受原。
本文引用的所有參考文獻(xiàn)均全文收編作為參考。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了含結(jié)構(gòu)域1的β2GPI多肽、編碼這些多肽的多核苷酸、含結(jié)構(gòu)域1之β2GPI多肽的模擬物、組合物以及使用這些多肽、多核苷酸和模擬物的方法。
因此，一方面，本發(fā)明提供了包括含結(jié)構(gòu)域1之β2GPI多肽的多肽，其中該多肽特異地與β2GPI一依賴型抗磷脂抗體結(jié)合，其中應(yīng)理解此多肽不是由完整的β2GPI氨基酸序列(如

圖1(SEQ ID NO:1)所示)組成的，另外，也不是由β2GPI的結(jié)構(gòu)域1、2和3或1、2、3和4組成的。在某些實(shí)施方案中，多肽包含結(jié)構(gòu)域1的片段，如表1所示的。在其它實(shí)施方案中，多肽包含構(gòu)象表位。在另外的實(shí)施方案中，多肽由結(jié)構(gòu)域1組成。
在另一方面，本發(fā)明提供了包括結(jié)構(gòu)域β2GPI多肽的多肽，其中此多肽缺少(可檢測(cè)到的)T細(xì)胞表位，所說的T細(xì)胞表位在具β2GPI依賴型抗磷脂抗體的個(gè)體中能激活T細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(或包含β2GPI多肽的多肽)任何一種的偶聯(lián)物、融合物和/或多聚形式。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(尤其是那些缺少T細(xì)胞表位的)與合適的多價(jià)平臺(tái)分子偶聯(lián)，該分子可能是蛋白質(zhì)的或非蛋白質(zhì)的。
另一方面，本發(fā)明提供了編碼此發(fā)明多肽實(shí)施方案的多核苷酸(包括分離的天然存在和非天然存在多核苷酸)?？稍诳寺』虮磉_(dá)載體和/或合適的宿主細(xì)胞內(nèi)分離此多核苷酸。
另一方面，本發(fā)明提供了結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的模擬物，所說的模擬物能特異結(jié)合與結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽可特異結(jié)合的抗體(即，與結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽共有表位)。模擬物可以是多肽或本文所述的許多物質(zhì)之一，包括有機(jī)和無機(jī)分子。模擬物可以包含或不包含T細(xì)胞表位，所說的T細(xì)胞表位能在具β2GPI依賴型抗磷脂抗體的個(gè)體中激活T細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明提供了含本文所述多肽、多核苷酸和/或模擬物實(shí)施方案中任一種的組合物。在一些實(shí)施方案中，組合物中還包括藥用可接受賦形劑。在一些實(shí)施方案中，組合物里包含了有效量的多肽，其中有效量是足以誘發(fā)耐受性的量。在一些實(shí)施方案(為了檢測(cè)的目的)中，有效量是足以檢測(cè)可與結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(或模擬物)結(jié)合之抗體的量。
另一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)樣品中β2GPI-依賴型抗磷脂抗體(或特異結(jié)合結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的抗體)的方法，包括(a)在允許穩(wěn)定抗原-抗體復(fù)合物形成的條件下使樣品中的抗體與結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(或含結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽或結(jié)構(gòu)域1β2GPI模擬物的多肽)接觸；及(b)檢測(cè)步驟(a)中形成的穩(wěn)定復(fù)合物。
另一方面，本發(fā)明提供了誘發(fā)個(gè)體耐受性的方法，包括施用有效量的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽于個(gè)體，尤其是缺乏T細(xì)胞表位的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽，其中有效量是足以誘發(fā)耐受性的量。
附圖簡述圖1描述了β2GPI的核苷酸(SEQ ID NO:1)和氨基酸(SEQ IDNO:2)序列。劃線上的數(shù)字表示氨基酸的位置。
圖2描述β2GPI結(jié)構(gòu)域1的核苷酸(SEQ ID NO:3)和氨基酸(SEQID NO:4)序列。劃線上的數(shù)字表示氨基酸的位置。
圖3是β2GPI之結(jié)構(gòu)域1的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，包括β2GPI-依賴型抗磷脂抗體結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸。
圖4是描述在NUNC微量滴定平板上進(jìn)行的競(jìng)爭抑制ELISA之結(jié)果的圖。用野生型β2GPI包被平板。用多種突變?chǔ)?GPI蛋白質(zhì)競(jìng)爭與抗體(來自7104號(hào)病人)的結(jié)合。符號(hào)表示如下重組β2GPI蛋白質(zhì)-□-,12345；-□-,1----； 12---；-□-,123-；-□-,1234-；-□-,-2345；-▲-,-345；-□-,-45；和-□-,----5.
重組蛋白質(zhì)表示為劃線表示丟失的結(jié)構(gòu)域；數(shù)字表示存在于蛋白質(zhì)中的結(jié)構(gòu)域。例如，“---345”是缺少結(jié)構(gòu)域1和2，但保留結(jié)構(gòu)域3、4和5的重組β2GPI蛋白質(zhì)。
圖5是描述與多種重組β2GPI蛋白質(zhì)結(jié)合之兔抗-β2GPI的ELISA分析結(jié)果圖。以所示濃度的多種重組β2GPI蛋白質(zhì)包被覆蓋鎳螯合物的微量滴定板孔，然后檢測(cè)兔抗-β2GPI抗體的結(jié)合能力。各符號(hào)分別代表如下重組β2GPI蛋白質(zhì)-□-,--345；-□-,---45； -2345；-□-, 12345；-□-,1234-；-□-,123--；-▲-,----5；和---□---,GST-6his。
圖6是描述與多種重組β2GPI蛋白質(zhì)結(jié)合之抗-β2GPI的ELISA分析結(jié)果圖。以所示濃度的多種重組β2GPI蛋白質(zhì)包被覆蓋鎳螯合物的微量滴定板孔，然后檢測(cè)人抗-β2GPI抗體6701(來自6701號(hào)病人)的結(jié)合能力。關(guān)于重組β2GPI的符號(hào)如圖5。另外的符號(hào)如下------，無β2GPI，有抗體加入；---+---，無β2GPI，無抗體。
圖7是描述檢測(cè)兔抗-β2GPI抗體與多種重組β2GPI蛋白質(zhì)結(jié)合的能力的ELISA結(jié)果圖，所說的重組β2GPI蛋白質(zhì)首先與包被心磷脂(CL)的微量滴定孔結(jié)合。用CL覆蓋IMMULON平板，隨后裝上所示濃度的重組β2GPI蛋白質(zhì)。重組β2GPI所用的符號(hào)如圖5。
圖8是描述檢測(cè)β2GPI-依賴型抗磷脂抗體制品6641(來自6641號(hào)病人)與多種重組β2GPI蛋白質(zhì)結(jié)合的能力的ELISA結(jié)果圖，所說的重組β2GPI蛋白質(zhì)首先與CL包被的微量滴定孔結(jié)合。用CL覆蓋IMMULON平板，隨后裝上所示濃度的重組β2GPI蛋白質(zhì)。重組β2GPI所用的符號(hào)如圖6。
圖9是描述競(jìng)爭抑制ELISA結(jié)果的圖，其中檢測(cè)了多種肽與野生型β2GPI競(jìng)爭性結(jié)合β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的能力。表示肽所用的符號(hào)如下-□-,β2GPI；-□-,CTPRVC； FSTVVP；-□-,KPDDLP；-□-,GRTCPK；-□-,TLKCTP；-▲-,ICPLTG；-□-,FICPLT；-□-,ITYSCK, GRTCPK.
圖10A和10B是描述多種濃度的結(jié)構(gòu)域1多肽(圖10A)和四聚偶聯(lián)化合物44(圖10B)與來自6626號(hào)病人的親和純化β2GPI-依賴型抗磷脂抗體結(jié)合的表觀平衡結(jié)合常數(shù)的圖。表觀平衡解離常數(shù)也已顯示。
圖11A和11B是描述多種濃度的結(jié)構(gòu)域1多肽(圖11A)和四聚偶聯(lián)化合物44(圖11B)與來自6701號(hào)病人的親和純化β2GPI-依賴型抗磷脂抗體結(jié)合的表觀平衡結(jié)合常數(shù)的圖。
圖12是描述競(jìng)爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖，其中β2GPI(包被于NUCU微量滴定板上)與來自6501號(hào)病人的血漿及可變量的四聚體結(jié)構(gòu)域(-◇-)1偶聯(lián)化合物44(--)、化合物45(-*-)和β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽(-◆-)及已被還原和烷基化的β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽(-■-)反應(yīng)。
圖13A和B描述了用CFA中的β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽-KLH偶聯(lián)物(圖13A)或只用CFA(圖13B)免疫小鼠的腘淋巴結(jié)細(xì)胞的劑量反應(yīng)。符號(hào)-□-,KLH偶聯(lián)物；--，未與KLH偶聯(lián)的β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽；-■-,KLH；△,PPD。
圖14是描述β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽-KLH偶聯(lián)物(10μg、50μg和100μg)引發(fā)之劑量應(yīng)答(以抗-β2GPI抗體表示)的線條圖。
圖15是描述抗β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽-KLH偶聯(lián)物的小鼠多克隆抗體特異性的圖，是用多種β2GPI結(jié)構(gòu)域突變體(-□-,1---；-◆-，還原和烷基化的1----； 12----；-△-；1234-；---■---,-2345；---□---,--345；--▲--,--45；-△-,1---5；-X-,12345)的競(jìng)爭性試驗(yàn)測(cè)定的。
圖16是描述親和純化的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體以及正常血漿和IgG對(duì)多個(gè)病人(6501、6636、6644、7011、7013、6701、7001、6625、6641)血液中的因子Va活性影響的線條圖。
進(jìn)行本發(fā)明的方式我們已發(fā)現(xiàn)β2GPI的結(jié)構(gòu)域1與β2GPI依賴型抗磷脂抗體特異結(jié)合(即含β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的表位)。鑒于現(xiàn)存文獻(xiàn)只描述了結(jié)構(gòu)域5和4對(duì)于此結(jié)合是重要的，故此發(fā)現(xiàn)尤其重要。例如，參閱，George等(1998)和Yang等(1997)。我們還發(fā)現(xiàn)β2GPI的結(jié)構(gòu)域1與至少100種不同的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體結(jié)合，這對(duì)于本文中的檢測(cè)/診斷及耐受原尤其顯著和重要，因而結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽對(duì)于攜帶β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的廣泛群體可能是有用的。此外，我們已發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)域1的各個(gè)肽(本文所述)看來與β2GPI-依賴型抗磷脂抗體特異結(jié)合。
因此，本發(fā)明提供了含有與β2GPI-依賴型抗磷脂抗體特異結(jié)合之結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(包括分離的結(jié)構(gòu)域1)的多肽。本發(fā)明還提供了基本上由可特異結(jié)合β2GPI-依賴型抗磷脂抗體之結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽組成的多肽。本發(fā)明的多肽對(duì)于β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的檢測(cè)(在有關(guān)的診斷、預(yù)測(cè)和/或監(jiān)測(cè)中)上是有用的，也可作為耐受劑使用。在某些實(shí)施方案中，尤其是在有關(guān)耐受原方面，β2GPI多肽缺少T細(xì)胞表位并/或是多價(jià)形式，諸如與平臺(tái)分子偶聯(lián)。本發(fā)明還提供了編碼β2GPI多肽的多核苷酸。這樣的多核苷酸可用于在體外或體內(nèi)生產(chǎn)β2GPI多肽。本發(fā)明還提供了結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的模擬物，它們與β2GPI-依賴型抗磷脂抗體共有識(shí)別位點(diǎn)(即表位)。本發(fā)明還提供了含結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽、編碼結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的多核苷酸和/或模擬物的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用β2GPI多肽和/或模擬物的方法，如用于檢測(cè)或誘發(fā)耐受性(即，B細(xì)胞耐受性的誘導(dǎo))的方法。通用技術(shù)除非另外提到，本發(fā)明將應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)中的分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)常規(guī)技術(shù)。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中有完整的解釋，如“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”第二版(Sambrook等，1989)；“寡核苷酸合成”(M.J.Gait,編輯，1984)；“動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)”(R.I.Freshney,編輯，1987)；“酶學(xué)方法”(AcademicPress,Inc.)；“實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)”(D.M.Weir&C.C.Blackwell，編輯)；“用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體”(J.M.Miller&M.P.Calos，編輯，1987)；“分子生物學(xué)最新方法”(F.M.Ausubel等，編輯，1987)；“PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，”(Mullis等，編輯，1994)；和“免疫學(xué)最新方法”(J.E.Coligan等，1991)。定義“β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽”是可特異結(jié)合β2GPI-依賴型抗磷脂抗體，且至少具有圖2(SEQ ID NO:4；結(jié)構(gòu)域1)所示5個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽。用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)可顯示β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽特異結(jié)合β2GPI-依賴型抗磷脂抗體，如競(jìng)爭性抑制試驗(yàn)，在本文和本領(lǐng)域中都有描述。術(shù)語“β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽”包含多種實(shí)施方案(其中許多在本文中有描述)，包括但不局限于，SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:4的片段；SEQ ID NO:4的延伸、插入和/或缺失；SEQ ID NO:4的序列變體。因此，術(shù)語“β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽”意指一類以結(jié)構(gòu)域1為基礎(chǔ)、顯示必需功能的分子。如此，β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽可能有至少5個(gè)(如上提及的)、至少6個(gè)、至少10個(gè)，至少12個(gè)，至少15個(gè)，至少20個(gè)，至少25個(gè)，至少30個(gè)，至少40個(gè)和/或至少60個(gè)圖2(SEQ ID NO4)中所示的連續(xù)氨基酸。β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽還可包含結(jié)構(gòu)域1的不同區(qū)域，這些區(qū)域綜合起來能特異結(jié)合β2GPI-依賴型抗磷脂抗體(如產(chǎn)生構(gòu)象表位)。如下所述，在某些實(shí)施方案中，“β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽”還缺少可檢測(cè)的T細(xì)胞表位。從本發(fā)明的目的出發(fā)，T細(xì)胞表位定義為能在帶β2GPI依賴型抗磷脂抗體的個(gè)體中激活T細(xì)胞。
與抗體“可特異結(jié)合”的多肽是本領(lǐng)域眾所周知的術(shù)語，而測(cè)定這些特異結(jié)合的方法也是本領(lǐng)域眾所周知的。若一分子與特定細(xì)胞或物質(zhì)的反應(yīng)或結(jié)合比它與別的細(xì)胞或物質(zhì)的反應(yīng)或結(jié)合更頻繁、更迅速、具更高的持續(xù)性和/或更大的親和性，該分子被稱為可“特異結(jié)合”。若一抗體與靶的結(jié)合比它與其它物質(zhì)的結(jié)合具更高的親和力、更容易和/或更持久，則可以說該抗體可“特異結(jié)合”靶。
“β2GPI-依賴型抗磷脂抗體”是與β2GPI可特異結(jié)合的任何抗體。如上所述，對(duì)于屬于術(shù)語“β2GPI-依賴型抗磷脂抗體”定義內(nèi)的這些抗體，臨床和文獻(xiàn)中的術(shù)語有不同的名稱，如“aPL”和“aCL”抗體，只要存在必需的結(jié)合特性即可(即，術(shù)語“aPL”和“aCL”抗體包括β2GPI-依賴型抗磷脂抗體)。本文的“抗體”定義明確指出，“β2GPI-依賴型抗磷脂抗體”包括含有可變區(qū)的片段，如Fab片段，只要保留了特異結(jié)合β2GPI的能力即可。如下所述，應(yīng)當(dāng)理解，與任何β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的特異結(jié)合即已足夠，盡管可能比較優(yōu)選的是β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽與一種以上β2GPI-依賴型抗磷脂抗體結(jié)合，優(yōu)選與至少兩種，優(yōu)選與至少五種，更優(yōu)選與至少10種，更優(yōu)選與至少20種不同的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體結(jié)合。
“抗體”是能通過其可變區(qū)內(nèi)至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)與諸如多肽之類靶分子特異結(jié)合的免疫球蛋白分子。使用于此時(shí)，該術(shù)語不僅包含完整的抗體，還包括其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)單鏈(ScFv)、其突變體、融合蛋白、人源化抗體及含所需特異性之抗原識(shí)別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子的任何其它修飾形式。
“完整的β2GPI”指β2GPI完整分子的氨基酸序列(圖1和SEQID NO:2中所描述的)。β2GPI的多核苷酸和多肽序列也可從文獻(xiàn)和GeneBank(接受號(hào)X58100)中公開獲得。
“融合多肽”是在不同位置含天然發(fā)生之外的區(qū)域的多肽。這些區(qū)域通常存在于不同蛋白質(zhì)中，而在融合多肽里被放置在一起，或它們通常存在于同一蛋白質(zhì)中，但在融合多肽中有新的排列次序。融合多肽也可產(chǎn)生自結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的線性或分支的多聚形式。
“T細(xì)胞表位”是本領(lǐng)域眾所周知的術(shù)語，指T細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)，更具體地說，是激活T細(xì)胞的多肽序列或化學(xué)結(jié)構(gòu)。測(cè)定T細(xì)胞表位存在的方法也是本領(lǐng)域眾所周知的，并描述于本文中。應(yīng)當(dāng)理解，以后可能會(huì)開發(fā)出更靈敏的試驗(yàn)以檢測(cè)T細(xì)胞表位的存在，對(duì)T細(xì)胞表位缺乏的確定取決于所用檢測(cè)系統(tǒng)的類型。對(duì)于本發(fā)明的目的來說，“缺乏”T細(xì)胞表位意指T細(xì)胞表位用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)，尤其是本申請(qǐng)的起始申請(qǐng)日時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)不到的。還應(yīng)當(dāng)理解的是，為了本發(fā)明的目的，“T細(xì)胞表位”能在含β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的個(gè)體中刺激T細(xì)胞。
本文可互換使用的術(shù)語“多核苷酸”和“核酸”指任何長度核苷酸的多聚形式，可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。這些術(shù)語包括單鏈、雙鏈或三鏈DNA、基因組DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA雜合體或含嘌呤和嘧啶堿基或其他天然的、化學(xué)或生化修飾的、非天然的或衍生核苷酸堿基的多聚體。多核苷酸主鏈可包含糖和磷酸基團(tuán)(通?？稍赗NA或DNA內(nèi)找到)，或者修飾或取代的糖或磷酸基團(tuán)?；蛘撸嗪塑账嶂麈溈砂T如亞磷酰胺之類合成亞基的多聚體，因此可以是寡脫氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的氨基磷酸酯磷酸二酯寡聚體。硫代磷酸酯鍵可代替磷酸二酯鍵使用。此外，雙鏈多核苷酸可獲自化學(xué)合成的單鏈多核苷酸產(chǎn)物，所謂的化學(xué)合成指在合適的條件下合成互補(bǔ)鏈并將雙鏈退火，或用合適的引物和DNA聚合酶從頭合成互補(bǔ)鏈。
以下是多核苷酸的非局限性例子基因或基因片段、外顯子、內(nèi)含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針和引物。優(yōu)選的多核苷酸是DNA。按本文所用的，“DNA”不僅包括堿基A、T、C和G，還包括他們的任何類似物或這些堿基的修飾形式，如甲基化核苷酸，核苷酸間的修飾，如不帶電的連鍵和硫代酯，糖模擬物及修飾和/或其它的主鏈結(jié)構(gòu)，如聚酰胺。
“天然發(fā)生的”指內(nèi)源多核苷酸或多肽序列，即在自然界中可找到的。此術(shù)語包括編碼蛋白質(zhì)的等位基因和等位形式，以及全長和已加工的多核苷酸和多肽。加工可一步或多步發(fā)生，這些術(shù)語包含了所有的加工階段。反之，“非天然發(fā)生的”序列指所有的其他序列，即不存在于自然界中的序列，如重組序列。
“縮主細(xì)胞”包括可作為或已作為載體或摻入多核苷酸和/或蛋白質(zhì)的受體的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。宿主細(xì)胞包括單個(gè)宿主細(xì)胞的后代，由于天然、偶然或有意的突變，這些后代不必與最初的親本細(xì)胞完全相同(在形態(tài)學(xué)上或在總DNA基因組方面)。宿主細(xì)胞包括用本發(fā)明多核苷酸體內(nèi)轉(zhuǎn)染了的細(xì)胞。
“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)染”指將外源多核苷酸插入宿主細(xì)胞，不考慮插入所用的方法，例如，脂轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或電穿孔。外源多核苷酸可作為非整合載體保持，例如質(zhì)粒，或者可整合入宿主細(xì)胞基因組中。
此處所用的術(shù)語“模擬物”(也稱“類似物”)指可與結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽所特異結(jié)合之β2GPI-依賴型抗磷脂抗體特異結(jié)合的生物學(xué)或化學(xué)合成物?！澳M物”與結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽共有表位或結(jié)合特異性。模擬物可以是顯示所需結(jié)合特性的任何化學(xué)物質(zhì)，因此可以是，例如，簡單或復(fù)雜的有機(jī)或無機(jī)分子；多肽；多核苷酸；碳水化合物；脂類；脂多糖；脂蛋白，或上述物質(zhì)的任何組合，包括，但不局限于，包含多核苷酸的多肽；糖基化多肽和糖脂。術(shù)語“模擬物”包括術(shù)語“mnimotope，”它是本領(lǐng)域眾所周知的術(shù)語。
“個(gè)體”是脊椎動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人。哺乳動(dòng)物包括，但不局限于，飼養(yǎng)動(dòng)物(farm animal)、運(yùn)動(dòng)類動(dòng)物(sport animal)、寵物、靈長類、小鼠和大鼠。
“B細(xì)胞無反應(yīng)性”是本領(lǐng)域眾所周知的術(shù)語，指需T細(xì)胞輔助產(chǎn)生和分泌抗體的那些B細(xì)胞的無應(yīng)答性，包括，但不局限于，不成熟和/或成熟B細(xì)胞的克隆缺失及/或B細(xì)胞不能生產(chǎn)抗體。
“銹發(fā)的耐受性”指降低和/或穩(wěn)定與免疫原的免疫應(yīng)答的程度?！懊庖邞?yīng)答”可以是體液的和/或細(xì)胞的，可用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)檢測(cè)。從本發(fā)明的目的出發(fā)，免疫應(yīng)答通常通過β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的存在反映。從定量上說，降低量(通過抗體產(chǎn)生的降低衡量)至少約為25％，更優(yōu)選至少約為50％，更優(yōu)選至少約為75％，更優(yōu)選至少約為90％，更優(yōu)選至少約為95％，最優(yōu)選100％。應(yīng)當(dāng)理解耐受性是抗原特異性的，并為本發(fā)明的目的應(yīng)用于具β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的那些個(gè)體?！罢T發(fā)的耐受性”還包括減慢和/或延遲抗體水平增加的速率。
“生物學(xué)樣品”包含種種獲自個(gè)體的樣品，并可用于診斷或監(jiān)測(cè)試驗(yàn)。此定義包含血液和生物學(xué)來源的其他液體樣品，如活組織樣品之類的固體組織樣品或組織培養(yǎng)物或它們的衍生細(xì)胞及其后代。該定義還包括已在獲得后用任何方式處理過的樣品，如用試劑處理、溶解處理或富集某一成分，如蛋白質(zhì)或多核苷酸。術(shù)語“生物學(xué)樣品”包括臨床樣品，還包括培養(yǎng)中的細(xì)胞、細(xì)胞上清、細(xì)胞裂解物、血清、血漿、生物液和組織樣品。
生化反應(yīng)中任何兩個(gè)或多個(gè)組分間形成的“穩(wěn)定復(fù)合物”指在二聚體或復(fù)合物形成與隨后的檢測(cè)(包括任選的洗滌步驟或可發(fā)生于其中的其它處理)間持續(xù)時(shí)間足夠長的二聚體或復(fù)合體。
“分離的”或“純化的”多肽或多核苷酸是基本上無其天然相關(guān)物質(zhì)的多肽或多核苷酸?；旧蠠o是指至少無50％的其天然相關(guān)物質(zhì)，優(yōu)選至少無70％，更優(yōu)選至少無80％，還更優(yōu)選至少無90％。
若一多核苷酸在其天然狀態(tài)或用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法處理后，可被轉(zhuǎn)錄和/或翻譯以產(chǎn)生多肽或其片段，則此多核苷酸被稱為“編碼”該多肽。為了本發(fā)明的目的，還為了避免對(duì)互補(bǔ)鏈的麻煩稱謂，此多核苷酸的反義(或互補(bǔ))鏈也被說成編碼此序列；即，“編碼”多肽的多核苷酸序列包括常規(guī)編碼鏈和互補(bǔ)序列(或鏈)。
“有效量”(當(dāng)用于耐受原關(guān)系中時(shí))是足以達(dá)到有益或預(yù)期臨床結(jié)果的量。有效量可以一或多次施用。為了本發(fā)明的目的，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的有效量是足以誘發(fā)耐受性的量，尤其是對(duì)于β2GPI-依賴型抗磷脂抗體來說。從治療方面來說，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的“有效量”是足以減輕、改善、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)、減慢或延遲β2GPI-依賴型抗磷脂相關(guān)疾病狀態(tài)(即，β2GPI-依賴型抗磷脂抗體顯示潛在或已有病理的狀態(tài))的發(fā)展。功效指示劑的檢測(cè)和測(cè)量通?；趯?duì)β2GPI-依賴型抗磷脂抗體和/或與疾病相關(guān)之臨床癥狀的測(cè)定，如動(dòng)脈或靜脈血栓形成、流產(chǎn)、一過性缺血發(fā)作、腦血管異常、一時(shí)性黑矇(單眼視覺)、自身免疫性溶血性貧血癥、心臟瓣膜損傷、心肌梗塞、血小板減少癥和偏頭痛疾病。
此處所說的“價(jià)鍵平臺(tái)分子”(valency platform molecule)指含允許預(yù)定量多肽(在本發(fā)明中是結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽)和/或模擬物附著之位點(diǎn)的非免疫原性分子。
當(dāng)用于描述價(jià)鍵平臺(tái)分子時(shí)，“非免疫原性的”表示此價(jià)鍵平臺(tái)分子在自身施用于個(gè)體時(shí)，不能引起免疫應(yīng)答，和/或不能引起足夠的免疫應(yīng)答?？山邮苊庖邞?yīng)答的程度取決于價(jià)鍵平臺(tái)分子所用的環(huán)境，可經(jīng)驗(yàn)測(cè)定。
“藥效團(tuán)”用于此處時(shí)，指結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽與靶抗體結(jié)合中涉及的關(guān)鍵基團(tuán)的三維定位和化學(xué)特性。本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽本發(fā)明提供了結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽。如上所述，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(a)包含描述結(jié)構(gòu)域1之圖2(SEQ ID NO:4)的至少5個(gè)(或更多個(gè))連續(xù)氨基酸；(b)可特異結(jié)合β2GPI-依賴型抗磷脂抗體(即一種或多種β2GPI-依賴型抗磷脂抗體)。圖3給出了結(jié)構(gòu)域1β2GPI三維結(jié)構(gòu)的模型(基于nmr測(cè)定之因子H1 sushi結(jié)構(gòu)域16的實(shí)際結(jié)構(gòu)(Norman等(1991)分子生物學(xué)雜志219:717；Barlow等(1991)生物化學(xué)30:997)，并顯示了按誘變研究所測(cè)定可能涉及結(jié)構(gòu)完整性和/或抗體結(jié)合的殘基，包括本文所給出的那些殘基。至于本發(fā)明的所有多肽實(shí)施方案，應(yīng)當(dāng)理解為本發(fā)明的多肽不包括天然的完整β2GPI，或任何其它原先已分離和定性的β2GPI形式，如結(jié)構(gòu)域缺失突變體(即，結(jié)構(gòu)域1、2、3；結(jié)構(gòu)域1、2、3、4)。
在一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括含(或，在某些實(shí)施方案中，由下述組成或基本由其組成的)結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽，條件是該多肽不是由(a)完整的β2GPI(SEQ ID NO:2),(b)結(jié)構(gòu)域1、2和3；或(c)結(jié)構(gòu)域1、2、3和4組成的。
在一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括由圖2(SEQ ID NO:4)所示之代表結(jié)構(gòu)域1的氨基酸序列組成的(或，在某些實(shí)施方案中，基本上由其組成的)多肽。如實(shí)施例1所述，我們已顯示了只有含結(jié)構(gòu)域1的那些結(jié)構(gòu)域缺失β2GPI多肽能特異結(jié)合β2GPI-依賴型抗磷脂抗體，而結(jié)構(gòu)域1單獨(dú)也能結(jié)合β2GPI-依賴型抗磷脂抗體。為了本發(fā)明的目的，β2GPI的結(jié)構(gòu)域1通常約為β2GPI的第一位氨基酸至第64位氨基酸(圖1)?；蛘?，也是為了本發(fā)明的目的，結(jié)構(gòu)域1(及本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽)的范圍可從(a)約第一個(gè)半胱氨酸至約第四個(gè)半胱氨酸(當(dāng)從N-端開始測(cè)定時(shí))；(b)約N端至約第五個(gè)半胱氨酸(更準(zhǔn)確的說，第五個(gè)半胱氨酸之前的最后一個(gè)氨基酸)；(c)約第一個(gè)半胱氨酸至約第五個(gè)半胱氨酸。在某些實(shí)施方案中，附加的半胱氨酸可添加至任何合適的位置，以用作偶聯(lián)的反應(yīng)基團(tuán)。因此，額外的半胱氨酸(在某些實(shí)施方案中是β2GPI的第五個(gè)半胱氨酸)可包含于任何位置，尤其是靠近或在C末端或N末端。結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽也可包含如下之中任何組分(或由它們組成或基本由它們組成):(a)SEQ IDNO:4的第一個(gè)氨基酸至第59個(gè)氨基酸；(b)SEQ ID NO:4的第2個(gè)氨基酸至第60個(gè)氨基酸；(c)SEQ ID NO:4的第2個(gè)氨基酸至第63個(gè)氨基酸；(d)SEQ ID NO:1的第1個(gè)氨基酸至第66個(gè)氨基酸；(e)SEQ IDNO:1的第4個(gè)氨基酸至第66個(gè)氨基酸；(f)SEQ ID NO:4的第一個(gè)氨基酸至第60個(gè)氨基酸；(g)SEQ ID NO:1的第一個(gè)氨基酸至第66個(gè)氨基酸。我們已發(fā)現(xiàn)含第五個(gè)半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽尤其便于偶聯(lián)(論述如下)。對(duì)于那些含β2GPI頭四個(gè)半胱氨酸的實(shí)施方案來說，通常應(yīng)當(dāng)理解，半胱氨酸之間的氨基酸序列應(yīng)為便于形成合適的二硫橋的形式，而半胱氨酸側(cè)翼的氨基酸序列(即N末端和C末端氨基酸)可以是任何序列(只要保留能使得與抗體結(jié)合的必需結(jié)構(gòu)即可)。
在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括含表1(SEQ ID NO:5-11)所示任何多肽的多肽。我們的實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例3中所述)證實(shí)了這些多肽能特異結(jié)合β2GPI依賴型抗磷脂抗體。
對(duì)于本發(fā)明的所有多肽實(shí)施方案來說，所述多肽能特異結(jié)合β2GPI-依賴型抗磷脂抗體。用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如競(jìng)爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)，可測(cè)定與β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的特異結(jié)合。例如，可用β2GPI(天然產(chǎn)生的或重組的，只要重組分子展示必需的結(jié)合特性即可)包被微量滴定板，并添加不同濃度的檢測(cè)多肽。然后加入親和純化的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體，并使結(jié)合產(chǎn)生。用諸如堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗人IgG之類的檢測(cè)系統(tǒng)或放射性測(cè)定結(jié)合的抗體量。用檢測(cè)多肽競(jìng)爭結(jié)合β2GPI的能力表示特異的結(jié)合。實(shí)施例1和3提供了檢測(cè)競(jìng)爭性結(jié)合的例證實(shí)驗(yàn)。也可用直接的結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定特異的結(jié)合，這是本領(lǐng)域所已知的，并在實(shí)施例1和3中舉例說明。
為了本發(fā)明的目的，應(yīng)當(dāng)理解，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽只需與一種β2GPI-依賴型抗磷脂抗體結(jié)合，盡管可能比較合乎需要的是結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽與一種以上β2GPI-依賴型抗磷脂抗體結(jié)合(例如，在檢測(cè)中)。β2GPI-依賴型抗磷脂抗體通常來自個(gè)體，而抗體序列在個(gè)體與個(gè)體之間有所不同。還應(yīng)當(dāng)理解，通過使用本領(lǐng)域已知的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的片段或其它重組產(chǎn)物，如Fab片段或單鏈可變區(qū)構(gòu)建體(scFv)，可證實(shí)與β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的特異結(jié)合。
因而，在某些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽可與一種以上的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體結(jié)合(即，至少2種，至少5種，至少10種，至少20種，至少50種或更多)。這些實(shí)施方案對(duì)于檢測(cè)尤其有用，因?yàn)檫@些多肽可用于檢測(cè)更寬范圍的可能攜帶β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的個(gè)體。表1．可特異結(jié)合β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的結(jié)構(gòu)域1片段

在某些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽包含sushi結(jié)構(gòu)?！皊ushi結(jié)構(gòu)域”為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，通常其特征在于(a)含將多肽鏈纏繞成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的某些殘基(如脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、亮氨酸、纈氨酸和/或組氨酸)；(b)分子量通常約為6kD；和(c)含β折疊結(jié)構(gòu)。Ichmose等(1990)生物化學(xué)雜志265:13411。
還應(yīng)當(dāng)理解，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽可通過構(gòu)象表位與β2GPI-依賴型抗磷脂抗體結(jié)合。因此，在某些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽包含(a)圖3的氨基酸55、56和58(異亮氨酸；天冬酰胺；亮氨酸)(SEQ ID NO:4的氨基酸55、56和58)；(b)圖3的氨基酸43-45(精氨酸；賴氨酸；苯丙氨酸)(SEQ ID NO:4的氨基酸43-45)；(c)SEQID NO:4的氨基酸40-45(甘氨酸；甘氨酸；甲硫氨酸；精氨酸；賴氨酸；苯丙氨酸)，優(yōu)選圖3的氨基酸38-44(SEQ ID NO:4的氨基酸38-44)；和/或(d)圖3的氨基酸19(賴氨酸)(SEQ ID NO:4的氨基酸19)，優(yōu)選包含(a)和(b)；優(yōu)選包含(a)和(c)；優(yōu)選包含(b)和(c)；優(yōu)選包含(a)和(d)；優(yōu)選包含(b)和(d)；優(yōu)選包含(c)和(d)；優(yōu)選包含(a)、(b)和(d)；優(yōu)選包含(a)、(c)和(d)；優(yōu)選包含(b)、(c)和(d)；優(yōu)選包含(a)、(b)和(c)；優(yōu)選包含(a)、(b)、(c)和(d)。通過誘變我們已發(fā)現(xiàn)從總體上或個(gè)體上說這些氨基酸對(duì)于結(jié)合可能都是關(guān)鍵的。
結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(或含結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的多肽)的大小可變化很大，只要符合所需功能(基于與β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的特異結(jié)合)即可。例如，與β2GPI依賴型抗磷脂抗體達(dá)到特異結(jié)合所需的長度可小至如5個(gè)氨基酸長的序列。我們的數(shù)據(jù)已顯示小至6聚的氨基酸序列仍能與β2GPI-依賴型抗磷脂抗體特異結(jié)合(實(shí)施例3)。
在某些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(以及包含或基本上由結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽組成的多肽)長度小于約350個(gè)氨基酸，優(yōu)選長度小于約300個(gè)氨基酸，優(yōu)選長度小于約250個(gè)氨基酸，優(yōu)選長度小于約200個(gè)氨基酸，優(yōu)選長度小于約160個(gè)氨基酸，優(yōu)選長度小于約150個(gè)氨基酸，優(yōu)選長度小于約125個(gè)氨基酸，優(yōu)選長度小于約115個(gè)氨基酸，優(yōu)選長度小于約110個(gè)氨基酸，優(yōu)選長度小于約100個(gè)氨基酸，優(yōu)選長度小于約75個(gè)氨基酸，優(yōu)選長度小于約60個(gè)氨基酸，優(yōu)選長度小于約50個(gè)氨基酸，優(yōu)選長度小于約25個(gè)氨基酸，優(yōu)選長度小于約15個(gè)氨基酸，優(yōu)選長度小于約10個(gè)氨基酸。
應(yīng)當(dāng)理解，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽可與其它結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(不管這些結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽相同或不同)以及β2GPI的其它結(jié)構(gòu)域相結(jié)合、偶聯(lián)和/或連接。因此，本發(fā)明包含結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的多聚形式。如本文所用，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的多聚形式包含多個(gè)(即1個(gè)以上)結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽。在一實(shí)施方案中提供了結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的線性聚合體。在另一實(shí)施方案中提供了結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的分支聚合體。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了(a)多個(gè)結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽；(b)含結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽和一個(gè)或多個(gè)β2GPI其它結(jié)構(gòu)域的多肽。這樣的實(shí)施例包括，但不局限于，(a)與結(jié)構(gòu)域2偶聯(lián)的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽；(b)與結(jié)構(gòu)域3偶聯(lián)的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽；(c)與結(jié)構(gòu)域5偶聯(lián)的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽；(e)與結(jié)構(gòu)域3、4和5偶聯(lián)的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽；(f)與結(jié)構(gòu)域4和5偶聯(lián)的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽。這些結(jié)構(gòu)域應(yīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，通常如下(從N端起)結(jié)構(gòu)域2，約為第65-120位氨基酸；結(jié)構(gòu)域3，約為第121-181位氨基酸；結(jié)構(gòu)域4，約為第182-244位氨基酸；結(jié)構(gòu)域5，約為第245-326位氨基酸(C末端)。
在另一實(shí)施方案中提供了結(jié)構(gòu)域1β2GPI多抗原肽(multipleantigen peptide，Map)。Map具有含放射分支狀賴氨酸突出的小免疫惰性核心，許多結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽可錨定(即共價(jià)附著)于其上。Posnett等(1988)生物化學(xué)雜志2631719-1725；Tam(1989)酶學(xué)方法168:7-15。結(jié)果產(chǎn)生具有結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽與核心高摩爾比率的大分子。對(duì)于ELISA之類的試驗(yàn)，Map是有效的抗原，也可用于多價(jià)呈遞，如用于耐受原方面。Map可合成制備，也可通過購買得到(Quality Controlled Biochemicals,Inc.Hopkinton,MA)。在典型的Map系統(tǒng)中，核心基質(zhì)由三種水平的賴氨酸和用于錨定結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的8個(gè)氨基酸組成。Map可用本領(lǐng)域已知方法合成，例如固相方法，參閱，R.B.Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.85:2149。
應(yīng)當(dāng)理解任何分支結(jié)構(gòu)，如環(huán)糊精均可使用。分支結(jié)構(gòu)可以，但不必很小。在誘發(fā)耐受性時(shí)，平臺(tái)不應(yīng)當(dāng)作為T細(xì)胞不依賴性抗原。
還應(yīng)理解可將某些序列變異引入結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽中，可能保持或增強(qiáng)其反應(yīng)性。因此，本發(fā)明包括對(duì)結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽不顯著影響其特性的修飾，以及具增強(qiáng)活性的變體。這些變體和修飾序列總體上稱為“動(dòng)能相等的變體”與另一結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽相比，它們可能具有相同的、增強(qiáng)的和減少的結(jié)合，被稱為相等的是因?yàn)樗鼈儽３至颂禺惤Y(jié)合β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的能力。多肽的修飾是本領(lǐng)域的常規(guī)試驗(yàn)，在此無需詳述。修飾多肽的例子包括具有保守氨基酸取代、不會(huì)顯著地負(fù)面改變功能活性的一個(gè)和多個(gè)氨基酸缺失或添加的多肽，或包括化學(xué)類似物的使用，包括α-甲基氨基酸取代、非蛋白質(zhì)天然發(fā)生的氨基酸(如刀豆氨酸、DL甲硫氨酸亞砜、鹽酸δ-羥賴氨酸和氨基異丁酸)以及非天然氨基酸。可相互保守取代的氨基酸殘基包括，但不局限于甘氨酸/丙氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；絲氨酸/蘇氨酸；賴氨酸/精氨酸和苯丙氨酸/酪氨酸。這些多肽還包括糖基化和非糖基化多肽，以及具其他翻譯后修飾的多肽，如用不同糖進(jìn)行糖基化、乙?；土姿峄?yōu)選氨基酸取代是保守的，即，取代氨基酸具有與原氨基酸相似的化學(xué)特性。這樣的保守取代是本領(lǐng)域所已知的，例子如上所述。
應(yīng)當(dāng)理解某些氨基酸變異(如取代)可能以或不以相同方式或相同程度影響結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽與β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的結(jié)合。因此，取代氨基酸的特性可影響結(jié)合的方式和/或程度。例如，我們已發(fā)現(xiàn)，用甘氨酸殘基取代第43位的精氨酸(SEQ ID NO:4的第43位氨基酸)會(huì)引起某些病人血清中與抗體結(jié)合活性的喪失，其他的未改變(而另有其它一些會(huì)改變(即干擾)結(jié)合能力)。另一實(shí)施例是，用賴氨酸或蘇氨酸取代第42位的甲硫氨酸看起來不影響結(jié)合(在我們已檢測(cè)的病人中)；不過，若用纈氨酸取代第42位的甲硫氨酸，則似乎在所有病人中結(jié)合均被消除了。
除20種天然氨基酸和它們的同型類似物(homoanalog)和正類似物(noranolog)外，本發(fā)明中還可應(yīng)用數(shù)種其他類型的α-氨基酸。這些其他類型的例子包括d-氨基酸、Nα-烷基氨基酸、α-烷基氨基酸、環(huán)狀氨基酸、嵌合氨基酸和各種各樣的氨基酸。這些非天然氨基酸已被廣泛用于修飾生物活性多肽以增強(qiáng)對(duì)蛋白水解的抗性，且/或賦予構(gòu)象限制以提高生物學(xué)活性。Hruby等(1990)生物化學(xué)雜志268:249-262；Hruby等(1995)分子生物學(xué)方法35:201-240。
最常用的Nα-烷基氨基酸是Nα-甲基氨基酸，如Nα-甲基半胱氨酸(nC)、Nα-甲基甘氨酸(nG)、Nα-甲基亮氨酸(nL)、Nα-甲基賴氨酸(nK)和Nα-甲基纈氨酸(nV)。α-烷基氨基酸的例子包括α-甲基丙氨酸(mA)、α-氨基異丁酸(aiB)、α-甲基脯氨酸(mP)、α-甲基亮氨酸(mL)、α-甲基纈氨酸(mV)、α-甲基-α-氨基丁酸(tv)、二乙基甘氨酸(deG)、二苯基甘氨酸(dpG)和二環(huán)己基甘氨酸(dcG)。Balaram(1992)Pure&Appl.Chem.64:1061-1066；Toniolo等(1993)生物聚合體33:1061-1072；Hinds等(1991)Med.Chem.34:1777-1789。
環(huán)狀氨基酸的例子包括1-氨基-1-環(huán)丙烷羧酸(cG)、1-氨基-1-環(huán)戊烷羧酸(Ac5c)、1-氨基-1-環(huán)己烷羧酸(Ac6c)、aminoindanecarboxylic acid(ind)、四氫異喹啉羧酸(Tic)和2-哌啶羧酸(Pip)。C.Toniolo(1990)Int’l.J.Peptide Protein Res.35:287-300；Burgess等(1995)J.Am.Chem.Soc.117:3808-3819。嵌合氨基酸的例子包括青霉胺(Pe)；半胱氨酸與纈氨酸、4R-和4S-巰基脯氨酸(Mpt)的聯(lián)合體；同型半胱氨酸與脯氨酸和4R-和4S-羥脯氨酸(hyP)的聯(lián)合體；以及同型絲氨酸和脯氨酸的聯(lián)合體。各種各樣α氨基酸的例子包括堿性氨基酸模擬物，如鳥氨酸(Or)、Nε-甲基賴氨酸(mK)、4-吡啶基丙氨酸(pyA)、4-哌啶子基丙氨酸(piA)和4-氨基苯丙氨酸；酸性氨基酸模擬物，如瓜氨酸(Cit)和3-羥基纈氨酸；芳香族氨基酸模擬物，如1-萘基丙氨酸(1-Nal)、2-萘基丙氨酸(2-Nal)、苯基甘氨酸(pG)、3,3-二苯基丙氨酸(dpA)、3-(2-噻酚基)丙氨酸(Thi)和鹵代苯丙氨酸(如2-氟代苯丙氨酸和4-氯代苯丙氨酸)；疏水氨基酸模擬物，如叔丁基甘氨酸(即叔亮氨酸(tL))、2-氨基丁酸(Abu)、環(huán)己基丙氨酸(Cy)、4-四氫吡喃丙氨酸(tpA)、3,3-二環(huán)己基丙氨酸(dcA)和3,4-脫氫脯氨酸。
除α-氨基酸外，諸如β氨基酸之類的其他氨基酸也可用于本發(fā)明中。這些其他氨基酸的例子包括2-氨基苯甲酸(Abz)、β-氨基丙酸(β-Apr)、γ-氨基丁酸(γ-Abu)和6-氨基己酸(ε-Ahx)。諸如4-氯丁酸(By)和3-氯丙酸(Pp)之類的羧酸也已在環(huán)硫醚肽的合成中用作N-末端的第一個(gè)殘基。
其他的修飾方法包括使用本領(lǐng)域已知的偶聯(lián)技術(shù)，包括，但不局限于，酶促方法、氧化取代和螯合。修飾可用于，例如，免疫試驗(yàn)的標(biāo)記附著，如放免試驗(yàn)中放射性部分的附著。用本領(lǐng)域已建立的方法制備修飾的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽，并可用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行篩選，其中一些已描述于此處及實(shí)施例中。
本發(fā)明還包括含一個(gè)或多個(gè)β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽的融合蛋白質(zhì)。從本發(fā)明的目的出發(fā)，β2GPI結(jié)構(gòu)域1融合蛋白質(zhì)含一個(gè)或多個(gè)β2GPI多肽以及在天然分子中不附著的其他氨基酸序列，例如，來自別的區(qū)域的異源序列或同源序列，如β2GPI的另外的結(jié)構(gòu)域。有用的異源序列包括，但不局限于，提供從宿主細(xì)胞中分泌出來、增強(qiáng)免疫反應(yīng)性的序列或便于多肽偶聯(lián)至免疫試驗(yàn)支持物或載體的序列。例如，β2GPI多肽可與便于純化的異源序列融合。這樣的序列例子在本領(lǐng)域中是已知的，包括那些編碼諸如Myc、HA(來自流感病毒血凝素)、His-6或FLAG之類表位的序列。其他便于純化的異源序列來自如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)(MBP)和免疫球蛋白Fc部分之類的蛋白質(zhì)。
結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽可以包含或不包含T細(xì)胞表位。對(duì)于檢測(cè)的目的而言，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽可以包含或不包含T細(xì)胞表位，因?yàn)樵诖硕嚯牡闹饕猛臼菣z測(cè)β2GPI-依賴型抗磷脂抗體，這并不依賴于T細(xì)胞表位的存在。不過，在耐受原有關(guān)方面，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽缺少對(duì)于具β2GPI-依賴型抗磷脂抗體之個(gè)體可檢測(cè)的T細(xì)胞表位。從而，在某些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽不包含(即缺乏)T細(xì)胞表位(因此，含結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的多肽不包含T細(xì)胞表位)。
檢測(cè)T細(xì)胞表位存在的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，可使用檢測(cè)T細(xì)胞增殖的多種試驗(yàn)(如胸苷摻入)。還可通過用本領(lǐng)域眾所周知的方法檢查T細(xì)胞來源淋巴因子的分泌測(cè)定T細(xì)胞表位的存在。盡管應(yīng)當(dāng)理解胸苷摻入的量可能變化(取決于被檢測(cè)的多肽)，但不能誘發(fā)高于背景的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的胸苷摻入(即用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法測(cè)定通常p小于0.05)的多肽通常被認(rèn)為缺乏T細(xì)胞表位。大體上，刺激指數(shù)小于約2-3，更優(yōu)選小于約1表明T細(xì)胞表位缺乏。通過經(jīng)驗(yàn)測(cè)定T細(xì)胞表位的位置和組成。
在耐受原有關(guān)方面，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽優(yōu)選可特異與B細(xì)胞表面上的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體結(jié)合(即，與B細(xì)胞的表面抗體結(jié)合，其中該抗體能特異結(jié)合β2GPI-依賴型抗磷脂表位)。此結(jié)合，尤其是與交聯(lián)一起，被認(rèn)為可激發(fā)B細(xì)胞的無變應(yīng)性。應(yīng)當(dāng)理解，由于從定義上說結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽能特異結(jié)合β2GPI-依賴型抗磷脂抗體，所以預(yù)期任何結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽同樣應(yīng)能夠結(jié)合B細(xì)胞上的表面β2GPI-依賴型抗磷脂抗體。
如下所述(以及上文多聚形式中述及)，在耐受原有關(guān)方面中，通過多聚形式和/或與合適的價(jià)鍵平臺(tái)分子偶聯(lián)，結(jié)構(gòu)域1多肽優(yōu)選以多價(jià)形式呈遞。本發(fā)明的多肽制備可用本領(lǐng)域已知方法制備本發(fā)明的多肽。這些多肽可用重組方法(即單個(gè)或融合多肽)或化學(xué)合成產(chǎn)生。用化學(xué)合成可方便地制備多肽，尤其是多達(dá)約50個(gè)氨基酸的較短多肽?；瘜W(xué)合成的方法是本領(lǐng)域所已知的，并可購買得到。例如，應(yīng)用固相方法通過自動(dòng)多肽合成儀可生產(chǎn)多肽。還可用本領(lǐng)域已知的技術(shù)化學(xué)合成制備多肽。
還可用重組方法通過表達(dá)系統(tǒng)制備多肽。由于編碼多肽之多核苷酸的可得性，所以可構(gòu)建編碼完整(即天然的)多肽、其功能相等片段或重組形式的表達(dá)載體。編碼所需多肽的多核苷酸，不管是融合或成熟形式以及是否包含分泌信號(hào)序列，均可連接入適于任何便利宿主的表達(dá)載體。真核和原核生物系統(tǒng)均可使用。然后從溶解細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離多肽并純化至其目的用途所需的程度。用本領(lǐng)域已知的任何方法均可完成表達(dá)于宿主系統(tǒng)中的多肽的純化或分離。例如，可將編碼完整多肽或其片段的cDNA可操作性地與合適啟動(dòng)子連接，插入表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)染入合適的宿主細(xì)胞。隨后在允許轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并回收所預(yù)期的多肽。還可使用其他控制轉(zhuǎn)錄或翻譯的區(qū)段，如將多肽定向于特異細(xì)胞區(qū)室的信號(hào)序列(即，為了分泌)。原核宿主細(xì)胞的例子是本領(lǐng)域已知的，包括，例如，大腸桿茵和枯草芽孢桿菌。真核宿主細(xì)胞的例子是本領(lǐng)域所已知的，包括酵母、禽類、昆蟲、植物和動(dòng)物細(xì)胞，如COS7、HeLa、CHO和其他的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。酵母系統(tǒng)包括釀酒酵母、粟酒裂殖酵母和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)。
例如，為了在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽(例如，使用菌株SMD1168和SMD1168H)，使用編碼β2GPI的全長cDNA作為PCR的模板，產(chǎn)生在氨基末端具重構(gòu)的Kex2信號(hào)肽切割位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域1基因片段。將片段克隆入用限制酶XhoⅠ和SalⅠ線性化的表達(dá)載體pPICZaipha(Invitrogen Corp.)。所構(gòu)建的基因用酵母α-因子信號(hào)肽置換了天然結(jié)構(gòu)域1信號(hào)肽，并終止于羧基端的所選氨基酸處。
當(dāng)使用表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)β2GPI多肽時(shí)，經(jīng)常優(yōu)選構(gòu)建便于純化的融合蛋白。融合蛋白組分的例子包括，但不局限于，myc、HA、FLAG、His-6、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)或免疫球蛋白的Fc部分。這些方法是本領(lǐng)域所已知的。參閱，例如，Redd等(1997)生物化學(xué)雜志272:11193-11197?？捎帽绢I(lǐng)域已知技術(shù)從融合體中去除不需要的氨基酸，如His-6。例如，羧肽酶A可用于去除羧基末端氨基酸。羧肽酶A終止于脯氨酸或精氨酸。為了便于純化，可使用固相羧肽酶A(Sigma)。
優(yōu)選地，尤其是用于診斷目的時(shí)，多肽至少部分純化或與其他細(xì)胞組分分離。優(yōu)選多肽純度至少達(dá)50％。在此上下文中，純度計(jì)算為制品總蛋白質(zhì)含量的重量百分比。更優(yōu)選蛋白質(zhì)純度達(dá)50-75％。還可獲得更高純度的多肽，并包含于本發(fā)明中。為了臨床使用，多肽優(yōu)選高度純化，至少約80％的純度，無致熱源和其他污染物。蛋白質(zhì)純化的方法是本領(lǐng)域所已知的并詳述于此。
在某些系統(tǒng)，尤其是某些重組系統(tǒng)中，對(duì)于含額外(第五個(gè))半胱氨酸或待還原半胱氨酸(例如，為了將多肽偶聯(lián)至平臺(tái)分子)的實(shí)施方案來說，起始產(chǎn)物可包含低分子量混合二硫鍵，其中第五個(gè)(或額外的反應(yīng)性)半胱氨酸與其他的相對(duì)低分子量部分共價(jià)連接。在這些例子中，額外半胱氨酸的選擇性還原是合乎需要的(同時(shí)保持其它二硫鍵)。用固相支持物如丙烯酰胺(如REDUCTACRYL，CalBiochem,San Diego)上的DTT之類的固相還原劑可完成這樣的選擇性還原。
此外，在設(shè)計(jì)和/或用來生產(chǎn)具額外半胱氨酸(即，半胱氨酸用作反應(yīng)基團(tuán))之結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的系統(tǒng)中，可能期望制備這樣的多肽，其中有附加氨基酸在序列中緊隨額外的半胱氨酸后，以在合成和/或生產(chǎn)中保護(hù)該半胱氨酸。
優(yōu)選地，尤其是若多肽將與平臺(tái)偶聯(lián)時(shí)(下述)，使用化學(xué)合成?；瘜W(xué)合成允許N或C末端的修飾，這方便了與平臺(tái)分子的偶聯(lián)。
當(dāng)生產(chǎn)結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽時(shí)，如生產(chǎn)那些除結(jié)構(gòu)域1的4個(gè)半胱氨酸之外還有附加半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽時(shí)，應(yīng)選擇條件以促進(jìn)正確的二硫橋形成。作為一個(gè)例子，通過溶解于6M鹽酸胍(GnHCl)中變性還原的多肽，使?jié)舛葹?.5mg/ml。通過在室溫和如下復(fù)性緩沖液中(0.1M GnHCl,0.SmM Tris-HCl和1mM EDTA，pH8.5)透析完成折疊。為了幫助正確的二硫橋形成，加入0.3mM和3mM的分別為氧化和還原的谷胱甘肽的混合物。用HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)混合物，質(zhì)譜分析不同的產(chǎn)物。在我們的實(shí)驗(yàn)中，環(huán)化5小時(shí)后，分析級(jí)的HPLC顯示有約65％的轉(zhuǎn)換，其中約50％具有正確的質(zhì)量(Mw=7260)，約15％作為谷胱甘肽加和物出現(xiàn)(Mw=7567)。然后用反相HPLC純化缺乏谷胱甘肽的折疊蛋白質(zhì)。結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的偶聯(lián)本發(fā)明還提供了結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的偶聯(lián)物。在某些實(shí)施方案中，可將結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽與載體或標(biāo)記偶聯(lián)。獲得這樣連接的許多技術(shù)是本領(lǐng)域所已知的，在此無需詳述?？墒褂冒踩易陨聿徽T發(fā)對(duì)宿主有害之抗體產(chǎn)生的任何載體。合適的載體一般是大的、代謝慢的高分子，如蛋白質(zhì)；多糖，如膠乳功能化的sepharose、瓊脂糖、纖維素、纖維素珠等等；多聚氨基酸，如多谷氨酸、多賴氨酸等等；氨基酸共聚物；和失活的病毒顆粒或減毒細(xì)菌，如沙門氏茵。尤其有用的蛋白質(zhì)底物是血清白蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵清蛋白、破傷風(fēng)類毒素和本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的其他蛋白質(zhì)。
標(biāo)記是本領(lǐng)域所已知的，在此無需詳述。有許多不同的標(biāo)記和標(biāo)記方法是本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員所已知的?？捎糜诒景l(fā)明的標(biāo)記類型例子包括酶、放射性同位素、熒光化合物、膠體金屬、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光化合物。本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員知道其他的合適標(biāo)記，或可用常規(guī)實(shí)驗(yàn)法確定合適的標(biāo)記。此外，可用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員通用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使這些標(biāo)記與本領(lǐng)域的多肽結(jié)合。
結(jié)構(gòu)域1β2PI多肽(更優(yōu)選缺乏T細(xì)胞表位)可與非免疫原性價(jià)鍵平臺(tái)分子(也稱“平臺(tái)”)偶聯(lián)，這可增強(qiáng)結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的呈遞。美國專利號(hào)5,162,515；5,276,013；5,552,391。平臺(tái)可以是蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)的(即，有機(jī)的)。蛋白質(zhì)平臺(tái)的例子包括，但不局限于，清蛋白、γ球蛋白、免疫球蛋白(IgG)和卵清蛋白。Borel等(1990)免疫學(xué)方法126:159-168；Dumas等(1995)Arch.Dematol.Res.287:123-128；Borel等(1995)Int.Arch.AllergyImmunol.107:264-267；Borel等(1996)Ann.N.Y.Acad.Sci.778:80-87。最優(yōu)選多價(jià)的平臺(tái)分子(即，包含一個(gè)以上的結(jié)合或連接位點(diǎn))。多價(jià)平臺(tái)優(yōu)選含有至少兩個(gè)連接位點(diǎn)，更優(yōu)選至少3個(gè)，更優(yōu)選至少5個(gè)，更優(yōu)選至少7個(gè)，更優(yōu)選至少10個(gè)，更優(yōu)選至少12個(gè)，更優(yōu)選至少15個(gè)連接位點(diǎn)。不過，應(yīng)當(dāng)理解，在誘發(fā)耐受性有關(guān)方面(即當(dāng)平臺(tái)與合適結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽結(jié)合使用以引起免疫耐受性時(shí))，取決于所用結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的特性和特定的條件，任何數(shù)目的連接位點(diǎn)都可能是足夠的。還應(yīng)當(dāng)理解平臺(tái)不是T細(xì)胞非依賴性抗原。
優(yōu)選的價(jià)鍵平臺(tái)分子是生物學(xué)穩(wěn)定的，即，它們顯示體內(nèi)排泄的半壽期經(jīng)常是數(shù)小時(shí)到數(shù)天到數(shù)月以達(dá)到治療效用，優(yōu)選由合成的組成確定的單鏈組成。它們的分子量通常約為200-200000，優(yōu)選約200-50000(或更少，如30000)。本發(fā)明中的價(jià)鍵平臺(tái)分子例子是多聚體(或由多聚體組成)，如聚乙二醇(PEG)、聚-D-賴氨酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、D-谷氨酸和D-賴氨酸(比率3∶2)。優(yōu)選的多聚體是基于分子量約200-8000的聚乙二醇(PEG)?？膳c結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽偶聯(lián)的其他分子是清蛋白和IgG。
其他適用于本發(fā)明的優(yōu)選價(jià)鍵平臺(tái)分子是化學(xué)確定的非聚合的價(jià)鍵平臺(tái)分子，如公開于共有的美國專利5552391中的那些分子。與前述的更傳統(tǒng)的平臺(tái)相比，這些平臺(tái)具有分子量均一(即均勻)的優(yōu)點(diǎn)(與多分散的分子量相反)，因而是“化學(xué)確定的”。因此，應(yīng)當(dāng)理解使用這些平臺(tái)的偶聯(lián)物群含均一分子量的平臺(tái)或基本上是單分散的(即，具有狹窄的分子量分布)。平臺(tái)分子樣品(如平臺(tái)分子的組合和/或類群)的分子量分布寬度的檢查尺度是樣品的多分散性。多分散性被用作衡量多聚體樣品分子量均一或不均一的尺度。通過用數(shù)字平均分子量(Mn)除重量平均分子量(Mw)來計(jì)算多分散性。對(duì)于完全單分散的多聚體來說，Mw/Mn的值是統(tǒng)一的。用本領(lǐng)域可獲得的方法檢查多分散性(Mw/Mn)，如凝膠滲透層析。平臺(tái)分子樣品的多分散性(Mw/Mn)優(yōu)選小于2，更優(yōu)選小于1.5，或小于1.2，小于1.07，小于1.02，或如約1.05-1.5或約1.05-1.2。典型的多聚體通常具有的多分散性是2-5，或在某些情況下是20或更大。因?yàn)榉肿釉诖笮∩匣揪唬瑑r(jià)鍵平臺(tái)分子低多分散性特性的優(yōu)點(diǎn)包括提高了生物適合性和生物有效度，而由于分子量廣泛變化引起的生物活性變化被最小化。因而多分散性分子以藥物學(xué)上最適的方式配制，且易于分析。此外樣品中分子群體的化合價(jià)受到控制。
適用于本發(fā)明的優(yōu)選均一的化學(xué)確定的價(jià)鍵平臺(tái)分子例子包括衍生的2，2’-乙二胺二氧乙烯(EDDA)和三乙基乙二醇(TEG)。其他優(yōu)選的均勻、化學(xué)確定的平臺(tái)分子例子描述于下文及本領(lǐng)域中。在其他的實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽與清蛋白、IgG和/或PEG偶聯(lián)。
另外的合適價(jià)鍵平臺(tái)分子包括，但不局限于，四氨基苯、七氨基β環(huán)糊精、四氨基季戊四醇、1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四烷(Cyclam)和1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷(Cyclen)。
一般說來，用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)合成技術(shù)制備這些平臺(tái)。PEG必須被衍生化并制備成多價(jià)的，這可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)完成。一些適于偶聯(lián)合成的物質(zhì)，如PEG、清蛋白和IgG可購買得到。
可以許多方式完成結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽與價(jià)鍵平臺(tái)分子的偶聯(lián)，其中一般涉及多肽和價(jià)鍵平臺(tái)分子上一個(gè)或多個(gè)交聯(lián)劑和官能團(tuán)。平臺(tái)和結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽必須具有合適的連接基團(tuán)。用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)合成技術(shù)將連接基團(tuán)加到平臺(tái)上?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)的固相合成技術(shù)或重組技術(shù)將連接基團(tuán)加到結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽上。為了與接頭連接，重組方法中可能需要進(jìn)行翻譯后修飾，這樣的方法是本領(lǐng)域所已知的。
作為例子來說，多肽包含氨基酸側(cè)鏈部分，此部分含用作偶聯(lián)多肽至平臺(tái)之位點(diǎn)的官能團(tuán)，如氨基、羧基或巰基基團(tuán)。若多肽未包含這些基團(tuán)，可將具這樣的官能團(tuán)的殘基加到多肽上?？捎霉滔嗪铣杉夹g(shù)或重組技術(shù)摻入這樣的殘基，兩種方法均是肽合成領(lǐng)域眾所周知的。當(dāng)多肽具有碳水化合物側(cè)鏈時(shí)，可用常規(guī)化學(xué)方法將氨基、巰基和/或醛基官能團(tuán)摻入其中。例如，可在氰基硼氫鈉存在時(shí)通過與乙二胺反應(yīng)摻入伯氨基團(tuán)，通過半胱胺二鹽酸鹽的反應(yīng)并隨后用標(biāo)準(zhǔn)二硫化物還原劑還原可引入巰基，而在過氧化物氧化后可產(chǎn)生醛基。如果價(jià)鍵平臺(tái)分子不具有合適的官能團(tuán)，也可以相似的方式將其衍生化以包含官能團(tuán)。
多肽還可在其C-末端通過稱為逆蛋白水解的過程被位點(diǎn)特異性修飾?；旧?，逆蛋白水解使用了蛋白水解酶以催化酰胺鍵的形成，所用條件是驅(qū)動(dòng)反應(yīng)向此方向的條件。為了在其C-末端通過酰胺鍵與含酰肼接頭(Rose,K等，生物偶聯(lián)化學(xué)1991,2,154-159)或含氨氧基接頭(Rose,K等，生物偶聯(lián)化學(xué)1996,7,552-556)連接，已用逆蛋白水解修飾多肽。這樣的修飾多肽可進(jìn)行反應(yīng)，與包含醛基或酮基的其它感興趣分子形成腙或肟鍵。除其它接頭外，通過逆蛋白水解還可將諸如含巰基接頭之類的物質(zhì)連接。
可變長度的疏水接頭對(duì)連接多肽(或其它生物活性分子)至價(jià)鍵平臺(tái)分子上是有用的。合適的接頭包括乙二醇線性寡聚物或多聚物。這樣的接頭包括符合以下公式的接頭R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2，其中n=0-200,m=1或2,R1=H或如三苯甲基之類的保護(hù)基團(tuán)，R2=H或烷基或芳香基，如4-硝基苯基酯。這些接頭可用于將諸如鹵代乙?；?haloaceyl)、馬來酰胺等之類含巰基反應(yīng)基團(tuán)的分子通過硫醚連接至通過酰胺鍵含氨基的第二個(gè)分子。這些接頭的附著次序是可變的，即硫醚可以先形成或后形成。
如上所述，通過許多方法可將結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽與許多合適的平臺(tái)連接。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用了四溴乙?；脚_(tái)PIZ/IDA/TEG-β2GPI結(jié)構(gòu)域1。其他優(yōu)選的實(shí)施方案見實(shí)施例。
PIZ/IDA/TEG(PITG)平臺(tái)的衍生物可制備如下。
PITG平臺(tái)上的相容性交聯(lián)基團(tuán)例子

偶聯(lián)物

以偶聯(lián)物實(shí)施方案為例，通過固相肽合成或重組方法制備N-末端帶巰基接頭的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽。接頭可以是半胱氨酸或含SH部分。然后通過合適的衍生化平臺(tái)(如溴代乙?；虻獯阴；?可將被修飾的多肽烷化。
在某些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽通過硫氫基團(tuán)(巰基或SH)(例如在半胱氨酸上的)偶聯(lián)，形成偶聯(lián)物中的硫醚鍵。在某些實(shí)施方案中通過包括β2GPI的第五個(gè)半胱氨酸提供此反應(yīng)性半胱氨酸(實(shí)施例5)。
在某些實(shí)施方案中，通過肟鍵合形成偶聯(lián)物?？赏ㄟ^例如，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽上的醛或酮之類羰基與含氨氧基、氨氧基乙?；桶毖趸榛惏毖趸磻?yīng)基團(tuán)的平臺(tái)之間的反應(yīng)形成肟鍵。氨基氧基團(tuán)可以在三甘醇或己基鏈上；不過，只要終止于-ONH2，含碳、氧、氮或硫原子的任何鏈就符合要求。
為了制備這些偶聯(lián)物，選擇性地修飾結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽以在多肽特異位置，如N-末端產(chǎn)生醛或酮部分。其次，將多肽與含氨基氧基團(tuán)的多價(jià)鍵平臺(tái)反應(yīng)形成平臺(tái)與多肽之間的肟鍵。
通過轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)可以將結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的N-末端轉(zhuǎn)變成醛或酮，這是本領(lǐng)域所已知的。一般說來，轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)將N-末端碳-氮單鍵轉(zhuǎn)變成碳氧雙鍵。N-末端的甘氨酸反應(yīng)形成乙醛?；环N醛基。大部分其他氨基酸由于氨基酸側(cè)鏈而反應(yīng)形成酮。
在N-末端產(chǎn)生乙醛?；牧硪环椒ㄊ怯眠^碘酸鈉氧化N-末端的絲氨酸或絲氨酸。此氧化作用切割N-末端絲氨酸或蘇氨酸的羥基和氨基之間的碳-碳鍵，形成乙醛?；鶊F(tuán)。
在某些實(shí)施方案中，為了將選擇性修飾多肽與平臺(tái)連接，可以產(chǎn)生含氨基氧乙?；?AOA)反應(yīng)基團(tuán)的多價(jià)鍵平臺(tái)。通過用N-保護(hù)的氨基氧乙?；鶊F(tuán)?；㈦S后去除保護(hù)基團(tuán)，可方便地將氨基氧乙酰(AOA)基團(tuán)附著于含胺基團(tuán)的多價(jià)鍵平臺(tái)上。不過，乙醛?；嚯呐cAOA衍生平臺(tái)的反應(yīng)過程緩慢，需數(shù)天才形成多肽和平臺(tái)之間的肟鍵。實(shí)施例5描述了偶聯(lián)化合物44的合成，其中包括將轉(zhuǎn)氨基化β2GPI多肽附著于氨基乙?；木燮脚_(tái)上。本發(fā)明包括此偶聯(lián)物。
在其他實(shí)施方案中，可使用含氨基氧烷基反應(yīng)基團(tuán)的平臺(tái)。氨基氧烷基基團(tuán)定義為在第一個(gè)碳位置處的氨基氧基團(tuán)，其中第一個(gè)碳優(yōu)選并不直接附著于電子吸收基團(tuán)上，如作為羰基基團(tuán)一部分的第二個(gè)碳上。我們已觀察到氨基氧烷基基團(tuán)比氨基氧乙?；鶊F(tuán)更易與酮和醛反應(yīng)形成肟。看起來氨基氧乙?；鶊F(tuán)通常比不與羰基鄰接的其他氨基氧基團(tuán)(氨基氧烷基基團(tuán))反應(yīng)性低?？烧J(rèn)為由于電子吸收作用，氨基氧乙?；鶊F(tuán)的羰基引起反應(yīng)性的降低。有關(guān)這些平臺(tái)和偶聯(lián)物的更多信息可見于實(shí)施例和共同擁有的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)____(代理人文檔號(hào)25231-20074000)。通過將轉(zhuǎn)氨基化β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽附著于氨基氧基四聚平臺(tái)上合成實(shí)施例5所述的偶聯(lián)化合物45。本發(fā)明包括此偶聯(lián)物，以及來自以AO為基礎(chǔ)合成的那些β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽肟偶聯(lián)物。本發(fā)明的多核苷酸本發(fā)明還提供了編碼結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的多核苷酸(包括分離的天然存在和非天然存在多核苷酸)。這樣的核苷酸可用于，例如，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的生產(chǎn)。用重組克隆/表達(dá)載體和蛋白質(zhì)純化方法之類的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可完成結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的生產(chǎn)。若在體內(nèi)生產(chǎn)，需用諸如下述之類的合適表達(dá)系統(tǒng)。憑借對(duì)結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的氨基酸序列的了解(用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù)獲得)，可設(shè)計(jì)編碼特異氨基酸序列的多核苷酸。多核苷酸可合成或從基因組或cDNA序列中獲得(在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候)。
本發(fā)明還包括含任何上述多核苷酸的克隆載體和表達(dá)載體。這些載體是本領(lǐng)域眾所周知的(如用于體外的細(xì)菌、哺乳動(dòng)物、酵母和昆蟲表達(dá)體系)，在此無需描述。參閱，例如，Gacesa和Ramji,載體，John Wiley&Sons(1994)。
本發(fā)明還包括含(即用其轉(zhuǎn)化，或包含)任何本文所述多核苷酸和/或載體的宿主細(xì)胞。原核和真核宿主細(xì)胞均可使用。原核宿主包括細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和分枝桿菌。真核宿主有真菌(包括酵母)、昆蟲、鳥類、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。宿主系統(tǒng)是本領(lǐng)域所已知的，在此無需詳述。除此之外，本發(fā)明的宿主細(xì)胞可用作上述多核苷酸的源泉和/或用于結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽多核苷酸和/或多肽生產(chǎn)的載體。它們還可用作結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的體內(nèi)運(yùn)送載體。本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域1β2GPI模擬物本發(fā)明還提供了結(jié)構(gòu)域1β2GPI模擬物(或類似物)，它們可特異結(jié)合結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(包括完整的結(jié)構(gòu)域1)所特異結(jié)合的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體(即，模擬物與結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽共有特異于β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的表位)。另一方面，模擬物模擬了結(jié)構(gòu)域1中的表位(即，在結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽存在時(shí)競(jìng)爭結(jié)合β2GPI-依賴型抗磷脂抗體)。模擬物可以是如上所述的許多化學(xué)物質(zhì)。根據(jù)它們的化學(xué)特性不同，可以用化學(xué)和生化領(lǐng)域(包括生物技術(shù))中的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的模擬物。這些模擬物可用于檢測(cè)中并/或用作耐受原。當(dāng)用作耐受原時(shí)，模擬物缺少可檢測(cè)的T細(xì)胞表位。
用常規(guī)技術(shù)可鑒定本發(fā)明的模擬物。例如，可篩選候選分子以測(cè)定它們是否(a)與β2GPI-依賴型抗磷脂抗體特異結(jié)合和/或(b)缺乏T細(xì)胞表位(即，不能引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答或T細(xì)胞相關(guān)活性)。本領(lǐng)域和本文中已描述了這兩種活性或二者之一的測(cè)定。用本領(lǐng)域已知的噬菌體展示方法(包括微量淘選)可完成候選多肽模擬物的篩選(見實(shí)施例3)。以下是一些這樣的技術(shù)的概述。
為了從表位文庫篩選中鑒定最佳表位，已開發(fā)了不同程度嚴(yán)謹(jǐn)性的種種試驗(yàn)。試驗(yàn)以增加的嚴(yán)謹(jǐn)性列舉如下生物淘選(biopanning)<微量淘選(micropanning)<噬茵體-捕捉ELISA<噬茵體ELISA=茵落印跡=肽ELISA。
“生物淘選”這種技術(shù)是將親和純化的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體和帶隨機(jī)肽插入片段之噬菌體混合，然后抗體特異的回收捕捉結(jié)合的噬茵體。此噬菌體使繁殖于含四環(huán)素培養(yǎng)基中的大腸桿菌具有四環(huán)素抗性，然后將它們分離。多輪生物淘選富集了樣品中免疫特異性噬茵體的數(shù)目。通常在3-5輪篩選之后回收噬茵體，但它們可能只代表對(duì)于篩選抗體以低親和性非特異結(jié)合的序列。需要有進(jìn)一步評(píng)估這些噬茵體(微量淘選)的方法。
微量淘選提供了對(duì)噬茵體與β2GPI-依賴型抗磷脂抗體結(jié)合相對(duì)強(qiáng)度的估計(jì)。在3輪或更多輪生物淘選之后進(jìn)行微量淘選，并使用與生物淘選中所用相同的抗體。此方法包括，從最后一輪生物淘選中稀釋噬菌體，微量淘選分析50個(gè)或更多個(gè)這些克隆。通過培養(yǎng)各克隆至相同密度，然后在事先以恒量抗體包被的微量滴定孔中溫育以最佳單一濃度稀釋的噬茵體，從而完成微篩選。噬茵體的最適單一濃度是最可能體現(xiàn)最寬范圍微量淘選值(0-4+)的濃度，因此對(duì)被檢測(cè)克隆有最大辨別力。這以6個(gè)隨機(jī)挑選克隆的微量淘選表現(xiàn)為基礎(chǔ)，其中測(cè)定了系列稀釋獲得的噬茵體多種濃度下的淘選值。與抗體溫育后，洗去未結(jié)合的噬菌體，而結(jié)合噬茵體的量被用作噬茵體插入片段對(duì)抗體親和性的指示。通過弱酸洗脫，隨后中和及感染大腸桿菌測(cè)定結(jié)合噬菌體的量。通過將大腸桿菌鋪于含四環(huán)素的瓊脂平板上，然后測(cè)定各克隆獲得的茵落密度，對(duì)被感染大腸桿菌的數(shù)目進(jìn)行定量。
開發(fā)噬菌體-捕捉ELISA檢測(cè)以提供中間水平的試驗(yàn)，從而消除微量淘選的相對(duì)低嚴(yán)謹(jǐn)性和噬茵體或肽ELISA試驗(yàn)的高嚴(yán)謹(jǐn)性之間的差距。初步研究顯示，一些抗體制品通過微量淘選得到太多的陽性克隆，但通過噬菌體-ELISA或肽-ELISA則一個(gè)也得不到。描述如下的噬茵體-ELISA的局限性是，各噬茵體上只有5拷貝p-Ⅲ，即使有許多包被于孔上的噬茵體，也只有很少拷貝的插入片段，因而檢測(cè)需要抗體對(duì)插入片段具極高親和性。用噬菌體-捕捉ELISA方法，可擴(kuò)增信號(hào)多次，這促進(jìn)了對(duì)抗體和插入片段之間較低親和性、穩(wěn)定相互作用的檢測(cè)。
噬菌體-捕捉ELISA包括如下步驟。用β2GPI-依賴型抗磷脂抗體包被微量滴定孔并如微量淘選試驗(yàn)中添加噬茵體克隆。洗去未結(jié)合噬茵體，用結(jié)合噬茵體的酶偶聯(lián)羊抗血清對(duì)結(jié)合噬茵體的量進(jìn)行定量。將噬菌體捕捉ELISA篩選的噬茵體與許多aPL抗體反應(yīng)，在隨后ELISA試驗(yàn)中可提供強(qiáng)信號(hào)。此中間水平的靈敏性可使得肽合成效率更高，因?yàn)楹苌僖恍┪⒘刻赃x陽性噬茵體是噬茵體捕捉ELISA陽性的。結(jié)果是，合成自陽性噬茵體-捕捉ELISA噬茵體的肽通常具免疫反應(yīng)性。
篩選的噬茵體-ELISA方法需要插入片段與篩選抗體非常緊密地結(jié)合。噬茵體直接包被至微量滴定板的孔上，并與篩選抗體一起溫育。洗滌去除未結(jié)合抗體后，添加抗人IgG堿性磷酸酶偶聯(lián)物以結(jié)合與噬菌體結(jié)合的任何β2GPI-依賴型抗磷脂抗體。然后按本領(lǐng)域眾所周知的方法，通過添加顯色底物至孔中(其將與堿性磷酸酶反應(yīng))檢測(cè)β2GPI-依賴型抗磷脂抗體。
菌落印跡試驗(yàn)可用于被生物淘選之噬茵體感染的大腸桿菌的大規(guī)模菌落篩選。對(duì)于鑒定免疫反應(yīng)性克隆來說，此方法是噬茵體-ELISA之外的又一選擇，顯示了可比水平的靈敏度，且檢測(cè)前無需培養(yǎng)各噬菌體克隆。在此試驗(yàn)中，將被一輪生物淘選得到的噬茵體感染的大腸桿菌鋪于大直徑硝酸纖維素(NC)膜上，并在含四環(huán)素的瓊脂平板表面培養(yǎng)過夜。Barbas等(1991)美國國家科學(xué)院院報(bào)88:7978-7982。各茵落產(chǎn)生自含相同序列之噬菌體的感染。用此NC“主膜(master)”制備NC上的數(shù)次復(fù)制轉(zhuǎn)移印跡并培養(yǎng)于瓊脂平板表面?；瘜W(xué)和酶促裂解印跡上的噬茵體感染茵落后，可用蛋白質(zhì)印跡中常用的技術(shù)，即染色或免疫印跡探測(cè)噬菌體?？蓪⒁逊忾]的印跡與篩選aPL抗體溫育。洗滌去除未結(jié)合抗體后，添加抗人IgG辣根過氧化物酶偶聯(lián)物，以結(jié)合與噬菌體結(jié)合之任何β2GPI-依賴型抗磷脂抗體。顯色底物的添加可定位主平板上代表免疫特異性噬茵體的離散菌落，可將其克隆用于進(jìn)一步研究。
DNA測(cè)序測(cè)定上述試驗(yàn)中最佳反應(yīng)噬茵體的肽插入片段序列后，用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)Fmoc肽化學(xué)方法制備相應(yīng)的肽。對(duì)于肽-ELISA試驗(yàn)來說，肽可以制備成例如分支四價(jià)分子，即各分子具有四拷貝插入片段。這樣的分子可包被微量滴定板孔，同時(shí)還具有暴露于溶液中的表位，可被抗體結(jié)合。如上所述，與Map所用方法相似，通過在頭兩個(gè)偶聯(lián)模擬物處摻入賴氨酸作為分支點(diǎn)，合成四價(jià)肽。Posnett等(1988)。在各臂上的賴氨酸之后添加由甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-絲氨酸組成的間隔子，然后加入插入片段，包括噬茵體中的框架氨基酸，羧基端的脯氨酸-甘氨酸和氨基端的丙氨酸-甘氨酸-脯氨酸。用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方法將此合成中的所有氨基酸逐個(gè)添加上去。
用ELISA檢驗(yàn)這些肽，ELISA的進(jìn)行是通過包被肽于微量滴定板孔上，然后以標(biāo)準(zhǔn)ELISA模式檢測(cè)它們與aPL抗體的反應(yīng)性。實(shí)踐中，肽通常與原篩選抗體極強(qiáng)結(jié)合，并顯示與其他β2GPI-依賴型抗磷脂抗體有部分交叉反應(yīng)性。同時(shí)包括非β2GPI-依賴型抗磷脂抗體對(duì)照以消除非特異結(jié)合肽。
肽競(jìng)爭結(jié)合ELISA測(cè)定了兩肽是否結(jié)合給定試驗(yàn)者血清中的相同抗體群，并對(duì)與β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的相對(duì)結(jié)合親和性進(jìn)行定量。在此試驗(yàn)中，多種單聚肽與包被于微量滴定板孔上的四價(jià)肽競(jìng)爭。為了進(jìn)行此試驗(yàn)，用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc化學(xué)方法將待評(píng)估的肽合成為單體，即，無四價(jià)肽合成中所用的賴氨酸分支。然后純化單體肽并以已知濃度溶解。用已知結(jié)合β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的四價(jià)肽包被微量滴定板的孔。將系列稀釋的單體肽與恒定稀釋度的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體一起溫育。通過測(cè)定四價(jià)肽抗該抗體的效價(jià)并選擇滴定曲線下降段上的稀釋度事先測(cè)定β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的稀釋液。將抗體與單體肽溫育1小時(shí)后，添加抗體/肽溶液至微量滴定板孔中并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的顯色ELISA。將獲自各孔的比色讀數(shù)繪制成圖，測(cè)定降低β2GPI-依賴型抗磷脂抗體與四價(jià)肽之結(jié)合的各單體肽的濃度。50％抑制的點(diǎn)被用作對(duì)單體肽結(jié)合相對(duì)強(qiáng)度的衡量。
此試驗(yàn)的一種變化形式是使用以β2GPI/心磷脂取代四價(jià)肽包被微量滴定板，并檢測(cè)單體肽阻斷β2GPI-依賴型抗磷脂抗體與β2GPI/CL上的表位結(jié)合的能力。在此試驗(yàn)中，將最適濃度的無IgG人血清用作β2GPI的來源。將數(shù)種濃度的單體肽與最適濃度的β2GPI-抗磷脂抗體以與用四價(jià)肽作平板底物的試驗(yàn)類似的方式溫育。溫育(β2GPI/CL)平板中的β2GPI-依賴型抗磷脂/肽后，如同四價(jià)試驗(yàn)中一樣在最大吸收的一半處測(cè)定抗體的結(jié)合和50％抑制所需的肽濃度。
此試驗(yàn)的另一種變化形式是檢驗(yàn)單體肽阻斷β2GPI-依賴型抗磷脂抗體與直接包被于Nunc Maxisorp微量滴定板孔中之β2GPI結(jié)合的能力。在這種變化形式中，不用心磷脂，所用稀釋劑和封閉劑是脫脂奶而非魚明膠。
此試驗(yàn)的另一種改變形式是檢測(cè)多價(jià)結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽偶聯(lián)物耐受原分子或結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽單體阻斷血清或血漿中β2GPI-依賴型抗磷脂抗體與直接包被于Nunc Maxisorp微量滴定板孔中的β2GPI的結(jié)合的能力。試驗(yàn)中不用心磷脂。在封閉和稀釋溶液中均使用了脫脂牛奶加去污劑吐溫-80。
誘導(dǎo)耐受性的理想表位應(yīng)與β2GPI依賴型抗磷脂抗體一樣具有盡可能強(qiáng)的相互作用，但應(yīng)不包含任何不必要的殘基。為了推斷表位的最小組成，制備具如下特點(diǎn)的各肽模擬物(ⅰ)缺少給定殘基，例如，缺失羧基和/或氨基端的框架殘基，或(ⅱ)其中已進(jìn)行了氨基酸取代，從而與表位文庫篩選中所發(fā)現(xiàn)的序列不同。這些氨基酸取代可以是天然的，例如用異亮氨酸取代亮氨酸，或非天然的，例如用α甲基脯氨酸取代脯氨酸。然后通過肽競(jìng)爭ELISA檢查這些缺失和/或取代的影響。
本發(fā)明還包括模擬物的偶聯(lián)體、含模擬物的組合物、含模擬物的試劑盒和編碼任何多肽模擬物的多核苷酸。上文已描述了如何制備和使用這些實(shí)施方案，所提出的原理和技術(shù)同樣適用于模擬物。本發(fā)明的組合物本發(fā)明進(jìn)一步提供了含結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(包括上述所有多肽實(shí)施方案，如融合體、多聚多肽和偶聯(lián)物)的組合物，以及含編碼結(jié)構(gòu)域1β2GPI之多核苷酸的組合物和含模擬物的組合物。這些組合物對(duì)可受益于耐受性誘導(dǎo)的個(gè)體施用時(shí)尤其有用。此組合物還可用作檢測(cè)系統(tǒng)的試劑。
一般說來，用于誘發(fā)耐受性的本發(fā)明組合物包含有效量的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(或模擬物)，優(yōu)選包含在藥用可接受的賦形劑中，并可以多種配方配制。正如本領(lǐng)域眾所周知的，藥用可接受的賦形劑是相對(duì)惰性的物質(zhì)，它方便了藥理學(xué)有效物質(zhì)的施用。例如，賦形劑可使藥品保持形狀或稠度，或用作稀釋劑。合適的賦形劑包括，但不局限于，穩(wěn)定劑、潤濕劑和乳化劑、用于改變滲透性的鹽、膠囊化試劑、緩沖液和皮膚滲透增強(qiáng)劑。在《Remington的藥物科學(xué)》(第19版，Mack出版社(1995))一書中提出了賦形劑以及用于腸胃外和非腸胃外藥物運(yùn)送的配方。
一般說來，將這些組合物配制成注射服用形式(如，腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)注射，等等)。因此，這些組合物優(yōu)選與藥用可接受載體，如鹽、Ringer溶液、葡萄糖溶液等聯(lián)合使用。大體上，從溶解度和滲透性等的實(shí)際經(jīng)驗(yàn)考慮出發(fā)，偶聯(lián)物通常占配方重量的約0.01％-10％。具體的給藥方式，即劑量、時(shí)間和重復(fù)度，將取決于具體個(gè)體和個(gè)體的病史。大體上，每周服用劑量約為1μg-100mg偶聯(lián)物/kg體重，優(yōu)選約100μg-10mg/kg體重。對(duì)于諸如半壽期之類的問題，從經(jīng)驗(yàn)考慮通常將對(duì)劑量的確定有參考價(jià)值。其他合適的劑量安排可以頻繁如每天一劑或每周3劑，或每周一劑，或每2-4周一劑，或每個(gè)月一劑或更低頻率的安排，這取決于個(gè)體和疾病狀態(tài)?？赡芤蠓磸?fù)用藥，通常按B細(xì)胞轉(zhuǎn)換率定時(shí)，以獲得和/或維持體液無反應(yīng)性狀態(tài)。如果檢測(cè)到抗體GPL值增加，這樣的反復(fù)用藥通常包括每30-60天或更快用藥約1μg-10mg/kg體重或更高?；蛘?，對(duì)于某些病理狀況可能要求組合物的緩釋。用于達(dá)到緩釋的種種配方和裝置是本領(lǐng)域所已知的。
其他的配方包括本領(lǐng)域已知的合適運(yùn)送形式，包括，但不局限于，諸如脂質(zhì)體之類的載體。Mahato等(1997)藥學(xué)研究14:853-859。脂質(zhì)體制品包括，但不局限于，細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑、多層脂質(zhì)體和單層脂質(zhì)體。
在一些實(shí)施方案中，組合物中可存在一種以上的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(或模擬物)。這樣的組合物可包含至少一種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種不同的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽。正如本領(lǐng)域經(jīng)常所說的，這樣的“雞尾酒”尤其可用于治療較寬范圍的個(gè)體群。它們也可能比只使用一種(或較雞尾酒中所含的種類少)結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽更有效。
組合物可單獨(dú)施用或與用于增強(qiáng)和/或補(bǔ)充結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽成效的其他形式藥劑結(jié)合使用，包括，但不局限于，抗輔助T細(xì)胞療法。這樣的治療通常應(yīng)用諸如類固醇或環(huán)孢素之類抑制T細(xì)胞的藥劑。
用本領(lǐng)域已知的臨床參數(shù)可識(shí)別適合接受這樣的組合物的個(gè)體，如β2GPI-依賴型抗磷脂抗體GPL值的測(cè)定、與疾病狀態(tài)尤其相關(guān)的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體存在的測(cè)定和/或β2GPI-依賴型抗磷脂相關(guān)病理狀態(tài)的癥狀。優(yōu)選個(gè)體是人。至于β2GPI-依賴型抗磷脂抗體，GPL值至少約為10，優(yōu)選約為20，更優(yōu)選約為40可能表示需要施用任何這些組合物。此值基于目前可購買到的試劑盒，即固相β2GPI-依賴型抗磷脂抗體ELISA(如，Inova(San Diego)；Theratest(Chicago)；APL Diagnostics(Louisville))。指示需要施用這些組合物的還有具任何β2GPI-依賴型抗磷脂抗體相關(guān)失調(diào)(即，疾病)家族史的那些個(gè)體，或被認(rèn)為具有“正?！盙PL值但在一段時(shí)間內(nèi)顯示GPL值增加的那些個(gè)體。
大體上，通過檢查上述臨床參數(shù)中的任何變化，尤其是β2GPI-依賴型抗磷脂GPL值的變化，判斷施用任何這些組合物的功效。不過，對(duì)于認(rèn)為或已顯示與待治療狀況相關(guān)的任何參數(shù)的檢查都是合適的。
至于可用作試劑(如在檢測(cè)試驗(yàn)中)的那些組合物，這些組合物通常包含足以完成檢測(cè)的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(即，一或多種多肽)的量。這些量可憑經(jīng)驗(yàn)方便地確定。這些組合物可進(jìn)一步包含諸如緩沖液之類的物質(zhì)以完成檢測(cè)。這些組合物還可任選地與檢測(cè)基質(zhì)復(fù)合，如固相(如，在免疫親和柱中)。含結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的試劑盒本發(fā)明還提供了含(即包含)一或多種結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(或一或多種結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽模擬物)和任選的作為標(biāo)準(zhǔn)之結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽抗體的試劑盒，優(yōu)選用于檢測(cè)β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的診斷試劑盒。診斷實(shí)驗(yàn)室、實(shí)踐性實(shí)驗(yàn)室、開業(yè)者或個(gè)人可完成使用本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的診斷和監(jiān)測(cè)方法。本發(fā)明涉及的試劑盒包括能夠用來完成對(duì)抗結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽抗體的存在進(jìn)行的試驗(yàn)的那些試劑盒，如本文所述的任一種試劑盒，從而檢測(cè)和/或定量那些抗體。本發(fā)明所涉及的試劑盒還包括，例如可用于檢測(cè)體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中抗結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的抗體的試劑盒。因此，本發(fā)明包括用于檢測(cè)和/或定量生物學(xué)樣品中的抗結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽抗體，優(yōu)選β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的含結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒被恰當(dāng)?shù)匕b，并可任選地提供對(duì)此方法有用的附加組分。這些任選組分包括，但不局限于，緩沖液、捕捉劑、現(xiàn)象劑(developing reagent)、標(biāo)記、反應(yīng)表面、檢測(cè)裝置、對(duì)照樣品、說明書和解釋性信息。
在檢測(cè)人β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的存在時(shí)，可應(yīng)用檢測(cè)抗體結(jié)合的合適方式(試劑盒中提供)，諸如標(biāo)記的抗人抗體，其中的標(biāo)記可以是酶、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光材料、放射性同位素、輔酶。一般說來，所用的標(biāo)記是酶。
除檢測(cè)β2GPI-依賴型抗磷脂抗體之外，β2GPI多肽(或一或多種結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽模擬物)可以是檢測(cè)凝血之試劑盒的組分。這樣的試劑盒能檢測(cè)β2GPI-依賴型抗磷脂抗體在介導(dǎo)血栓形成途徑中的作用(如果有的話)。例如，β2GPI-依賴型抗磷脂抗體可延遲活化的蛋白質(zhì)C對(duì)活化的因子Va的失活作用或可激活組織因子凝血途徑。如實(shí)施例11所述，我們已發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)域1特異性抗β2GPI抗體延緩了因子Va的失活。結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(和/或模擬物)可用于區(qū)別β2GPI-依賴型抗磷脂抗體介導(dǎo)的作用和影響因子Va失活或組織因子途徑活化的其他機(jī)制。此外，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(和/或模擬物)可用于其他的功能性凝血(如血栓形成)試驗(yàn)中，其中來自個(gè)體的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體或血清或血漿可影響特異性凝血試驗(yàn)的結(jié)果。例如，若結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(和/或模擬物)的存在改變了凝血試驗(yàn)的結(jié)果(與缺少結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(和/或模擬物)時(shí)此試驗(yàn)的結(jié)果比較)，則凝固途徑中牽涉β2GPI-依賴型抗磷脂抗體。此信息在評(píng)估潛在特異療法中尤其有用。使用結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(和結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽模擬物)的方法本發(fā)明還提供了利用結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(和/或結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽模擬物)的方法，它們可應(yīng)用于檢測(cè)和/或治療中。因此，本發(fā)明包括利用本發(fā)明的β2GPI多肽(和/或本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽模擬物)檢測(cè)生物學(xué)樣品中合適靶目標(biāo)的方法。利用多肽進(jìn)行診斷(即檢測(cè))試驗(yàn)的方法是本領(lǐng)域所廣泛已知的，對(duì)于普通技術(shù)人員來說是常規(guī)的。通常，為了完成本發(fā)明的診斷(即，檢測(cè))，可提供本發(fā)明的多肽或模擬物之一(通常是組合物)作為檢測(cè)生物樣品中與其反應(yīng)的靶目標(biāo)的試劑。從診斷參數(shù)待檢查的個(gè)體中獲取合適的生物學(xué)樣品，由此提供靶分子。如果需要，在進(jìn)行試驗(yàn)前可將靶分子自樣品中部分純化或擴(kuò)增。本發(fā)明還提供了利用本發(fā)明多肽或模擬物純化β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的方法。本發(fā)明還提供了利用本發(fā)明的多肽、多核苷酸和/或模擬物誘發(fā)耐受性的方法。β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的檢測(cè)在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測(cè)生物學(xué)樣品中可特異結(jié)合結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽抗體，優(yōu)選β2GPI依賴型抗磷脂抗體的方法。這些方法通?？蓱?yīng)用于臨床中，例如，用于診斷和/或監(jiān)測(cè)個(gè)體中β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的水平。這些方法包括在適于抗結(jié)構(gòu)域1β2GPI特異抗體(如β2GPI-依賴型抗磷脂抗體)與結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽之間穩(wěn)定復(fù)合物形成的條件下使樣品中的(β2GPI-依賴型抗磷脂)抗體與結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(即，本發(fā)明的任何多肽)接觸，并檢測(cè)所形成的穩(wěn)定復(fù)合物(如果有的話)。因?yàn)槟壳吧袩o用于這些抗體的普遍方便或合適的試驗(yàn)，本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽使得這些方法尤其有用。許多免疫試驗(yàn)方法是本利用所已知的，在此無需詳述。待檢查β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的合適樣品是生物學(xué)樣品，包括血清或血漿(優(yōu)選血清)和靶組織洗脫物。應(yīng)當(dāng)理解，所形成復(fù)合物的檢測(cè)可以是直接的(如檢查復(fù)合物相關(guān)標(biāo)記的量)或間接的(如檢查試驗(yàn)中所置換的標(biāo)記配體的量)。
為了將本發(fā)明的多肽或模擬物用于個(gè)體中所說抗體的檢測(cè)，可進(jìn)行免疫試驗(yàn)。多肽或模擬物以試劑形式提供，抗體是生物學(xué)樣品中的靶分子。例如，可用固相蛋白A捕捉存在于血清樣品中的人IgG抗體分子，然后用標(biāo)記的多肽試劑覆蓋?？贵w量應(yīng)與固相上附著的標(biāo)記成比例?；蛘?，可首先用含抗體的檢測(cè)樣品覆蓋表達(dá)多肽的細(xì)胞或組織部分，然后用如標(biāo)記的抗免疫球蛋白之類的檢測(cè)試劑覆蓋?？贵w量應(yīng)與固相上附著的標(biāo)記成比例。然后將樣品中所檢測(cè)的抗體量與對(duì)照樣品中檢測(cè)的量進(jìn)行比較。
在本發(fā)明方法中，通常通過已知技術(shù)將結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽或模擬物固定到合適的固相上，如親和柱填充材料或塑料表面如微滴板或測(cè)桿(dipstick)。合適的親和柱填充材料包括例如瓊脂珠基質(zhì)、聚丙烯酰胺、玻璃、纖維素或交聯(lián)葡聚糖。合適的塑料表面包括聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚對(duì)苯二甲酸酯、乙二醇、聚酯、聚丙烯等。通常，任何標(biāo)準(zhǔn)的微滴板均可使用?；蛘?，固相可以是其中摻入了結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽或模擬物的凝膠或基質(zhì)形式。
為進(jìn)一步說明，可以將可能含有可與結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽之抗體(如β2GPI-依賴型抗磷脂抗體)的檢測(cè)樣品與通常被可檢測(cè)標(biāo)記(如用放射性同位素或酶)的預(yù)定的非限量結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽混合。在液相試驗(yàn)中，用諸如過濾或?qū)游鲋惙蛛x技術(shù)去除未反應(yīng)的試劑。在這些免疫試驗(yàn)技術(shù)中，復(fù)合物相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記量與樣品中的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體量正相關(guān)?？稍O(shè)計(jì)相似的試驗(yàn)，其中檢測(cè)樣品中的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體與被標(biāo)記抗體競(jìng)爭性地結(jié)合有限量的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽。在此，標(biāo)記的量與樣品中的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體量負(fù)相關(guān)。
在一些實(shí)施方案中，生物學(xué)樣品是組織樣品或組織洗脫物，并通過例如競(jìng)爭性結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)與組織樣品相關(guān)聯(lián)的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的量。這些方法可能在應(yīng)檢測(cè)和/或監(jiān)測(cè)特殊組織中β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的存在情況和/或含量時(shí)尤其有用。此類試驗(yàn)可指示，例如，是否顯示有特殊疾病(或疾病的風(fēng)險(xiǎn))(如血栓形成或凝固紊亂的具體形式)。為了診斷和/或監(jiān)測(cè)的目的，這樣的試驗(yàn)還可用于對(duì)β2GPI-依賴型抗磷脂抗體更精確和靈敏的定位測(cè)定。此外，關(guān)于β2GPI-依賴型抗磷脂的定位信息還可為臨床醫(yī)生提供合適治療選擇方案的指示。
應(yīng)當(dāng)理解這些檢測(cè)方法可應(yīng)用于多種臨床狀況中。例如，檢測(cè)法可用于鑒定顯示有發(fā)展性β2GPI-依賴型抗磷脂相關(guān)狀況或紊亂危險(xiǎn)的個(gè)體(可能是因能區(qū)別病理相關(guān)抗體和非病理相關(guān)抗體所引起的)。檢測(cè)還可用于監(jiān)測(cè)治療過程(如施用任何上述組合物)。檢測(cè)還可幫助從非病原抗體中識(shí)別病原抗體。檢測(cè)還可幫助臨床醫(yī)生決定最佳治療方法和/或預(yù)測(cè)。
如上所述，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(和/或模擬物)還可用作凝血試驗(yàn)中的診斷組分，特別是在β2GPI-依賴型抗磷脂抗體能改變特異凝血試驗(yàn)結(jié)果的試驗(yàn)中。例如，如果結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(和/或模擬物)的存在可改變凝血試驗(yàn)的結(jié)果(與缺乏結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(和/或模擬物)時(shí)此試驗(yàn)的結(jié)果相比)，則此凝固途徑中牽涉β2GPI-依賴型抗磷脂抗體。因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(和/或模擬物)可用于區(qū)別β2GPI-依賴型抗磷脂抗體介導(dǎo)的作用與凝血的其他機(jī)制(如血栓形成)，本發(fā)明包括檢測(cè)凝血(如血栓形成)中β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的參與(介導(dǎo))的方法，包括(a)利用來自個(gè)體的合適生物學(xué)樣品和結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(和/或模擬物)進(jìn)行凝血試驗(yàn)；(b)用來自個(gè)體的合適生物學(xué)樣品進(jìn)行凝血試驗(yàn)，但不使用結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(和/或模擬物)；(c)比較(a)和(b)的結(jié)果，其中結(jié)果的不同表明β2GPI-依賴型抗磷脂抗體參與凝血反應(yīng)。這些方法還可用于根據(jù)β2GPI-依賴型抗磷脂抗體在凝血中的介導(dǎo)作用監(jiān)測(cè)病人的狀態(tài)，以及進(jìn)行最初的檢測(cè)。這些方法還可用于指示或檢測(cè)β2GPI-依賴型抗磷脂抗體涉及(即，介導(dǎo))的凝血異常。
對(duì)于這些方法來說，血漿或血清均可使用。或者使用通過本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法分離的IgG級(jí)分。實(shí)施例11中提供了凝血檢測(cè)系統(tǒng)的例子。在一些實(shí)施方案中，通常通過測(cè)定凝固時(shí)間確定活化因子V(Va)的水平。檢測(cè)凝血的試驗(yàn)、裝置和試劑盒是本領(lǐng)域所已知的，并可購買得到。β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的純化本發(fā)明還包括純化可與結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽特異結(jié)合之抗體(如β2GPI-依賴型抗磷脂抗體)的方法，包括使含β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的生物學(xué)樣品與結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽或其模擬物在能形成穩(wěn)定抗原-抗體復(fù)合物的條件下接觸，收獲形成的復(fù)合物(如果有的話)。通常，將結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽或模擬物偶聯(lián)至親和基質(zhì)以便用親和柱純化。這樣的方法是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，在此無需詳述。實(shí)施例1還描述了β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的親和純化。誘發(fā)耐受性的方法本發(fā)明還包括誘發(fā)耐受性(即耐受原狀態(tài))的方法，包括將有效量的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(或含結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的多肽)或其模擬物施用于個(gè)體上，它們均缺少可檢測(cè)的T細(xì)胞表位。如上所述，優(yōu)選地，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(或含結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的任何多肽)或模擬物還與適當(dāng)?shù)钠脚_(tái)分子偶聯(lián)。為了本發(fā)明的目的，應(yīng)當(dāng)理解，通過誘發(fā)耐受性減少和/或消除、穩(wěn)定免疫應(yīng)答和/或降低免疫應(yīng)答增加速率是對(duì)β2GPI的免疫應(yīng)答。因此，誘發(fā)的耐受性是抗原特異的，其中的抗原是β2GPI，在已確定具有(至少在施用本發(fā)明多肽和/或模擬物之前)β2GPI依賴型抗磷脂抗體的個(gè)體中產(chǎn)生了耐受性。
本發(fā)明的適當(dāng)多肽(即，缺乏T細(xì)胞表位的含結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽或模擬物)可單獨(dú)使用或與可提高所需活性/目標(biāo)的其他物質(zhì)結(jié)合使用。如上所述，種種多肽也可相互結(jié)合使用。種種配方和服用方法已論述于上文中。
用本領(lǐng)域已知的方法可完成對(duì)于是否已誘發(fā)耐受性的測(cè)定。大體上，通過檢測(cè)針對(duì)結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的免疫應(yīng)答測(cè)定耐受性。用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)法可測(cè)量針對(duì)結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的免疫應(yīng)答，包括例如測(cè)量與結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽或模擬物結(jié)合的抗體水平；測(cè)量用結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽免疫后細(xì)胞因子的產(chǎn)生；在施用本發(fā)明的β2GPI多肽或模擬物之后用來自接受此用藥的個(gè)體(即，具β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的個(gè)體)的T細(xì)胞體外分析對(duì)于結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的T細(xì)胞應(yīng)答，包括，例如，標(biāo)準(zhǔn)的3H-胸苷攝入測(cè)定，用于測(cè)量在抗原呈遞細(xì)胞情況下呈遞結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽時(shí)的T細(xì)胞增殖；標(biāo)準(zhǔn)的51Cr釋放測(cè)定，用于測(cè)量細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)呈遞結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的細(xì)胞的殺滅作用，等等。
以下實(shí)施例用于說明，但并未限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1:β2GPI的結(jié)構(gòu)域1與β2GPI-依賴型抗磷脂抗體具免疫反應(yīng)性材料和方法結(jié)構(gòu)域缺失突變體的構(gòu)建β2GPI由5個(gè)“sushi”結(jié)構(gòu)域組成。為了確定β2GPI的抗原性區(qū)域，我們選擇性地從β2GPI中去除一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域。Igarashi等應(yīng)用了此方法((1996)血液87:3262-3270)，他們制備了人β2GPI的多個(gè)缺失體，各缺失體各包含結(jié)構(gòu)域4和5、結(jié)構(gòu)域3-5、結(jié)構(gòu)域2-5、結(jié)構(gòu)域1-4和結(jié)構(gòu)域1-3。除Igarashi等人所述的結(jié)構(gòu)域缺失突變體外，我們還構(gòu)建了只含結(jié)構(gòu)域1和2的人β2GPI突變體。
這些缺失突變體構(gòu)建的起始點(diǎn)是克隆入pBacPAK9(Clontech)的人β2GPI全長cDNA(Steinkasserer等(1991)Biochem.J.277:387-391)，由S.Krilis惠贈(zèng)。第一步是在C-末端引入GlyHis6。在這個(gè)過程中，通過將C-末端的半胱氨酸密碼子從TGC改變成TGT，隨后是甘氨酸(GGC)和組氨酸(CAC)，建立了唯一的Msc1限制性位點(diǎn)(TGGCCA)。His6標(biāo)記的目的是方便用Ni螯合層析純化突變蛋白質(zhì)。
用單鏈DNA定點(diǎn)誘變引入GlyHis6。所用方法與Kunkel等人，酶學(xué)方法(1987)154:367-382中公開的方法一樣。在用輔助噬茵體M13K07感染包含插入了人β2GPI cDNA之噬茵粒pBacPAK9的細(xì)胞時(shí)，從生長培養(yǎng)基中收集的噬茵體顆粒大量含有單鏈DNA形式pBacPAK9。此外，如果所應(yīng)用的細(xì)胞是諸如CJ236之類的dut1、ung1基因型細(xì)胞，就用尿苷置換DNA中的一些胸苷。用酚抽提從噬茵體中純化單鏈DNA，酒精沉淀。
與C-末端半胱氨酸一側(cè)區(qū)域互補(bǔ)并編碼GlyHis6的寡核苷酸ApoH-G6H具有序列5’AAACCACCTTAATGGTGATGGTGATGGTGGCCACATGGCTTTACA3’(SEQ ID NO:13)，將它與已生長于大腸桿菌CJ236中、含人β2GPI基因的pBacPAK9單鏈DNA退火。用Kunkel的方法延長互補(bǔ)寡核苷酸，產(chǎn)生雙鏈DNA。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌K91.菌株K91不含dut1、ung1基因型，其結(jié)果是含尿苷的DNA將被降解。應(yīng)富集編碼GlyHis6的新合成鏈。用T7測(cè)序酶試劑盒或耐熱測(cè)序酶試劑盒(Amersham Life Sciences)通過DNA測(cè)序分析克隆。
按上述方式利用以下寡核苷酸產(chǎn)生人β2GPI的結(jié)構(gòu)域缺失突變體B2del3-605’GAC ATA CTC TGG GTG TCC GTC CTG CAA TAG C 3’(SEQ ID NO:14)B2del3-1205’TGG AGG GCA GAT GAT CCG TCC TGC AAT AGC 3’ (SEQ ID NO:15)B2del3-1825’GAA TGG GCA TTF TAC TTC CCG TCC TGC AAT AGC 3’(SEQ ID NO:16)B2del3-2425’AGG TAA TTT ACA AGA TGC CCG TCC TGC AAT AGC 3’SEQ ID NO:17)B2del242-3265’ATG GTG ATG GTG GCC ACA ACT TGG CAT GGC 3’(SEQ ID NO:18)B2del 182-3265’ATG GTG ATG GTG GCC GCA TTC TGG TAA TTT AG 3’(SEQ ID NO:I9)寡核苷酸中的數(shù)字指人β2GPI的氨基酸。例如，B2del3-60指第3-60位氨基酸從β2GPI中缺失。產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包含結(jié)構(gòu)域2-5。
有關(guān)構(gòu)建概述如下。結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體 預(yù)期蛋白質(zhì)序列SEO ID NO:2,3,4,5 B2del3-60 GRTPR 203,4,5 B2del3-120 GRIIC 214,5 B2del3-182 GREVK 225 B2del3-242 GRASC 231,2,3,4 B2del242-326GRTCP 241,2,3 B2del182-326GRTCP 24應(yīng)用PCR產(chǎn)生其他突變體。反應(yīng)模板是含人β2GPI cDNA的pBacPAK9。序列為5’CTA TAA ATA CGG ATC CCG GGA ATTCG3’(SEQ ID NO:25)、引發(fā)于pBacPAK9多克隆區(qū)域上游的寡核苷酸pBacPac9 PCR1270、1297用作5’引物。為了構(gòu)建只有結(jié)構(gòu)域1的克隆，將具有序列5’GCA GCT GGC CAA CTC TGG GTG TAC ATTTCA GAG TG3’(SEQ ID NO:26)的寡核苷酸結(jié)構(gòu)域1PCR(64)Msc1用作3’引物。同樣地，為了產(chǎn)生含結(jié)構(gòu)域1和2的突變體，將具有序列5’GCA GCT GGC CAA TGA TGG GAG CAC AGA GAG GAA G3’(SEQ ID NO:27)的寡核苷酸結(jié)構(gòu)域1、2PCR(122)Msc1用作3’引物。PCR進(jìn)行25輪循環(huán)。產(chǎn)物酚抽提并酒精沉淀。用BamHⅠ在5’端、Msc1在3’端消化這些片段。將這些消化的DNA片段用凝膠純化，連接入已用相同限制酶切除全長β2GPI的pBacPAK9中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿茵XL1-blue，用DNA測(cè)序?qū)寺《ㄐ浴＝Y(jié)果如下結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體 預(yù)期蛋白質(zhì)序列SEO ID NO:1 B2del165-326 GRTCP 241,2 B2del123-326 GRTCP 24從感染昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化β2GPI的所有缺失突變體。通常，離心去除細(xì)胞，用至少10倍體積的磷酸緩沖鹽水(PBS；137mMNaCl,2.7mM KCl,4.3mM Na2HPO4·7H2O,1.4mM KH2PO4)在4℃透析培養(yǎng)基18小時(shí)。第二天，離心去除沉淀。將透析過的培養(yǎng)基調(diào)成50mM NaPO4,pH7.5,0.5MNaCl，將Ni-NTA樹脂加入透析過的培養(yǎng)基中，緩慢混合。4℃1小時(shí)后，用布氏漏斗收集樹脂，裝入4℃保存的水夾層柱中。用50mM NaPO4,PH7.5,0.5M NaCl進(jìn)一步洗柱直至無可檢測(cè)到的蛋白。用含20mM、35mM或100mM咪唑的相同緩沖液順序洗柱。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS PAGE)分析。收集適當(dāng)?shù)慕M分，濃縮蛋白質(zhì)，用Tris緩沖鹽水(TBS；50mM TrisClpH7.5,150mM NaCl)透析。親和純化β2GPI-依賴型抗磷脂抗體為了分離β2GPI-依賴型抗磷脂抗體，將含心磷脂的多層脂質(zhì)分散體(還包含膽固醇和聯(lián)十六烷基磷酸酯)與β2GPI-依賴型抗磷脂血漿(或血清)一起保溫。將血清離心沉淀這些脂質(zhì)體。洗滌后，用2％的辛基葡糖苷去污劑裂解脂質(zhì)體混合物，加入蛋白A瓊脂糖柱中。進(jìn)一步洗滌首先去除脂類、然后去除非IgG組分后，用弱酸將IgGβ2GPI依賴型抗磷脂抗體從蛋白A上洗脫下來，中和、交換緩沖液并用ACA ELISA檢測(cè)。此方法產(chǎn)生了富集高達(dá)10000倍的aPL抗體，按與兔IgG抗人β2GPI抗血清進(jìn)行的Western印跡所顯示的，其中無任何污染的β2GPI。此方法的一個(gè)例子如下。從血清中純化β2GPI依賴型抗磷脂抗體從顯示各種癥狀的不同年齡病人血清中純化多個(gè)病人的抗體，這些癥狀包括SLE、APS(包括APS的多種現(xiàn)象，包括靜脈血栓形成、流產(chǎn)、血小板減少、CVA(腦血栓意外，即中風(fēng))、TIA(一過性缺血發(fā)作)和動(dòng)脈栓塞。
將25mL圓底搖瓶(Kontes Scientific Co.,Vineland,N.J.)中1.2mL心磷脂(Sigma Chemical,St.Louis,MO,#C-1649)、0.464mL膽固醇(Sigma Diag.,St.Louis,MO,#965-25)、0.088mL的每mL氯仿5mg聯(lián)十六烷基磷酸酯(Sigma Chemical,St.Louis,MO,D-263 1)的混合物在Rotavap(Buchi，瑞士)干燥約5分鐘。去除溶劑后，加入2mL0.96％(wt./vol.)NaCl(J.T.Baker,Inc.,Phillipsburg,NJ)并于VortexGenie Mixer(Scientific Industries,Inc.,Bohemia,NY)中混合11分鐘。將脂質(zhì)體懸液在37℃溫育1小時(shí)。同時(shí)，在Sorvall RT 6000離心機(jī)(Dupont Co.Wilmington,DE)中600xg、8℃離心6501血清10分鐘。將4mL上清與已制備好的脂質(zhì)體懸液一起放入25mL圓底搖瓶中，在軌道式搖床Tektator V(Scientific Products,McGraw Park,IL)中以中等速率4℃振蕩溫育混合物48小時(shí)，再37℃2小時(shí)。加入20mL冷TBS，將混合物轉(zhuǎn)移至50mL的聚碳酸酯離心管中(Nalge Co.,Rochester,NY),在RC3離心機(jī)中用SS-34轉(zhuǎn)頭(Sorvall-Dupont,Wilmington,DE)4℃,27000xg離心15分鐘。用25mL冷的0.96％NaCl在RC3離心機(jī)上洗沉淀3次。將沉淀溶解于1mL含2％(wt/vol)n-辛基-β-D-吡喃葡糖苷(Calbiochem,La Jolla,CA)的TBS中，加入0.6mL蛋白A/交聯(lián)瓊脂糖(Repligen Corporation,Cambridge,MA)柱中，此柱已事先用15倍床體積的1M乙酸洗滌，用15倍柱床體積的TBS平衡。用40倍床體積的2％辛基吡喃葡糖苷洗滌抗體-蛋白A/瓊脂糖柱以去除脂類，繼續(xù)用TBS洗滌直至洗脫液在280nm處的光密度接近基線。用1M乙酸洗脫結(jié)合的抗體。收集各為1mL的組分，每組分立即用0.34mL3MTris(Bio-Rad，電泳級(jí)的)中和，放置于冰浴中，在分光光度計(jì)(Hewlett-Packard,8452A Diode Array Spectrophotometer,PaloAlto,CA)中280nm處測(cè)定各組分的光密度。匯集含抗體的部分，在Centricon-30濃縮器(Amicon Division,W.R.Grace&Co.,Beverly,MA)中按制造商的說明書濃縮并用TBS洗4次。通過讀取濃縮液試樣在280nm處的光密度確定來自4mL血清6501的純化抗體的終產(chǎn)量，其中1mg=1.34A280nm。所獲的平均產(chǎn)量是4mL血清6501為750μg抗體。檢測(cè)純化抗體的ACA活性，并用Laemmli SDS-PAGE檢查純度?；谛牧字腅LISA用50μg/ml溶于乙醇的心磷脂溶液30μl包被微量滴定板(來自Dynex Technologies的Immulon 1#3350),4℃干燥過夜，用pH7.2的PBS洗3次，再用75μl 5％(w/v)的魚明膠(Hipure LiquildGelatin,Norland Products Inc.695 Joyce Kilmer Ave.,NeW BrunswickN.J.,USA)室溫封閉1小時(shí)。用PBS洗平板3次，加入50μl溶于5％魚明膠的10μg/ml全長重組β2GPI,37℃溫育1小時(shí)。用PBS洗平板3次，將50μl親和純化的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體(所用的抗體濃度如表2所示)或兔抗-β2GPI加入各孔中，37℃溫育1小時(shí)。用PBS洗平板3次，加入50μl適當(dāng)稀釋于5％魚明膠的堿性磷酸酶偶聯(lián)抗免疫球蛋白(抗-人IgG,γ鏈特異性，Zymed#62-8422)或抗兔IgG(Zymed#362-61220),37℃溫育1小時(shí)。用PBS洗平板3次，加入50μl堿性磷酸酶顯色底物(PPMP溶液；7.8g一磷酸酚肽加69.5g2-氨基-2-甲基-1-丙醇溶于100mL水的貯液，臨用前以1∶26的比率用水稀釋)，室溫溫育30分鐘。在微量平板自動(dòng)讀取儀中測(cè)定平板在550nm的光密度(Bio-Teck lnstruments,model EL311)。競(jìng)爭性抑制ELISA用10μg/ml溶于pH9.5,0.1M碳酸氫鹽的全長重組β2GPI 50μl包被微量滴定板(MaxiSorpTM,Nalge Nunc International,Denmark),4℃放置過夜，用pH7.2的0.15M PBS洗3次，用75μl2％的脫脂奶粉(Carnation,2％NFDM)室溫封閉1小時(shí)。檢測(cè)抑制劑稀釋于2％NFDM中，各包被孔中加入25μl稀釋液。用2％NFDM稀釋親和純化的β2GPI依賴型抗磷脂抗體，在各孔中加入25μl恒定濃度的稀釋液，包括無抑制劑的一組孔，用作陽性對(duì)照?；旌峡變?nèi)的溶液并于37℃溫育平板1小時(shí)。用PBS洗平板3次，加入50μl適當(dāng)稀釋于2％NFDM中的與堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗-人IgG,γ鏈特異性(Zymed#62-8422),37℃溫育1小時(shí)。用PBS洗平板3次，加入50μl堿性磷酸酶PPMP顯色底物溶液，室溫溫育30分鐘。在微量平板自動(dòng)讀取儀中測(cè)定平板在550nm的光密度(Bio-TeckInstruments,model EL311)。用獲自無抑制劑各孔的平均OD550除抑制劑存在時(shí)獲得的OD550，然后乘以100測(cè)得抑制百分率，(更具體地說，[無抑制劑的對(duì)照孔的平均A550-背景A550]-[抑制劑存在時(shí)的A550-背景A550]/[無抑制劑之對(duì)照孔的A550-背景A550]×100)。重組β2GPI和突變體的直接結(jié)合，用ELISA估計(jì)用系列稀釋于PBS中的多種重組β2GPI 50μl包被鎳螯合物包被的微孔平板(NCP 010 00 Xenopore Corp.374 Midland Ave.SaddleBrook,NJ USA)，室溫2小時(shí)。用PBS洗平板3次，以溶于PBS的1％明膠(Sigma#G-2500)75μl室溫封閉1小時(shí)。用PBS洗平板3次，加入50μl親和純化的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體(所用濃度為事先顯示約為80％最大結(jié)合的濃度)或兔抗-β2GPI,37℃溫育1小時(shí)。用PBS洗平板3次，加入50μl適當(dāng)稀釋于1％明膠中的堿性磷酸酶偶聯(lián)抗免疫球蛋白(抗-人IgG,γ鏈特異，Zymed#62-8422)或抗兔IgG(Zymed#62-6122),37℃溫育1小時(shí)。用PBS洗平板3次，加入50μl堿性磷酸酶PPMP顯色底物溶液，室溫溫育30分鐘。在微量平板自動(dòng)讀取儀中測(cè)定平板在550nm的光密度(Bio-Tecklnstruments,model EL311)。有關(guān)抑制作用的研究結(jié)果用7-9種不同的重組β2GPI突變蛋白質(zhì)測(cè)定13個(gè)不同病人的親和純化β2GPI-依賴型抗磷脂抗體制品之抗原特異性。以劑量依賴的形式檢測(cè)各突變重組β2GPI蛋白抑制親和純化的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體結(jié)合全長重組β2GPI的能力。典型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖4所示。所有13個(gè)親和純化的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的檢驗(yàn)結(jié)果總結(jié)于表2中。以下數(shù)值還在只有結(jié)構(gòu)域1的重組蛋白質(zhì)中觀察到(1----；見表2的名稱)Ab 6203,Max20,50％>10；Ab7008,Max40,50％>10；Ab650t,Max30,50％>10；Ab6626,Max 50,50％>10；Ab6632,Max 70,50％3；Ab6644,Max45,50％>10；Ab 7015,Max 30,50％>10；Ab 7101,Max 20,50％>10；Ab 6701,Max80,50％4；Ab 6641,Max98,50％>10.
只有含結(jié)構(gòu)域1的那些突變體抑制β2GPI-依賴型抗磷脂抗體與全長重組β2GPI的結(jié)合(圖4)。這一點(diǎn)對(duì)于所有13個(gè)β2GPI-依賴型抗磷脂抗體制品均為正確的(表2)。所有含結(jié)構(gòu)域1的重組突變?chǔ)?GPI蛋白抑制大于90％，這一事實(shí)表明這些抗體的所有可檢測(cè)抗-β2GPI活性是直接針對(duì)結(jié)構(gòu)域1的。表2．用13種不同的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體制品對(duì)9種重組β2GPI蛋白進(jìn)行競(jìng)爭抑制試驗(yàn)的數(shù)據(jù)總結(jié)。
Max=在檢測(cè)濃度觀察到的最大抑制作用。
50％=產(chǎn)生50％抑制作用時(shí)的濃度(μM)12345 1---- 12---123--1234- -2345--345---45 ----5Ab# Max 50％Max 50％Max50％ Max50％ Max 50％ Max 50％ Max 50％ Max 50％ Max 50％7104 90 0.8 900 0.8 90 1 98 1900.7 10>5720>505>40 0>476203 75 0.8 60 (20) >10 20>10 75 130>810>5710>50 10>40 5>477008 90 0.2 70 (40) >10 40>10 800.4 50>820>5720>50 20>40 20 >476501 80 0.2 70 (30) 30 (>10) 30>10 850.8 30>820>5715>50 15>40 10 >476626 80 0.3 85 (50) 8 (>10) 50>10 900.8 40>818>5720>50 15>40 10 >476632 90 0.8 90 (70) 8 (3) 70 3 900.2 602 20>5720>50 20>40 10 >476644 90 0.2 90 (45) 8 (>10) 45>10 900.7 508 10>5710>50 10>40 10 >477015 90 0.2 90 (30) 8 (>10) 30>10 900.7 508 10>5710>50 10>40 10 >477101 80 0.8 70 (20) 8 (>10) 20>10 70 320 >8 5>57 5>505>40 5 >476652 95 0.8 NDND ND ND 950.3 100 0.5 40>1630>15 20 >5 15 >476509 70 0.1 NDND ND ND 900.3 803 20>1620>15 20 >5 10 >476701 100 0.1 ND (80) ND (4) ND ND 950.3 30 >8 10>1620>15 15 >5 10 >476641 96 0.1 ND (98) ND (>10) ND ND 60 4602 20>1610>15 20 >5 10 >47在缺乏心磷脂的條件下用β2GPI-依賴型抗磷脂抗體檢測(cè)重組突變?chǔ)?GPI蛋白直接結(jié)合的結(jié)果檢查7-9個(gè)不同的重組β2GPI突變蛋白質(zhì)以確定它們?cè)谌狈﹃庪x子磷脂時(shí)是否可支持親和純化的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體制品的直接結(jié)合。用來自11個(gè)不同病人的親和純化β2GPI-依賴型抗磷脂抗體制品檢驗(yàn)所有的重組突變?chǔ)?GPI。以劑量依賴方式檢查各突變重組β2GPI蛋白質(zhì)，GST-6his用作陰性對(duì)照。重組突變?chǔ)?GPI蛋白通過其6-組氨酸尾與鎳包被的微量滴定板結(jié)合。檢測(cè)的所有重組突變?chǔ)?GPI蛋白質(zhì)與兔抗β2GPI結(jié)合，顯示它們可用抗體評(píng)估(圖5)。典型結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，只有那些含結(jié)構(gòu)域1的蛋白質(zhì)結(jié)合親和純化β2GPI-依賴型抗磷脂抗體(圖6)。所有11個(gè)親和純化β2GPI依賴型抗磷脂抗體的檢驗(yàn)結(jié)果總結(jié)于表3中。結(jié)果顯示，所有病人的抗體顯著結(jié)合含結(jié)構(gòu)域1的β2GPI重組蛋白質(zhì)，而對(duì)于缺結(jié)構(gòu)域1的重組蛋白質(zhì)則幾乎無特異結(jié)合。
表3．用裝有所示重組缺失突變?chǔ)?GPI蛋白質(zhì)的鎳螯合孔對(duì)8種不同β2GPI-依賴型抗磷脂抗體制品的直接結(jié)合試驗(yàn)各缺失突變體抗體組合的最大O.D.
123451---- 12--- 123-- 1234- -2345 --345 ---45 ----5Ab#6501 1.7720.911 0.028 0.909 0.628 0.018 0.030 0.086 0.0046626 1.5270.560 0.073 1.250 0.563 0.008 0.022 0.086 0.0286652 0.6400.262ND 0.320 0.135 0.008 0.016 0.013 0.0126632 1.4190.351 0.016 0.121 0.003 0.031 0.004 0.000 0.0137008 1.3800.195 0.008 0.360 0.149 0.019 0.018 0.030 0.0076701 0.9480.388ND 0.841 0.715 0.002 0.002 0.000 0.0006203 1.2701.029 0.119 0.938 0.668 0.074 0.072 0.142 0.0447015 1.8641.102 0.063 1.160 0.454 0.114 0.042 0.167 0.0786641 2.5550.252 --0.530 0.145 0.045 0.019 0.112 0.0186644 1.8480.493 --1.020 0.768 0.041 0.048 0.151 0.0177101 1.2570.804 --0.951 0.843 0.056 0.042 0.167 0.078兔 2.0651.9737 --1.971 1.708 1.873 1.993 1.941 1.663在存在心磷脂時(shí)重組突變?chǔ)?GPI蛋白質(zhì)與β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的直接結(jié)合檢查7種不同的重組β2GPI突變蛋白質(zhì)以確定存在陰離子磷脂時(shí)它們是否可支持親和純化β2GPI-依賴型抗磷脂抗體制品的直接結(jié)合。用兔抗β2GPI和親和純化β2GPI-依賴型抗磷脂抗體制品檢驗(yàn)所有的7種重組突變?chǔ)?GPI。以劑量依賴方式檢查各突變重組β2GPI蛋白質(zhì)，GST-6his用作陰性對(duì)照。重組突變?chǔ)?GPI與事先用心磷脂包被的微量滴定板結(jié)合。所有7種重組突變?chǔ)?GPI蛋白質(zhì)與兔抗β2GPI結(jié)合，顯示它們可結(jié)合心磷脂并可用抗體評(píng)估(圖7)。用病人抗體進(jìn)行典型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，只有那些含結(jié)構(gòu)域1和結(jié)構(gòu)域5二者的蛋白質(zhì)結(jié)合親和純化的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體(圖8)。
基于此實(shí)施例中的上述數(shù)據(jù)，我們認(rèn)為在一定條件下，β2GPI與固相支持物的結(jié)合方式(如照射平板、心磷脂包被平板、Nunc品牌微量滴定板和就含6-his尾的重組β2GPI蛋白質(zhì)來說可用鎳螯合平板)能使得結(jié)構(gòu)域1的抗原表位可自由靠近β2GPI-依賴型抗磷脂抗體，但當(dāng)此抗體與其他表面，如非照射平板、許多其他品牌微量滴定板之類的表面結(jié)合時(shí)并不能如此。這些抑制作用的研究證實(shí)了其他人關(guān)于在缺乏磷脂時(shí)β2GPI-依賴型抗磷脂可結(jié)合β2GPI的報(bào)道。GalIi等(1990)Lancet335:1544；Rouby等(1995)；Arvieux等(1991)免疫學(xué)方法143:223。在競(jìng)爭性抑制試驗(yàn)中有抑制作用的相同5種重組突變?chǔ)?GPI-含結(jié)構(gòu)域1的那些多肽-與在鎳螯合平板上結(jié)合β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的那些多肽相同。由兔抗β2GPI與所有9種重組蛋白質(zhì)結(jié)合的能力證實(shí)與鎳螯合平板結(jié)合的重組β2GPI突變蛋白質(zhì)。相反，只有全長重組β2GPI(即，含結(jié)構(gòu)域1和結(jié)構(gòu)域5二者的唯一被檢測(cè)重組蛋白質(zhì))可在心磷脂包被平板上方便地檢測(cè)到。通過兔抗β2GPI結(jié)合所有9種重組蛋白質(zhì)的能力確認(rèn)與心磷脂包被平板結(jié)合的重組β2GPI突變蛋白質(zhì)。
抑制作用數(shù)據(jù)(圖4)和通過鎳包被平板直接結(jié)合的數(shù)據(jù)(圖6)均清楚地顯示了所研究的13種β2GPI-依賴型抗磷脂抗體制品的抗原特異性針對(duì)的是β2GPI結(jié)構(gòu)域1的表位。實(shí)施例2:APS病人的抗體特異性前一實(shí)施例所述研究中表位結(jié)合區(qū)域的定位依賴于對(duì)來自高滴度APS病人的親和純化抗體的使用。APS抗體的親和純化要求高滴度病人，不容易用它去研究較低滴度的病人或大群病人。因此，我們創(chuàng)建了新的方法去評(píng)估APS病人樣品中的抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該方法以血清為基礎(chǔ)，且可用于評(píng)估較大量的病人。
表面等離子體振子共振(surface plasmon resonance,SPR)提供了對(duì)于固定蛋白質(zhì)和可溶分析物之間相互作用的定量檢測(cè)方法。目前的研究應(yīng)用SPR測(cè)定正常人組和APS病人組血漿中固定化β2GPI和β2GPI結(jié)構(gòu)域缺失突變體之間的相互作用。設(shè)計(jì)各研究方法以確定β2GPI結(jié)構(gòu)域1的免疫優(yōu)勢(shì)是否可推廣至較多數(shù)APS病人。材料和方法試劑。CM5芯片、NHS和EDC及HBS-EP緩沖液來自BIAcore。人親血球蛋白(表型1-1)是含β2GPI中的共有重復(fù)短基元的蛋白質(zhì)，將其固定于芯片上的隔離流動(dòng)室中并用作陰性對(duì)照。用桿狀病毒蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)在Tn5細(xì)胞中表達(dá)重組β2GPI和β2GPI的結(jié)構(gòu)域缺失突變體，并用鎳螯合柱自上清純化。Iverson等(1998)美國國家科學(xué)院院報(bào)95:15542-15546。正常人血漿樣品可購買到(George KingBiomedical)或自提。來自診斷有原發(fā)或繼發(fā)性(對(duì)于狼瘡來說)抗磷脂抗體綜合癥的個(gè)體的病人血漿樣品獲自許多臨床來源。
研究中所用的55個(gè)對(duì)照來自異源樣品。分析中包括購自GeorgeKing Bio-Medical(Overland Park,KS)的30個(gè)對(duì)照樣品(15個(gè)男性；15個(gè)女性；平均年齡34歲，范圍19-45歲)、5個(gè)當(dāng)?shù)刂驹刚?3個(gè)男性，2個(gè)女性)、2個(gè)商業(yè)來源的匯集樣品和18個(gè)未知來源的血庫捐獻(xiàn)者。從數(shù)個(gè)來源收集病人樣品，包括具有靜脈血栓形成、動(dòng)脈阻塞、腦血栓、多次流產(chǎn)和血小板減少病史的病人。通過內(nèi)部試驗(yàn)測(cè)定，研究牽涉的所有病人具有IgG抗磷脂抗體水平(GPL)水平≥20。
用Immunopure Plus蛋白質(zhì)G瓊脂糖珠和Immunopure IgG結(jié)合和洗脫緩沖液按制造商推薦的方法(Pierce)從血漿中分離全部IgG級(jí)分。
表面等離子體振子共振.所有實(shí)驗(yàn)均用BIAcoreTM2000裝置在25℃以流速10μL/分鐘進(jìn)行。用脫氣HBS-EP緩沖液進(jìn)行芯片的平衡和結(jié)合研究，該緩沖液組成為0.01M HEPES pH7.4,0.15M NaCl,3mMEDTA和0.005％(v/v)表面活性劑P20。通過使40μL 0.05M NHS/0.2MEDC流過芯片將芯片激活，然后暴露于合適的蛋白質(zhì)配基中，完成蛋白質(zhì)配基通過其自由氨基基團(tuán)與CM5芯片的共價(jià)偶聯(lián)。通過使其溶于10mM乙酸(pH4.8)的25μg/mL溶液50μL流過NHS活化的CM5芯片固定重組β2GPI(His)6、β2GPI的結(jié)構(gòu)域缺失突變體和親血球蛋白。然后用1M乙醇胺(pH8.5)40μL淬滅芯片表面的過量反應(yīng)基團(tuán)。用HBS-EP以1∶1的比率稀釋人血漿樣品(130μL)，流過β2GPI芯片，收集780秒的應(yīng)答值。在各樣品接觸之間用80μL 0.1M甘氨酸-HCl(pH2.1),0.1MNaCl再生芯片。因?yàn)樵跈z測(cè)期間未達(dá)到結(jié)合平衡，用制造商的軟件(BiaEvaluation version2.2,Uppsala,瑞典)使結(jié)合曲線擬合以下方程式，確定平衡結(jié)合值(Req)Rt=Req(1-e-ks(t-t0))+R0其中Rt是在時(shí)間t時(shí)的檢測(cè)的BIAcore應(yīng)答，Req是平衡平臺(tái)應(yīng)答，t是時(shí)間，t0是起始時(shí)間，ks是表觀結(jié)合常數(shù)(ks=kaC+kdis，其中ka是結(jié)合常數(shù)，C是分析濃度，而kdis是解離常數(shù))，而R0是應(yīng)答補(bǔ)償。在一些實(shí)驗(yàn)中，通過與蛋白G結(jié)合然后從其上酸洗脫獲得來自人血漿樣品的總IgG組分。將與蛋白G結(jié)合后剩下的血漿與新鮮蛋白G珠再混合，并作為無IgG血漿分離。將用緩沖液以1∶1比率稀釋的中和IgG制品和無IgG血漿如上所述流經(jīng)β2GPI芯片。結(jié)果和討論將含結(jié)構(gòu)域1-5、2-5和只含結(jié)構(gòu)域1的重組人β2GPI克隆入桿狀病毒表達(dá)載體并表達(dá)于TN5細(xì)胞中。分析純化蛋白質(zhì)的等份試樣，用氨基酸分析定量。各蛋白質(zhì)包含單個(gè)的氨基末端，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)便于以氨基酸分析為基礎(chǔ)進(jìn)行精確的定量。
APS病人組來自多個(gè)中心，由已診斷具有抗磷脂抗體綜合癥(APS)癥狀且GPL≥20的106個(gè)病人組成。病史不完全，但可獲的病史包括靜脈血栓形成、動(dòng)脈血栓形成、腦血栓、多次流產(chǎn)、早產(chǎn)和血小板減少。GPL值從20-807(413±161，平均±SD)，中間值是77。正常對(duì)照人群由55個(gè)樣品組成，獲自內(nèi)部捐獻(xiàn)者、商業(yè)來源和圣地哥血庫。
用緩沖液以1∶1的比率稀釋來自APS病人和對(duì)照的血清，評(píng)估其與固定化β2GPI(D1-5)的結(jié)合。與β2GPI(D1-5)的相互作用大小顯示于表4中。對(duì)于106個(gè)APS病人和55個(gè)對(duì)照病人來說，β2GPI(D1-5)的平均Req分別是730和328，中間值是635和201。從統(tǒng)計(jì)學(xué)上說，病人和對(duì)照組之間的差別是顯著的(p＜0.01,Student’s t-檢驗(yàn))。APS和對(duì)照血清與β2GPI(D2-5)相互作用的大小在這些組中是不同的(表4)。
表4．病人血清的結(jié)合

計(jì)算選擇性比率，以描述血清樣品與區(qū)別僅在于結(jié)構(gòu)域1出現(xiàn)與否的β2GPI結(jié)構(gòu)域缺失突變體之間的相對(duì)結(jié)合。通過用β2GPI(D2-5)的結(jié)合除與β2GPI(D1-5)的結(jié)合(Req)計(jì)算此選擇性比率。任意選擇3或更大的系數(shù)來限定呈現(xiàn)優(yōu)先與含結(jié)構(gòu)域1之天然蛋白質(zhì)相互作用的病人。在對(duì)照組中與β2GPI(D1-5)和β2GPI(D2-5)的相互作用較小，大部分對(duì)照病人顯示對(duì)任一種固定蛋白均無選擇性(表4)。相反，88％的APS病人呈現(xiàn)對(duì)含結(jié)構(gòu)域1之β2GPI的選擇性≥3倍。41％(43/106)的APS病人具有可忽略的與β2GPI(D2-5)的相互作用(Req＜9)，選擇性比率極高。
將具選擇性比率為3的10個(gè)病人的血清進(jìn)一步鑒定，以確定血清中觀察到的相互作用是否可歸于IgG級(jí)分?？傃獫{、無IgG血漿和具β2GPI(D1-5)的總IgG的結(jié)合相互作用顯示于圖5中。用蛋白G從血清中去除IgG，將基本上去除所有與固定化蛋白質(zhì)的特異結(jié)合相互作用。用酸從蛋白G級(jí)分洗脫IgG級(jí)分，并檢驗(yàn)它與蛋白質(zhì)的相互作用(在表5中指示為“總IgG”，隨后的中和作用以相對(duì)于總血漿和無IgG血漿為50％的比率稀釋了IgG級(jí)分)。IgG級(jí)分只顯示與β2GPI(D1-5)相互作用，產(chǎn)生的應(yīng)答大小與原始血清和β2GPI(D1-5)相互作用的大小相似(注意稀釋度不同)。因此，此檢驗(yàn)系統(tǒng)中結(jié)構(gòu)域1選擇性病人血清與β2GPI的結(jié)合可歸于IgG級(jí)分。
表5．“D1-選擇性”APS病人血漿樣品的BIAcore Req值病人總血漿(1∶2) 無IgG漿(1∶2) 總IgG(1∶4)(d2-5) (d1-5) (d2-5)(d1-5)(d2-5) (d1-5)6501 333 1526 0 0 0 7326701 199 952 0 0 0 4606626 37 1622 049 0 11326515 259 1024 0 0 0 4406207 19 1450 0 0 0 4806642 8 811 048 0 4807015 158 2092 0 0 0 8646703 65 1001 0 0 0 5566601 84 792 0 0 0 2667201 0 603 0 0 0 292進(jìn)一步評(píng)估非選擇性APS病人亞組(選擇性比率＜3)，以確定它們的結(jié)合是否可歸于IgG級(jí)分。結(jié)果如表6所示。就結(jié)構(gòu)域1選擇性病人來說，通過用蛋白G處理血清耗盡IgG級(jí)分，可去除所有與任一種固定化蛋白質(zhì)的相互作用。看起來病人的IgG級(jí)分反映了在原始血清樣品中觀察到的結(jié)合(表6)。
表6．“無選擇性”的APS病人血漿樣品的BIAcore Req值病人 總血漿(1∶2) 無 IgG 血漿總IgG(1∶4)(1∶2)(d2-5) (d1-5) (d2-5) (d1-5) (d2-5) (d1-5)6117 386 324 0 079 1206194 31972046 0 0 688 4706649 553 758 0 0 127 2536627 549 324 0 0 182 1327013 167 241 0 075 1156611 1002 892 0 0 177 251本研究應(yīng)用了表面等離子體振子共振技術(shù)定位大的、交叉類群APS病人中的抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(n=106；GPL≥20)。與非APS對(duì)照相比，APS病人血清顯示與β2GPI的結(jié)合明顯更大。此外，與含除結(jié)構(gòu)域1之外所有結(jié)構(gòu)域的β2GPI結(jié)構(gòu)域缺失突變體相比，大部分病人血清結(jié)合天然β2GPI(D1-5)的程度要大得多。相對(duì)于缺少結(jié)構(gòu)域1的結(jié)構(gòu)域缺失突變體來說，88％的病人顯示對(duì)含結(jié)構(gòu)域1之β2GPI3倍或更多倍的特異性。通過耗盡IgG組分可完全去除APS病人血清中的結(jié)構(gòu)域1結(jié)合活性，在IgG級(jí)分中可完全重建結(jié)合活性。這些結(jié)果表明，在多數(shù)APS病人中免疫顯性結(jié)合表位位于β2GPI的氨基末端結(jié)構(gòu)域。實(shí)施例3檢驗(yàn)結(jié)構(gòu)域1片段對(duì)β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的免疫反應(yīng)性六肽合成將附著至Wang樹脂的N-α-Fmoc保護(hù)氨基酸在溶于二甲基甲酰胺(DMF)的20％哌啶中懸浮兩次，總反應(yīng)時(shí)間30分鐘，以將胺去保護(hù)。制備具C-末端脯氨酸的六肽，使未保護(hù)的脯氨酸附著于氯三苯甲基樹脂而非Wang樹脂，以防止哌嗪二酮的形成。
分別用DMF和甲醇漂洗樹脂一次。將N-羥基苯并三唑(6 equiv)、1,3-二異丙基碳二亞胺(6 equiv)和第二個(gè)氨基酸(6 equiv)和指示劑在DMF中的溶液加入樹脂中。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物最少1.5小時(shí)。然后分別用DMF和甲醇漂洗樹脂一次。在一小部分被漂洗過的樹脂上進(jìn)行Kaiser檢驗(yàn)(在甲醇中的5％茚三酮兩滴+1滴吡啶+1滴乙醇中的80％酚)以證實(shí)缺乏游離胺。
反復(fù)進(jìn)行去保護(hù)和氨基酸添加步驟來完成序列合成。如上所述將最后一個(gè)氨基酸去保護(hù)以產(chǎn)生游離胺。
用在三氟乙酸(TFA)中含7.5％(重量)苯酚、2.5％(體積)乙二硫醇、5.0％(體積)水和5.0％(體積)茴香硫醚的溶液將肽從樹脂上切下。攪拌混合物至少3小時(shí)。真空抽氣去TFA，沉淀肽并用醚洗兩次。將固體溶于1∶1的乙腈/水以用于分析。通過LCMS在1.0×150mm的C18(5μ,150)柱上鑒定此肽(A:0.1％TFA,2％乙腈的水溶液；B:0.08％TFA,2％水的乙腈溶液)。
真空或凍干去乙腈和水，將肽儲(chǔ)存于0℃。
再次大規(guī)模制備有活性的肽，并用C18柱純化(A:0.1％TFA水溶液；B:0.08％TFA的乙腈溶液)。競(jìng)爭性抑制ELISA用50μL溶于0.1M碳酸氫鹽，pH9.5的10μg/ml全長重組β2GPI包被微量滴定板(MaxiSorpTM,Nalge Nunc International,丹麥)，4℃保存過夜，用0.15M PBS,pH7.2洗三次，用2％的脫脂奶粉(Carnation,2％NFDM)75μL室溫封閉1小時(shí)。檢驗(yàn)抑制劑稀釋于2％NFDM中，將25μL各稀釋液加入包被孔中。親和純化的β2GPI依賴型抗磷脂抗體稀釋于2％NFDM中，將25μL恒定濃度的稀釋液加入孔中，包括一組無抑制劑的11個(gè)孔，用作陽性對(duì)照。將孔中溶液混勻，37℃溫育平板1小時(shí)。用PBS洗平板三次，加入適當(dāng)稀釋于2％NFDM中的50μL堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗人IgG,γ鏈特異，(Zymed#62-8422),37℃溫育1小時(shí)。用PBS洗平板三次，加入50μL堿性磷酸酶PPMP顯色底物溶液，室溫溫育30分鐘。在微量平板自動(dòng)讀取儀(Bio-TeckInstruments,model EL311)中測(cè)定平板在550nm的光密度。通過用獲自無抑制劑的11孔的平均OD550除抑制劑存在時(shí)獲得的OD550，然后乘以100測(cè)定抑制百分率。抑制作用研究合成74種肽并在競(jìng)爭性抑制ELISA中進(jìn)行篩選。簡短地說，將未純化的“粗制”肽以1∶2比率稀釋后用三種不同的親和純化的抗心磷脂抗體篩選。然后在加倍稀釋度以1∶2的稀釋比率再篩選陽性肽。再合成和純化在高稀釋度時(shí)能抑制的28種肽。然后在競(jìng)爭性試驗(yàn)中檢驗(yàn)這些純化的肽。重組β2GPI也作為陽性對(duì)照一起檢測(cè)。
圖9所示的結(jié)果表明，一些肽可抑制抗心磷脂抗體與β2GPI的結(jié)合。因?yàn)榇蟛糠直粰z驗(yàn)肽不抑制，說明一定程度的特異性是由具抑制作用的肽引起的。除兩種陽性肽外，其他所有的肽均通過結(jié)構(gòu)域1中出現(xiàn)的兩套二硫鍵連接的半胱氨酸集中在一起。這兩種未被如此集中的兩種肽抑制也最差。這些二硫鍵連接的半胱氨酸可能產(chǎn)生了能被β2GPI依賴型抗磷脂抗體所識(shí)別的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例4用誘變和微量淘選數(shù)據(jù)確定結(jié)構(gòu)域1中對(duì)結(jié)合β2GPI依賴型抗磷脂抗體起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基易錯(cuò)PCR易錯(cuò)PCR進(jìn)行如下。在增加Taq聚合酶錯(cuò)誤率的條件下PCR擴(kuò)增人β2GPI的結(jié)構(gòu)域1.引物是使第1-64位氨基酸擴(kuò)增的引物。摻入一Sfc1限制性位點(diǎn)作為氨基酸1的一部分。在3’端氨基酸64之后摻入Sal1限制位點(diǎn)。用0.25mM MnCl2如Leung等(1989)技術(shù)111中所述進(jìn)行PCR反應(yīng)。用Sfc1和Sal1消化PCR產(chǎn)物并克隆入已用Apal1和Sal1消化的fd-tet-DOG2。這將結(jié)構(gòu)域1置于pⅢ N-末端緊接pⅢ信號(hào)序列之后。連接反應(yīng)液電穿孔大腸桿菌K91。收獲噬茵體并用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)效價(jià)。用微量淘選技術(shù)檢驗(yàn)產(chǎn)生的噬茵體克隆。微量淘選用蛋白G包被2類Immulon平板。蛋白G溶于0.1M NaHCO3,濃度為5μg/mL，在微量滴定板上每孔加100μL,4℃保存過夜。從平板上棄過量的蛋白G溶液，用200μL 2YT在振蕩平臺(tái)室溫振蕩1小時(shí)封閉各孔。用200μL Tris緩沖鹽水，pH7.4/0.5％Tween20(TBS/Tween)在自動(dòng)平板清洗儀上洗孔4次。將用2YT稀釋成2.5μg/mL的人β2GPI依賴型抗磷脂6626、6501、6701、兔β2GPI依賴型抗磷脂或?qū)φ盏恼gG 100μl加入洗過的孔中。將平板在搖床上室溫溫育1小時(shí)。
從生物淘選產(chǎn)生的瓊脂平板上收獲待微量淘選檢驗(yàn)的噬茵體。用無菌牙簽將待檢驗(yàn)的各克隆轉(zhuǎn)移至園底96孔微量滴定板(Corning,Corning,NY)各隔離的孔中，每孔含200μL2YT/Tet,30℃溫育過夜。溫育過夜后，用微量滴定板固定器1300xg室溫離心噬茵體培養(yǎng)物10分鐘。上清液是“純”噬茵體的來源。1∶100-1∶1000稀釋純噬菌體，向平板中加入100μL，平板中含如上所述制備的蛋白G結(jié)合的β2GPI依賴型抗磷脂抗體6501和正常IgG。將稀釋噬茵體和aPL抗體或?qū)φ誌gG在平面旋轉(zhuǎn)儀上室溫溫育2小時(shí)。在自動(dòng)平板清洗儀上用TBS/Tween洗9次后，用20μL 0.2N HCl-甘氨酸/0.1％BSA,pH2.2洗脫IgG結(jié)合的噬茵體。洗脫液持續(xù)室溫溫育10分鐘，其間制備每孔中含20μL新鮮饑餓大腸桿菌的新Corning微量滴定板并保持冰冷。將140μL 29mMTris加入含噬茵體洗脫液的平板中以中和pH，然后將20μL噬茵體懸浮液從各孔中轉(zhuǎn)移入含饑餓大腸桿菌的平板各孔中。37℃溫育10分鐘后，加入200μL 2YT，在37℃再次溫育30分鐘。用多通道加樣器將各孔的8μL溶液點(diǎn)到2YT/Tet大瓊脂平板上，保持來自最后一塊微量滴定板的原8×12孔模式和方向。使斑點(diǎn)干燥30分鐘后，平板在30℃溫育過夜。第二天，茵落半定量評(píng)分為0-4+，用0象征＜10個(gè)菌落；1+=10-30；2+=30個(gè)茵落至70％鋪滿；3+=70-90％鋪滿；4+=鋪滿。
結(jié)果顯示于表7A和7B中。對(duì)于表7A而言，在兩個(gè)不同的時(shí)間進(jìn)行兔抗人β2GPI試驗(yàn)。突變列舉為原氨基酸、突變位置和突變位置的氨基酸。例如，S31F表明第31位的絲氨酸突變成了苯丙氨酸。未突變結(jié)構(gòu)域1具有數(shù)值為3+，而結(jié)構(gòu)域5噬茵體數(shù)值為-。沉默突變未顯示。克隆開始于N末端并向C末端延伸。
表7B表示突變分析的擴(kuò)充，顯示了針對(duì)附加抗體檢驗(yàn)附加突變體。最后的4個(gè)噬菌體克隆具有用星號(hào)指示的突變，表明噬茵體具有多個(gè)突變(3A4:D8A,S13T；3F123:L10I,P17Q,Y22C；3G1:R2W,S38T；4D1:N56T,R63G)。
結(jié)果表明(見下文)，(a)試驗(yàn)是一致的；(b)不是所有的抗體反應(yīng)相同；(c)同一位置的不同突變可具有非常不同的作用(例如，參見Met42)。
總結(jié)果以圖3所示的結(jié)構(gòu)域1三級(jí)結(jié)構(gòu)模型描述。它顯示氨基酸55-58(異亮氨酸、天冬酰胺、亮氨酸)、氨基酸40-45(包括氨基酸43-45，即精氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸)和氨基酸19(賴氨酸)對(duì)于與aCL抗體的結(jié)合是重要的。表7A．突變結(jié)構(gòu)域1噬茵體的微量淘選

表7突變結(jié)構(gòu)域1噬茵體的微量淘選

實(shí)施例5與平臺(tái)偶聯(lián)的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽四價(jià)平臺(tái)BA/PIZ/IDA/TEG(BA/PITG)的合成化合物1向冷卻至0℃的1.02g(4.37mmol)N-(叔丁氧羰基)-亞氨二乙酸(US 5,552,39l中的化合物量，化學(xué)確定的非聚合物價(jià)鍵平臺(tái)分子及其偶聯(lián)物)和1.01g(8.75mmol)N-羥基琥珀酰亞胺的50mL無水THF溶液中加入2.26g(10.94mmol)二環(huán)己基碳二亞胺。將混合物攪拌16小時(shí)并緩慢升溫至室溫，然后向混合物中依次加入2.22g(10.1mmol)單-CBZ-哌嗪的25mL THF溶液和1.22mL(887mg,8.75mmol)三乙胺。將混合物室溫?cái)嚢?小時(shí)然后過濾。將濾液濃縮并將殘余物溶于125mL乙酸乙酯，然后與2×125mL 1N鹽酸、125mL飽和碳酸氫鈉溶液一起振搖，干燥(硫酸鎂)、過濾然后濃縮得到2.39g粘稠狀固體。通過硅膠色譜純化(95/5二氯甲烷/甲醇)得到1.85g(66％)1。
化合物2向1.74g(2.74mmol)化合物1的10mL二氯甲烷溶液中加入10mL三氟乙酸，然后將混合物室溫?cái)嚢?小時(shí)。將混合物濃縮，將殘余物溶于5mL二氯甲烷。將混合物冷卻至0℃并加入100mL飽和碳酸氫鈉。然后將混合物用4×100mL二氯甲烷萃取。合并二氯甲烷層，干燥(硫酸鎂)，過濾然后濃縮得到1.46g(99％)粘稠的吸濕性固體狀化合物2，該化合物直接用于下一步驟。
化合物3于0℃下，向0.7g(1.3mmol)化合物2和226μL(168mg,1.30mmol)二異丙基乙基胺的溶液中加入127μL三甘醇雙氯甲酸酯的4mL二氯甲烷溶液，然后將混合物室溫?cái)嚢?小時(shí)。將混合物在80mL二氯甲烷和80mL 1N鹽酸之間進(jìn)行分配。將二氯甲烷層用2×80mL水洗滌，干燥(硫酸鎂)，過濾然后濃縮得到736mg(93％)結(jié)晶固體狀的化合物3。
化合物5將化合物3(61mg,0.48mmol)溶于3mL 30％HBr/HOAc并將得到的混合物室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后加入5mL乙醚。將混合物置于冰箱內(nèi)1小時(shí)然后離心。將得到的沉積物用乙醚洗滌然后干燥得到四氫溴酸鹽4并將其溶于1mL水中。向混合物中加入49mg(0.58mmol)碳酸氫鈉和3mL二噁烷。如需要，可補(bǔ)加碳酸氫鈉以使混合物呈堿性。將混合物冷卻至0℃，加入748mg(2.89mmol)溴乙酸酐。將混合物攪拌2小時(shí)，然后在20mL 1N硫酸和20mL 80/20二氯甲烷/甲醇之間進(jìn)行分配。將有機(jī)層干燥(硫酸鈉)，過濾然后濃縮得到粗品量，將其通過硅膠色譜純化(二氯甲烷/甲醇)得到5。 AOA/PITG四聚體平臺(tái)和β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽偶聯(lián)物化合物44的合成轉(zhuǎn)氨基的結(jié)構(gòu)域1(TA/D1)在使用前，向水和乙酸鈉緩沖液中通入氦氣。將結(jié)構(gòu)域1(10.55mg,1.49μmol)在聚丙烯試管中溶于0.5mL水中，然后加入4.0mL 2M pH5.5的乙酸鈉緩沖液。向混合物中加入3.73mg(14.9μmol)CuSO4的0.5mL水溶液，然后加入2.75mg(29.9μmol)水合乙醛酸在0.5mL 2M pH5.5的乙酸鈉緩沖液中的溶液。將混合物置于氮?dú)夥障虏睾偷財(cái)嚢?8小時(shí)，此時(shí)，分析HPLC表明反應(yīng)已經(jīng)結(jié)束，所述分析HPLC采用4.6mm×250mm,300埃，5μm，聯(lián)苯基柱(Vydac)并于280nm下檢測(cè)(1mL/分鐘，梯度25％-45％B,0-20分鐘，A=0.1％TFA/H2O,B=0.1％TFA/CH3CN)。近似的保留時(shí)間如下D,13.2分鐘；TA/D1,13.7分鐘；氧化的TA/D1,13.4分鐘。將混合物用水稀釋至體積為20mL，過濾，通過HPLC純化(22.4mm×250mm,300埃，10μm，聯(lián)苯基柱(Vydac,Hesperia,CA)(12mL/分鐘；梯度25％-40％B,0-40分鐘，A=0.1％TFA/H2O,B=0.1％TFA/CH3CN)。收集經(jīng)分析HPLC證實(shí)含有純凈TA/D1的餾份并冷凍干燥得到5.0mg(48％)TA/D1。 氨基氧乙?；?AOA)/PITG平臺(tái)的合成4-硝基苯基-N-(叔丁氧羰基)氨基氧乙酸酯，2’:0℃下，向攪拌中的1.5g(7.85mmol)N-(叔丁氧羰基)氨基氧乙酸(Aldrich Chemical Co.,St.Louis,MO)(化合物1’)的35mL無水THF溶液中依次加入1.09g(7.85mmol)4-硝基苯酚和1.62g(7.85mmol)DCC。將混合物在氮?dú)夥障掠?℃攪拌0.5小時(shí)，然后室溫?cái)嚢?8小時(shí)。將混合物過濾除去二環(huán)己基脲，然后將濾液濃縮并通過硅膠色譜純化(95/5氯仿/異丙醇)得到2.30g(94％)白色固體狀化合物2’:1H NMR(CDCl3)δ1.51(s,9H),4.73(s,2H),7.36(d,2H),7.73(s,1H),8.32(d,2H)。
BOC保護(hù)的AOA/PITG平臺(tái)，4’的合成將化合物3(300mg,0.235mmol)用1.5mL 30％溴化氫的乙酸溶液處理30分鐘。通過加入乙醚使形成的四胺的氫溴酸鹽析出沉淀。將混合物離心，棄除上清液。將殘余的固體用醚洗滌，真空干燥，溶于9mL DMF。向形成的混合物中加入294μL(1.69mmol)二異丙基乙基胺，然后加入410mg(1.31mmol)化合物2的3mLDMF溶液。將混合物在氮?dú)夥障聰嚢?小時(shí)，然后在15/1氯仿/甲醇和鹽水之間進(jìn)行分配。將水層用15/1氯仿/甲醇洗滌兩次，將合并的有機(jī)層干燥(硫酸鈉)然后濃縮得到680mg油。通過硅膠色譜純化(95/5至75/25氯仿/甲醇的梯度)得到215mg(65％)白色固體狀化合物4’:1H NMR(CDCl3)δ1.49(s,36H),3.40-3.73(m,40H),4.24(m,12H),4.59(重疊的單峰，8H),8.21(s,2H),8.32(s,2H)。
AOA/PITG平臺(tái)，化合物5’向攪拌中的67mg(0.047mmol)化合物4’的10/1/1乙酸乙酯/氯仿/甲醇溶液中通入氯化氫氣體15分鐘，然后將混合物繼續(xù)攪拌15分鐘。將混合物真空濃縮并在真空下放置16小時(shí)得到43mg(78％)白色固體狀的化合物5’:1H NMR(DMSO)δ3.33-3.67(m,40H),4.08(m,4H),4.18(s,8H),4.90(s,8H)；質(zhì)譜(ES)m/z計(jì)算值C40H69N14O18:1033，實(shí)測(cè)值1033。 四價(jià)D1偶聯(lián)物化合物44的合成將TA/D1(0.90mg,1.28×10-7mol)在聚丙烯試管中溶于250μL 0.1M乙酸鈉(pH4.60)緩沖液。向混合物中加入16.6μL(18.9μg,1.60×10-8mol)0.97μmol/mL的AOA/PITG平臺(tái)(化合物5’)在0.1M乙酸鈉(pH 4.60)緩沖液中的溶液。將混合物在氮?dú)夥障聹睾偷財(cái)嚢?天，此時(shí)，分析HPLC表明反應(yīng)已經(jīng)結(jié)束，所述分析HPLC采用4.6mm×250mm,300埃，5μm，聯(lián)苯基柱(Vydac)并于280nm下檢測(cè)(1mL/分鐘，梯度25％-45％B,0-20分鐘，A=0.1％TFA/H2O,B=0.1％TFA/CH3CN)。近似的保留時(shí)間如下TA/D1,13.7分鐘；化合物44,17.2分鐘。將混合物用95/5水/乙腈稀釋至體積為1mL并通過HPLC純化(10mm×250mm,300埃，5μm，聯(lián)苯基柱(Vydac)(3mL/分鐘；梯度25％-45％B,0-40分鐘，A=0.1％TFA/H2O,B=0.1％FA/CH3CN)。收集經(jīng)分析HPLC證實(shí)含有純凈的偶聯(lián)物化合物44的餾份并冷凍干燥得到0.4mg(25％)化合物44質(zhì)譜(ES，平均m/z),C1320H2032N338O370S20的計(jì)算值29,198。實(shí)測(cè)值29,218。 四聚體AOTEG/DEA/DEG平臺(tái)和β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽偶聯(lián)物的合成2-[2-(2-碘乙氧基)乙氧基]乙醇，7將2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]乙醇(12.66g,75.1mmol)和碘化鈉(33.77g,225.3mmol)溶于250mL丙酮。在燒瓶上連接回流冷凝器，然后將混合物加熱回流18小時(shí)。冷卻時(shí)，將混合物濃縮，將殘余物與400mL二氯甲烷以及300mL水和100mL飽和亞硫酸氫鈉水溶液的混合物一起振搖。將水層用2×400mL二氯甲烷洗滌并將合并的二氯甲烷層干燥(硫酸鎂)，過濾然后濃縮得到18.3g(94％)淺黃色油狀的7，該化合物不經(jīng)純化直接用于下一步反應(yīng)1H NMR(CDCl3)δ2.43(brds,1H),3.28(t,2H),3.61(m,2H),3,68(s,4H),3.78(m,4H)；質(zhì)譜(ES)m/z:C6H13O3INa(M+Na)+的計(jì)算值283.0。實(shí)測(cè)值283.0。
2-[2-(2-N-(叔丁氧羰基)氨基氧乙氧基)乙氧基]乙醇，8向5.85g(1.50mmol)2-[2-(2-碘乙氧基)乙氧基]乙醇，化合物7中加入2.00g(1.00mol)N-(叔丁氧羰基)羥基胺(Aldrich Chemical Co.)和3.36mL(3.42g,1.50mmol)DBU。將混合物攪拌得到溫度升高的粘稠液體，將其置于55℃的油浴中18小時(shí)形成白色沉淀，該沉淀使混合物固化。將混合物溶于20mL二氯甲烷然后加入500mL攪拌的乙酸乙酯中形成沉淀，濾出沉淀，將濾液濃縮得到棕黃色的油。通過快速色譜純化(50％丙酮/己烷)得到2.61g(67％)油狀的8。1HNMR(CDCl3)δ1.50(s,9H),3.65(t,2H),3.70(brds,4H),3.76(m,4H),4.06(t,2H),7.83(brds,1H)；13C NMR(CDCl3)δ28.0,61.3,68.9,70.1,70.3,72.5,72.6,75.1,81.2,157.1.
2-[2-(2-N-(叔丁氫羰基)氨基氧乙氧基)乙氧基]乙基溴化物，9將溴(約0.283mmol)滴加到50mg(0.188mmol)化合物8、74mg(0.283mmol)三苯膦和31μL(30mg,0.377mmol)吡啶的2mL二氯甲烷溶液中直至橙色不再消失。將混合物室溫?cái)嚢?.5小時(shí)，然后加入1mL飽和亞硫酸氫鈉溶液除去過量的溴。然后將混合物在10mL水和2×15mL乙酸乙酯之間進(jìn)行分配。將合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥(硫酸鈉)，過濾然后濃縮。將殘余物通過硅膠色譜純化(35/65丙酮/己烷)得到54mg油狀的化合物21HNMR(CDCl3)δ1.49(s,9H),3.48(t,2H),3.68(s,4H),3.73(m,2H),3.84(t,2H),4.03(t,2H),7.50(s,1H)；13CNMR(CDCl3)δ28.3,30.4,69.4,70.6(兩個(gè)信號(hào)),71.3,75.5,81.7,156.9.
2-[2-(2-N-(叔丁氧羰基)氨基氧乙氧基)乙氧基]乙基疊氧化物.10從化合物9合成將100mg(0.305mmol)化合物9的0.25mL無水DMF溶液加入到159mg(2.44mmol)疊氮化鈉的0.5mL無水DMF溶液中。用另外0.25ml DMF將殘余的9沖洗到反應(yīng)混合物中，然后將混合物于115℃加熱3小時(shí)。冷卻時(shí)，將混合物在3mL水和4×3mL二氯甲烷之間進(jìn)行分配。將合并的有機(jī)層用10mL水洗滌，干燥(硫酸鈉)，過濾然后濃縮得到黃色的油。通過硅膠色譜純化(35/65丙酮/己烷)得到67mg(76％)油狀的10:1HNMR(CDCl3)δ1.47(s,9H),3.4l(t,2H),3.69(brd s,4H):3.73(m,4H),4.03(t,2H),7.50(s,1H)；13C NMR(CDCl3)δ28.1,50.5,69.1,70.1,70.4(兩個(gè)信號(hào))，75.2,81.3,156.7.
從化合物13合成10氮?dú)夥障?，?58mg(0.69mmol)化合物13的5mL DMF溶液中加入358mg(5.50mmol)疊氮化鈉。將混合物室溫?cái)嚢?8小時(shí)，加入100mL水，將混合物用3×50mL乙酸乙酯萃取。合并乙酸乙酯層并用50mL水洗滌，干燥(硫酸鈉)，過濾然后濃縮得到294mg無色的油。通過硅膠色譜純化(30/70丙酮/己烷)得到無色油狀的化合物10。
化合物11:(MR-508-128)將化合物10(1.36g,4.70mmol)和三苯膦(1.48g,5.64mmol)溶于24mL THF和8mL水，然后將形成的溶液室溫?cái)嚢?小時(shí)。加入約160μL(8滴)1N NaOH，然后將混合物攪拌18小時(shí)。將混合物真空濃縮，將濃縮物通過硅膠色譜純化(80/8/2CH3CN/H2O/濃NH4OH)得到1.16g(94％)黃色油狀的111HNMR(CDCl3)δ1.50(s,9H),1.90(brd,2H),2.88(t,2H),3.56(t,2H),3.65(m,4H),3.71(m,2H),4.01(m,2H)。
1,2-雙(2-碘乙氧基)乙烷,化合物12將10.0g(5.3mmol)1,2-雙(2-氯乙氧基)乙烷(Aldrich Chemical Co.)和16.0g(107mmol)碘化鈉的110mL丙酮溶液加熱回流18小時(shí)。將混合物濃縮并將殘余物用氯仿研制以溶解產(chǎn)物而使鹽不溶解。將混合物過濾，將濾液濃縮得到橙色的油。通過硅膠色譜純化(梯度，10/90 EtOAc/己烷至15/85 EtOAc/己烷)得到17.8g(90％)橙色油1HNMR(CDCl3)δ3.28(t,4H),3.67(s,4H),3.78(t,4H)；13C NMR(CDCl3)δ3.6,70.5,72.2.
化合物13將DBU(284μL,290mg,1.90mol)加入到266mg(2.0mmol)N-(叔丁氧羰基)羥基胺(Aldrich Chemical Co.)和2.96g(8.0mmol)化合物12的混合物中，然后將混合物密封并振搖至均勻。15分鐘后，混合物固化，將其放置45分鐘。向混合物中加入5mL二氯甲烷并將混合物再次振搖以溶解固體。將形成的溶液加入到200mL乙酸乙酯中。補(bǔ)加50mL乙酸乙酯，將混合物過濾以除去固體。將濾液濃縮得到油，將該油在100mL乙酸乙酯和3×50mL 1N鹽酸之間進(jìn)行分配。將乙酸乙酯層用2×50mL 1N氫氧化鈉洗滌，隨后用2×50mL 5％亞硫酸氫鈉溶液洗滌然后濃縮得到2.6g黃色的油。通過硅膠色譜純化(梯度，20/80至45/55 EtOAc/己烷)得到515mg(69％)黃色油狀的化合物13:1HNMR(CDCl3)δ1.50(s,9H),3.28(t,2H),3.68(s,4H),3.72(m,4H),4.02(t,2H),7.72(s,lH)；13C NMR(CDCl3)δ2.9,28.3,68.9,69.4,70.2,70.6,72.0,75.4,81.6,156.9.
二甘醇雙-4-硝基苯基碳酸酯，化合物60將吡啶(30.5mL,377mmol)緩慢加入到0℃的5.0g(47.1lmmol)二甘醇和23.74g(118mmol)4-硝基苯基氯甲酸酯的500mL THF溶液中。移走冷卻浴，將混合物室溫?cái)嚢?8小時(shí)。將混合物再次冷卻至0℃，用6N HCl酸化，然后在400mL 1N HCl和2×400mL二氯甲烷之間進(jìn)行分配。將合并的有機(jī)層干燥(硫酸鎂)，過濾然后濃縮得到24.3g白色固體。用己烷/EtOAc結(jié)晶得到16.0g(78％)白色粉末狀混合物37:mp 110℃；1H NMR(CDCl3)δ3.89(t,4H),4.50(t,4H),7.40(d,4H),8.26(d,4H).
化合物61將2.5g(5.73mmol)化合物37的17mL吡啶溶液加入到0℃的1.8g(17.2mmol)二乙醇胺的3mL吡啶溶液中。移走冷卻浴，將混合物室溫?cái)嚢?小時(shí)得到化合物38，該混合物不經(jīng)分離直接用于下一步驟。
化合物14將上一步驟的混合物再次冷卻至0℃，加入40mL二氯甲烷，隨后加入11.55g(57.3mmol)4-硝基苯基氯甲酸酯的60mL二氯甲烷溶液，然后將混合物室溫?cái)嚢?0小時(shí)。將混合物再次冷卻至0℃，用1N HCl酸化，然后在300mL 1N HCl和2×200mL二氯甲烷之間進(jìn)行分配。將合并的有機(jī)層干燥(硫酸鎂)，過濾然后濃縮得到13.6g黃色固體。通過硅膠色譜純化(CH2Cl2/MeOH和EtOAc/己烷)得到4.91g(83％)粘的無定形固體狀化合物39:1H NMR(CDCl3)δ3.72(m,12H),4.31(t,4H),4.48(m,8H),7.40(m,8H),8.29(m,8H)。

BOC-保護(hù)的AOTEG/DEA/DEG平臺(tái)，化合物15將三乙胺(157μL,114mg,1.13mmol)加入到攪拌的193mg(0.188mmol)化合物14(按照以上及1998年12月9日申請(qǐng)的U.S.系列號(hào)60/111,641中的描述制備)，然后加入298mg(1.13mmol)化合物11。將混合物恢復(fù)至室溫并攪拌過夜。將混合物冷卻至0℃，用1N HCl酸化，然后在20mL 1NHCl和4×20mL二氯甲烷之間進(jìn)行分配。將合并的有機(jī)層用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，干燥(硫酸鎂)，過濾然后濃縮得到279mg黃色的油。通過硅膠色譜純化(97/3 CH2Cl2/MeOH)得到138mg(48％)油狀的15；1H NMR(CDCl3)δ1.49(s,36H),3.35(m,8H),3.46-3.78(m,44H),4.04(t,8H),4.21(m,12H),5.80(m,4H),7.91(s,4H)；質(zhì)譜(ES)m/z計(jì)算值C62H117N10O33(M+H)+:1528.8。實(shí)測(cè)值1528.5。
化合物16將化合物15(60mg,39.2μmol)溶于10mL 1/9三氟乙酸/二氯甲烷，然后將混合物保持在室溫下3小時(shí)。用溫和的氮?dú)饬髡舫軇缓髮堄辔锶苡谧钌倭康纳V溶劑(5/7.5/87.5濃NH4OH/H2O/CH3CN)中并將混合物上到硅膠柱上。通過硅膠色譜純化(梯度5/7.5/87.5至5/10/85的濃NH4OH/H2O/CH3CN)得到36mg(82％)無色油狀的16:1H NMR(CDCl3)δ3.37(m,8H),3.58(m,16H),3.67(s,16H),3.71(m,12H),3.86(m,8H),4.17-4.29(m,12H),4.93(brd,8H),5.91(m,4H)；13C NMR(CDCl3)δ40.9,47.7,48.2,62.9,64.7,69.4,69.6,70.2,70.3,70.5,74.8,156.1,156.6；質(zhì)譜(ES)m/z計(jì)算值C42H85N10O25(M+H):1129。實(shí)測(cè)值1129。
為了通過分析HPLC檢測(cè)純度,按照如下方式制備四丙酮肟。將化合物16(0.38mg,0.34μmol)在HPLC樣品瓶中溶于240μL 0.1MNaOAc緩沖液。向溶液中加入10μL 49μL丙酮在2.0mL 0.1M NaOAc緩沖液中的溶液。將混合物放置1小時(shí)，然后取樣進(jìn)行HPLC分析(4.6mm C18柱，1mL/min,210nm檢測(cè)，梯度在20分鐘內(nèi)10-60％B,A=0.1％TFA/H2O,B=0.1％TFA/CH3CN,tR=19分鐘)；收集的洗脫液的質(zhì)譜(ES)m/z計(jì)算值C54H101N10O25(M+H):1289。實(shí)測(cè)值1289。 四價(jià)D1偶聯(lián)物化合物45的合成將TA/D1(5.20mg,7.37×10-7mol)在聚丙烯試管中溶于2.0mL通過氦氣的0.1M乙酸鈉(pH 4.60)緩沖液中。向混合物中加入15.07μL(139μg,1.23×10-7mol)8.147μmol/mLAOTEG/DEA/DEG平臺(tái)(化合物16)的0.1M乙酸鈉(pH4.60)緩沖液溶液。將混合物在氮?dú)夥障聹睾偷財(cái)嚢?3小時(shí)，此時(shí)，分析HPLC表明反應(yīng)已經(jīng)結(jié)束，所述分析HPLC采用4.6mm×250mm,300埃，5μm，聯(lián)苯基柱(Vydac)并于280nm下檢測(cè)(1mL/分鐘，梯度25％-45％B,0-20分鐘，A=0.1％TFA/H2O,B=0.1％TFA/CH3CN)。近似的保留時(shí)間如下TA/D1,13.7分鐘；偶聯(lián)物化合物45,17.2分鐘。將混合物用水稀釋至體積為5mL并通過HPLC純化(10mm×250mm,300埃，5μm，聯(lián)苯基柱(Vydac)(3mL/分鐘；梯度25％-45％B,0-40分鐘，A=0.1％TFA/H2O,B=0.1％TFA/CH3CN)。收集經(jīng)分析HPLC證實(shí)含有純凈偶聯(lián)物化合物45的餾份并冷凍干燥得到1.73mg(48％)偶聯(lián)物化合物45質(zhì)譜(ES，平均m/z)計(jì)算值C1322H2048N334O377S20:29,294。實(shí)測(cè)值29,294。 通過將第五半胱氨酸用烷基鹵化物平臺(tái)烷基化制備四價(jià)D1偶聯(lián)物，化合物65結(jié)構(gòu)域1有四個(gè)氧化形式的半胱氨酸，適當(dāng)折疊的結(jié)構(gòu)域1有兩個(gè)二硫鍵?？梢栽谔烊话腚装彼嵬獾腘-末端或C-末端的任何位置包含第五個(gè)半胱氨酸。在該實(shí)施例中，包含第五個(gè)半胱氨酸，它是β2GPI的第二結(jié)構(gòu)域中固有的。由于其含有游離的巰基，因此第五半胱氨酸可用于和設(shè)計(jì)用于同巰基反應(yīng)的平臺(tái)進(jìn)行反應(yīng)。這種平臺(tái)之一是鹵代乙?；脚_(tái)如化合物23。
將第五-Cys D1(四當(dāng)量)溶于通過氦氣的100mM pH8.0的硼酸鈉緩沖液中。將溶液保持在氮?dú)夥障拢尤脘逡阴；钠脚_(tái)(化合物23)(1當(dāng)量)的溶液。將混合物攪拌至反應(yīng)結(jié)束，然后將混合物通過制備HPLC純化得到四價(jià)的偶聯(lián)物(化合物65)。

AOTEG/PIZ/DEA/DEG平臺(tái)，化合物17的合成將吡啶(610μL,596mg,7.54mmol)緩慢加入到攪拌中的500mg(1.88mmol)化合物8和760mg(3.77mmol)對(duì)-硝基苯基氯甲酸酯的14mL二氯甲烷溶液中，然后將混合物室溫?cái)嚢?8小時(shí)。將混合物冷卻至0℃，然后用1N鹽酸酸化。將得到的混合物在100mL 1N鹽酸和3×100mL二氯甲烷之間進(jìn)行分配。將合并的有機(jī)層干燥(硫酸鎂)，過濾然后濃縮得到1.05g粘的固體。通過硅膠色譜純化(6/4己烷/EtOAc)得到505mg(62％)淺黃色油狀的化合物17:1H NMR(CDCl3)δ1.47(s,9H),3.67-3.78(m,6H),3.80(m,2H),4.02(m,2H),4.48(m,2H),7.40(d,2H),7.50(s,1H),8.29(d,2H)；質(zhì)譜(ES)m/z計(jì)算值C18H26N2O10Na(M+Na):453.1。實(shí)測(cè)值453.0。
BOG-保護(hù)的AOTEG/PIZ/DEA/DEG平臺(tái)，化合物19向化合物18(按照1998年12月9日申請(qǐng)的U.S.系列號(hào)60/111,641中的描述制備)在碳酸氫鈉水溶液和二噁烷的混合物中的溶液中加入4當(dāng)量化合物17的二噁烷溶液。反應(yīng)結(jié)束后，將混合物在水和二氯甲烷之間進(jìn)行分配。將二氯甲烷層濃縮，干燥，然后通過硅膠色譜純化得到化合物19。
AOTEG/PIZ/DEA/DEG平臺(tái)，化合物20按照與制備化合物16時(shí)所述基本相似的方式從化合物19上除去BOC保護(hù)基得到化合物20。 AOTEG/SA/AHAB/TEG平臺(tái)，S-乙?；?2-[2-(2-N-叔丁氧基羰基氨基氧乙氧基)乙氧基]-乙基硫醇，化合物21a的合成向500mg(1.52mmol)化合物9a的30mL丙酮溶液中加入191mg(1.68mmol)硫代乙酸鉀(Aldrich Chemical Co.)。將混合物室溫?cái)嚢?8小時(shí)，然后濾除形成的沉淀。將濾液濃縮并在300mL EtOAc和2×80mL鹽水之間進(jìn)行分配。將EtOAc層干燥(硫酸鈉)，過濾然后濃縮得到460mg(93％)淺棕色油狀的化合物21a:1H NMR(CDCl3)δ1.48(s,9H),2.35(s,3H),3.12(t,2H),3.61(t,2H),3.64(m,4H),3.73(m,2H),4.02(m,2H),5.52(s,1H)；13C NMR(CDCl3)δ28.3,28.8,30.6,69.3,69.8,70.2,70.5,75.3,81.5,156.8,195.3.
2-[2-(2-N-叔丁氧基羰基氨基氧乙氧基)乙氧基]-乙基硫醇，化合物22a將化合物21a用通過氮?dú)獾?/1 6N NH4OH/CH3CN溶液在氮?dú)夥障率覝靥幚?小時(shí)。將混合物真空濃縮得到化合物22a，該化合物可不經(jīng)純化直接使用。
BOC-保護(hù)的AOTEG/SA/AHAB/TEG平臺(tái)，24a將化合物23(按照J(rèn)ones等，《藥物化學(xué)雜志》(J.Med.Chem.)1995,38,2138-2144的描述制備)加入到4當(dāng)量化合物22a在通過氮?dú)獾?0/90 H2O/CH3CN中的溶液中。向形成的溶液中加入4當(dāng)量二異丙基乙基胺。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將混合物在水和二氯甲烷之間進(jìn)行分配。將二氯甲烷層濃縮，干燥，通過硅膠色譜純化得到化合物24a。
AOTEG/SA/AHAB/TEG平臺(tái)，25a按照與制備化合物16時(shí)所述基本相似的方式從化合物24a上除去BOC保護(hù)基得到化合物25a。

AOHEX/SA/AHAB/TEG平臺(tái)，1-碘-6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧己烷，化合物9b的合成向140mg(1.05mmol)N-(叔丁氧基羰基)羥基胺(Aldrich Chemical Co.)和658μL(1.35mg,4.0mmol)化合物12的多相混合物中加入149μL(152mg,1.0mmol)DBU。將混合物室溫?cái)嚢?0秒，此時(shí)，反應(yīng)混合物固化。將該固體放置過夜，然后溶于50mL二氯乙烷。將溶液用2×25mL 1N NaOH和3×25mL 1N HCl洗滌。將合并的堿性含水層用25mL二氯甲烷萃取并將合并的酸性含水層用25mL二氯甲烷萃取。將合并的二氯甲烷層干燥(硫酸鈉)，過濾然后濃縮得到黃色的油。通過硅膠色譜純化(梯度；1/99/0.1至15/85/0.1的EtOAc/己烷/MeOH)得到216mg(68％)黃色油狀的9b:1H NMR(CDCl3)δ1.40(m,4H),1.48(s,9H),1.62(m,2H),1.83(m,2H),3.20(t,2H),3.84(t,2H),7.10(s,1H)。
S-乙?；?6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧己-1-硫醇，化合物21b將化合物9b(209mg,0.61mmol)加入到硫代乙酸鉀的15mL丙酮溶液中，然后將混合物室溫?cái)嚢?8小時(shí)。真空蒸除丙酮，將殘余物在50mL二氯甲烷和3×25mL 1N NaOH之間進(jìn)行分配。將二氯甲烷層干燥(硫酸鈉)，過濾然后濃縮得到棕色油。通過硅膠色譜純化(15/85 EtOAc/己烷)得到166mg(94％)無色油狀的化合物21b:1H NMR(CDCl3)δ1.39(m,4H),1.48(s,9H),1.59(m,4H),2.32(s,3H),2.86(t,2H),3.82(t,2H),7.10(s,1H)。
6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧己-1-硫醇，化合物22b按照如下描述制備純凈的22b的樣品。將化合物21b(50mg,172μmol)和22μL(17.4mg,85.8μmol)三正丁基膦置于氮?dú)夥障?，向混合物中加?mL通過氮?dú)獾?M NaOH的甲醇溶液。將混合物室溫?cái)嚢?8小時(shí)，然后加入172μL(180mg,3mmol)三氟乙酸。將混合物在25mL乙酸乙酯和3×25mL 1N HCl之間進(jìn)行分配。將合并的水層用25mL乙酸乙酯萃取，干燥(硫酸鈉)，過濾然后濃縮得到油。通過硅膠色譜純化(15/85/0.1EtOAc/己烷/MeOH)得到28mg無色油狀的22b:1H NMR(CDCl3)δ1.32(t,1H),1.40(m,4H),1.49(s,9H),1.62(m,4H),2.53(dt,2H),3.84(t,2H),7.09(s,1H)。
BOC-保護(hù)的AOHEX/SA/AHAB/TEG平臺(tái)，24b將化合物21b(13mg,45μmol)和6μL(4.5mg,22.3μmol)三-正丁基膦置于氮?dú)夥障拢蚧旌衔镏屑尤?mL通過氮?dú)獾?/16N NH4OH/CH3CN溶液。將混合物室溫?cái)嚢?小時(shí)然后真空濃縮。將殘余物溶于3mL通過氮?dú)獾?0/90水/CH3CN溶液。將形成的溶液保持在氮?dú)夥障?，向其中依次加?0mg(7.44μmol)化合物23和8μL(5.77mg,44.6μmol)二異丙基乙基胺。將混合物攪拌18小時(shí)然后真空濃縮。將殘余物通過硅膠色譜純化(多梯度，1/99至5/95至7.5/92.5至10/90至15/85的MeOH/CH2Cl2)得到14mg(93％)無色油狀的24b:TLC(10/90 MeOH/CH2Cl2),Rf=0.3；質(zhì)譜(ES)m/z計(jì)算值C92H173N14O26S4(M+H):2018。實(shí)測(cè)值2018。
AOHEX/SA/AHAB/TEG平臺(tái)，25b按照與制備化合物16時(shí)所述基本相似的方式從化合物24b上除去BOC保護(hù)基。

AOHOC/DT/TEG平臺(tái)，6-(叔丁氧羰基氨基氧)己-1-醇，27的合成向179μL(183mg,1.2mmol)DBU的1mL二氯甲烷溶液中加入133mg(1.0mmol)N-(叔丁氧羰基)羥基胺(Aldrich Chemical Co.)和157μL(217mg,1.2mmol)6-溴己-1-醇(Aldrich Chemical Co.)，然后將混合物室溫?cái)嚢?8小時(shí)。將混合物濃縮得到黃色的油。通過硅膠色譜純化(35/5/65 EtOAc/MeOH/己烷)得到180mg(77％)無色油狀的化合物27:1H NMR(CDCl3)δ1.39(m,4H),1.48(s,9H),1.59(m,4H),3.63(t,2H),3.85(t,2H),7.42(s,1H)；13C NMR(CDCl3)δ25.6,25.8,28.1,28.4,62.8,76.8,81.7,157.2。
化合物28:0℃下，向100mg(0.428mmol)化合物27的2mL二氯甲烷溶液中加入90μL(88.1mg,1.11mmol)吡啶，然后加入113mg(0.557mg)對(duì)硝基苯基氯甲酸酯(Aldrich Chemical Co.)。將混合物室溫?cái)嚢?小時(shí)，冷卻至0℃，用1N HCl酸化，然后在20mL 1N HCl和3×20mL二氯甲烷之間進(jìn)行分配。將合并的二氯甲烷層用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，干燥(硫酸鎂)，過濾然后濃縮。通過硅膠色譜純化得到化合物28。
化合物29向二亞乙基三胺的EtOAc溶液中加入2當(dāng)量二異丙基乙基胺，然后加入2當(dāng)量化合物28。將混合物攪拌至反應(yīng)結(jié)束。去除溶劑，將產(chǎn)物(化合物29)通過硅膠色譜純化。
BOC-保護(hù)的AOHOC/DT/TEG平臺(tái)，30向三甘醇雙氯甲酸酯(Aldrich Chemical Co.)的吡啶溶液中加入2當(dāng)量化合物29。將混合物攪拌至反應(yīng)結(jié)束，然后在1N HCl和二氯甲烷之間進(jìn)行分配。將二氯甲烷層干燥然后濃縮，將產(chǎn)物通過硅膠色譜純化得到化合物30。
AOHOC/DT/TEG平臺(tái)，31按照與制備化合物16時(shí)所述基本相似的方式從化合物30上除去BOC保護(hù)基。 AOTEG/IDA/TEG平臺(tái)，化合物32的合成向三甘醇雙氯甲酸酯(Aldrich Chemical Co.)的吡啶溶液中加入2當(dāng)量亞氨二乙酸(AldrichChemical Co.)。將混合物攪拌至反應(yīng)結(jié)束，然后在1N HCl和二氯甲烷之間進(jìn)行分配。將二氯甲烷層干燥然后濃縮，將產(chǎn)物通過硅膠色譜純化得到化合物32。
化合物33將化合物32的THF溶液用6當(dāng)量NHS和6當(dāng)量DCC處理1小時(shí)。向混合物中加入4當(dāng)量化合物11，然后將混合物攪拌至反應(yīng)結(jié)束。加入乙酸以除去過量的DCC，然后濾除形成的固體。將濾液濃縮并通過硅膠色譜純化得到化合物33。
化合物34按照與制備化合物16時(shí)所述基本相似的方式從化合物33上除去BOC保護(hù)基。 AOTEGO/LEV/PITG的合成平臺(tái)，對(duì)硝基苯基乙酰丙酸酯，35向800mg(6.89mmol)乙酰丙酸(Aldrich Chemical Co.)的4.25mL吡啶溶液中加入1.78g(7.58mmol)4-硝基苯基三氟乙酸酯(Aldrich Chemical Co.)。將形成的溶液攪拌15分鐘，然后在28ml水和2×28mL二氯甲烷之間進(jìn)行分配。將合并的二氯甲烷層干燥(硫酸鎂)，過濾然后濃縮。將濃縮物通過硅膠色譜純化(梯度，25/75至30/70的EtOAc/己烷)得到1.06g(74％)化合物35:1HNMR(CDCl3)δ2.28(s,3H),2.87(m,4H),7.29(d,2H),8.28(d,2H).
1,2-雙(2-(叔丁氧羰基)氨基氧乙氧基)乙烷，化合物36向243mg(0.66mmol)化合物12中加入219mg(1.64mmol)N-(叔丁氧基羰基)羥基胺(Aldrich Chemical Co.)，然后加入246μL(250mg,1.64mmol)DBU。將混合物室溫?cái)嚢柚疗涔袒?約1小時(shí))。再放置1小時(shí)后，將混合物溶于2mL二氯甲烷，然后將形成的溶液加入到100mL乙酸乙酯中以使DBU的氫碘酸鹽析出沉淀。另外加入50mL乙酸乙酯，然后將混合物過濾。將濾液用2×50mL 1N HCl、2×50mL 5％亞硫酸氫鈉溶液和25mL鹽水洗滌。將乙酸乙酯層干燥(硫酸鈉)，過濾然后濃縮得到油。通過硅膠色譜純化(梯度，40/60至50/50至80/20的EtOAc/己烷)得到164mg(65％)無色油狀的化合物36:1H NMR(CDCl3)δ1.48(s,18H),3.65(s,4H),3.72(t,4H),4.02(t,4H),7.80(s,2H)；13CNMR(CDCl3)δ28.2,69.0,70.3,75.2,81.3,156.8。
1,2-雙(2-氨基氧乙氧基)乙烷，化合物37將化合物36(559mg,1.47mmol)溶于15mL乙酸乙酯，然后向溶液中通入氯化氫氣體30分鐘。將混合物真空濃縮得到72mg(90％)粘稠的鹽酸鹽形式的化合物37:1H NMR(D2O)δ3.75(s,4H),3.87(m,4H),4.27(m,4H)；質(zhì)譜(ES)m/z計(jì)算值C6H17N2O4(M+H):181.1。實(shí)測(cè)值181.1。
化合物38將化合物3用30％HBr的乙酸溶液處理除去CBZ保護(hù)基得到四胺氫溴酸鹽。將該四胺溶于碳酸氫鈉的水和二噁烷溶液中，然后向溶液中加入4當(dāng)量化合物35。反應(yīng)結(jié)束后，將混合物在水和二氯甲烷之間進(jìn)行分配。將二氯甲烷層濃縮，干燥，然后通過硅膠色譜純化得到化合物38。
AOTEGO/LEV/PITG平臺(tái)，化合物39向化合物38的0.1M pH4.6的乙酸鈉緩沖液中加入20當(dāng)量化合物37。反應(yīng)結(jié)束后，將混合物在水和二氯甲烷之間進(jìn)行分配。將二氯甲烷層濃縮，干燥，然后通過硅膠色譜純化得到化合物39。 AO/DEGA/DEG平臺(tái)，化合物41的合成將溴(約6當(dāng)量)滴加到化合物40、6當(dāng)量三苯膦和8當(dāng)量吡啶的二氯甲烷溶液中直至橙色不再消失。將混合物室溫?cái)嚢?.5小時(shí)或直至反應(yīng)結(jié)束，然后加入飽和亞硫酸氫鈉溶液以破壞過量的溴。將混合物在水和乙酸乙酯之間進(jìn)行分配。將合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥(硫酸鈉)，過濾，濃縮，通過硅膠色譜純化得到化合物41。
化合物42向化合物41中加入6當(dāng)量N-(叔丁氧基羰基)羥基胺(Aldrich Chemical Co.)和6當(dāng)量DBU。將混合物根據(jù)需要加熱足夠長的時(shí)間使反應(yīng)完成。冷卻后，將混合物溶于二氯甲烷并將形成的溶液加入到乙酸乙酯中形成沉淀，過濾除去沉淀，然后將濾液濃縮。通過快速色譜純化得到8。
化合物43按照與制備化合物16時(shí)所述基本相似的方式從化合物42上除去BOC保護(hù)基。 使用化合物37作為雙功能基接頭制備四價(jià)偶聯(lián)物的另一種方法除了將轉(zhuǎn)氨基化的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽直接與四價(jià)氨基氧平臺(tái)反應(yīng)外，還可將轉(zhuǎn)氨基化的結(jié)構(gòu)域1與過量的化合物37在pH4.6的100mM乙酸鈉緩沖液中反應(yīng)得到其中氨基氧接頭通過肟鍵與結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽連接的化合物53。將化合物53與過量的接頭分離，然后將4當(dāng)量化合物53與平臺(tái)38在pH4.6的100mM乙酸鈉緩沖液中反應(yīng)形成第二套肟鍵，得到四價(jià)偶聯(lián)物，化合物54。 使用化合物21a作為雙功能基接頭的前體制備四價(jià)偶聯(lián)物的另一種方法將化合物21a用氫氧化銨處理除去乙酰基硫保護(hù)基，然后用三氟乙酸處理除去BOC保護(hù)基，得到接頭55。將含有乙醛?；亩嚯?在該情況下為TA/D1)與化合物55反應(yīng)得到化合物56，帶有通過肟鍵連接的巰基接頭的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽?？梢詫⑺漠?dāng)量的化合物56與平臺(tái)23反應(yīng)得到四價(jià)結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽偶聯(lián)物，化合物57。 實(shí)施例6結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽四聚體偶聯(lián)化合物44的結(jié)合特性用表面等離子體振子共振的方法分析四聚體偶聯(lián)化合物44與兩種親和純化的人抗β2GPI抗體的結(jié)合。四聚體偶聯(lián)化合物44的kd測(cè)定的材料和方法試劑。CM5芯片、NHS和EDC及HBS-EP緩沖液來自BIAcore。將匯集的人正常IgG(Zymed)固定在芯片上的分離流動(dòng)室中，用作陰性對(duì)照。來自兩個(gè)病人(6701和6626)的親和純化β2GPI結(jié)構(gòu)域1特異抗體固定于分離的流動(dòng)室中。
表面等離子體振子共振。所有的實(shí)驗(yàn)均以流速10μL/分鐘，25℃進(jìn)行于BIAcoreTM2000裝置上。用脫氣HBS-EP緩沖液完成芯片平衡和結(jié)合研究，該緩沖液含0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA和0.005％(v/v)表面活性劑P20。將40μL的0.05M NHS/0.2M EDC流經(jīng)芯片使其活化，然后暴露在合適的蛋白質(zhì)配基中，從而完成蛋白質(zhì)配基通過其游離氨基與CM5芯片的共價(jià)偶聯(lián)。通過使溶于10mM乙酸(pH4.8)的100μg/mL親和純化抗體和正常IgG溶液100μL流經(jīng)NHS活化的CM5芯片，從而將抗體和IgG固定。然后用40μL 1M乙醇胺(pH8.5)淬滅芯片表面的過量反應(yīng)基團(tuán)。
滴定。用HBS-EP稀釋桿狀病毒表達(dá)的β2GPI結(jié)構(gòu)域1和四聚體化合物44，使其流經(jīng)芯片，并收集780秒的應(yīng)答值。在兩次樣品接觸之間用80μL0.1M甘氨酸-HCl(pH2.1)、0.1M NaCl再生芯片。對(duì)各樣品進(jìn)行5次滴定。因?yàn)樵跈z測(cè)期間未達(dá)到結(jié)合平衡，用制造商的軟件(BiaEvaluation version2.2,Uppsala,瑞典)將結(jié)合曲線擬合以下方程式，確定平衡結(jié)合值(Req)Rt=Req(l-e-ks(t-t0))+R0其中Rt是在時(shí)間t時(shí)檢測(cè)的BIAcore應(yīng)答，Req是平衡平臺(tái)應(yīng)答，t是時(shí)間，t0是起始時(shí)間，ks是表觀結(jié)合常數(shù)(ks=kaC+kdis，其中ka是結(jié)合常數(shù)，C是分析物濃度，而Kdis是解離常數(shù))，而R0是應(yīng)答補(bǔ)償，(Marquart-Levenberg算法)。
各滴定結(jié)合曲線均具有陰性對(duì)照(正常IgG)室背景，在滴定時(shí)減去此值。用GraphPad Prism軟件版本2.01將計(jì)算的Req對(duì)濃度作圖。將數(shù)據(jù)擬合單位點(diǎn)結(jié)合(等軸雙曲線Y=Bmax*X/[Kd+X]),Kd值以摩爾單位計(jì)算。通過測(cè)280nm處的吸收值測(cè)定結(jié)構(gòu)域1和化合物44的摩爾濃度，消光系數(shù)為1.85。結(jié)果和討論將來自病人6701和6626的親和純化抗體固定在隔離的微量流動(dòng)腔里，并暴露于不同濃度的人β2GPI結(jié)構(gòu)域1或化合物44。測(cè)定各濃度的平衡結(jié)合值并作圖以確定表觀平衡解離常數(shù)。結(jié)合等溫線見圖10和11(消光系數(shù)=1.85；100μg/mL固定的抗體)，解離常數(shù)見表8。
這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)了親和純化的抗磷脂抗體可與β2GPI的結(jié)構(gòu)域1結(jié)合。此外，它們證實(shí)了結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽與平臺(tái)連接的四聚體偶聯(lián)物也能與這些抗體結(jié)合，親和力與四聚體中存在的結(jié)構(gòu)域1的摩爾濃度相等或更大。
表8結(jié)構(gòu)域1和化合物44與親和純化的抗磷脂抗體結(jié)合的表觀平衡解離常數(shù)

實(shí)施例7體外檢測(cè)結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽偶聯(lián)物的競(jìng)爭性抗體結(jié)合用PBS中的2.5μg/mL β2GPI以100μL/孔的量包被NuncMaxisorp微量平板(Nalge Nunc International,丹麥)，室溫溫育2小時(shí)，用250μl/孔2％脫脂牛奶和0.4％Tween-80(Sigma Chemical Co.)室溫封閉2小時(shí)。用TBS洗5次后，往各孔中添加臨用前1小時(shí)內(nèi)制備的100μL溶液，終濃度為每孔中有1∶200稀釋的病人6501的血漿，不同量的四聚結(jié)構(gòu)域1偶聯(lián)化合物44和化合物45或?qū)φ战Y(jié)構(gòu)域1單體在2％脫脂牛奶和0.4％Tween-80中的溶液。室溫溫育1小時(shí)后用TBS洗平板5次。在各孔中添加100μL以1∶1000稀釋于2％脫脂牛奶和0.4％Tween-80中的堿性磷酸酶偶聯(lián)抗人IgG,γ鏈特異(Zymed)。室溫溫育1小時(shí)后用TBS洗平板5次。在各孔中添加100μlPPMP顯色底物，室溫顯色。在商用微量平板讀取儀(Bio-Tek InstrumentsEL311)測(cè)定各孔在A550nm處的光吸收值。圖12中的結(jié)果顯示化合物44和45均與血清(病人6501)中的抗磷脂抗體有效競(jìng)爭。還原和烷化的結(jié)構(gòu)域1未顯示這樣的競(jìng)爭性，是陰性對(duì)照。常規(guī)的單體結(jié)構(gòu)域1也顯示競(jìng)爭性結(jié)合，用作陽性對(duì)照。實(shí)施例8檢測(cè)結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽偶聯(lián)物的免疫小鼠模型檢測(cè)對(duì)結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽耐受性的免疫模型需滿足的要求是(1)免疫接種必須產(chǎn)生能識(shí)別結(jié)構(gòu)域1的抗體和(2)免疫接種必須不產(chǎn)生識(shí)別結(jié)構(gòu)域1的T細(xì)胞。用結(jié)構(gòu)域1多肽-KLH偶聯(lián)物免疫接種將產(chǎn)生識(shí)別KLH但無對(duì)結(jié)構(gòu)域1之可檢測(cè)反應(yīng)性的T細(xì)胞。為此目的，我們已在昆蟲細(xì)胞體系中制備了含羧基端第五個(gè)半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽(SEQ ID NO:1的第1-66位氨基酸)。此分子已通過第五個(gè)半胱氨酸共價(jià)附著至KLH。將此偶聯(lián)物用于免疫小鼠。用結(jié)構(gòu)域1-KLH偶聯(lián)物免疫產(chǎn)生識(shí)別KLH但對(duì)結(jié)構(gòu)域1無可檢測(cè)反應(yīng)性的T細(xì)胞。另一方面，用結(jié)構(gòu)域1-KLH偶聯(lián)物免疫接種確實(shí)導(dǎo)致了結(jié)構(gòu)域1特異抗體的產(chǎn)生。材料和方法檢測(cè)抗結(jié)構(gòu)域1抗體的ELISA用0.1M碳酸氫鹽(pH9.5)中的β2GPI 5μg/ml 50μl包被NUNC微量滴定孔過夜。用PBS洗孔然后加入2％脫脂奶粉(NFDM)封閉1小時(shí)。洗孔并加入50μl稀釋于2％NFDM中的各小鼠血清的系列稀釋液，室溫溫育1小時(shí)，洗滌并加入50μl堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG，室溫溫育1小時(shí)，洗滌并加入50μl底物。30分鐘后讀取550nm的OD值。制備已用50μg偶聯(lián)物免疫的小鼠血清庫。在所有試驗(yàn)中檢測(cè)此庫并以標(biāo)準(zhǔn)庫的百分?jǐn)?shù)表示。競(jìng)爭性抑制ELISA用0.1M碳酸氫鹽(pH9.5)中的重組β2GPI 5μg/ml 50μl包被NUNC微量滴定板，4℃過夜，用0.15M PBS(pH7.2)洗3次，用溶于PBS的75μl 2％脫脂奶粉(2％NFDM)室溫封閉1小時(shí)。將檢測(cè)抑制劑稀釋于2％NFDM中，往包被的孔中加入25μl各稀釋液或只加入NFDM。單克隆抗體稀釋于2％的NFDM中，將25μl恒定濃度稀釋液加入孔中?；旌峡字兴芤翰⑵桨迨覝販赜?小時(shí)。用PBS洗平板3次后，添加適當(dāng)稀釋于2％NFDM中的50μl堿性磷酸酶偶聯(lián)抗小鼠IgG(γ鏈特異)，37℃溫育1小時(shí)。用PBS洗平板3次后，加入50μl堿性磷酸顯色底物，20℃溫育平板30分鐘。在微量平板自動(dòng)讀取儀上檢測(cè)A550。抑制百分率測(cè)定如下[(無抑制劑之對(duì)照孔的平均A550-背景A550)-(有抑制劑時(shí)的A550-背景A550)/(無抑制劑之對(duì)照孔的平均A550-背景A550)]×100?？菇Y(jié)構(gòu)域1抗體的免疫小鼠模型用吸附于明礬上的10、50或100μg KLH-結(jié)構(gòu)域1偶聯(lián)物及2×109個(gè)百日咳桿菌作佐劑免疫接種5只C57B1/6小鼠組。3周后用10μg鹽水中的偶聯(lián)物對(duì)所有小鼠加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)7天后給小鼠放血，收獲血清并檢測(cè)抗結(jié)構(gòu)域1的活性。結(jié)果顯示于圖14中。用結(jié)構(gòu)域1-KLH免疫接種不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)域1特異的抗體應(yīng)答。小鼠免疫接種和T細(xì)胞增殖試驗(yàn)將乳化于完全弗氏佐劑(CFA)中的25μg結(jié)構(gòu)域1(D1)-KLH偶聯(lián)物從后足墊處注射入C57B1/6小鼠。將乳化CFA(無抗原)從后足墊處注射入另一組小鼠中。7天后從各組的5只小鼠中收獲腘淋巴結(jié)。從類似的免疫接種中收集淋巴結(jié)并制備單細(xì)胞懸液。除了檢測(cè)抗原是D1-KLH、KLH和結(jié)構(gòu)域1(未偶聯(lián))外，如上所述象培養(yǎng)人細(xì)胞一樣培養(yǎng)這些細(xì)胞。PPD用作陽性對(duì)照。第四天，將25μl含1μCi的3H-胸苷加入各孔中。第五天，收獲孔中的內(nèi)含物并測(cè)定各孔中的放射性。用陰性對(duì)照的平均CPM除各孔的CPM，計(jì)算各孔的刺激指數(shù)(SI)。測(cè)定各重復(fù)試驗(yàn)的平均值(和標(biāo)準(zhǔn)偏差)SI。結(jié)果和討論用競(jìng)爭性抑制ELISA試驗(yàn)測(cè)定多克隆小鼠抗KLH-結(jié)構(gòu)域1偶聯(lián)物的特異性。在已用β2GPI包被的孔中將多種重組形式的β2GPI與有限量的抗體混合。然后用堿性磷酸酶偶聯(lián)的二抗檢測(cè)仍與孔結(jié)合的抗體量。如方法部分所述測(cè)定抑制作用百分率，并對(duì)抑制劑的微摩爾濃度作圖。結(jié)果如圖15所示。用同一偶聯(lián)物免疫接種確實(shí)產(chǎn)生了特異于結(jié)構(gòu)域1的抗體應(yīng)答(圖15)。
至于T細(xì)胞增殖，圖13的結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)域1-KLH免疫小鼠的細(xì)胞對(duì)結(jié)構(gòu)域1-KLH和KLH以及陽性對(duì)照PPD應(yīng)答，引起增殖。它們不對(duì)結(jié)構(gòu)域1(非偶聯(lián)的)產(chǎn)生應(yīng)答。另一方面，只用CFA免疫的小鼠的細(xì)胞不對(duì)檢測(cè)抗原產(chǎn)生應(yīng)答，但對(duì)陽性對(duì)照PPD產(chǎn)生應(yīng)答。
也就是說，對(duì)于免疫小鼠模型而言，抗原引發(fā)作用必須不引發(fā)識(shí)別所給耐受原的T細(xì)胞，但必須產(chǎn)生將識(shí)別耐受原的記憶B細(xì)胞，在此處所提及的免疫小鼠模型符合對(duì)免疫小鼠模型的這兩個(gè)基本要求。實(shí)施例9檢測(cè)在體內(nèi)作為耐受原的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽用明礬上與匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽并如上所述使用百日咳桿菌作為佐劑免疫小鼠。3周后，用一定劑量范圍的耐受原處理小鼠，耐受原可以與平臺(tái)偶聯(lián)或不偶聯(lián)。未處理的一組作為對(duì)照組。5天后，用與KLH偶聯(lián)的10μg結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽加強(qiáng)免疫包括對(duì)照組在內(nèi)的所有小鼠，7天后給小鼠放血。用已知方法分析它們血清中的抗-β2GPI結(jié)構(gòu)域1抗體，包括，例如上文實(shí)施例中所述的ELISA。然后將這些值用于確定組中所有個(gè)體的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)施例10檢測(cè)T細(xì)胞反應(yīng)性確認(rèn)缺乏對(duì)于結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的T細(xì)胞反應(yīng)性表明，作為耐受原來說，它不從T細(xì)胞提供任何第二信號(hào)的表位給B細(xì)胞。相反，如果耐受原為T細(xì)胞提供增殖(活化)信號(hào)，則耐受原可能會(huì)加強(qiáng)B細(xì)胞的應(yīng)答。
為了測(cè)定T細(xì)胞活化作用，收集循環(huán)淋巴細(xì)胞并進(jìn)行組織培養(yǎng)。將待測(cè)結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽加至培養(yǎng)物上約1周。在這周末，用3H-胸苷脈沖標(biāo)記T細(xì)胞以測(cè)定是否有細(xì)胞增殖。任選地，也測(cè)定了組織培養(yǎng)物上清中細(xì)胞因子的存在情況。實(shí)施例11抗β2GPI抗體通過延遲因子Va的失活作用有助于超凝血方法在存在和缺乏被診斷具抗磷脂綜合癥(APS)之病人的親和純化抗體或總IgG制品時(shí)測(cè)定阻塞起始后正常人血漿中的已活化因子V(Va)水平。親和純化抗體鑒定為抗β2GPI結(jié)構(gòu)域1。如下所述從病人血清中制備總IgG。
用Amelung KC4A微凝血儀以修改過的兩階段阻塞試驗(yàn)測(cè)定因子Va水平如下。在旋轉(zhuǎn)的微量比色池中37℃預(yù)熱50μl因子V缺陷的人血漿(Chromogenix)1分鐘。用預(yù)熱的(37℃)Owren’s緩沖液(Sigma)以1∶10稀釋樣品。將50μl稀釋樣品加入50μl因子V缺陷的血漿中。將100μl37℃的ThromboMAX加鈣(Sigma)加入以引發(fā)阻塞。記錄阻塞的時(shí)間。1個(gè)單位的Va活性定義為用正常參照人血漿(Accuclot,Sigma)的1∶10稀釋液凝血V缺陷血漿的時(shí)間。在此實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，1個(gè)單位的因子Va活性相應(yīng)于約30秒的凝血時(shí)間。
為了測(cè)定存在或缺乏抗磷脂抗體或IgG時(shí)隨時(shí)間產(chǎn)生的因子Va的量，利用以下系統(tǒng)產(chǎn)生以上標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)中所測(cè)的樣品。混合以下試劑并在37℃溫育一份正常人參照血漿(Accuclot,Sigma)，一份25mMCaCl2和一份含磷脂酰絲氨酸試劑(125μg/ml)和Tris-緩沖鹽水(TBS)及抗體或IgG的溶液(在預(yù)期濃度適用時(shí))。將TBS用于修正抗體或IgG的體積差異。在添加37℃CaCl2引發(fā)凝血前混合正常血漿、磷脂酰絲氨酸、抗體或IgG(若存在)和TBS并在37℃溫育2分鐘，凝塊形成后即將其去除。樣品混合物的總體積取決于所檢驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)目。在各時(shí)間點(diǎn)取出12.5μl溫育樣品，1∶10稀釋于Owren’s緩沖液中，并用上文的標(biāo)準(zhǔn)因子Va試驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。樣品中隨時(shí)間產(chǎn)生的Va的水平反映在因子V缺陷血漿凝固時(shí)間的校正上。凝血4-5分鐘時(shí)有最高的Va水平，因子Va活性水平在4-7個(gè)單位的范圍內(nèi)。這相應(yīng)于此實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)中約5-6秒的凝血時(shí)間。
在將APS病人IgG添加到試驗(yàn)中的情況下，通過混合100μl血清(用Pierce Immunopure IgG結(jié)合緩沖液1∶l稀釋)和100μl瓊脂糖固定的蛋白G珠(Pierce Immunopure Plus)從人血清樣品中制備總IgG。
在常溫下緩慢振蕩混合物10分鐘。蛋白G結(jié)合人免疫球蛋白G之所有亞類的Fc區(qū)域。10分鐘后短暫離心混合物以沉淀珠子。棄血清混合物上清。
然后用200μlIgG結(jié)合緩沖液洗結(jié)合有IgG的珠子3次，以去除吸附的蛋白質(zhì)。隨后用3倍100μlIgG洗脫緩沖液(Pierce,Immunopure IgG洗脫緩沖液)從蛋白G珠上將結(jié)合的IgG洗脫下來。立即用100μl 1M NaPO4pH7.5中和洗脫的IgG，從100μl血漿樣品中得到了總的終體積為400μl的IgG制品。中和過的IgG制品儲(chǔ)存于4℃待分析。
用標(biāo)準(zhǔn)的微量平板Bradford方法(Bio-Rad試劑)測(cè)定IgG制品的蛋白質(zhì)濃度。檢測(cè)3份試樣，各樣品每份5μl,以各平板上的牛血清清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)曲線。用KC4軟件計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。
為了因子Va凝血試驗(yàn)中分析，用Microcon離心過濾裝置(Amicon，截流分子量30000)將100μl IgG制品濃縮至25μl.25μl全用于單時(shí)間點(diǎn)因子Va檢驗(yàn)。結(jié)果體外凝血試驗(yàn)中比較來自抗磷脂病人的總IgG和來自正常對(duì)照的親和純化抗體延遲因子Va失活的能力。總IgG和親和純化抗體的結(jié)果分別見表9和圖16。來自正常對(duì)照受試者的IgG和親和純化抗體不改變?cè)谄鹗寄?0分鐘觀察到的因子Va的失活作用。相反，來自抗磷脂病人的IgG延遲了因子Va的失活作用(Student’s t-檢驗(yàn)為p＜0.05)。用親和純化抗體也觀察到對(duì)因子Va失活的相似作用。這些數(shù)據(jù)顯示，人抗β2GPI抗體可通過延遲因子Va的失活作用部分產(chǎn)生超凝血狀態(tài)。表9APS病人IgGI.D.20＂Va IgG 活性(單位) (mg) (單位/mg)73080.980.0812.2573090.850.0614.1773100.850.0614.1773110.840.0712.0073120.920.0615.3373130.820.0613.6773141.130.0618.8373150.990.0714.1473160.870.0614.5073170.920.0811.5073180.810.0810.1373190.950.10 9.5073200.830.0516.6073210.840.0712.0073220.810.0613.5073230.830.09 9.7673010.830.0516.6073020.870.0517.4073031.050.0813.1373041.440.0720.5773050.790.08 9.8873060.900.0712.8673071.100.0715.7165011.160.0619.3366361.210.0524.2066250.860.10 8.6066460.720.0514.4066231.170.0716.7165100.700.0514.00平均0.930.0714.33STD 0.170.01 3.55
正常IgGI.D.20＂Va IgG 活性(單位) (mg) (單位/mg)N260F 0.770.06 12.83N712M 0.690.07 9.86N266F 0.780.09 8.67N199F 0.790.08 9.88N280M 0.760.07 10.86平均0.760.07 10.42STD 0.0396230.011402 1.557503盡管為了便于理解，通過圖示說明和實(shí)施例已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了一些詳述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將明顯認(rèn)識(shí)到可對(duì)其進(jìn)行進(jìn)行一定程度的變化和修改。因此，這些描述和實(shí)施例不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明范圍由所附的權(quán)利要求來說明。
序列表<110>Marquis,M.DavidIverson,M.GilbertVictoria,J.EdwardJones,S.DavidLinnik,Matthew<120>治療和診斷性的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽及其使用方法<130>252312006900<140>未轉(zhuǎn)讓<141>1999-06-08<150>60/088,656<151>1998-06-09<150>60/103,088<151>1998-10-05<160>30<170>Windows Version 3.0所用的FastSEQ<210>1<211>978<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(1)...(978)<400>1gga cgg acc tgt ccc aag cca gat gat tta cca ttt tcc aca gtg gtc 48Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val1 5 10 15ccg tta aaa aca ttc tat gag cca gga gaa gag att acg tat tcc tgc 96Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys20 25 30aag ccg ggc tat gtg tcc cga gga ggg atg aga aag ttt arc tgc cct144Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro35 40 45ctc aca gga ctg tgg ccc atc aac act ctg aaa tgt aca ccc aga gta192Leu Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val50 55 60tgt cct ttt gct gga atc tta gaa aat gga gcc gta cgc tat acg act240Cys Pro Phe Ala Gly Ile Leu Glu Asn Gly Ala Val Arg Tyr Thr Thr65 70 75 80ttt gaa tat ccc aac acg atc agt ttt tct tgt aac act ggg ttt tat288Phe Glu Tyr Pro Asn Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr Gly Phe Tyr85 90 95ctg aat ggc gct gat tct gcc aag tgc act gag gaa gga aaa tgg agc336Leu Asn Gly Ala Asp Ser Ala Lys Cys Thr Glu Glu Gly Lys Trp Ser100 105 110ccg gag ctt cct gtc tgt gct ccc atc atc tgc cct cca cca tcc ata384Pro Glu Leu Pro Val Cys Ala Pro Ile Ile Cys Pro Pro Pro Ser Ile115 120 125cct acg ttt gca aca ctt cgt gtt tat aag cca tca gct gga aac aat432Pro Thr Phe Ala Thr Leu Arg Val Tyr Lys Pro Ser Ala Gly Asn Asn130 135 140tcc ctc tat cgg gac aca gca gtt ttt gaa tgt ttg cca caa cat gcg480Ser Leu Tyr Arg Asp Thr Ala Val Phe Glu Cys Leu Pro Gln His Ala145 150 155 160atg ttt gga aat gat aca att acc tgc acg aca cat gga aat tgg act528Met Phe Gly Asn Asp Thr Ile Thr Cys Thr Thr His Gly Asn Trp Thr165 170 175aaa tta cca gaa tgc agg gaa gta aaa tgc cca ttc cca rca aga cca576Lys Leu Pro Glu Cys Arg Glu Val Lys Cys Pro Phe Pro Ser Arg Pro180 185 190gac aat gga ttt gtg aac tat cct gca aaa cca aca crt tat tac aag624Asp Asn Gly Phe Val Asn Tyr Pro Ala Lys Pro Thr Leu Tyr Tyr Lys195 200 205gat aaa gcc aca ttt ggc tgc cat gat gga tat tct ctg gat ggc ccg672Asp Lys Ala Thr Phe Gly Cys His Asp Gly Tyr Ser Leu Asp Gly Pro210 215 220gaa gaa ata gaa tgt acc aaa ctg gga aac tgg tct gcc atg cca agt720Glu Glu Ile Glu Cys Thr Lys Leu Gly Asn Trp Ser Ala Met Pro Ser225 230 235 240tgt aaa gca tct tgt aaa tta cct gtg aaa aaa gcc act gtg gtg tac768Cys Lys Ala Ser Cys Lys Leu Pro Val Lys Lys Ala Thr Val Val Tyr245 250 255caa gga gag aga gta aag att cag gaa aaa ttt aag aat gga atg cta816Gln Gly Glu Arg Val Lys Ile Gln Glu Lys Phe Lys Asn Gly Met Leu260 265 270cat ggt gat aaa gtt tct ttc ttc tgc aaa aat aag gaa aag aag tgt864His Gly Asp Lys Val Ser Phe Phe Cys Lys Asn Lys Glu Lys Lys Cys275 280 285agc tat aca gag gat gct cag tgt ata gat ggc act atc gaa gtc ccc912Ser Tyr Thr Glu Asp Ala Gln Cys Ile Asp Gly Thr Ile Glu Val Pro290 295 300aaa tgc ttc aag gaa cac agt tct ctg gct ttt tgg aaa act gat gca960Lys Cys Phe Lys Glu His Ser Ser Leu Ala Phe Trp Lys Thr Asp Ala305 310 315 320tcc gat gta aag cca tgc 978Ser Asp Val Lys Pro Cys325<210>2<211>326<212>PRT<213>人<400> 2Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val1 5 10 15Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys20 25 30Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro35 40 45Leu Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val50 55 60Cys Pro Phe Ala Gly Ile Leu Glu Asn Gly Ala Val Arg Tyr Thr Thr65 70 75 80Phe Glu Tyr Pro Asn Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr Gly Phe Tyr85 90 95Leu Asn Gly Ala Asp Ser Ala Lys Cys Thr Glu Glu Gly Lys Trp Ser100 105 110Pro Glu Leu Pro Val Cys Ala Pro Ile Ile Cys Pro Pro Pro Ser Ile115 120 125Pro Thr Phe Ala Thr Leu Arg Val Tyr Lys Pro Ser Ala Gly Asn Asn130 135 140Ser Leu Tyr Arg Asp Thr Ala Val Phe Glu Cys Leu Pro Gln His Ala145 150 155 160Met Phe Gly Asn Asp Thr Ile Thr Cys Thr Thr His Gly Asn Trp Thr165 170 175Lys Leu Pro Glu Cys Arg Glu Val Lys Cys Pro Phe Pro Ser Arg Pro180 185 190Asp Asn Gly Phe Val Asn Tyr Pro Ala Lys Pro Thr Leu Tyr Tyr Lys195 200 205Asp Lys Ala Thr Phe Gly Cys His Asp Gly Tyr Ser Leu Asp Gly Pro210 215 220Glu Glu Ile Glu Cys Thr Lys Leu Gly Asn Trp Ser Ala Met Pro Ser225 230 235 240Cys Lys Ala Ser Cys Lys Leu Pro Val Lys Lys Ala Thr Val Val Tyr245 250 255Gln Gly Glu Arg Val Lys Ile Gln Glu Lys Phe Lys Asn Gly Met Leu260 265 270His Gly Asp Lys Val Ser Phe Phe Cys Lys Asn Lys Glu Lys Lys Cys275 280 285Ser Tyr Thr Glu Asp Ala Gln Cys Ile Asp Gly Thr Ile Glu Val Pro290 295 300Lys Cys Phe Lys Glu His Ser Ser Leu Ala Phe Trp Lys Thr Asp Ala305 310 315 320Ser Asp Val Lys Pro Cys325<210>3<211>192<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(1)...(192)<400>3gga cgg acc tgt ccc aag cca gat gat tta cca ttt tcc aca gtg gtc 48Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val1 5 10 15ccg tta aaa aca ttc tat gag cca gga gaa gag att acg tat tcc tgc 96Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys20 25 30aag ccg ggc tat gtg tcc cga gga ggg atg aga aag ttt arc tgc cct144Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro35 40 45crc aca gga ctg tgg ccc arc aac act ctg aaa tgt aca ccc aga gta192Leu Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val50 55 60<210>4<211>64<212>PRT<213>人<400>4Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val1 5 10 15Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys20 25 30Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro35 40 45Leu Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val50 55 60<210>5<211>6<212>PRT<213>人<400>5Cys Thr Pro Arg Val Cys1 5<210>6<211>6<212>PRT<213>人<400>6Phe Ser Thr Val Val Pro1 5<210>7<211>7<212>PRT<213>人<400>7Lys Pro Pro Asp Asp Leu Pro1 5<210>8<211>6<212>PRT<213>人<400>8Gly Arg Thr Cys Pro Lysl 5<210>9<211>6<212>PRT<213>人<400>9Thr Leu Lys Cys Thr Pro1 5<210>10<211>6<212>PRT<213>人<400>10I1e Cys Pro Leu Thr Gly1 5<210>11<211>6<212>PRT<213>人<400>11Phe Ile Cys Pro Leu Thr1 5<210>12<211>6<212>PRT<213>人<400>12Ile Thr Tyr Ser Cys Lys1 5<210>13<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>13aaaccacctt aatggtgatg gtgatggtgg ccacatggct ttaca45<210>14<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>14gacatactct gggtgtccgt cctgcaatag c31<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>15tggagggcag atgatccgtc ctgcaatagc30<210>16<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>16gaatgggcat tttacttccc gtcctgcaat agc33<210>17<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>17aggtaattta caagatgccc gtcctgcaat agc33<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>18atggtgatgg tggccacaac ttggcatggc30<210>19<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400> 19atggtgatgg tggccgcatt ctggtaattt ag32<210> 20<211> 5<212>PRT<213>人工序列<220><223>從β2GPI(SEQ ID NO:2)中缺失第3-60位氨基酸<400> 20Gly Arg Thr Pro Arg1 5<210> 21<211> 5<212>PRT<213>人工序列<220><223>從β2GPI(SEQ ID NO2)中缺失第3-120位氨基酸<400> 21Gly Arg Ile Ile Cys1 5<210> 22<211> 5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>從β2GPI(SEQ ID NO:2)中缺失第3-182位氨基酸<400>22Gly Arg Glu Val Lys1 5<210>23<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>從β2GPI(SEQ ID NO:2)中缺失第3-242位氨基酸<400>23Gly Arg Ala Ser Cys1 5<210>24<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>從β2GPI(SEQ ID NO:2)中缺失第242-326位氨基酸或第182-326位氨基酸或第165-326位氨基酸或第123-326位氨基酸<400>24Gly Arg Thr Cys Pro1 5<210>25<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>25ctataaatac ggatcccggg aattcg26<210>26<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>26gcagctggcc aactctgggt gtacatttca gagtg35<210>27<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>27gcagctggcc aatgatggga gcacagagag gaag34<210>28<211>63<212>PRT<213>人<400>28Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val1 5 10 15Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys20 25 30Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro35 40 45Leu Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg50 55 60<210>29<211>62<212>PRT<213>人<400>29Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val Pro1 5 10 15Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys Lys20 25 30Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro Leu35 40 45Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg50 55 60<210>30<211>65<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>30Gly Arg Thr Cys Pro Lys Pro Asp Asp Leu Pro Phe Ser Thr Val Val1 5 10 15Pro Leu Lys Thr Phe Tyr Glu Pro Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Ser Cys20 25 30Lys Pro Gly Tyr Val Ser Arg Gly Gly Met Arg Lys Phe Ile Cys Pro35 40 45Leu Thr Gly Leu Trp Pro Ile Asn Thr Leu Lys Cys Thr Pro Arg Val50 55 60Cys6權(quán)利要求
1．含結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的多肽，其中所述多肽可特異結(jié)合β2GPI-依賴型抗磷脂抗體，且該多肽不是由多肽SEQ ID NO:2(圖1)組成；也不是由β2GPI的結(jié)構(gòu)域1、2和3組成；也不是由β2GPI的結(jié)構(gòu)域1、2、3和4組成。
2．權(quán)利要求1的多肽，其中結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽含多肽SEQ IDNO:4(圖2)。
3．權(quán)利要求1的多肽，其中結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽選自包括SEQ IDNO:5-12的組。
4．權(quán)利要求1的多肽，其中結(jié)構(gòu)域1 β2GPI多肽含SEQ ID NO:1的約第1-66位氨基酸。
5．權(quán)利要求1的多肽，其中結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽含SEQ ID NO:4的約第1-59位氨基酸。
6．含權(quán)利要求1之多肽的融合多肽。
7．含權(quán)利要求1之多肽的聚合多肽。
8．權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽缺乏T細(xì)胞表位，所說的T細(xì)胞表位能在具β2GPI依賴型抗磷脂抗體的個(gè)體中激活T細(xì)胞。
9．權(quán)利要求8的多肽的偶聯(lián)物。
10．權(quán)利要求9的偶聯(lián)物，其中該偶聯(lián)物包含標(biāo)記。
11．權(quán)利要求9的偶聯(lián)物，其中該偶聯(lián)物包含價(jià)鍵平臺(tái)分子。
12．權(quán)利要求11的偶聯(lián)物，其中的平臺(tái)分子是蛋白質(zhì)類的。
13．權(quán)利要求11的偶聯(lián)物，其中的平臺(tái)分子是非蛋白質(zhì)類的。
14．權(quán)利要求11的偶聯(lián)物，其中價(jià)鍵平臺(tái)分子群的分子量是均勻的。
15．權(quán)利要求11的偶聯(lián)物，其中平臺(tái)分子通過硫醚鍵與多肽連接。
16．權(quán)利要求11的偶聯(lián)物，其中平臺(tái)分子通過肟鍵與多肽連接。
17．權(quán)利要求11的偶聯(lián)物，其中平臺(tái)分子是
18．權(quán)利要求11的偶聯(lián)物，其中平臺(tái)分子是
19．權(quán)利要求11的偶聯(lián)物，其中偶聯(lián)物是 其中D1是β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽。
20．權(quán)利要求11的偶聯(lián)物，其中偶聯(lián)物是 其中D1是β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽。
21．編碼權(quán)利要求1多肽的分離的天然存在的多核苷酸。
22．編碼權(quán)利要求1多肽的非天然存在的多核苷酸。
23．編碼權(quán)利要求8多肽的分離的天然存在的多核苷酸。
24．編碼權(quán)利要求8多肽的非天然存在的多核苷酸。
25．含權(quán)利要求21之多核苷酸的表達(dá)載體。
26．含權(quán)利要求21之多核苷酸的克隆載體。
27．用權(quán)利要求21之多核苷酸轉(zhuǎn)化了的宿主細(xì)胞。
28．結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的模擬物，其中該模擬物可特異結(jié)合結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽能特異結(jié)合的β2GPI-依賴型抗磷脂抗體。
29．權(quán)利要求28的模擬物，它是一種多肽。
30．權(quán)利要求29的模擬物，它缺乏T細(xì)胞表位，所說的T細(xì)胞表位能在具β2GPI依賴型抗磷脂抗體的個(gè)體中激活T細(xì)胞。
31．用于檢測(cè)可與結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽特異結(jié)合的抗體，以合適的包裝包含權(quán)利要求1之多肽的試劑盒。
32．用于檢測(cè)凝血的試劑盒，其中以合適的包裝包含權(quán)利要求1之多肽。
33．含有效量的權(quán)利要求8之多肽的組合物，其中有效量是足以誘發(fā)耐受性的量。
34．權(quán)利要求33的組合物，其中還包括藥用可接受的賦形劑。
35．含有效量的權(quán)利要求1之多肽的組合物，其中有效量是足以檢測(cè)β2GPI依賴型抗磷脂抗體的量。
36．檢測(cè)樣品中可與權(quán)利要求1之多肽特異結(jié)合的抗體的方法，包括(a)在允許形成穩(wěn)定的抗原-抗體復(fù)合物的條件下使樣品中的抗體與權(quán)利要求1的多肽接觸；和(b)檢測(cè)步驟(a)中形成的穩(wěn)定復(fù)合物(如果有的話)。
37．權(quán)利要求36的方法，其中的抗體是β2GPI-依賴型抗磷脂抗體。
38．純化β2GPI-依賴型抗磷脂抗體的方法，包括在允許穩(wěn)定的抗原-抗體復(fù)合物形成的條件下使生物樣品與權(quán)利要求1的多肽接觸，并收獲形成的復(fù)合物(如果有的話)。
39．誘發(fā)個(gè)體耐受性的方法，包括將含權(quán)利要求8之多肽的有效量組合物施用于該個(gè)體。
40．權(quán)利要求39的方法，其中的個(gè)體是人。
41．誘發(fā)個(gè)體耐受性的方法，包括將含權(quán)利要求11之偶聯(lián)物的有效量組合物施用于該個(gè)體。
42．權(quán)利要求41的方法，其中的個(gè)體是人。
43．權(quán)利要求42的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:4的約第1-60位氨基酸的序列。
44．檢測(cè)β2GPI-依賴型抗磷脂抗體介導(dǎo)的凝血的方法，包括以下步驟(a)用來自個(gè)體的合適生物學(xué)樣品進(jìn)行第一個(gè)凝血實(shí)驗(yàn)，其中實(shí)驗(yàn)中添加權(quán)利要求1的多肽；(b)在缺乏權(quán)利要求1之多肽的條件下用來自該個(gè)體的合適生物學(xué)樣品進(jìn)行第二個(gè)凝血實(shí)驗(yàn)；(c)比較步驟(a)和(b)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中結(jié)果中存在差異表明了β2GPI-依賴型抗磷脂抗體對(duì)凝血的介導(dǎo)。
全文摘要
本發(fā)明提供了結(jié)構(gòu)域1β
文檔編號(hào)G01N33/68GK1310759SQ99808415
公開日2001年8月29日 申請(qǐng)日期1999年6月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月9日
發(fā)明者D·M·瑪奎斯, G·M·艾沃森, E·J·維克多利亞, D·S·瓊斯, M·D·林尼克 申請(qǐng)人:拉卓拉藥物公司