專利名稱:神經(jīng)變性的鑒別診斷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及神經(jīng)變性的診斷領(lǐng)域。本發(fā)明涉及新的使用檢測體液中的不同神經(jīng)學標記的聯(lián)合測定法來鑒別診斷神經(jīng)變性的方法。本發(fā)明還涉及新的檢測腦脊液中的Rab3a、SNAP25或α-融合核素(α-synuclein)的方法,以及這些方法在用于鑒別診斷神經(jīng)變性的聯(lián)合測定法中的用途。
背景技術(shù):
神經(jīng)變性是多種神經(jīng)學疾病的特征之一。神經(jīng)變性可能牽涉到軸索損害,逐漸發(fā)展的神經(jīng)元死亡;神經(jīng)遞質(zhì)的釋放或受體的功能異常;髓磷脂的破壞;CNS血流改變;血/腦屏障機能障礙和/或改變的氧代謝;其他CNS代謝途徑的困難和/或各種其他(常常是未知的)可能引起CNS機能障礙的情況。今天,不同的疾病已與神經(jīng)機能障礙的不同方面聯(lián)系起來(有關(guān)的概述參見Wilson等,1991年)。例如,早老性癡呆是所有神經(jīng)變性疾病中最重要的,其中牽涉到大腦皮質(zhì)中神經(jīng)細胞的死亡和消失。這是老年人中最常見的癡呆,它給病人和家庭帶來了痛苦,并因需要對受到該疾病的影響而完全失去能力的病人進行長期護理而導(dǎo)致了經(jīng)濟上的損失。額顳葉性癡呆是原發(fā)性退變性癡呆的第二種最常見的類型,占所有癡呆病人的大約3-10%(Brun,1993年;Knopman,1993年)。臨床表現(xiàn)的特征是出現(xiàn)主導(dǎo)性額葉綜合征(Sjgren,1997年),這也可在其他疾病象情感性精神病和精神分裂癥中觀察到(Abbruzzese等,1997年)。雷維小體病是與進行性癡呆或精神病一起存在的疾病。帕金森氏病的征兆在開始時可能不存在或較輕微,但最終變得普遍,且僵化通常很嚴重。雷維小體大量見于腦干、基底前腦、丘腦下體和新大腦皮質(zhì)。帕金森氏病是發(fā)生于中老年的雷維小體病類型,它有非常徐緩的進展和長時間的病程??梢詫⑺醋魇巧窠?jīng)系統(tǒng)疾病的例子,主要涉及黑質(zhì)紋狀體多巴胺能系統(tǒng)。另一方面,腦血管疾病是由與腦部血管有關(guān)的多個病理過程之一引起的。它是發(fā)達國家中繼心臟病和癌癥之后列第三位的主要死亡原因,總的流行率達到794人每100 000人。65歲以上的人群中有5%受到中風的影響,中風是作為這些病理過程之一的結(jié)果發(fā)生的急性神經(jīng)學損傷。神經(jīng)變性也可能因接觸某些化學物質(zhì)(表1)、輻射、化療或低氧-局部缺血事件而引起。兒童期白血病和腦腫瘤的治療(或預(yù)防)的長期并發(fā)癥包括行為變化、學習成績不好、記憶力損失、智力下降、生長遲緩、激素失調(diào)、和CT掃描異常(大腦萎縮、腦室擴張、大腦內(nèi)鈣化)。白血病幸存者在經(jīng)過未照射顱側(cè)的放射治療或化學治療后分別觀察到了智力發(fā)育延遲(IQ、記憶力、注意力、空間視覺能力短缺)(Fletcher等,1988年)或認知能力衰退(Ochs等,1991年)。此外,4歲以下的孩子特別容易受到顱側(cè)放療和/或化療的神經(jīng)毒性作用的傷害(Moore等,1986年;Jannoun等,1983年)。對于大多數(shù)藥劑來說,高劑量的治療、聯(lián)合化療、伴隨的顱側(cè)放療以及頸動脈內(nèi)(intracarotic)或鞘內(nèi)注射都比標準的口服或靜脈內(nèi)治療更有可能導(dǎo)致神經(jīng)學并發(fā)癥。神經(jīng)系統(tǒng)的任何部分都可能受到損害。當癌癥病人受到更有力的治療、接受更多的化療、活得更長時,以及當新的化療試劑開發(fā)出來、現(xiàn)有試劑的使用增強或以新的途徑使用時,癌癥化療的神經(jīng)學并發(fā)癥將變得更普遍、更嚴重和更復(fù)雜。
對于大多數(shù)神經(jīng)學病況,由于疾病過程容易證明,病人都尋求一般的醫(yī)療護理。臨床醫(yī)師的任務(wù)是開發(fā)能對疾病的部位和其可能的病因作出精確診斷的神經(jīng)學分析方法。只有在準確的診斷后,才可能對疾病進行有效的處置和治療。現(xiàn)已開發(fā)出一些用于診斷病人的神經(jīng)變性的技術(shù),諸如正電子發(fā)射X線體層照像術(shù)(PET),單光子發(fā)射計算體層攝影術(shù)(SPECT)和核磁共振光譜學(NMRS),這些技術(shù)使得有可能研究腦的功能和結(jié)構(gòu)。但是,大多數(shù)神經(jīng)學疾病仍然是在排除了其它疾病形式的基礎(chǔ)上進行臨床診斷的,并且在有些情況下,甚至不可能將不同的神經(jīng)學疾病區(qū)別開來。例如,對精神抑制藥敏感的雷維小體型癡呆或雷維小體癡呆(LBD)在臨床上非常難以與早老性癡呆區(qū)分(McKeith等,1996年;Ballard等,1998年)。多數(shù)病人(75%以上)是從神經(jīng)病理學上定義為早老性癡呆病人,同時據(jù)估計有15-25%的臨床上診斷為早老性癡呆的病人患有雷維小體性癡呆(Hooten等,1998年)。由于雷維小體性癡呆對乙酰膽堿酯酶治療更為敏感,因此要得到最佳治療效果,就必需將雷維小體性癡呆與早老性癡呆區(qū)別開(Levy等,1994年;Perry等,1994年;Wilcock等,1994年)。
額顳葉性癡呆也經(jīng)常被誤診為其它類型的癡呆或其它精神病,因為在其它疾病中也可觀察到額顳葉性癡呆的癥狀。
在血管疾病和早老性癡呆之間沒有明確的差別,此時也明顯存在誤診的危險。由于對血管疾病進行藥物治療是可能的,因此早期的正確診斷十分重要。
對于大多數(shù)神經(jīng)病學家來說,對由誘導(dǎo)因素諸如某些化學物質(zhì)、輻射、化療或低氧-局部缺血事件等引起的腦損害的識別和治療仍然是經(jīng)常而重要的臨床問題。在臨床診斷不明確的情況下,最后的診斷只能不可挽回地通過神經(jīng)病理學檢查作出。這樣,就只有通過尸檢才可能精確地鑒別診斷神經(jīng)變性。因此,用于早期檢測病人的神經(jīng)學疾病和用于監(jiān)控由不同因素誘導(dǎo)的神經(jīng)學變化的方法,對于確定是否可以繼續(xù)接觸誘導(dǎo)因素、對個體患者使用的劑量和藥物是否適宜、以及對于開始恰當?shù)闹委煟紝⒎浅S袔椭?br>
最近有許多神經(jīng)學標記已適合使用,它們能反映與細胞死亡、軸突生長/再誘導(dǎo)、炎癥和/或血腦屏障機能障礙有關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的病況。
例如,微管相關(guān)蛋白τ是雙螺旋絲狀體(PHF)和神經(jīng)纖絲團(NFT)的主要蛋白成分(Brion等,1985年;Delacourte和Defossez,1986年;Grundke-Iqbal等,1986年;Kosik等,1986年;Wood等,1986年;Kondo等,1988年)。τ蛋白存在不同的同種型,其中在成人的腦中發(fā)現(xiàn)了4-6種,但在胎兒的腦中只檢測到1個同種型。多種多樣的同種型是通過可變mRNA剪接而從人17號染色體上的單基因產(chǎn)生的(Himmler,1989年;Goedert等,1989年;Andreadis等,1992年)。正如從分子克隆推斷出的,τ蛋白的最顯著的特性是一段31或32個氨基酸的序列,它出現(xiàn)在分子的羧基末端部分,這段序列可以重復(fù)3或4次。其他多樣性是通過τ分子的NH2-末端部分中的29或58個氨基酸長的插入片段產(chǎn)生的(Goedert等,1989年)。在體內(nèi),τ通過涉及其集中在τ的重復(fù)區(qū)(255-381)的微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域的相互作用促進微管在神經(jīng)元的軸索隔室中的裝配和穩(wěn)定性(Lewis等,1988年)。在正常情況下,成人的腦含有2-3摩爾磷酸每摩爾τ(Selden和Pollard,1983年;Ksiezak-Reding等,1992年)。根據(jù)對大鼠和人的研究,正常τ蛋白中不同部位的磷酸化依賴于發(fā)育狀態(tài)(Lee等,1991年;Bramblett等,1993年;Goedert等,1993年)。作為磷酸化的結(jié)果產(chǎn)生的60、64和68 kDa的τ變種已在顯示神經(jīng)纖絲團的腦部區(qū)域中檢測到(Delacourte等,1990年;Goedert等,1992年;Flament等,1990年;Greenberg和Davies,1990年)。這些腦含有6-8摩爾磷酸每摩爾τ(Ksiezak-Reding等,1992年)。在從PHF分離的τ(PHF-τ)中,在多個位置上發(fā)生磷酸化(Iqbal等,1989年;Lee等,1991年;Hasegawa等,1992年)。迄今為止,對腦提取物中的磷酸-τ的檢測,無論是經(jīng)由抗體(Mab Alz50:Ghanbari等,1990年;Mab Ab423:Harrington等,1991年;Mab AT120:Vandermeeren等,1993年;Mab AT180;Mab AT270國際申請公開WO95/17429;和Mab AT8國際申請公開WO 93/08302),還是經(jīng)由分子量的改變(Flament等,1990年),或者是借助功能測定(Bramblett等,1992年),都已用于區(qū)別帶有改變的細胞骨架性能的癡呆和正常的老齡病人或患有其他類型癡呆的病人。各自識別τ的非磷酸化表位的單克隆抗體的組合已用于檢測腦脊液中τ和PHF-τ的存在(Van de Voorde等,1995年)。
神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的γ-亞單位是神經(jīng)元胞質(zhì)溶膠的主要成分(Kato等,1981年)。NSE占到可溶性腦蛋白總量的3%。在成人中,它被認為可用于評估局部缺血、感染或腫瘤起源的活性神經(jīng)元損害(Garcia等,1994年)。對兒童血清中的NSE尚沒有研究。Nara等(1988年)顯示,腦脊液或血清中的高濃度NSE與昏迷兒童的不良結(jié)果和死亡相關(guān)。但是,增加的血清NSE不是CNS起源必要的。有一些組織,包括外周神經(jīng)元、內(nèi)分泌腺、淋巴細胞、紅細胞和血小板,含有NSE(Kaiser,1989年),這可能危害這種標記的單獨使用。
β-淀粉狀蛋白是40-43個氨基酸長的肽,它從叫做淀粉樣前體蛋白或APP的大的前體蛋白經(jīng)由蛋白水解切割產(chǎn)生。淀粉狀蛋白是在正常細胞的代謝過程中產(chǎn)生的。淀粉樣肽顯示出高度的不均一性?,F(xiàn)已鑒別出兩種主要形式的β-淀粉狀蛋白β-淀粉狀蛋白(1-40)和β-淀粉狀蛋白(1- 42)。β-淀粉狀蛋白(1-42)是早老性癡呆、唐氏綜合征和正常老化的腦中的神經(jīng)炎性斑的主要成分。它可能是神經(jīng)毒性的,并且已知能增加神經(jīng)元的易損性而導(dǎo)致其他損傷。此外,低濃度的可溶性淀粉狀蛋白可導(dǎo)致獨立于并行的神經(jīng)毒性的膽堿能活動減退。乙酰膽堿在認知過程中起決定性的作用(Auld等,1998年)。特異性識別肽的了解充分的表位的高親和力單克隆抗體的開發(fā)已導(dǎo)致了對未濃縮腦脊液中的β-淀粉狀蛋白(1-42)肽的簡單測試法(Citron等,1997年;Johnson-Wood等,1997年)。這種測試已證明在監(jiān)控干擾APP加工的藥物、輻射或化學物質(zhì)的長期作用中也是有價值的。
生長相關(guān)蛋白-43(GAP-43)(也叫做神經(jīng)調(diào)制素(neuromodulin)或B-50)是神經(jīng)組織特異性蛋白,主要集中在軸突和突觸前末端。GAP-43被認為在神經(jīng)元的生長、軸突的形成、以及在再生和神經(jīng)元的萌芽中起主要作用(Skene和Willard,1981年;Basi,1987年;Benowitz等,1989年;Mercken等,1992a)。突觸蛋白在突觸功能中起不同作用。在確定可用于融合的小泡的量時,象突觸蛋白這樣的蛋白質(zhì)是重要的,而在將小泡定向到膜上時,Rab3a和Rab親和蛋白是重要的。??窟^程由小突觸小泡蛋白、SNAP25、Sec和突觸融合蛋白的分子復(fù)合物來確定,而據(jù)信CSP和突觸結(jié)合蛋白在小泡內(nèi)容物的Ca2+-依賴性釋放中起重要作用。α-融合核素富有黑質(zhì)和基底神經(jīng)節(jié)的突觸,并屬于包括α-融合核素和γ-融合核素的蛋白質(zhì)家族。
存在和穩(wěn)定于體液中的并且反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元的代謝狀態(tài)的這類細胞內(nèi)標記可能在神經(jīng)變性的早期識別中是有用的,甚至是在臨床征兆出現(xiàn)之前??墒褂?可能與其他診斷方法結(jié)合使用)的神經(jīng)元功能的生化指標將非常有助于提高神經(jīng)變性的臨床診斷準確度和對其的醫(yī)療監(jiān)控。
早老性癡呆的特征在于豐富的細胞外衰老斑、細胞內(nèi)團塊和突觸損失。τ蛋白和β-淀粉狀蛋白(1-42)分別是這些團塊和斑(這是AD的神經(jīng)病理學檢查中的兩種診斷結(jié)構(gòu))中的必需成分。τ蛋白和β-淀粉狀蛋白(1- 42)均已在腦脊液(CSF)中檢測到,并且現(xiàn)在已完全肯定CSF-τ和CSF-β-淀粉狀蛋白(1-42)可以用作早老性癡呆的神經(jīng)學標記,盡管尚不清楚與早老性癡呆的病理生理學有關(guān)的CSF濃度怎樣變化。CSF-τ在早老性癡呆病人中與年齡相當?shù)膶φ障啾仍黾恿?,并且涉及到腦中的團塊的數(shù)量,而β-淀粉狀蛋白(1-42)在早老性癡呆病人體內(nèi)卻減少了。β-淀粉狀蛋白(1-42)可能與斑的形成無關(guān),因為在沒有彌漫性衰老斑的癡呆諸如額葉性癡呆中發(fā)現(xiàn)它減少了。盡管有關(guān)腦組織的研究提示了斑和癡呆程度的關(guān)系,并確定地提示了團塊和癡呆程度的關(guān)系,但正如通過簡短精神狀態(tài)確定的那樣,CSF-τ和CSF-β-淀粉狀蛋白(1-42)的濃度并非始終與癡呆程度有關(guān),也會發(fā)生與其他類型的癡呆的重疊。除了使用τ和β-淀粉狀蛋白(1-42)外,使用β-淀粉狀蛋白(1-40)作為神經(jīng)學標記(Shoji等,1998年)沒有改善對早老性癡呆的診斷測定,因為β-淀粉狀蛋白(1-40)在早老性癡呆病人體內(nèi)的濃度與正常對照相比沒有變化(Motter等,1995年)。
有關(guān)腦GAP-43的研究顯示,其濃度在早老性癡呆的額葉皮質(zhì)中降低了,但在其他區(qū)域中則升高了(Coleman等,1992年)。對于癡呆病患者的體液中的GAP-43還沒有進行過研究。
AD病人腦中的另一個重要的結(jié)構(gòu)變化是突觸損失。事實上,最近的測量團塊、斑和突觸損失的量的研究顯示,突觸損失是主要與癡呆程度相關(guān)聯(lián)的(Terry等,1991年)。近來的研究中觀察到了突觸小泡蛋白免疫反應(yīng)性的降低。對于其他突觸蛋白也證明了類似的降低情況突觸結(jié)合蛋白,Rab3a,小突觸小泡蛋白和突觸融合蛋白(Blennow等,1996年;Davidsson等,1996年;Shimohama等,1997年;Ferrer等,1998年)。對于幾種形式的帕金森氏病來說,也有強烈的跡象表明突觸蛋白起病理作用。在兩種罕見的家族性帕金森氏病形式中檢測到了α-融合核素的兩種突變,并且α-融合核素被描繪為是雷維小體中的主要成分。體內(nèi)雷維小體的形成可由融合核素的積聚產(chǎn)生,融合核素積聚可能是快速軸突運輸減少或融合核素過量表達的結(jié)果(Jensen等,1998年)。由于突觸蛋白看來是癡呆程度的主要相關(guān)因素之一(Terry等,1991年),因此它將用于提供檢測和定量體液中的突觸蛋白的方法。對于突觸蛋白在CSF中的存在和定量尚沒有進行充分探究。嗜鉻粒蛋白已經(jīng)用作CSF中突觸損失的標記,但減少只顯示在“純”或Ⅰ型早老性癡呆中(Blennow等,1995年)。之后不久顯示在CSF中存在突觸結(jié)合蛋白Ⅰ(Davidsson等,1996年)。在這項研究中證明,突觸結(jié)合蛋白在早老性癡呆病人的左海馬結(jié)構(gòu)和額葉皮質(zhì)的9號布勞德曼區(qū)中選擇性減少了。在CSF的集合體的基礎(chǔ)上顯示這種減少也可見于CSF中,但尚未定量。Davidsson等(1996年)未能檢測CSF中的Rab3a和突觸小泡蛋白。
對于因接觸某些化學物質(zhì)、輻射、化療或低氧-局部缺血事件而導(dǎo)致的神經(jīng)變性來說,也沒有準確的診斷工具。產(chǎn)前窒息可能與神經(jīng)后遺癥有關(guān)。然而,對于低氧-局部缺血事件后的腦損害嚴重性的早期準確評估仍然是新生兒護理中最困難的問題之一。迄今,臨床的、腦電圖描記和神經(jīng)放射學評估,加上腦血流量研究,是最容易獲得的方法。隨著“CSF中各成分的變化反映了改變的腦代謝活性”這一點逐漸變得越來越明顯,對CSF神經(jīng)學標記的檢測可以補充低氧-局部缺血事件的評估中的臨床數(shù)據(jù)(Garcia-Alix等,1994年)。對于化療、輻射或低氧-局部缺血事件后的老年時期的CSF神經(jīng)學標記和行為變化之間的聯(lián)系從未評估過。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供特定檢測、定量和/或鑒別診斷個體的神經(jīng)變性的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供更具體的檢測、定量和/或鑒別診斷個體的早老性癡呆的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供更具體的檢測、定量和/或鑒別診斷個體的雷維小體病的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供更具體的檢測、定量和/或鑒別診斷個體的帕金森氏病的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供更具體的檢測、定量和/或鑒別診斷個體的額顳葉性癡呆的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供區(qū)別早老性癡呆和帕金森氏病的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供區(qū)別早老性癡呆和雷維小體性癡呆的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供特定檢測或定量早老性癡呆中的血管問題的方法以及鑒別診斷不同形式的早老性癡呆的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供診斷因化療導(dǎo)致的或因接觸化學物質(zhì)或輻射導(dǎo)致的神經(jīng)變性的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供診斷個體因采用化療治療白血病或腦腫瘤而導(dǎo)致神經(jīng)變性的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供診斷由產(chǎn)前窒息而導(dǎo)致的神經(jīng)變性的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供新的用于檢測腦脊液中突觸蛋白Rab3a的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供新的用于檢測腦脊液中Rab3a的方法,從而可以更具體地檢測、定量和/或鑒別診斷個體的神經(jīng)變性。
本發(fā)明的另一個目的是提供新的用于檢測腦脊液中Rab3a的方法,從而可以更具體地檢測、定量和/或鑒別診斷早老性癡呆。
本發(fā)明的另一個目的是提供新的用于檢測腦脊液中突觸蛋白α-融合核素的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供新的用于檢測腦脊液中α-融合核素的方法,從而可以更具體地檢測、定量和/或鑒別診斷個體的神經(jīng)變性。
本發(fā)明的另一個目的是提供新的用于檢測腦脊液中α-融合核素的方法,從而可以更具體地檢測或定量早老性癡呆和/或雷維小體病和/或可以鑒別診斷早老性癡呆與雷維小體病。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于實施如上所述的方法的診斷試劑盒。
本發(fā)明的另一個目的是提供治療性監(jiān)控和/或確定某種治療的有效性的方法。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及特定檢測、定量和/或鑒別診斷個體的神經(jīng)變性的方法。這些方法涉及測定所述個體的一種或多種體液樣品中至少三種神經(jīng)學標記的濃度,由此通過所述所有神經(jīng)學標記的濃度與對照樣品相比的數(shù)量變化來反映神經(jīng)變性的類型和程度。
從本發(fā)明的實施例可以看出,通過使用至少三種神經(jīng)學標記,可以更特定和靈敏地檢測許多神經(jīng)變性疾病。同樣很明顯,通過使用至少三種神經(jīng)學標記,就有可能將在臨床診斷的基礎(chǔ)上無法鑒別的多種神經(jīng)變性疾病區(qū)別開來。
本申請中所用的術(shù)語“神經(jīng)變性”和“神經(jīng)變性疾病”代表相同的含義,在整個申請文件中可以互換使用。這些術(shù)語包括與神經(jīng)元機能障礙有關(guān)的任何一種腦病。Wilson等(1991年)的文章中提及了各種與神經(jīng)變性有關(guān)的疾病。它們包括早老性癡呆,中風(局灶性腦損傷),彌漫性腦損傷,血管疾病,帕金森氏病,雷維小體病,克羅伊茨費爾特-雅各布病,額顳葉性癡呆,急性熱病性多神經(jīng)炎,多發(fā)性硬化,常壓性腦積水,肌萎縮性側(cè)索硬化,精神分裂癥,抑郁,山黧豆中毒,癲癇和窒息。不過,這個名單并不完全。還包括已知與神經(jīng)元機能障礙有關(guān)的其他疾病。神經(jīng)變性也包括與神經(jīng)元機能障礙有關(guān)的以及由特定誘導(dǎo)因素引起的任何方式的腦損害或任何一種腦病。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中,要特定檢測、定量和/或鑒別診斷的神經(jīng)變性疾病選自下列成員早老性癡呆,雷維小體病,帕金森氏病和額顳葉性癡呆。雷維小體病用于表示在腦干、基底前腦、丘腦下體和/或新大腦皮質(zhì)中顯示雷維小體的任何一種疾病。雷維小體病包括帕金森氏病、多系統(tǒng)性萎縮和雷維小體性癡呆。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中,要特定檢測、定量和/或鑒別診斷的神經(jīng)變性疾病是由低氧-局部缺血事件、化療、放療導(dǎo)致的,或者是由于接觸化學物質(zhì)或輻射導(dǎo)致的。更具體地說,神經(jīng)變性可能由在白血病或腦腫瘤的治療過程中的化療或放療引起。
不過,這里列出的神經(jīng)變性疾病并不完全,應(yīng)當還包括其中腦出現(xiàn)機能障礙的其他疾病。
本發(fā)明中所用的詞語“特定檢測神經(jīng)變性”的意思是檢測某種疾病或某種神經(jīng)學病因與某種神經(jīng)變性疾病的關(guān)聯(lián)時,比用少于三種神經(jīng)學標記進行診斷時獲得的結(jié)果具有更高的靈敏度和特異性。
本發(fā)明中所用的詞語“定量神經(jīng)變性”的意思是確定因某種神經(jīng)變性疾病導(dǎo)致的神經(jīng)元機能障礙的程度。本發(fā)明中所用的詞語“鑒別診斷神經(jīng)變性”是指以“將某種疾病或某種神經(jīng)學病因與某種神經(jīng)變性疾病關(guān)聯(lián)起來”這種方式區(qū)別開各種神經(jīng)變性疾病。
特定檢測、定量和/或鑒別診斷個體的神經(jīng)變性是通過使用包含下列步驟的免疫測定檢測所述個體的一種或多種體液樣品中的至少三種不同的神經(jīng)學標記完成的-從所述個體獲得一種或多種體液樣品;和-在適合生成抗原-抗體復(fù)合物的條件下,使所述體液樣品與各自識別該體液樣品中的不同神經(jīng)學標記的至少三種不同抗體(第一抗體或捕獲抗體)接觸;和-檢測所述抗體與所述體液樣品的免疫結(jié)合;-推斷所述體液中所述神經(jīng)學標記的濃度,所述所有神經(jīng)學標記的濃度與對照樣品相比的數(shù)量變化反映了神經(jīng)變性的類型和程度。
然后進行檢測免疫結(jié)合的過程將由抗原和識別其中一種神經(jīng)學標記的抗體形成的所述抗原-抗體復(fù)合物與下列物質(zhì)混合在一起a)第二抗體(或檢測抗體)
*它可以是識別抗原-抗體復(fù)合物的特異性表位但不識別單獨的第一抗體的單克隆抗體,或者*它可以是識別抗原-抗體復(fù)合物的特異性表位但不識別單獨的第一抗體的多克隆抗體,所述多克隆抗體優(yōu)選使用固定化神經(jīng)學標記或神經(jīng)學標記-第一抗體復(fù)合物通過免疫親和層析純化;b)用于特異性標記所述第二抗體或與所述第二抗體偶聯(lián)的標記,所述標記是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何可能的標記;c)用于進行抗體和體液樣品之間的、第二抗體和神經(jīng)學標記-第一抗體復(fù)合物之間的和/或從另一方面來說,結(jié)合第二抗體和標記之間的免疫反應(yīng)的適宜緩沖溶液;和d)出于標準化的目的,也可能是與用于檢測神經(jīng)學標記的抗體反應(yīng)的純化蛋白質(zhì)或合成肽。
有利地,用于本發(fā)明的抗體為固定在適宜支持體上的固定化狀態(tài)。這些抗體可以存在于最多三個(在檢測3個以上神經(jīng)學標記的情況下為多個)不同的支持體上或存在于同一個支持體上。當抗體存在于同一個支持體上時(例如在一個微量滴定板的孔中),每種抗體的免疫結(jié)合可以利用特異性標記進行檢測。另外,抗體可以存在于同一支持體的不同位置上。在后者的情況下,檢測可以用測定這些抗體中任何一種的免疫結(jié)合的通用標記進行。有利地,第二抗體自身攜帶著標記或用于直接或間接與標記偶聯(lián)的基團。另外,本發(fā)明的方法可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何一種其他免疫測定形式加以實施。
術(shù)語“表位”是指被抗體結(jié)合部位特異性束縛的抗原-抗體復(fù)合物部分。表位可以用本領(lǐng)域中已知的任何一種技術(shù)確定,或者可以用本領(lǐng)域中已知的各種各樣的計算機預(yù)測模型預(yù)測。
本發(fā)明中所用的詞語“識別”、“與……反應(yīng)”、“免疫結(jié)合”或“生成抗原-抗體復(fù)合物”將被解釋為抗原和抗體之間在遵守抗體和抗原的免疫學特性的所有條件下發(fā)生的結(jié)合。
術(shù)語“體液”是指人體中存在的所有液體,包括但不限于血液、淋巴、尿和腦脊液(CSF)。
在一個具體實施方案中,本發(fā)明涉及如上所述的方法,其中體液樣品選自腦脊液樣品和血液樣品。血液樣品可包括從病人采集的全血樣品。更優(yōu)選的是血液樣品包括血漿樣品或血清樣品。
在本發(fā)明的方法中,也有可能檢測兩種不同體液中的相同標記(同時檢測至少另外一種標記)或者檢測三種不同體液中的相同標記。例如,檢測腦脊液中的兩種神經(jīng)學標記,同時在血漿中檢測這兩種神經(jīng)學標記之一。如實施例部分中所示,同樣地檢測兩種不同體液中的相同標記可使檢測更特定和靈敏,與只在一種體液中檢測這種標記相比,可以更好地鑒別診斷神經(jīng)變性。
在本發(fā)明的方法中檢測的神經(jīng)學標記可以是與某種類型的神經(jīng)元細胞功能有關(guān)的任何一種蛋白質(zhì),它們在神經(jīng)變性的條件下在一種或多種體液中的濃度指示了疾病過程或神經(jīng)學病因。在一定的神經(jīng)學疾病條件下,在一種或多種體液中,有些神經(jīng)學標記的濃度升高了,另一些則降低了。在一定的神經(jīng)學疾病條件下在某種體液中,3、4、5、6、7、8種或更多濃度發(fā)生改變的神經(jīng)學標記的任何可能的組合可以用于特定檢測、定量和/或鑒別診斷個體的所述神經(jīng)學疾病。用于特定檢測、定量和/或鑒別診斷神經(jīng)變性的可能的神經(jīng)學標記包括τ蛋白,神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE),β-淀粉狀蛋白(1-42),β-淀粉狀蛋白(1-40),神經(jīng)調(diào)制素,突觸蛋白(諸如Rab3a,SNAP25,α-融合核素,突觸蛋白,突觸結(jié)合蛋白,小突觸小泡蛋白,突觸融合蛋白,Rab親和蛋白,n-sec,半胱氨酸線性蛋白(cystein string protein)以及其他),膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP),S100,IL6,TNF,IL1,IL2,神經(jīng)纖絲(NF),髓鞘堿性蛋白(MBP)和14-3-3。不過,這個名單并不完全,指示某種疾病過程或神經(jīng)學病因的其他神經(jīng)學標記也可以使用。其中一些神經(jīng)學標記在患有不同神經(jīng)學疾病和腦損害的病人的體液中的行為顯示在表2中。
特異性識別上面所提到的神經(jīng)學標記之一的、本領(lǐng)域中制備或存在的任何單克隆或多克隆抗體可以用于檢測神經(jīng)學標記。特異性識別τ蛋白的抗體包括Alz50(Ghanbari等,1990年),Ab423(Harrington等,1991年),AT8(國際申請公開WO 93/08302),AT120(Vandermeeren等,1993年);AT180和AT270(國際申請公開WO 95/17429)以及AT100(國際申請公開WO 96/04309)。但也可以使用本領(lǐng)域中已知的特異性識別τ蛋白的其他抗體。特異性識別NSE的抗體包括10C1和2E7以及購自Innogenetics(Gent,Belgium)的其他抗體,商業(yè)上可獲得的抗體,諸如可從Dako購得的(Glostrup,Denmark;Cat No BBS/NC/VI-H14),從Biogenex購得的(San Ramon,CA,USA;Cat No MA055-5C和AM055-5M),從RDI購得的(Flanders,NJ,USA;Cat No RDI-TRK4N6),從Roche Diagnostic Systems購得的(Basel,Switzerland;Cat No 0734373),從Immunosource購得的(Brussels,Belgium;Cat No CLA 73/5和CR7041M)以及從Cortex Biochem購得的(San Leandro,CA,USA;Cat No CR7047)。這個有關(guān)識別NSE的抗體的名單并不完全,其他抗體(商業(yè)上獲得的或本領(lǐng)域中描述的)也可以使用。特異性識別β-淀粉狀蛋白的抗體包括2H3,8E5(Johnson-Wood等,1997年),10H3(Majocha等,1992年;Friedland等,1994年),2G3(Citron等,1996年),BA-27和BC-05(Suzuki等,1994年),BNT77(Asami-Odaka等,1995年),369.2B(Knig等,1996年),22C11(Lannfelt等,1995年),6E10(Kim等,1990年)和AMY-33(Stern等,1990年)。但也可使用本領(lǐng)域中已知的識別β-淀粉狀蛋白的另外任何一種抗體。特異性識別神經(jīng)調(diào)制素的抗體包括NM2(Oestreicher等,1994年),NM4(Six等,1992年),NM1,NM3,NM6,NM7和NM8(Mercken等,1992a)。但也可使用本領(lǐng)域中已知的識別神經(jīng)調(diào)制素的另外任何一種抗體。特異性識別Rab3a的抗體包括商業(yè)上可獲得的抗體,諸如可從Transduction Labs購得的(Lexington,KY,USA;Cat No R35520)。也可使用商業(yè)上獲得或本領(lǐng)域中描述的識別Rab3a的其他抗體。特異性識別SNAP25的抗體包括商業(yè)上可獲得的抗體,諸如可從Serotec購得的(Oxford,UK;Cat No SP12),從Sternberger Monoclonals公司購得的(Distributedby Affinity Research Products Lim.,Mamhead,Exeter,UK;Cat NoSMI-81),從Chemicon購得的(Temecula,CA,USA;Cat No MAB331)和從Transduction Labs購得的(Lexington,KY,USA;Cat No S35020)。這個有關(guān)識別SNAP25的抗體的名單并不完全,也可以使用商業(yè)上獲得的或本領(lǐng)域中描述的識別SNAP25的其他抗體。特異性識別α-融合核素的抗體包括商業(yè)上可獲得的抗體,諸如可從Transduction Labs購得的(Lexington,KY,USA;Cat No S63320)。也可以使用商業(yè)上獲得或本領(lǐng)域中描述的識別α-融合核素的其他抗體。用于特定檢測有可能用作神經(jīng)學標記的其他突觸蛋白的各種抗體也是商業(yè)上可獲得的和/或本領(lǐng)域中已知的。特異性識別S100的抗體包括商業(yè)上可獲得的抗體,諸如可從Biogenex購得的(San Ramon,CA,USA;Cat No MA058-C和AM058-5M)和從Innogenetics購得的(Gent,Belgium;Cat No M-011)。這個有關(guān)識別S100的抗體的名單并不完全,也可以使用商業(yè)上獲得的或本領(lǐng)域中描述的識別S100的其他抗體。特異性識別14-3-3的抗體包括商業(yè)上可獲得的抗體,諸如可從Santa Cruz Biotechnology購得的(Santa Cruz,CA,USA;Cat No sc-1657)和從Transduction Labs購得的(Lexington,KY,USA;Cat No F46820)。這個有關(guān)識別14-3-3的抗體的名單并不完全,也可以使用商業(yè)上獲得的或本領(lǐng)域中描述的識別14-3-3的其他抗體。特異性識別神經(jīng)纖絲的抗體包括商業(yè)上可獲得的抗體,諸如可從Innogenetics購得的(Gent,Belgium;Cat NoM-011和M-005)和從Alexis購得的(Lufelfingen,Switzerland;Cat No BC-4000-A-L001和BC-4010-A-L001)。這個有關(guān)識別神經(jīng)纖絲的抗體的名單并不完全,也可以使用商業(yè)上獲得的或本領(lǐng)域中描述的識別神經(jīng)纖絲的其他抗體。
衍生自這些單克隆抗體的片段諸如Fab,F(ab)’2,ssFv(“單鏈可變片段”)和其他保留了抗體可變區(qū)的抗體樣構(gòu)造,假如它們保留了原始的結(jié)合性能,就可用于本發(fā)明的方法。這些片段一般利用,例如,木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或其他蛋白酶對抗體的酶促消化產(chǎn)生。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說眾所周知的是,單克隆抗體或其片段可以修飾后用于各種用途。小抗體和多價抗體諸如二價體(diabodies)、三價體、四價抗體和五價體(peptabodies)也可以用于本發(fā)明的方法。國際專利申請WO98/29442中全面描述了這些片段和多價抗體的制備和使用。
用于本發(fā)明方法的單克隆抗體可以是利用重組DNA技術(shù)制成的鼠單克隆抗體的人源化變型,脫離了編碼H和L鏈的鼠和/或人基因組DNA序列或編碼H和L鏈的cDNA克隆。另外,用于本發(fā)明方法的單克隆抗體可以是人單克隆抗體。術(shù)語“人源化抗體”是指免疫球蛋白的至少一部分構(gòu)架區(qū)衍生自人免疫球蛋白序列。
本發(fā)明方法中所用的抗體可以利用酶、熒光或放射性型的適宜標記物進行標記。
在本發(fā)明的具體實施方案中,至少一種要在上述方法中檢測的神經(jīng)學標記選自下列成員τ蛋白,磷酸-τ蛋白,β-淀粉狀蛋白(1-42),β-淀粉狀蛋白(1-40),神經(jīng)調(diào)制素,神經(jīng)元特異性烯醇化酶和/或突觸蛋白。其中有一種選自上述成員的、3、4、5、6、7、8種或多種標記的任何可能的組合可以用于特定檢測、定量和/或鑒別診斷個體的神經(jīng)變性。很清楚,要用于本發(fā)明方法的1個以上(即2、3、4、5、6、7個或更多)或者甚至是所有神經(jīng)學標記都可選自上述成員。
在本發(fā)明的更具體的實施方案中,要在上述方法中檢測的1個、更優(yōu)選2個、首選3個神經(jīng)學標記選自下列成員-τ蛋白,β-淀粉狀蛋白(1-42)和神經(jīng)調(diào)制素;或-τ蛋白,神經(jīng)元特異性烯醇化酶和神經(jīng)調(diào)制素;或-τ蛋白,磷酸-τ蛋白和β-淀粉狀蛋白(1-42);或在另一個更具體的實施方案中,在一種體液(優(yōu)選CSF)中檢測τ蛋白,并在兩種不同的體液(優(yōu)選CSF和血漿)中檢測β-淀粉狀蛋白(1-42)。
在本發(fā)明的另一個更具體的實施方案中,要在上述方法中檢測的至少一種神經(jīng)學標記是選自下列成員的突觸蛋白Rab3a、SNAP25和α-融合核素。其中有一種選自上述突觸蛋白成員的、3、4、5、6、7、8種或多種標記的任何可能的組合可以用于特定檢測、定量和/或鑒別診斷個體的神經(jīng)變性。
因此,本發(fā)明也涉及新的檢測腦脊液中的Rab3a的方法,該方法至少包含以下步驟-從個體獲得腦脊液樣品;和-在適合生成抗原-抗體復(fù)合物的條件下,使所述腦脊液樣品與識別Rab3a的單克隆抗體(第一抗體或捕獲抗體)接觸;和-檢測所述抗體與所述腦脊液樣品的免疫結(jié)合。
盡管特異性識別Rab3a的抗體可以用于檢測腦組織中的Rab3a,但檢測腦脊液中的Rab3a時卻沒有這么顯著。Davidsson等(1996年)利用他們所用的方法未能檢測出腦脊液中的Rab3a。
能特定檢測腦脊液中的Rab3a的任何抗體都可用于本發(fā)明的新方法。用于本發(fā)明方法的優(yōu)選的單克隆抗體可以從Transduction Labs獲得(Lexington,KY,USA;Cat No R35520)。
有利地,用于本發(fā)明的單克隆抗體為固定在適宜支持體上的固定化狀態(tài)。另外,本發(fā)明的方法可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何一種其他免疫測定形式加以實施。
然后進行檢測免疫結(jié)合的過程將由抗原和識別Rab3a的抗體形成的所述抗原-抗體復(fù)合物與下列物質(zhì)混合在一起
a)第二抗體(或檢測抗體)*它可以是識別抗原-抗體復(fù)合物的表位但不識別單獨的第一抗體的單克隆抗體;或者*它可以是識別抗原-抗體復(fù)合物的表位但不識別單獨的第一抗體的多克隆抗體,所述多克隆抗體優(yōu)選使用固定化Rab3a或Rab3a-第一抗體復(fù)合物通過免疫親和層析純化。
b)用于特異性標記所述第二抗體或與所述第二抗體偶聯(lián)的標記,所述標記是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何可能的標記;c)用于進行抗體和腦脊液樣品之間的、第二抗體和神經(jīng)學標記-第一抗體復(fù)合物之間的和/或結(jié)合第二抗體和標記之間的免疫反應(yīng)的適宜緩沖溶液;和d)出于標準化的目的,也可能是與識別Rab3a的抗體反應(yīng)的純化蛋白質(zhì)或合成肽。
如本發(fā)明實施例中所示,多克隆Rab3a血清可以用作檢測抗體。
有利地,第二抗體自身攜帶著標記或用于直接或間接與標記偶聯(lián)的基團。
本發(fā)明也涉及新的檢測腦脊液中的SNAP25的方法,該方法至少包含以下步驟-從個體獲得腦脊液樣品;和-在適合生成抗原-抗體復(fù)合物的條件下,使所述腦脊液樣品與識別SNAP25的單克隆抗體(第一抗體或捕獲抗體)接觸;和-檢測所述抗體與所述腦脊液樣品的免疫結(jié)合。
盡管特異性識別SNAP25的抗體可以用于檢測腦組織中的SNAP25,但檢測腦脊液中的SNAP25時卻沒有這么顯著且以前沒有顯示過。
能特定檢測腦脊液中的SNAP25的任何抗體都可用于本發(fā)明的新方法。用于本發(fā)明方法的優(yōu)選的單克隆抗體可以從Serotec獲得(Oxford,UK;Cat No SP12),從Sternberger Monoclonals公司獲得(Di stributed by Affinity Research Products Lim.,Mamhead,Exeter,UK;Cat No SMI-81),從Chemicon獲得(Temecula,CA,USA;Cat No MAB331)或從Transduction Labs獲得(Lexington,KY,USA;Cat No S35020)。
有利地,用于本發(fā)明的單克隆抗體為固定在適宜支持體上的固定化狀態(tài)。另外,本發(fā)明的方法可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何一種其他免疫測定形式加以實施。
然后進行檢測免疫結(jié)合的過程將由抗原和識別SNAP25的抗體形成的所述抗原-抗體復(fù)合物與下列物質(zhì)混合在一起a)第二抗體(或檢測抗體)*它可以是識別抗原-抗體復(fù)合物的表位但不識別單獨的第一抗體的單克隆抗體;或者*它可以是識別抗原-抗體復(fù)合物的表位但不識別單獨的第一抗體的多克隆抗體,所述多克隆抗體優(yōu)選使用固定化SNAP25或SNAP25-第一抗體復(fù)合物通過免疫親和層析純化。
b)用于特異性標記所述第二抗體或與所述第二抗體偶聯(lián)的標記,所述標記是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何可能的標記;c)用于進行抗體和腦脊液樣品之間的、第二抗體和神經(jīng)學標記-第一抗體復(fù)合物之間的、和/或結(jié)合第二抗體和標記之間的免疫反應(yīng)的適宜緩沖溶液;和d)出于標準化的目的,也可能是與識別SNAP25的抗體反應(yīng)的純化蛋白質(zhì)或合成肽。
如本發(fā)明實施例中所示,多克隆SNAP25血清可以用作檢測抗體。
有利地,第二抗體自身攜帶著標記或用于直接或間接與標記偶聯(lián)的基團。
本發(fā)明也涉及新的檢測腦脊液中的α-融合核素的方法,該方法至少包含以下步驟-從個體獲得腦脊液樣品;和-在適合生成抗原-抗體復(fù)合物的條件下,使所述腦脊液樣品與識別α-融合核素的單克隆抗體(第一抗體或捕獲抗體)接觸;和-檢測所述抗體與所述腦脊液樣品的免疫結(jié)合。
盡管特異性識別α-融合核素的抗體可以用于檢測腦組織中的α-融合核素,但檢測腦脊液中的α-融合核素時卻沒有這么顯著。由于以前從未報道過α-融合核素在腦脊液中的存在,人們甚至懷疑CSF中是否存在α-融合核素。首先,本發(fā)明人能顯示腦脊液中存在α-融合核素。此外,開發(fā)出了用于定量檢測腦脊液中的α-融合核素的精確方法。本發(fā)明人還顯示α-融合核素在某些神經(jīng)變性疾病(包括但不限于雷維小體病)條件下發(fā)生了變化。
能特定檢測腦脊液中的α-融合核素的任何抗體都可用于這種新方法。用于本發(fā)明方法的優(yōu)選的單克隆抗體可以從Transduction Labs獲得(Lexington,KY,USA;Cat No R35520)。
有利地,用于本發(fā)明的單克隆抗體為固定在適宜支持體上的固定化狀態(tài)。這種固定化狀態(tài)可能是微量滴定板,其上涂覆或未涂覆抗-IgG。另外,本發(fā)明的方法可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何一種其他免疫測定形式加以實施。
然后進行檢測免疫結(jié)合的過程將由抗原和識別α-融合核素的抗體形成的所述抗原-抗體復(fù)合物與下列物質(zhì)混合在一起a)第二抗體(或檢測抗體)*它可以是識別抗原-抗體復(fù)合物的表位但不識別單獨的第一抗體的單克隆抗體;或者*它可以是識別抗原-抗體復(fù)合物的表位但不識別單獨的第一抗體的多克隆抗體,所述多克隆抗體優(yōu)選使用固定化α-融合核素或α-融合核素-第一抗體復(fù)合物通過免疫親和層析純化。
b)用于特異性標記所述第二抗體或與所述第二抗體偶聯(lián)的標記,所述標記是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何可能的標記;c)用于進行抗體和腦脊液樣品之間的、第二抗體和神經(jīng)學標記-第一抗體復(fù)合物之間的、和/或結(jié)合第二抗體和標記之間的免疫反應(yīng)的適宜緩沖溶液;和d)出于標準化的目的,也可能是與識別α-融合核素的抗體反應(yīng)的純化蛋白質(zhì)或合成肽。
有利地,第二抗體自身攜帶著標記或用于直接或間接與標記偶聯(lián)的基團。
在優(yōu)選的實施方案中,用于檢測Rab3a、SNAP25和/或α-融合核素的這些方法可以與用于檢測一種或多種其他神經(jīng)學標記的方法結(jié)合使用,以特定地檢測、定量和/或鑒別診斷個體的神經(jīng)變性。
在更優(yōu)選的實施方案中,用于檢測Rab3a、SNAP25和/或α-融合核素的這些方法可以與用于檢測一種或多種選自下列成員的神經(jīng)學標記的方法結(jié)合使用τ蛋白,磷酸-τ蛋白,β-淀粉狀蛋白(1-42),β-淀粉狀蛋白(1-40),神經(jīng)調(diào)制素,神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)。
更具體地說,用于特定檢測、定量和/或鑒別診斷神經(jīng)變性的神經(jīng)學標記可以從以下幾組中選擇-τ蛋白,磷酸-τ蛋白,NSE,β-淀粉狀蛋白(1-42),β-淀粉狀蛋白(1-40),神經(jīng)調(diào)制素或Rab3a;或-τ蛋白,磷酸-τ蛋白,NSE,β-淀粉狀蛋白(1-42),β-淀粉狀蛋白(1-40),神經(jīng)調(diào)制素或SNAP25;或-τ蛋白,磷酸-τ蛋白,NSE,β-淀粉狀蛋白(1-42),β-淀粉狀蛋白(1-40),神經(jīng)調(diào)制素或α-融合核素。
選自上述各組的3、4、5、6或7個標記的任何可能的組合可以用于特定檢測、定量和/或鑒別診斷個體的神經(jīng)變性。
在另一個實施方案中,用于檢測Rab3a、SNAP25和/或α-融合核素的方法可以一起使用來特定檢測、定量和/或鑒別診斷神經(jīng)變性。因此,本發(fā)明涉及其中兩個或三個神經(jīng)學標記選自Rab3a、SNAP25和α-融合核素的方法。
一個非常具體的實施方案涉及用于特定檢測或定量早老性癡呆和/或雷維小體病和/或用于鑒別診斷早老性癡呆與雷維小體病的如上所述的方法,其中-至少測定腦脊液樣品中α-融合核素的濃度;和/或-測定腦脊液樣品中τ蛋白、β-淀粉狀蛋白(1-42)和α-融合核素的濃度。
另一個非常具體的實施方案涉及用于特定檢測或定量早老性癡呆和/或用于鑒別診斷早老性癡呆與其他癡呆的方法,其中-測定腦脊液樣品中τ蛋白、β-淀粉狀蛋白(1-42)和Rab3a的濃度;或-測定腦脊液樣品中τ蛋白、β-淀粉狀蛋白(1-42)和SNAP25的濃度。
另一個非常具體的實施方案涉及用于特定檢測或定量早老性癡呆和/或帕金森氏病和/或用于鑒別診斷早老性癡呆與帕金森氏病的方法,其中測定腦脊液樣品中τ蛋白、β-淀粉狀蛋白(1-42)和神經(jīng)調(diào)制素的濃度。
另一個非常具體的實施方案涉及用于特定檢測或定量由化療、接觸化學物質(zhì)和/或輻射而導(dǎo)致的神經(jīng)變性的方法,其中測定腦脊液樣品中τ蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶和神經(jīng)調(diào)制素的濃度。
另一個非常具體的實施方案涉及用于特定檢測或定量個體為治療白血病或腦腫瘤而因化療、接觸化學物質(zhì)和/或輻射導(dǎo)致的神經(jīng)變性的方法,其中測定腦脊液樣品中τ蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶和神經(jīng)調(diào)制素的濃度。
另一個非常具體的實施方案涉及用于特定檢測或定量由產(chǎn)前窒息導(dǎo)致的神經(jīng)變性的方法,其中至少檢測三種神經(jīng)學標記。
另一個非常具體的實施方案涉及用于特定檢測或定量額顳葉性癡呆和/或用于鑒別診斷額顳葉性癡呆與其他癡呆的方法,其中測定腦脊液樣品中τ蛋白、磷酸-τ蛋白和β-淀粉狀蛋白(1-42)的濃度。
另一個非常具體的實施方案涉及用于特定檢測或定量早老性癡呆中的血管問題、用于鑒別診斷不同形式的早老性癡呆和/或用于鑒別診斷早老性癡呆與其他癡呆的方法,其中至少-定量測定腦脊液樣品中τ蛋白和β-淀粉狀蛋白(1-42)的濃度以及定量測定血漿樣品中β-淀粉狀蛋白(1-42)的濃度;或-定量測定腦脊液樣品中磷酸-τ蛋白和β-淀粉狀蛋白(1-42)的濃度以及定量測定血漿樣品中β-淀粉狀蛋白(1-42)的濃度;或-定量測定腦脊液樣品中τ蛋白和磷酸-τ蛋白的濃度以及定量測定血漿樣品中β-淀粉狀蛋白(1-42)的濃度;或-定量測定腦脊液樣品中τ蛋白、磷酸-τ蛋白和β-淀粉狀蛋白(1-42)的濃度。
上述通過測定個體體液中的至少三種神經(jīng)學標記的濃度來特定檢測、定量和/或鑒別診斷所述個體的神經(jīng)變性的方法可以單獨使用、與容易監(jiān)控的神經(jīng)學終點(例如白細胞計數(shù))結(jié)合使用、或與測量血漿中的藥物濃度結(jié)合使用。
本發(fā)明還涉及用于特定檢測、定量和/或鑒別診斷個體的神經(jīng)變性的診斷試劑盒,它包含至少三種各自識別所述個體的一種或多種體液樣品中的不同神經(jīng)學標記的抗體。
更具體地說,本發(fā)明涉及用于特定檢測、定量和/或鑒別診斷個體的神經(jīng)變性的診斷試劑盒,它至少包含支持體諸如微量滴定板,該滴定板上加有在一起或在分離的孔中的至少三種各自識別所述個體的一種或多種體液樣品中的不同神經(jīng)學標記的抗體。
本發(fā)明還涉及用于特定檢測、定量和/或鑒別診斷個體的神經(jīng)變性的試劑盒,它包含-支持體諸如微量滴定板,該滴定板包含在一起或在分離的孔中的至少三種各自識別不同神經(jīng)學標記的抗體(第一抗體或捕獲抗體);-第二抗體(檢測抗體),各自識別其中一種神經(jīng)學標記-第一抗體復(fù)合物*它可以是能與神經(jīng)學標記-第一抗體復(fù)合物的表位形成免疫復(fù)合物但不能與單獨的第一抗體形成免疫復(fù)合物的單克隆抗體;或者*它可以是能與神經(jīng)學標記-第一抗體復(fù)合物的表位形成免疫復(fù)合物但不能與單獨的第一抗體形成免疫復(fù)合物的多克隆抗體,所述多克隆抗體優(yōu)選使用固定化神經(jīng)學標記或神經(jīng)學標記-第一抗體復(fù)合物通過免疫親和層析純化;-可能的話,用于特異性標記所述第二抗體或與所述第二抗體偶聯(lián)的標記;-可能的話,用于進行第一抗體和體液樣品之間的、第二抗體和神經(jīng)學標記-第一抗體復(fù)合物之間的和/或結(jié)合第二抗體和標記之間的免疫反應(yīng)的適宜緩沖溶液;-可能的話,出于標準化的目的,用于檢測神經(jīng)學標記的、由該試劑盒的抗體特異性識別的純化蛋白質(zhì)或合成肽。
在具體的實施方案中,本發(fā)明涉及各自設(shè)計用于實施如上所述的一個或多個方法的如上所述的診斷試劑盒。
更具體地說,本發(fā)明涉及如上所述的診斷試劑盒,它至少包含特異性識別以下物質(zhì)的抗體-α-融合核素;或-τ蛋白,β-淀粉狀蛋白(1-42)和α-融合核素;或-τ蛋白,β-淀粉狀蛋白(1-42)和Rab3a;或-τ蛋白,β-淀粉狀蛋白(1-42)和SNAP25;或-τ蛋白,β-淀粉狀蛋白(1-42)和神經(jīng)調(diào)制素;或-τ蛋白,神經(jīng)元特異性烯醇化酶和神經(jīng)調(diào)制素;或-τ蛋白,磷酸-τ蛋白和β-淀粉狀蛋白(1-42);或-τ蛋白和β-淀粉狀蛋白(1-42);本發(fā)明還涉及用于檢測腦脊液中的Rab3a的試劑盒,它至少包含識別Rab3a的單克隆抗體。
本發(fā)明還涉及用于檢測腦脊液中的Rab3a的試劑盒,它至少包括含有識別Rab3a的單克隆抗體的支持體,諸如微量滴定板。
更具體地說,本發(fā)明涉及用于檢測腦脊液中的Rab3a的試劑盒,它包含-至少,含有識別Rab3a的單克隆抗體(第一抗體或捕獲抗體)的支持體,諸如微量滴定板;-第二抗體(或檢測抗體)*它可以是能與Rab3a-第一抗體復(fù)合物的表位形成免疫復(fù)合物但不能與單獨的第一抗體形成免疫復(fù)合物的單克隆抗體;或者*它可以是能與Rab3a-第一抗體復(fù)合物的表位形成免疫復(fù)合物但不能與單獨的第一抗體形成免疫復(fù)合物的多克隆抗體,所述多克隆抗體優(yōu)選使用固定化Rab3a或Rab3a-第一抗體復(fù)合物通過免疫親和層析純化;-可能的話,用于特異性標記所述第二抗體或與所述第二抗體偶聯(lián)的標記;-可能的話,用于進行抗體和腦脊液樣品之間的、第二抗體和Rab3a-第一抗體復(fù)合物之間的和/或結(jié)合第二抗體和標記之間的免疫反應(yīng)的適宜緩沖溶液;-可能的話,出于標準化的目的,用于檢測Rab3a的、由該試劑盒的抗體特異性識別的純化蛋白質(zhì)或合成肽。
本發(fā)明還涉及用于檢測腦脊液中的SNAP25的試劑盒,它至少包含識別SNAP25的單克隆抗體。
本發(fā)明還涉及用于檢測腦脊液中的SNAP25的試劑盒,它至少包括含有識別SNAP25的單克隆抗體的支持體,諸如微量滴定板。
更具體地說,本發(fā)明涉及用于檢測腦脊液中的SNAP25的試劑盒,它包含-至少,含有識別SNAP25的單克隆抗體(第一抗體或捕獲抗體)的支持體,諸如微量滴定板;-第二抗體(或檢測抗體)*它可以是能與SNAP25-第一抗體復(fù)合物的表位形成免疫復(fù)合物但不能與單獨的第一抗體形成免疫復(fù)合物的單克隆抗體;或者*它可以是能與SNAP25-第一抗體復(fù)合物的表位形成免疫復(fù)合物但不能與單獨的第一抗體形成免疫復(fù)合物的多克隆抗體,所述多克隆抗體優(yōu)選使用固定化SNAP25或SNAP25-第一抗體復(fù)合物通過免疫親和層析純化;-可能的話,用于特異性標記所述第二抗體或與所述第二抗體偶聯(lián)的標記;-可能的話,用于進行抗體和腦脊液樣品之間的、第二抗體和SNAP25-第一抗體復(fù)合物之間的和/或結(jié)合第二抗體和標記之間的免疫反應(yīng)的適宜緩沖溶液;-可能的話,出于標準化的目的,用于檢測SNAP25的、由該試劑盒的抗體特異性識別的純化蛋白質(zhì)或合成肽。
本發(fā)明還涉及用于檢測腦脊液中的α-融合核素的試劑盒,它至少包含識別α-融合核素的單克隆抗體。
本發(fā)明還涉及用于檢測腦脊液中的α-融合核素的試劑盒,它至少包括含有識別α-融合核素的單克隆抗體的支持體,諸如微量滴定板。
更具體地說,本發(fā)明涉及用于檢測腦脊液中的α-融合核素的試劑盒,它包含-至少有支持體,諸如含有(可能通過抗-IgG抗體)直接與微量滴定板相連的識別α-融合核素的單克隆抗體(第一抗體或捕獲抗體)的微量滴定板;-第二抗體(或檢測抗體)*它可以是能與α-融合核素-第一抗體復(fù)合物的表位形成免疫復(fù)合物但不能與單獨的第一抗體形成免疫復(fù)合物的單克隆抗體;或者*它可以是能與α-融合核素-第一抗體復(fù)合物的表位形成免疫復(fù)合物但不能與單獨的第一抗體形成免疫復(fù)合物的多克隆抗體,所述多克隆抗體優(yōu)選使用固定化α-融合核素或α-融合核素-第一抗體復(fù)合物通過免疫親和層析純化;-可能的話,用于特異性標記所述第二抗體或與所述第二抗體偶聯(lián)的標記;-可能的話,用于進行抗體和腦脊液樣品之間的、第二抗體和α-融合核素-第一抗體復(fù)合物之間的和/或結(jié)合第二抗體和標記之間的免疫反應(yīng)的適宜緩沖溶液;-可能的話,出于標準化的目的,用于檢測α-融合核素的、由該試劑盒的抗體特異性識別的純化蛋白質(zhì)或合成肽。
本發(fā)明還涉及如上所述的任一方法或任一試劑盒用于醫(yī)療監(jiān)控和/或確定某種治療的有效性的用途。
描述對已公開的任何一種標記具有特異性的抗體的所有參考文獻的內(nèi)容都結(jié)合到本發(fā)明的說明書中作為參考。
以下實施例僅僅是用于闡述本發(fā)明。
表格表1.化療的神經(jīng)學并發(fā)癥(部分名單)
表2.許多神經(jīng)學標記在某些神經(jīng)變性疾病下的行為
+神經(jīng)學標記的量增加;-神經(jīng)學標記的量減少;=神經(jīng)學標記的量沒有變化。簡寫AD早老性癡呆;PD帕金森氏?。籆JD克羅伊茨費爾特-雅各布??;GBS急性熱病性多神經(jīng)炎;ALS肌萎縮性側(cè)索硬化;MS多發(fā)性硬化;P-τ磷酸-τ;NSE神經(jīng)元特異性烯醇化酶;βA(1-42):β-淀粉狀蛋白(1-42);βA(1-40):β-淀粉狀蛋白(1-40);NM神經(jīng)調(diào)制素;NF神經(jīng)纖絲。
表3.小鼠用α-融合核素免疫接種后得到的效價
表4.腦脊液中細胞內(nèi)蛋白的濃度(均值±SD)
AU=任意單位*與對照有顯著性差異(p≤0.05;Whitney檢驗)**來自對照病人的有關(guān)β-淀粉狀蛋白(1-42)在腦脊液中的濃度的數(shù)據(jù)未得到。
表5.每種單獨的標記以及各種標記的組合的似然比
*來自對照病人的有關(guān)β-淀粉狀蛋白(1-42)在腦脊液中的濃度的數(shù)據(jù)是從另一項研究中得到的。
表6.加入本研究的病人的特性
表6.加入本研究的病人的特性(續(xù))
表7a.對于有B細胞NHL的病人的治療方案(UKCCSG 9602)
表7a.續(xù)
IT=鞘內(nèi)給藥;IV=靜脈內(nèi)給藥;PO=口服;LP=腰椎穿刺;MTX=甲氨蝶呤;Ara-C=阿糖胞苷表7b.對于有非B細胞ALL/NHL的病人的治療方案(EORTC58881)
表7b.續(xù)
表7c.對于有AML的病人的治療方案(EORTC 58921)
IT=鞘內(nèi)給藥;IV=靜脈內(nèi)給藥;PO=口服;SC=皮下給藥;LP=腰椎穿刺;Ara-C=阿糖胞苷;VP16=
表8.實施例7中所述的4組病人的τ蛋白、β-淀粉狀蛋白(1-42)和神經(jīng)調(diào)制素的平均腦脊液濃度
*與對照比有顯著性差異(p<0.01;雙側(cè)Wilcoxon檢驗)濃度表示為pg/ml,均值±標準誤差表9.患有早老性癡呆、帕金森氏病的病人和年齡相當?shù)膶φ詹∪说摩拥鞍?、?淀粉狀蛋白(1-42)和神經(jīng)調(diào)制素的平均腦脊液濃度
**與對照病人比有顯著性差異(p<0.01);*與對照病人比有顯著性差異(p<0.05);++與AD病人比有顯著性差異(p<0.01);+與AD病人比有顯著性差異(p<0.05)。生物學參數(shù)的結(jié)果用pM表示(均值±SD)。NM=神經(jīng)調(diào)制素;AD=早老性癡呆;PD=帕金森氏病;C=對照病人。
圖1.實施例1.3中所述的蛋白質(zhì)印跡,顯示了Rab3a在早老性癡呆和對照病人的腦的顳皮質(zhì)中的免疫反應(yīng)性。1、12.8μl對照病人n°3;2、6.4μl對照病人n°3;3、3.2μl對照病人n°3;4、1.6μl對照病人n°3;5、1.0μl對照病人n°3;6、10μl對照病人n°3;7、10μl AD病人n°1;8、10μl AD病人n°2;9、10μl對照病人n°1;10、10μl對照病人n°2;11、10μl AD病人n°3;12、10μl對照病人n°4。
圖2.突觸蛋白Rab3a(a)和SNAP25(b)在腦脊液中的穩(wěn)定性。如實施例1.5中所述,突觸蛋白的降解經(jīng)由對突觸蛋白具有特異性的夾心ELISA測量。將純化突觸蛋白摻加在CSF集合體中并在37℃下培養(yǎng)過夜(圖例Rab3a在CSF中;SNAP25在CSF中)。作為對照,將突觸蛋白摻加在相同的CSF集合體中并直接測量(圖例Rab3a;SNAP25)。還測定在1%BSA中的穩(wěn)定性(結(jié)果未顯示)。
圖3.對購自Transduction Labs的α-融合核素的抗體(Lexington,KY,USA;Cat No S63320)的特異性的說明。ACoumassie染色凝膠;B用抗-His單克隆抗體展開的蛋白質(zhì)印跡,以顯示所有產(chǎn)物的表達;C用購自Transduction Labs(Lexington,KY,USA)的單克隆抗體展開的蛋白質(zhì)印跡。泳道1表達α-融合核素的大腸桿菌;泳道2表達β-融合核素的大腸桿菌;泳道3表達γ-融合核素的大腸桿菌;泳道4含有表達神經(jīng)元特異性烯醇化酶的大腸桿菌的對照泳道;泳道5分子量標準物;泳道6沒有任何質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。
圖4.檢測200ml CSF中的α-融合核素。如實施例2.2中所述,混合CSF借助Rotophor按照分子量和等電點分離。M分子量標記;R1:pI3;R2:pI4;R3:pI4.5;R4:pI4.5;R5:pI5;R6:pI5;R7:pI5.5;R8:pI6;R9:pI6;R10:pI6.5;R11:pI6.5;R12:pI7;R13:pI7;R14:pI7.5。
圖5.用于單克隆抗體3B5和9B6對α-融合核素的羧基末端作圖的α-融合核素和重疊肽的氨基酸序列。用于肽合成的羧基端部分用粗體顯示。圖中顯示了被單克隆抗體和商品抗體(Clone 42,IgG1,Transduction Labs,Lexington,KY,USA)識別的肽。
圖6.不同的α-融合核素羧基端肽與抗體3B5、9B6和Clone 42反應(yīng)后得到的光密度(OD)。光密度在實施例2.4所述的免疫測定中測量。X軸上的號碼(1-12)與圖5中所示的肽的號碼一致。
圖7.如實施例1.6和3.1中所述的、用夾心ELISA測量的、32名AD病人、20名患有血管性癡呆(MID)的病人和11名對照病人的CSF中的Rab3a和τ蛋白的濃度。
圖8.實施例4.1中所述的AD病人的Rab3a和SNAP25、Rab3a和β-淀粉狀蛋白(1-42)以及Rab3a和τ蛋白的CSF-濃度之間的相互關(guān)系。Rab3a、SNAP25、τ蛋白和β-淀粉狀蛋白(1-42)的濃度如實施例1.6和3所述用夾心ELISA測量。
圖9.給予任何治療之前的診斷時的τ值1、AML(3);2、AML-CNS+(1);3、Down AML(2);4、脊髓發(fā)育不良(2);5、其他[成神經(jīng)管細胞瘤(2),橫紋肌肉瘤(2),顱內(nèi)胚細胞瘤(1)];6、B-NHL(8);7、霍奇金病(3);8、Down NB ALL(1);9、NB ALL(21);10、NB ALL-Brachman綜合征(1);11、NB ALL-CNS+(1);12、NB ALL-VHR(4);13、對照(6)。(病人數(shù))。
圖10.CSF神經(jīng)學標記τ蛋白(a)、神經(jīng)調(diào)制素(b)、β-淀粉狀蛋白(1-42)(c)和NSE(d)、血清LDH(e)和CSF WBC(f)在第1天時的濃度。1、AML;2、AML-CNS+;3、Down AML/MDS;4、脊髓發(fā)育不良;5、慢性骨髓瘤性白血病(myelomic leukemia);6、B-NHL;7、霍奇金病;8、Down NB ALL;9、NB ALL;10、NB ALL-Brachman綜合征;11、NB ALL-CNS+;12、NB ALL-VHR;13、LCH,橫紋肌肉瘤,胚細胞瘤,成神經(jīng)管細胞瘤,絨膜癌;14、對照,成視網(wǎng)膜細胞瘤(健康的),hemofagocytose(gezond HLH)。實施例3中描述了這些標記的檢測方法。
圖11.B細胞NHL病人的化療過程中,CSF神經(jīng)學標記τ蛋白(a)、神經(jīng)調(diào)制素(b)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(c)在各次腰椎穿刺(LP)操作中的濃度。X軸上的數(shù)字對應(yīng)于表7a中給出的LP數(shù)。實施例3中描述了這些標記的檢測方法。
圖12.13名非B ALL病人在化療的不同階段,CSF神經(jīng)學標記τ蛋白(a)和神經(jīng)調(diào)制素(b)的濃度。實施例3中描述了這些標記的檢測方法。
圖13.非B細胞ALL病人的化療過程中,CSF神經(jīng)學標記τ蛋白(a)、β-淀粉狀蛋白(1-42)(b)、神經(jīng)調(diào)制素(c)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(d)在各次腰椎穿刺(LP)操作中的濃度。X軸上的數(shù)字對應(yīng)于表7b中給出的LP數(shù)。實施例3中描述了這些標記的檢測方法。
圖14.AML病人的化療過程中,τ蛋白(a)和神經(jīng)調(diào)制素(b)在各次腰椎穿刺(LP)操作中的濃度。X軸上的數(shù)字對應(yīng)于表7c中給出的LP數(shù)。實施例3中描述了這些標記的檢測方法。
圖15.τ蛋白(a)、β-淀粉狀蛋白(1-42)(b)和神經(jīng)調(diào)制素(或生長相關(guān)蛋白43)(c)各自在如實施例7中所述歸類稱為神經(jīng)學對照(急性熱病性多神經(jīng)炎,多發(fā)性硬化等)(1 CONT)、有記憶力損傷的人(2 MEM)、癥狀發(fā)生前的家族性早老性癡呆病人(PS1突變)(3 PFAD)、家族性早老性癡呆病人(PS1突變)(4 FAD)、早老性癡呆病人(5 AD)和有血管性癡呆的病人(6 VAD)的個體中的濃度。β-淀粉狀蛋白(1-42)的濃度如實施例3中所述進行測量。數(shù)據(jù)用pg/ml表示。
圖16.τ蛋白和神經(jīng)調(diào)制素在60名患有早老性癡呆(AD)的病人和32名年齡相當?shù)膶φ詹∪酥械母髯詽舛戎g的相互關(guān)系。τ蛋白和神經(jīng)調(diào)制素的濃度如實施例3中所述進行測量。
圖17.τ/nm和β-淀粉狀蛋白(1-42)在患有早老性癡呆(AD)、帕金森氏病(PARK)的病人和對照病人(CONT)中的各自濃度之間的相互關(guān)系。τ蛋白、神經(jīng)調(diào)制素和β-淀粉狀蛋白(1-42)的濃度如實施例3中所述進行測量。
實施例實施例1CSF中Rab3a和SNAP25的檢測1.1 Rab3a和SNAP25的克隆利用制造商提供的擴增方案,用特異性引物來擴增編碼來自Quick-ScreenTM人類cDNA文庫(Clontech,Palo Alto,CA,USA;CatNo K1003-1)的序列的Rab3a和SNAP25。簡而言之94℃下培養(yǎng)45秒、60℃下退火45秒、72℃下用Taq聚合酶(Stratagene,Amsterdam,TheNetherlands;Cat No 600131)延伸2分鐘,以上操作循環(huán)35次。最后在72℃下進行7分鐘聚合酶延伸反應(yīng)使該程序結(jié)束。反應(yīng)在Perkin-Elmer(überlingen,Germany)DNA循環(huán)變溫加熱器(480型)上進行。用于擴增Rab3a的引物的序列是基于人Rab3a序列(Zahraoui等,1989年)ATG引物ATG GCA TCG GCC ACA GAC TCG CGC TAT GGG(Tm=76℃)和反向引物CGCG TCTAG AGG CTC TCA GCA GGC GCA GTC CTGGTG CGG(Tm=77℃)。用于擴增SNAP25的引物的序列是基于人SNAP25序列(Zhao等,1994年)ATG引物ATG GCC GAA GAC GCA GAC ATGCGC AAT GAG(Tm=75℃)和反向引物CGCG CTAG ACA CTT AAC CAC TTCCCA GCA TCT TTG TTG(Tm=59℃)。
將PCR產(chǎn)物再次擴增,以產(chǎn)生足夠多量的PCR產(chǎn)物,用T4 DNA聚合酶補齊,用XbaⅠ切割并連接在NcoⅠ-鈍化的、XbaⅠ切割pIGRHISA(Innogenetics,Gent,Belgium;Cat No 2075)中。于是,對于Rab3a產(chǎn)生了pIGRHISARab3a(Innogenetics,Gent,Belgium;Cat No 3008),對于SNAP25產(chǎn)生了pIGRH6SNAP25a(Innogenetics,Gent,Belgium;Cat No 2941)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成DH1(λ)(Bachmann,1987年),并分析四環(huán)素抗性集落的插入片段的存在。對插入片段測序,含有正確序列的質(zhì)粒(Zahraoui等,1989年;Zhao等,1994年)用于后面的步驟。對于Rab3a存在一些PCR人工產(chǎn)物。正確的序列從兩種克隆進行裝配。
1.2 Rab3a和SNAP25的表達和純化Rab3a和SNAP25分別使用基于PL的表達系統(tǒng)pIGRHISARab3a和pIGRH6SNAP25a在大腸桿菌中表達。用熱敏cI阻抑物將正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成MC1061 pACI(Wertman等,1986年)。在12.5%的丙烯酰胺凝膠上可見25kDa左右的coumassie可染色條帶,指示了合理的表達水平。重組蛋白制成含有6個另外的組氨酸殘基的融合蛋白標記物,以使經(jīng)過NiIMAC柱迅速純化。使用3升熱誘導(dǎo)的大腸桿菌將10mg以上的重組Rab3a和SNAP25純化達到至少95%均一性(Hochuli,1988年;Van Gelder等,1993年)。
1.3 Rab3a和SNAP25特異性抗體的產(chǎn)生和特性描述在兔子體內(nèi)培養(yǎng)重組Rab3a和SNAP25的抗體。將50μg純化蛋白質(zhì)腹膜內(nèi)注射到兩只兔子體內(nèi)(100μg/只兔子)。注射每4周進行一次,并用ELISA測定效價。在腦提取物上描繪抗體的特性。有關(guān)Rab3a的免疫反應(yīng)性的結(jié)果顯示在圖1中。來自早老性癡呆病人和對照病人的組織樣本通過在5體積的1%SDS,1%釩酸鈉,10mM Tris pH7.4中迅速勻漿并在水浴中煮沸5分鐘而制備。勻漿液離心(12000g,室溫)5分鐘以除去不溶物質(zhì)。將少量上清液樣品用于使用BCA法測量蛋白質(zhì)濃度(Pierce,Rockford,Illinois,USA)。上清液用水稀釋至蛋白質(zhì)濃度為2mg/ml,并加入等體積的2x樣品緩沖液(250mM Tris pH6.8,3%SDS,10%甘油,0.006%溴酚藍和2%β-巰基乙醇)。按照Laemmli系統(tǒng)在10-12.5%凝膠上進行凝膠電泳。用半干印跡法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素上(Schleicher和Schuell,Dassel,Germany;Cat No401196)。該硝化纖維素過濾器用在10mM Tris pH7.5,150mM NaCl中的1%BSA封閉。以在1%BSA中的適宜濃度(±1μg/ml)下加入第一抗體和第二抗體。
1.4 Rab3a和SNAP25特異性抗體的免疫親和純化純的重組抗原在0.3M NaHCO3,pH8.6中透析過夜。測定透析前后的OD280值來估計蛋白質(zhì)的量。用Mini-Leak-Medium(KEM-EN-TECBiozyme,Vancouver,BC,Canada;Cat No 10127,Lot No 60232-5)按照制造商提供的說明對抗體進行免疫提純。將部分抗體生物素化(Amersham,Place Little Chalfont Buchinghamshire,UK;Cat No RPN2202)。利用銀染和蛋白質(zhì)印跡來監(jiān)控純化和標記情況(結(jié)果未顯示)。
1.5 Rab3a和SNAP25在CSF中的穩(wěn)定性和存在的評估使用特異性單克隆抗體(Transduction Labs,Lexington,KY,USA;R35520和S35020)作為捕獲抗體,免疫純化的多克隆兔抗血清作為檢測抗體,在CSF中摻加的突觸蛋白Rab3a和SNAP25的穩(wěn)定性在37℃下培養(yǎng)過夜后再評估。在500pg/ml濃度下,SNAP25和Rab3a的重組免疫反應(yīng)性在測試的CSF中過夜后沒有變化(圖2)。
有關(guān)CSF中存在這兩種蛋白質(zhì)的直接證據(jù)通過從50ml CSF提取白蛋白和IgG并在柱上分級分離而得到。將各級分干燥并溶于樣品緩沖液,在12%丙烯酰胺凝膠上流過并作印跡。PVDF膜用Rab3a和SNAP25單克隆抗體探測。檢測預(yù)期分子量和pI值的免疫反應(yīng)條帶。
1.6用于Rab3a和SNAP25檢測和CSF濃度的定量測定的夾心ELISA的開發(fā)在以單克隆Rab3a或SNAP25抗體作為捕獲抗體和以生物素化的免疫親和純化的多克隆抗體作為檢測抗體的基礎(chǔ)上開發(fā)夾心ELISA。Maxisorp微量滴定板涂覆Affini純山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,Pennsylvania,USA;CatNo 115-035-144)。在PBS中的1%BSA(臨床級98%脂肪酸游離;ICN,Biomedical Research Products,Costa Mesa,CA,USA;Cat No 105033,Lot No 6p384)用作封閉緩沖液。加入在封閉緩沖液中稀釋1/1000倍的小鼠抗-Rab3a(Transduction Labs,Lexington,KY,USA;Cat NoR35520,IgG2a,Clone 9,Lot No 606-259-1550 lot 2)或抗-SNAP25(Transduction Labs,Lexington,KY,USA;Cat No S35020,IgG1,Clone 20)。培養(yǎng)后,加入不同濃度的重組抗原(濃度范圍40000-2.56pg/ml)。同時加入親和純化的兔抗-Rab3a或抗-SNAP25抗血清,加入濃度應(yīng)使得到最佳的背景-信號比。然后經(jīng)由辣根標記的鏈霉抗生物素蛋白(Immuno Research Laboratories,Inc.,West Grove,Pennsylvania,USA;Cat No 016-030-084)在1/2000的稀釋度下檢測生物素化的兔抗體。偶聯(lián)過氧化物酶經(jīng)由TMB,H2O2底物溶液檢測。與2N H2SO4反應(yīng)30分鐘后反應(yīng)停止,在450nm測量吸光度?;谶@種ELISA,可以檢測濃度低至10pg/ml的Rab3a。有關(guān)SNAP25的測定基于相同的原理。實施例2α-融合核素在腦脊液中的存在和檢測2.1有關(guān)商品抗體對α-融合核素的特異性的評估評估可從商業(yè)上獲得的單克隆抗體(Transduction Labs,Lexington,KY,USA;Cat No S63320,IgG1)對不同的融合核素同種型的特異性。α-融合核素、β-融合核素和γ-融合核素可讀框(從ATG到終止密碼子)從人類腦cDNA文庫(HL5081;Clontech,Palo Alto,CA,USA)開始使用基于公開的序列數(shù)據(jù)的引物(α-融合核素登記號L08850;β-融合核素登記號S69965;γ-融合核素登記號AF010126)進行擴增。據(jù)報道,在γ-融合核素的原始序列中有一些重要的氨基酸變化K12E和K68E,并且在這個克隆中氨基酸109的多態(tài)性是E109V。插入片段在于氨基端加入了6個另外的組氨酸的基于PL的表達系統(tǒng)(ICCG 3307;Innogenetics,Gent,Belgium)中亞克隆。附加了His的融合核素融合蛋白標記物在大腸桿菌中進行表達。隨后該大腸桿菌蛋白在SDS-PAGE上運行,并用購自Transduction Labs(Lexington,KY,USA)的商品單克隆抗體進行免疫印跡分析。這種單克隆抗體顯示將對α-融合核素是特異性的,繪制該融合核素蛋白的羧基端部分的圖(圖3)。
2.2α-融合核素在腦脊液中的存在的評估將來自多個病人的CSF混合。200ml混合的CSF按照等電點借助Rotophor分離。隨后,所得級分在SDS-PAGE上運行,并用購自Transduction Labs(Lexington,KY,USA)的單克隆抗體進行免疫印跡分析。在19kDa范圍內(nèi)并且pI在4-6的范圍內(nèi)檢測到兩個免疫反應(yīng)條帶(圖4)。較低的條帶可能是C端截短形式,因為一些陰性電荷的氨基酸(末尾20個氨基酸中的6E)的缺失導(dǎo)致pI向更具堿性的一端遷移。在這種免疫反應(yīng)性的基礎(chǔ)上,估計α-融合核素的濃度范圍在pg/ml范圍內(nèi)。
2.3 α-融合核素特異性抗體的產(chǎn)生和特性描述α-融合核素從3升誘導(dǎo)大腸桿菌培養(yǎng)物純化,使得純化10mg以上α-融合核素(從coumassie和銀染色凝膠估計純度在90%以上)。將蛋白質(zhì)按照幾種免疫接種方案(表3)注射到小鼠體內(nèi)。4次注射后,在包被ELISA中評估對α-融合核素的效價。6只小鼠的效價超過100000(效價定義為導(dǎo)致OD值兩倍于背景的血清稀度)。
最后一次注射后三天,從動物312(m3)取出脾細胞并用于主要按照Khler和Milstein(1975年)所述的方法進行的細胞融合。在第一次篩選循環(huán)中,雜交瘤在直接包被測定中測試特異性抗體的存在。隨后,在含有α-、β-、γ-融合核素和來自α-融合核素的缺失突變體的大腸桿菌裂解液的斑點印跡上再次對它們進行測試,以選出能產(chǎn)生識別融合核素蛋白上的不同表位的抗體的雜交瘤。
2.4α-融合核素特異性抗體的特性描述分離出兩種雜交瘤3B5(IgG2a)和9B6(IgG1),在斑點印跡上它們對α-融合核素具有特異性。為了確定其精確表位,將羧基端部分(64-140位)合成為10個重疊肽(圖5)。這些肽為14個氨基酸長,有7個氨基酸重疊。生物素化肽以1μg/ml的濃度捕捉在鏈霉抗生物素蛋白包被的滴定板上。α-融合核素特異性抗體在這些肽上培養(yǎng),隨后用抗小鼠酶偶聯(lián)抗體檢測。酶,辣根過氧化物酶,使用三甲基聯(lián)苯胺作為底物進行測量。3B5和9B6都識別含有序列LEDMPVDPDNEAYE(113-126位)的肽,提示了這種單克隆抗體的線型表位(圖6)。在同一組實驗中,先前已顯示識別α-融合核素的商品抗體(Clone 42,IgG1,Transduction Labs,Lexington,KY,USA;Cat No S63320)也能繪制成線型表位(序列AGSIAAATGFVKKD,85-98位)(圖6)。
2.5α-融合核素特異性抗體的純化和生物素化在第二和第三次亞克隆循環(huán)后,抗體的生成按比例擴大至1-2升,以用于10-20mg抗體的純化。用Mini-Leak-Medium(KEM-EN-TECBiozyme,Vancouver,BC,Canada;Cat No 10127,Lot No 60232-5)按照制造商提供的說明對抗體進行免疫提純。
生物素化按照已完全確定的步驟(Bonhard等,1984年)使用D-生物素?;?η-氨基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(Boehringer-Mannheim,Brussels,Belgium;Cat No 1008960)進行。
2.6用于α-融合核素檢測和腦脊液濃度的定量測定的夾心ELISA的開發(fā)在以α-融合核素抗體作為捕獲抗體并以一種生物素化單克隆抗體作為檢測抗體的基礎(chǔ)上開發(fā)夾心ELISA。Maxisorp微量滴定板涂覆Affini純山羊抗小鼠IgG(Jackson Immuno Research Laboratories,Inc.,West Grove,Pennsylvania,USA;Cat No 115-035-144)。在PBS中的1%BSA(臨床級98%脂肪酸游離;ICN,Biomedical ResearchProducts,Costa Mesa,CA,USA;Cat No 105033,Lot No 6p384)+1%小鼠血清用作封閉緩沖液。加入用封閉緩沖液稀釋1/1000倍的抗-α-融合核素(Transduction Labs,Lexington,KY,USA)。培養(yǎng)后,加入不同濃度的重組抗原(濃度范圍1000-2pg/ml)。同時在1%小鼠抗體的存在下加入生物素化抗-α融合核素單克隆抗體,加入濃度應(yīng)使得到最佳的背景-信號比。然后經(jīng)由辣根標記的鏈霉抗生物素蛋白(JacksonImmuno Research Laboratories,Inc.,West Grove,Pennsylvania,USA;Cat No 016-030-084)在1/2000的稀釋度下檢測生物素化的兔抗體。偶聯(lián)過氧化物酶通過TMB,H2O2底物溶液檢測。與2NH2SO4反應(yīng)30分鐘后反應(yīng)停止,在450nm測量吸光度。實施例3腦脊液中其他神經(jīng)學標記的檢測3.1τ和磷酸-τ總的τ蛋白用τ抗原試驗測量,使用AT120作為捕獲抗體,用生物素化HT7-BT2作為檢測抗體(INNOTEST hTau抗原,Innogenetics,Gent,Belgium)。單克隆抗體AT120同等良好地與正常和過磷酸化人τ蛋白反應(yīng)(Vandermeeren等,1993年),單克隆抗體HT7也同等良好地與正常和過磷酸化人τ蛋白反應(yīng),而單克隆抗體BT2優(yōu)先識別正常τ蛋白(Goedert等,1994年)。如先前所述制備的(Mercken等,1992b)親和純化的τ蛋白用作標準物。
磷酸-τ用夾心ELISA測量,使用HT7作為捕獲抗體,生物素化AT270作為檢測抗體(INNOTEST磷酸-τ(181),Innogenetics,Gent,Belgium)。AT270特異性識別磷酸-τ(國際申請公開WO 95/17429)。
3.2β-淀粉狀蛋白(1-42)β-淀粉狀蛋白(1-42)濃度用Innotestβ-淀粉狀蛋白(1-42)(Innogenetics,Gent,Belgium)測量。該測定法是夾心型ELISA,其中第一單克隆抗體21F12(對淀粉狀蛋白的羧基端有特異性)用作捕獲抗體,生物素化3D6(對氨基端有特異性)用作檢測抗體。21F12/3D6的組合能特異性檢測淀粉狀蛋白(1-42)肽。對于淀粉狀蛋白(1-43)觀察到一些交叉反應(yīng)性,但對于較短的肽則沒有觀察到(Citron等,1997年;Johnson-Wood等,1997年)。簡言之,將21F12抗體懸浮于10mMTris-10mM NaCl并涂敷到Nunc Maxisorbs微量滴定板上在4℃下過夜。經(jīng)過一次洗滌步驟后,滴定板在25℃下用PBS-0.1%酪蛋白封閉2小時。該試驗通過同時培養(yǎng)(1小時,25℃)75μl生物素化3D6和25μl CSF或標準物而進行。經(jīng)過數(shù)次洗滌步驟后,束縛抗體的量通過加入100μlHRP-鏈霉抗生物素蛋白(RDI,Flanders,New York,NY,USA)進行檢驗。在25℃下繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘。然后,加入100μl 0.42mM 3,5,3’,5’-四甲基聯(lián)苯胺作為過氧化物酶底物。與50μl 0.9N H2SO4反應(yīng)30分鐘后停止反應(yīng)。
3.3β-淀粉狀蛋白(1-40)測量β-淀粉狀蛋白(1-40)的濃度,使用購自Quality ControlledBiochemicals(QCB,Hopkinton,MA,USA)的C端特異性親和純化多克隆抗體作為捕獲抗體,3D6(Citron等,1997年;Johnson-Wood等,1997年)作為檢測抗體。Nunc Maxisorps微量滴定板在25℃下用在10mMTris-10mM NaCl緩沖液中的5μg/ml親和純化山羊抗兔IgG(H+L)(Jackson Immuno Research Laboratories,Inc.,West Grove,Pennsylvania,USA;Cat No 111-005-144)包被2小時。之后,滴定板在4℃下用PBS-0.1%酪蛋白封閉過夜。在25℃下以0.5μg/ml的濃度加入兔多克隆抗體(QCB,Hopkinton,MA,USA;Cat No 44-348-20)1小時。經(jīng)過數(shù)次洗滌步驟后,100μl CSF或標準物在25℃下培養(yǎng)2小時。束縛淀粉狀蛋白的量通過加入100μl生物素化3D6抗體進行檢驗,在25℃下以在綴合稀釋劑中的0.1μg/ml的濃度加入1小時。滴定板再次洗滌5次。束縛抗體的量通過加入100μl SV-AP(Gibco,Rockville,MD,USA;Cat No JK-4410)進行檢驗。在25℃下繼續(xù)培養(yǎng)1小時。經(jīng)過最后的洗滌步驟(5次)后,加入100μl溶解在底物緩沖液中的TMB作為過氧化物酶底物。與50μl 0.9N H2SO4反應(yīng)30分鐘后停止反應(yīng)。
3.4神經(jīng)調(diào)制素神經(jīng)調(diào)制素也用夾心型ELISA測量,使用兩種表位特異性單克隆抗體(NM2,NM4;Oestreicher等,1994年)。NM2選擇作為捕獲抗體,生物素化NM4作為檢測抗體。重組神經(jīng)調(diào)制素用作標準物。
3.5神經(jīng)元特異性烯醇化酶NSE的測量是基于夾心ELISA,使用抗-NSE單克隆抗體2E7作為捕獲抗體,用過氧化物酶標記的抗-NSE單克隆抗體10C1作為檢測抗體。來自人腦的純化NSE用作標準物(Vanmechelen等,1997年)。
蛋白質(zhì)濃度用BCA蛋白試劑(Pierce,Rockford,Illinois,USA)測定。實施例4聯(lián)合測定,使用CSF-Rab3a、CSF-SNAP25、CSF-τ和CSF-β-淀粉狀蛋白(1-42)作為神經(jīng)學標記,用于特定檢測早老性癡呆和鑒別早老性癡呆與年齡相當?shù)膶φ照?.1病人和對照受試者早老性癡呆(AD)組包括32名病人,15名男性和17名女性,平均年齡±SD為75.0±6.6歲。血管性癡呆(CAD)組有20名病人,10名男性和10名女性,平均年齡±SD為81.0±7.0歲。對照組包括18名個體,7名男性和11名女性,平均年齡±SD為67.5±5.5歲。可能是AD的診斷是按照NINCDS-ADRDA標準通過排除作出的(McKhann等,1984年)。有涉及癡呆的發(fā)展的一過性缺血發(fā)作和/或中風發(fā)作和/或CT發(fā)現(xiàn)大面積梗塞和/或多段腔隙、和/或臨床發(fā)現(xiàn)嚴重的血管病(諸如高動脈壓或伴有并發(fā)癥的糖尿病)或有這樣的病史的病人診斷為VAD。對照組由沒有精神病或神經(jīng)病、惡性病或系統(tǒng)病(例如類風濕性關(guān)節(jié)炎,傳染病)的病史、癥狀或體征的個體組成。在60歲以上的個體中,認知狀態(tài)使用簡短精神狀態(tài)檢查(Folstein等,1975年)來檢驗。將得分低于28的個體排除。該研究由Gteborg大學的道德委員會(Gteborg,Sweden)核準。病人(或其最近親)和對照組中的個體完全同意參加該研究。
4.2腦特異性腦脊液的分離方法已由Davidsson等(1996年)作了詳細描述。簡言之,將5-10ml CSF加載到用于選擇性去除白蛋白的Blue Sepharose分析柱上(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。然后將沒有白蛋白的級分加到裝有與Sepharose 4B共價相連的葡萄球菌蛋白G的分析柱上(Pharmacia,Uppsala,Sweden)以吸收IgG。未吸收的蛋白使用裝配有mRPC C2/C18柱(尺寸,內(nèi)徑2.1×100mm,凝膠體積0.35ml,粒徑3mm)的SMART系統(tǒng)(Pharmacia LKB technology,Uppsala,Sweden)通過mR-HPLC分離。蛋白質(zhì)用兩份線性梯度的三氟乙酸洗脫。將總共40個級分在Savant Speed Vac濃縮器中干燥。將各級分溶于SDS-PAGE樣品緩沖液,超聲處理并煮沸15分鐘,之后在12%聚丙烯酰胺上分離。
4.3對用于特定檢測早老性癡呆的組合測定的評估借助夾心ELISA測量32名AD病人、20名VAD病人和11名對照者的CSF樣品中的CSF-Rab3a、CSF-SNAP25、CSF-τ和CSF-β-淀粉狀蛋白(1-42)的濃度。所有標記的平均濃度概括在表4中。圖7中給出了τ蛋白和Rab3a的個體值。
在利用對AD病人的最高靈敏度和對對照病人的最高特異性而確定的截止值的基礎(chǔ)上確定似然比(表5)。由于Rab3a和SNAP25濃度是有相互關(guān)系的,因此可以只使用Rab3a或SNAP25與τ和β-淀粉狀蛋白(1-42)結(jié)合(圖8)。因此,未測定有關(guān)Rab3a和SNAP25的組合的似然比。三種神經(jīng)學標記的組合τ-β-淀粉狀蛋白(1-42)-Rab3a和τ-β-淀粉狀蛋白(1-42)-SNAP25的似然比與單獨的一種標記的似然比相比或與各自兩種標記的組合的似然比相比升高了,表明三種標記的組合能更特定和靈敏地檢測早老性癡呆。
全階乘復(fù)合變量分析(ANOVA),用所有標記作為因變量,性別作為因子,年齡和簡短精神得分評估(MMSE;Folstein等,1975年)作為協(xié)變量,在不同的組中顯示這些參數(shù)沒有一個發(fā)生協(xié)變。另外,無論是在單獨的各個組中還是將所有組結(jié)合在一起,都未能檢測到τ蛋白、β-淀粉狀蛋白(1-42)和Rab3a/SNAP25之間的明顯相關(guān)性。
分離有關(guān)Rab3a和SNAP25的其他抗體。CSF-Rab3a、CSF-SNAP25、CSF-τ蛋白和CSF-β-淀粉狀蛋白(1-42)的濃度在明確的臨床診斷組中進行研究,其中可接受的樣品大小允許進行統(tǒng)計學顯著性比較。實施例5聯(lián)合測定,使用CSF-τ、CSF-神經(jīng)調(diào)制素和CSF-神經(jīng)元特異性烯醇化酶作為神經(jīng)學標記,用于診斷治療白血病的兒童因化療誘導(dǎo)的神經(jīng)元損害5.1病人和對照受試者1996年8月至1998年9月間,從正在比利時的魯汶天主大學的兒科血液-腫瘤學系治療癌癥的83名兒童身上采集448份CSF樣品。所有病人在診斷的時候都經(jīng)過了全面的臨床評估。研究得到了他們父母的同意。
樣品只在用于對惡性腫瘤的疾病分期或治療的預(yù)定腰椎穿刺(LP)的過程中采集?;加醒簩W惡性腫瘤的不同組病人參加本研究(表6)。第1組包括9名B細胞非霍奇金淋巴瘤病人(B-NHL),按照聯(lián)合王國兒童癌癥患者團體(UKCCSG 9602)NHL方案(表7a)進行治療。在這個組中,4名病人有B細胞淋巴瘤,3名病人有伯基特淋巴瘤,2名病人有整形大細胞淋巴瘤(ALCL)。這些病人中有8名作縱向研究。第二組也是最大的一組包括42名患有非B細胞急性成淋巴細胞性白血病/非霍奇金淋巴瘤(NB ALL/NHL)的病人,按照“歐洲癌癥研究與治療組織”(EORTC)的方案58881(表7b)進行治療。在這組中,18名兒童伴有CD(+)枯萎病或普通NB ALL,2名病人伴有唐氏綜合征(DS),1名病人伴有布-朗綜合征,3名病人伴有普通B細胞枯萎病,1名病人有普通T細胞枯萎病,2名病人有原B細胞枯萎病,9名病人有前B細胞枯萎病,8名病人有T細胞枯萎病。38名兒童有白血病,5名有非霍奇金淋巴瘤Ⅱ期(1名)、Ⅲ期(3名)或Ⅳ期(1名),其中1名病人明顯牽涉到CNS(CNS+),這是按照在CSF、眼底鏡檢查和對比恍惚中有惡性細胞的研究方案確定的。按照治療方案中確定的標準,5名病人被認為是極高危(VHR)的病人(2名病人伴有T細胞枯萎病,3名伴有腎上腺皮質(zhì)激素抗藥性)。這組中有27名病人可以縱向進行研究。第三組由6名患有急性骨髓瘤性白血病(AML)的兒童組成,其中1名牽涉到CNS,2名有唐氏綜合征。有3名病人有MO,各1名病人有M1、M2或M7表型。所有這些病人都按照EORTC 58921方案(表7c)進行治療并縱向進行。其他病人由不同類的兒童組成(n=18),其中出于臨床原因,在他們的治療過程中或之后,進行腰椎穿刺以診斷感染和疾病分期。這組包括5名伴有成神經(jīng)管細胞瘤的兒童(3名疾病分期,1名治療過程中,1名治療后追查),3名伴有霍奇金病的兒童(疾病分期),3名伴有橫紋肌肉瘤的兒童(2名疾病分期,1名治療過程中),2名伴有脊髓發(fā)育不良綜合征(MDS)的兒童(疾病分期),2名伴有朗格罕氏組織細胞增多癥(langerhans cell histiocytis)的兒童(LVH/HLH,疾病分期),1名患有幼年期慢性骨髓瘤性白血病(CML)(治療過程中)、絨膜癌(追查)或生殖細胞瘤(疾病分期)的兒童。有一大群健康新生兒未采用,因為從這些病人采集腦脊液是不道德的。作為對照,懷疑患有腦膜炎但伴有否定判定(n=4)、局限性成視網(wǎng)膜細胞瘤(n=1)和家族性噬紅細胞性淋巴組織細胞增多病(n=1)的兒童加入研究。研究得到了他們父母的同意。
5.2研究設(shè)計使用預(yù)期和縱向的單中心研究設(shè)計。在加入該研究之前沒有病人接受過任何治療。在本探察研究中,在進行任何治療之前先從58名兒童得到CSF樣品(=診斷性腰椎穿刺或LP1)(其他詳細資料參見表7)。對于大多數(shù)病人,在所有時間點都沒有殘余樣品。缺少的值不是由于兒童的疾病狀態(tài)造成的,而是采樣或樣品儲藏過程中的人為結(jié)果。
進行腰椎穿刺以用于常規(guī)分析,或者在基線時進行以用于診斷性檢查,或者就在化療的IT給藥之前進行。將5ml CSF收集在不同的聚丙烯試管中。1份樣品立即以1500rpm離心2分鐘以消除細胞和其他不溶物質(zhì)。上清液儲藏在-70℃下以用于隨后的分析。冷凍/融解循環(huán)的次數(shù)限制在最小程度。常規(guī)CSF測量包括細胞學,蛋白質(zhì)濃度,葡萄糖,等等。
由于不受診斷組支配的所有神經(jīng)學標記數(shù)據(jù)的當量濃度都被拒絕了,因此將非參數(shù)統(tǒng)計學用于分析。Kruskal-Wallis檢驗用于研究關(guān)于有效變量(τ,神經(jīng)調(diào)制素,蛋白質(zhì)等)的組間差異。Wilcoxon符號等級配對檢驗用于檢查第一次診斷性LP和隨后的LP之間的差值。Pearson相關(guān)用于研究可能的協(xié)變。分析用Prism軟件2.01版(Gradhpad Software Inc.,San Deigo,CA,USA)、Systat 7版(SPSS,Chicago,IL,USA)進行。
5.3對用于診斷化療誘導(dǎo)的神經(jīng)元損害的聯(lián)合測定的評估治療前神經(jīng)學標記的濃度首先確定來自患有傳染病(但病毒和細菌培養(yǎng)物為陰性)的兒童(n=4)的CSF樣品的τ蛋白的正常上限濃度,其中1名患者有非常局限性的成視網(wǎng)膜細胞瘤,1名患者篩選家族性HLH。對照兒童的平均τ值是106.2pg/ml(95%CI=34.3-178.0)。任意截止正常值認為是312pg/ml(均值+3 SD),它在成人觀測值的范圍內(nèi)。80%的正常成人對照者的τ值在352pg/ml以下,而425pg/ml(p25-p75:274-713,n=150)是早老性癡呆病人的τ濃度中值(Hulstaert等,1999年)。樣品首先獨立于病人數(shù)進行分析;之后,再次在一個免疫滴定板上對來自1名病人的所有樣品進行分析。對于一組104份樣品用第一和第二種方法獲得的結(jié)果之間的相關(guān)系數(shù)是0.901(95%CI:0.856-0.933)。
分析每個病人子群的診斷時的τ濃度(圖9)。診斷時的τ濃度范圍是66-1500pg/ml。有關(guān)τ、神經(jīng)調(diào)制素、β-淀粉狀蛋白(1-42)、β-淀粉狀蛋白(1-40)、血清LDH和CSF白細胞數(shù)的數(shù)據(jù)(圖10)顯示在伴有或不伴有唐氏綜合征的各組中或在診斷組之間沒有明顯差異。此外,在τ濃度和WBC或LDH濃度之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。在τ濃度和兒童的年齡之間也未發(fā)現(xiàn)明顯的關(guān)系。2名有MDS的病人、有明顯CNS侵襲(CNS+)的病人,他們的診斷時的τ濃度明顯增強,但患有AML的兒童則無此現(xiàn)象。另外,三名因后窩中的成神經(jīng)管細胞瘤引起顱內(nèi)壓升高的入院病人,采集他們的CSF用于疾病分期,他們的CSF-τ濃度非常高(823,1397,1500)。不過,7/21患有非-B ALL/NHL的兒童、1/4有極高危標準的非-B ALL/NHL病人、2/4有AML的病人和2/8有B-細胞NHL的病人,他們的τ濃度在312pg/ml以上,盡管使用標準方法未檢測到CNS侵襲。
對于27名患有非-B ALL/NHL的病人或9名患有B細胞NHL的病人(數(shù)據(jù)未顯示),診斷時的τ濃度與腫瘤負擔無關(guān),正如由白細胞數(shù)(p=0.935,n=40)或血清LDH(p=0.855,n=39)反映出的。在LP1時,τ和神經(jīng)調(diào)制素之間有非常顯著的相關(guān)性[r=0.793;95%CI:0.658-0.928,n=50],表明這兩種蛋白的分泌在有些點是相互關(guān)聯(lián)的。τ和β-淀粉狀蛋白(1-42)之間未觀察到相關(guān)性(p=0.1032,n=52)。
B-NHL病人的治療過程中神經(jīng)學標記的濃度關(guān)于化療誘導(dǎo)的CSF中τ的增加的最驚人的差異是在B細胞NHL病人中檢測到的。來自三名病人的基線和第9天LP(=LP2)跟蹤樣品的結(jié)果是有效的,顯示于圖11a中。在第9天(即MTX和氫化可的松IT給藥以及MTX和長春新堿IV給藥后)已可測量到最大的τ增加值。稍后的測量顯示τ值沒有再增加。化療誘導(dǎo)的對神經(jīng)元代謝活性的作用得到了有關(guān)神經(jīng)調(diào)制素(圖11b)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(圖11c)的類似發(fā)現(xiàn)的確證。此外,τ和神經(jīng)調(diào)制素之間(r=0.722,95%CI:0.553-0.834,n=49)或神經(jīng)調(diào)制素和神經(jīng)元特異性烯醇化酶之間(r=0.622,95%CI:0.247-0.835,n=20)有驚人的相關(guān)性。
非B細胞ALL/NHL病人治療過程中神經(jīng)學標記的濃度得到按照EORTC方案58881進行治療的13名非-B ALL病人的覆蓋整個治療期的數(shù)據(jù)(pre-post樣品)。圖12a中顯示了個體患者的不同治療階段的中間τ值。在誘導(dǎo)期,當與治療前的濃度(LP1)相比(p=0.048)、或者與維持期相比(p=0.040)時,τ濃度顯著升高。1名病人在開始治療之前τ濃度已經(jīng)升高(893pg/ml),可能反映了已在進展的神經(jīng)學機能障礙。在治療前和誘導(dǎo)期之間神經(jīng)調(diào)制素濃度也有升高的趨勢(p=0.0522)(圖12b)。在治療開始時表現(xiàn)出高τ濃度的病人也顯示出在開始添加化療時的高神經(jīng)調(diào)制素濃度。2名病人的LP1和LP2的NSE數(shù)據(jù)是有效的[LP1(4.0ng/ml,3.4ng/ml);LP2(11.7ng/ml,9.6ng/ml)],NSE有顯著升高。
對來自非-B ALL病人的所有數(shù)據(jù)的分析顯示,在誘導(dǎo)期中觀察到了最高τ濃度。在誘導(dǎo)期中,分析的樣品中有41%(28/68)高于500 pg/ml。然后該百分率在間期下降至18.9%(14/74),在再次誘導(dǎo)過程中下降至16.7%(3/18),最后在維持期下降至9.7%(7/72)(圖13a)。治療開始前τ值已升高(>500pg/ml)的三名病人的τ值在化療后正?;S嘘P(guān)非-B ALL病人的β-淀粉狀蛋白(1-42)、神經(jīng)調(diào)制素和NSE濃度的數(shù)據(jù)分別顯示在圖13b、圖13c和圖13d中。此時,在τ和神經(jīng)調(diào)制素(r=0.658,95%CI=0.580-0.725,n=251)或NSE(r=0.589,95%CI=0.363-0.749,n=47)的濃度之間也有顯著的相關(guān)性。
本研究中縱向測試5名符合極高危標準的非-B ALL兒童。第1治療階段與EORTC 58881類似。5名病人中有4名觀察到類似的化療誘導(dǎo)的τ濃度變化,同時在τ和神經(jīng)調(diào)制素之間有極顯著的相關(guān)性(n=55;r=0.880,95%CI:0.802-0.929)。
1名唐氏綜合征-非B ALL病人診斷時的τ濃度為70pg/ml。在該縱向研究中所有非B ALL病人在第8天時τ濃度的平均升高值為250%(95%CI=130%-370%,n=13),在第21天時為200%(95%CI=150%-260%,n=8),而伴有唐氏綜合征的病人在第8天和第21天時τ濃度的升高百分數(shù)分別為820%和1200%。
1名特殊病人用潑尼松龍治療了8天,但由于高白血病負荷(610000WBC/mm3),在第1天時沒有IT給藥MTX。治療8天后,τ濃度仍很低,為155pg/ml。之后,該名病人象其他所有非B ALL病人一樣開始用EORTC方案治療,包括在以后的幾周內(nèi)IT注射MTX。τ濃度迅速升高,在第12、15、18、22和44天時分別達到744、948、1120、861和1023pg/ml。
從在另一個中心接受治療的兒童獲得1份CSF樣品,該名兒童在用MTX治療后出現(xiàn)明顯神經(jīng)毒性,并且他患有雙癱。該名兒童的τ和神經(jīng)調(diào)制素濃度超過了所用的最高標準物(τ濃度為1500pg/ml,神經(jīng)調(diào)制素為8000pg/ml),反映了總體神經(jīng)元變性。
AML治療過程中神經(jīng)學標記的濃度圖14a顯示了患有AML的患者個體的τ的進展情況。病人11、12和23在治療過程中τ沒有明顯升高(表7c)。病人12在第1天和第8天時進行LP,他患有侵略性疾病并且在骨髓移植后很快就死了??蓮陌橛刑剖暇C合征的2名病人之一獲得縱向數(shù)據(jù),該名病人的τ濃度有些微升高,在300pg/ml以上,這與病人11和23的CSF中的τ濃度的進展情況形成了對照。病人69,診斷時證明有CNS侵襲,他的CSF中的τ和神經(jīng)調(diào)制素有驚人的升高(圖14b)。該名兒童仍在治療中,并且此刻病情已完全緩解。
結(jié)論在這個縱向研究中我們發(fā)現(xiàn)液體中τ、神經(jīng)調(diào)制素和NSE的濃度顯著升高,這很可能反映了與化療有關(guān)的神經(jīng)元損害,并且這主要是在ITMTX并結(jié)合IV皮質(zhì)類固醇和化療(ALL誘導(dǎo)和再次誘導(dǎo)治療,B細胞NHL治療)的時候?qū)е碌?,在間期治療過程中的高劑量IV和IT MTX過程中則沒有產(chǎn)生這樣的情況。實施例6用于診斷產(chǎn)前窒息導(dǎo)致的腦損害的聯(lián)合測定產(chǎn)期窒息可能與神經(jīng)元損害相關(guān)聯(lián)。在低氧-局部缺血事件的評估中,除了腦電圖和神經(jīng)系放射學數(shù)據(jù)以外,CSF神經(jīng)學標記可以補充臨床數(shù)據(jù)(Garcia-Alix,1994年)?,F(xiàn)在越來越有證據(jù)表明改變的腦代謝活性可由CSF中各成分的變化反映。對CSF標記的產(chǎn)前濃度以及因窒息引起的變化的分布進行評估。實施例7聯(lián)合測定,使用CSF-神經(jīng)調(diào)制素、CSF-τ和CSF-β-淀粉狀蛋白(1-42)作為神經(jīng)學標記,用于特定檢測早老性癡呆和用于鑒別早老性癡呆與對照受試者7.1病人和對照受試者得到109名個體的CSF。將這些個體分成4組(ⅰ)定義為癡呆的神經(jīng)學對照的組(n=70)。該組包括多發(fā)性硬化、急性熱病性多神經(jīng)炎、多神經(jīng)病和癲癇病人。其他組包括(ⅱ)記憶力損傷的老年病人(n=7),(ⅲ)早老性癡呆(AD)病人(n=27)和(ⅳ)血管性癡呆(VAD)病人(n=5)。所有病人都按照《國際疾病分類》第9版(疾病、損傷和死因的國際統(tǒng)計學分類手冊基于第9次修訂會議的推薦;1975年,由第29次世界健康大會通過。日內(nèi)瓦世界衛(wèi)生組織,1977年)規(guī)定的標準進行診斷。在AD組中,有2名病人來自其中presenilin突變決定該疾病的早期發(fā)作的家庭。這些病人中有1名是癥狀發(fā)生前的。
CSF作為神經(jīng)學檢查的一部分進行常規(guī)取樣。所有試驗都用剩余的CSF進行。只測量適當儲存于聚丙烯試管并只冷凍了一次的CSF樣品中的β-淀粉狀蛋白(1-42)。
7.2對用于特定檢測早老性癡呆和用于鑒別早老性癡呆與對照受試者的聯(lián)合測定的評估測定這些病人的CSF中的τ、β-淀粉狀蛋白(1-42)和神經(jīng)調(diào)制素(GAP-43)的濃度。表8中顯示了每組的平均CSF濃度。β-淀粉狀蛋白(1-42)、τ和神經(jīng)調(diào)制素的個體濃度分別顯示在圖15a、15b和15c中。
AD病人的CSF-τ和CSF-β-淀粉狀蛋白(1-42)有顯著變化。并且,AD病人的CSF-神經(jīng)調(diào)制素顯著升高。與此對照,在記憶力損傷的老年病人中,沒有觀察到CSF-神經(jīng)調(diào)制素的顯著作用,而CSF-τ濃度與對照受試者相比則顯著升高了。7名記憶力受損的病人中有3名的CSF-τ濃度高于由對照組確定的最大值(280pg/ml)。由于儲存不當,只能確定3名記憶力受損病人的CSF-β-淀粉狀蛋白(1-42)濃度。這3名病人中有2名的濃度在300pg/ml以下。這些病人中還有1名的CSF-τ濃度升高了。其他病人的CSF-τ濃度為278pg/ml,即,剛剛低于對照組確定的最大值。在癥狀發(fā)生前的家族性AD病人中,CSF-τ濃度升高至327pg/ml,同時β-淀粉狀蛋白(1-42)濃度低于300pg/ml。針對一些記憶力受損個體的樣品進行的這種分析表明,τ、β-淀粉狀蛋白(1-42)和神經(jīng)調(diào)制素的結(jié)合使用是指示早老性癡呆存在的較好指示器。為了達到統(tǒng)計學顯著性,用每組大量樣品進行分析(每個診斷組至少50份樣品)。實施例8聯(lián)合測定,使用CSF-神經(jīng)調(diào)制素、CSF-β-淀粉狀蛋白(1-42)和CSF-τ作為神經(jīng)學標記,用于特定檢測早老性癡呆、鑒別早老性癡呆與對照受試者,用于特定檢測帕金森氏病、鑒別帕金森氏病與對照受試者,以及用于鑒別早老性癡呆與帕金森氏病。
8.1病人和對照受試者從60名早老性癡呆病人、23名帕金森氏病病人和32名年齡相當?shù)膶φ詹∪双@得CSF。測定這些病人的CSF中的τ、β-淀粉狀蛋白(1-42)和神經(jīng)調(diào)制素(GAP-43)濃度。表9中顯示了每組的平均CSF濃度。
8.2對用于特定檢測早老性癡呆和鑒別早老性癡呆與對照受試者的聯(lián)合測定的評估AD病人的τ濃度與對照相比顯著升高,而β-淀粉狀蛋白(1-42)濃度則下降了。這兩組間的NM濃度沒有顯著差異。但是,NM和τ濃度顯著相關(guān)(圖16)。圖16的外部檢查顯示,AD病人的值可以與對照病人的分離開。后向判別分析(Morrison,1976年)用于確定哪個變量(τ、β-淀粉狀蛋白(1-42)、神經(jīng)調(diào)制素或τ/神經(jīng)調(diào)制素)能最好地區(qū)別早老性癡呆病人與對照病人。挑選出變量τ/神經(jīng)調(diào)制素和β-淀粉狀蛋白(1-42)并準確地分出了58名早老性癡呆病人中的55名(靈敏度94.8%,CI85.6%-98.9%)和31名對照病人中的30名(靈敏度96.8%,CI 83.3-99.9%)(圖17)。對大量樣品的進一步分析將能證明利用這三種標記診斷早老性癡呆的統(tǒng)計學上顯著的改善。
8.3對用于特定檢測帕金森氏病和鑒別帕金森氏病與對照受試者的聯(lián)合測定的評估后向判別分析(Morrison,1976年)用于確定哪個變量能最佳地區(qū)別對照與帕金森氏病病人。挑選出變量τ/神經(jīng)調(diào)制素和β-淀粉狀蛋白(1-42)。準確地分出了23名帕金森氏病病人中的14名(靈敏度60.9%,CI 38.6%-80.3%)和31名對照病人中的27名(靈敏度87.1%,CI70.2-96.4%)(圖17)。對大量樣品的進一步分析將能證明利用這三種標記診斷帕金森氏病的統(tǒng)計學上顯著的改善。
8.4對鑒別早老性癡呆與帕金森氏病的聯(lián)合測定的評估挑選出β-淀粉狀蛋白(1-42)和神經(jīng)調(diào)制素來鑒別早老性癡呆病人和帕金森氏病病人,對于早老性癡呆病人的靈敏度為94.8%(CI 85.6-98.9%),對于帕金森氏病病人的靈敏度為78.3%(CI 56.3%-92.5%)。對大量樣品的進一步分析將能證明利用這三種標記來鑒別早老性癡呆與帕金森氏病的統(tǒng)計學上顯著的改善。實施例9使用CSF-α-融合核素作為神經(jīng)學標記來鑒別雷維小體性癡呆與早老性癡呆9.1病人和對照受試者從30-40名早老性癡呆病人、10-20名雷維小體性癡呆病人和10-20名年齡相當?shù)膶φ詹∪双@得CSF。
9.2用于鑒別診斷早老性癡呆與雷維小體性癡呆的測定定量測定不同的病人組和對照組中病人的CSF中的α-融合核素濃度。早老性癡呆組的α-融合核素濃度的平均值與雷維小體性癡呆組的α-融合核素濃度的平均值之間的顯著差異使得我們能區(qū)別開這兩種類型的癡呆。通過將α-融合核素的定量測定與另外的至少兩種神經(jīng)學標記(諸如τ和β-淀粉狀蛋白(1-42))的定量測定結(jié)合起來,可以進一步改善對早老性癡呆與雷維小體性癡呆的鑒別。實施例10聯(lián)合測定,使用CSF-β-淀粉狀蛋白(1-42)、CSF-τ和CSF-磷酸-τ作為神經(jīng)學標記,用于特定檢測額顳葉性癡呆和鑒別額顳葉性癡呆與其他癡呆10.1病人和對照受試者從30-40名額顳葉性癡呆病人和10-20名年齡相當?shù)膶φ帐茉囌攉@得CSF。
10.2用于鑒別診斷額顳葉性癡呆與對照受試者的聯(lián)合測定定量測定不同的額顳葉性癡呆病人和對照病人的CSF中的β-淀粉狀蛋白(1-42)、τ和磷酸-τ的濃度。額顳葉性癡呆病人的τ和磷酸-τ濃度的平均值與對照病人的τ和磷酸-τ濃度的平均值相比顯著升高。而額顳葉性癡呆病人的β-淀粉狀蛋白(1-42)濃度與對照病人相比降低了。實施例11聯(lián)合測定,使用CSF-β-淀粉狀蛋白(1-42)、CSF-τ和血漿-β-淀粉狀蛋白(1-42)作為神經(jīng)學標記,用于特定檢測早老性癡呆中的血管問題和鑒別血管疾病與其他形式的早老性癡呆11.1病人和對照受試者從30-40名血管病病人、30-40名其他形式的早老性癡呆病人和10-20名年齡相當?shù)膶φ詹∪双@得CSF和血漿。
11.2用于鑒別診斷血管病與其他形式的早老性癡呆的聯(lián)合測定定量測定不同的血管病病人、其他形式的早老性癡呆病人和對照病人的CSF中的τ和β-淀粉狀蛋白(1-42)濃度以及血漿中的β-淀粉狀蛋白(1 42)濃度。血漿-β-淀粉狀蛋白(1-42)、CSF-τ和CSF-β-淀粉狀蛋白(1-42)濃度的數(shù)值差異使得我們能夠區(qū)別開血管病病人和患有其他形式的早老性癡呆的病人。
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權(quán)利要求
1.特定檢測、定量和/或鑒別診斷個體的神經(jīng)變性的方法,它包括以下步驟-從所述個體獲得一種或多種體液樣品;-利用特異性識別神經(jīng)學標記的抗體測定所述樣品中至少三種神經(jīng)學標記的濃度,由此,所述所有神經(jīng)學標記的濃度與對照樣品相比的數(shù)量變化反映了神經(jīng)變性的類型和程度。
2.按照權(quán)利要求1的方法,其中所述體液樣品選自腦脊液樣品和血液樣品。
3.按照權(quán)利1-2任一項所述的方法,其中一種或多種所述神經(jīng)學標記選自τ、磷酸-τ、β-淀粉狀蛋白(1-42)、β-淀粉狀蛋白(1-40)、神經(jīng)調(diào)制素、神經(jīng)元特異性烯醇化酶和/或突觸蛋白。
4.按照權(quán)利要求3的方法,其中所述突觸蛋白選自Rab3a、SNAP25和α-融合核素。
5.檢測腦脊液中的Rab3a的方法,該方法至少包含以下步驟-在適合生成抗原-抗體復(fù)合物的條件下,使腦脊液樣品與能與Rab3a反應(yīng)的抗體接觸;和-檢測所述抗體與所述腦脊液樣品的免疫結(jié)合。
6.檢測腦脊液中的α-融合核素的方法,該方法至少包含以下步驟-在適合生成抗原-抗體復(fù)合物的條件下,使腦脊液樣品與能與α-融合核素反應(yīng)的抗體接觸;和-檢測所述抗體與所述腦脊液樣品的免疫結(jié)合。
7.按照權(quán)利要求1-4任一項所述的方法,其中所述神經(jīng)變性選自早老性癡呆、雷維小體病、帕金森氏病和額顳葉性癡呆。
8.按照權(quán)利要求1-4任一項所述的方法,其中所述神經(jīng)變性是由化療引起或因接觸化學物質(zhì)或輻射引起的。
9.按照權(quán)利要求1-4任一項或按照權(quán)利要求6所述的方法,它用于特定檢測或定量早老性癡呆和/或雷維小體病和/或用于鑒別診斷早老性癡呆與雷維小體病,其中-測定腦脊液樣品中α-融合核素的濃度;和/或-測定腦脊液樣品中τ、β-淀粉狀蛋白(1-42)和α-融合核素的濃度。
10.按照權(quán)利要求1-4任一項或按照權(quán)利要求5所述的方法,它用于特定檢測或定量早老性癡呆和/或用于鑒別診斷早老性癡呆與其他癡呆,其中-測定腦脊液樣品中τ、β-淀粉狀蛋白(1-42)和Rab3a的濃度;或-測定腦脊液樣品中τ、β-淀粉狀蛋白(1-42)和SNAP25的濃度。
11.按照權(quán)利1-3任一項所述的方法,它用于特定檢測或定量早老性癡呆和/或帕金森氏病和/或用于鑒別診斷早老性癡呆與帕金森氏病,其中測定腦脊液樣品中τ、β-淀粉狀蛋白(1-42)和神經(jīng)調(diào)制素的濃度。
12.按照權(quán)利1-3任一項所述的方法,它用于特定檢測或定量因化療和/或接觸化學物質(zhì)和/或輻射而引起的神經(jīng)變性,其中測定腦脊液樣品中τ、神經(jīng)元特異性烯醇化酶和神經(jīng)調(diào)制素的濃度。
13.按照權(quán)利8或12的方法,其特征還在于檢測或定量其神經(jīng)變性的個體患有白血病或腦腫瘤。
14.按照權(quán)利1-3任一項所述的方法,它用于特定檢測或定量額顳葉性癡呆和/或用于鑒別診斷額顳葉性癡呆與其他癡呆,其中測定腦脊液樣品中τ、磷酸-τ和β-淀粉狀蛋白(1-42)的濃度。
15.按照權(quán)利1-3任一項所述的方法,它用于特定檢測或定量早老性癡呆中的血管問題、用于鑒別診斷不同形式的早老性癡呆和/或用于鑒別診斷早老性癡呆與其他癡呆,其中定量測定腦脊液樣品中τ和β-淀粉狀蛋白(1-42)的濃度以及定量測定血漿樣品中β-淀粉狀蛋白(1-42)的濃度。
16.用于特定檢測、定量和/或鑒別診斷個體的神經(jīng)變性的診斷試劑盒,它至少包含3種各自識別不同神經(jīng)學標記的抗體。
17.用于特定檢測、定量和/或鑒別診斷個體的神經(jīng)變性的診斷試劑盒,它包含-包含在一起或分離的至少3種各自識別不同神經(jīng)學標記的抗體(第一抗體或捕獲抗體)的支持體;-第二抗體(檢測抗體),各自識別其中一種神經(jīng)學標記-第一抗體復(fù)合物;-可能的話,用于特異性標記所述第二抗體或與所述第二抗體偶聯(lián)的標記;-可能的話,用于進行第一抗體和體液樣品之間的、第二抗體和神經(jīng)學標記-第一抗體復(fù)合物之間的和/或結(jié)合第二抗體和標記之間的免疫反應(yīng)的適宜緩沖溶液;-可能的話,出于標準化的目的,用于檢測神經(jīng)學標記的、由該試劑盒的抗體特異性識別的純化蛋白質(zhì)或合成肽。
18.按照權(quán)利要求16或17的診斷試劑盒,它特別設(shè)計用于實施權(quán)利要求1-15任一項所述的方法。
19.用于檢測CSF中的Rab3a的診斷試劑盒,它至少包含識別Rab3a的單克隆抗體。
20.用于檢測CSF中的Rab3a的診斷試劑盒,它包含-含有識別Rab3a的單克隆抗體(第一抗體)的支持體;-識別Rab3a-第一抗體復(fù)合物的第二抗體(或檢測抗體);-可能的話,用于特異性標記所述第二抗體或與所述第二抗體偶聯(lián)的標記;-可能的話,用于進行第一抗體和腦脊液樣品之間的、第二抗體和Rab3a-第一抗體復(fù)合物之間的和/或結(jié)合第二抗體和標記之間的免疫反應(yīng)的適宜緩沖溶液;-可能的話,出于標準化的目的,用于檢測Rab3a的、由該試劑盒的抗體特異性識別的純化蛋白質(zhì)或合成肽。
21.用于檢測CSF中的α-融合核素的診斷試劑盒,它至少包含識別α-融合核素的單克隆抗體。
22.用于檢測CSF中的α-融合核素的診斷試劑盒,它包含-含有識別α-融合核素的單克隆抗體(第一抗體)的支持體;-識別α-融合核素-第一抗體復(fù)合物的第二抗體(或檢測抗體);-可能的話,用于特異性標記所述第二抗體或與所述第二抗體偶聯(lián)的標記;-可能的話,用于進行第一抗體和腦脊液樣品之間的、第二抗體和α-融合核素-第一抗體復(fù)合物之間的和/或結(jié)合第二抗體和標記之間的免疫反應(yīng)的適宜緩沖溶液;-可能的話,出于標準化的目的,用于檢測α-融合核素的、由該試劑盒的抗體特異性識別的純化蛋白質(zhì)或合成肽。
23.按照權(quán)利要求1-22任一項所述的方法或診斷試劑盒用于治療性監(jiān)控和/或確定某種治療的有效性的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的使用檢測個體的一種或多種體液中的至少三種神經(jīng)學標記的聯(lián)合測定法來特定檢測、定量和/或鑒別診斷所述個體的神經(jīng)變性的方法,所述所有神經(jīng)學標記的濃度與對照樣品相比的數(shù)量變化反映了神經(jīng)變性的類型和程度。本發(fā)明還涉及檢測腦脊液中的Rab3a、SNAP25和α-融合核素的方法,以及這些方法在用于特定檢測、定量和/或鑒別診斷神經(jīng)變性的聯(lián)合測定法中的用途。
文檔編號G01N33/53GK1316055SQ99810286
公開日2001年10月3日 申請日期1999年6月29日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月3日
發(fā)明者E·范梅徹倫, H·范德斯蒂徹勒, A·范德沃爾德 申請人:基因創(chuàng)新有限公司