專利名稱：Rec2激酶的制作方法
1．發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。詳細地說，它涉及一個為某蛋白質(zhì)編碼的基因，這種蛋白質(zhì)在哺乳動物細胞中是激酶并且參與細胞周期調(diào)控和受損基因組DNA的修復(fù)。該基因和蛋白質(zhì)在此處分別稱為hsREC2和hsRec2，與具有同源染色體配對和鏈交換活性的哺乳動物蛋白質(zhì)RAD51處在同一超基因家族中，并且因為它與Ustilago maydis的同源配對鏈交換蛋白質(zhì)具有同源性而被分離出來。鑒于這樣的關(guān)系，這一基因和蛋白質(zhì)也可被稱為RAD51B和rad51B。
2．發(fā)明背景2.1 hsREC2的結(jié)構(gòu)與功能在每一個生物體的生命過程中，它的細胞DNA不斷地遭受到各種化學(xué)和物理事件使其結(jié)構(gòu)改變即潛在的突變。這些潛在的突變因為DNA鏈間的錯配而被細胞中的DNA修復(fù)酶識別。為了防止這些潛在突變固定下來后將發(fā)生的有害影響，所有生物體都有多種機制修復(fù)DNA錯配。除此之外，比較高級的動物已經(jīng)發(fā)展形成了這樣的機制即如果細胞DNA損傷程度很大的話，細胞將會進入程序性死亡(“凋亡”)。
DNA錯配修復(fù)和凋亡誘發(fā)通路的缺陷與腫瘤治療的發(fā)展、進程和結(jié)果的關(guān)系已被醫(yī)學(xué)家廣泛認識，即使是不完全的理解。Chung,D.C.&Rustgi,A.K.,1995,Gastroenterology 109:1685-99；Lowe,S.W.,et al.,1994,Science 266:807-10.因而有必要去識別和克隆那些編碼參與DNA修復(fù)和DNA錯配監(jiān)控蛋白質(zhì)的基因。
通過對細菌、真菌和酵母的研究，已識別出從遺傳學(xué)角度定義的三組參與錯配修復(fù)過程的基因。這三組基因分別被稱為切除修復(fù)組，傾向差錯修復(fù)組和重組修復(fù)組。每組中一個基因的突變體會表現(xiàn)出有特征的表現(xiàn)型。酵母重組修復(fù)組突變體導(dǎo)致的表現(xiàn)型有對電離輻射極敏感，孢子形成過程不足和有絲分裂重組的缺失或減少。Petes,T.D.,et al.,1991,in Broach,J.R.,et al.,eds.,THE MOLECULAR BIOLOGYOF THE YEAST SACCHAROMYCES,pp.407-522(Cold Spring Harbor Press,1991).
幾個與種族進化相關(guān)的基因已在重組修復(fù)組中找到大腸桿菌中的recA,Radding,C.M.,1989,Biochim.Biophys.Acta1008:131-145；釀酒酵母中的RAD51 Shinohara,A.,1992,Cell69:457-470,Aboussekhra,A.R.,et al.,1992,Mol.Cell.Biol.12:3224-3234,Basile,G.,et al.,1992,Mol.Cell.Biol.123235-3246；釀酒酵母中的RAD57 Gene 105:139-140；中的in U.maydis REC2,Bauchwitz,R.,&Holloman,W.K.,1990,Gene 105:139-288,Rubin,B.P.,et al.,1994,Mol.Cell.Biol.14:6287-6296。第三個釀酒酵母基因DMC1與recA相關(guān)，雖然DMC1突變體表現(xiàn)出細胞周期進程、重組和減數(shù)分裂過程中的缺陷，卻不屬于重組修復(fù)組。
REC2缺陷型U.maydis的突變體表現(xiàn)型其特征在于對電離輻射的極度敏感，有缺陷的有絲分裂和質(zhì)粒間重組，以及不能進行完全的減數(shù)分裂。Holliday,R.,1967,Mutational Research4:275-288.UmREC2,即U.maydis的REC2基因產(chǎn)品，已經(jīng)被廣泛地研究過了。它是一個包含781個氨基酸的ATP酶，在ATP存在的情況下，能在多種條件下催化同源DNA鏈的配對，例如它催化變性的單鏈形成雙螺旋DNA，催化雙螺旋與單鏈的同源DNA間交換，和催化在同一單鏈間形成抗核酸酶復(fù)合體。Kmiec,E.B.,et al.,1994,Mol.Cell.Biol.14:7163-7172.UmREC2的獨特之處在于它是唯一能與E.Coli酶recA一樣催化形成同源配對的真核生物ATP酶。
美國專利申請，編號08/373,134,1995年1月17日提交，W.K.Holloman和E.B.Kmiec公開了從U.maydis中得到的REC2，生產(chǎn)重組UmREC2的方案和對它的應(yīng)用方案。先于該發(fā)明日期之前一個REC2cDNA片段被IMAGE國際財團Lawrence Livermore國家實驗室得到，稱為質(zhì)粒p153195，其大約400bp的序列已可在dbEST數(shù)據(jù)庫中公開得到。
科學(xué)出版物標題基于REC2同源性的人和鼠基因的分離，1997年7月，Proc.Natl.Acad.Sci.94,7417-7422，作者Michael C.Rice等，公開了人和鼠REC2序列及人REC2cDNA序列，公開了輻射增加hsREC2在原代人上皮成纖維細胞中的轉(zhuǎn)錄水平?？茖W(xué)出版物Albala等著，1997年12月，Genomics46,476-479，也公開了相同的蛋白質(zhì)和cDNA序列，并稱之為RAD51B。一段，除了序列編碼的C-末端14個核苷酸和3’-端非翻譯序列之外與hsREC2序列相同的序列，由Cart wright R.等在1998年Nucleic Acids Research 26,1653-1659發(fā)表，稱之為hsR51h2。hsREC2和hsR51h2被認為代表了同一原始轉(zhuǎn)錄本的不同的加工過程，這項專利申請發(fā)表于1998年3月19日的WO98/11214。
hsREC2的結(jié)構(gòu)也公開在以下申請1996年9月11日遞交，編號60/025,929；1997年9月11日遞交，編號08/927,165；以及專利公開文本W(wǎng)O98/11214,1998年3月19日發(fā)表。
2.2細胞調(diào)控真核細胞周期包括4個時相G1期，S期(合成期)，G2期，M期(分裂期)。決定細胞所處時相和進入下一個時相的進程速度的相關(guān)生化事件是由一系列激酶，例如cdk2,cdc2等等所控制，而這些激酶又受與之相結(jié)合的稱為細胞周期素的不穩(wěn)定蛋白，例如cyclinD,cyclinE,cyclinA等的調(diào)控和激活。這些活化了的復(fù)合體依次去磷酸化其它那些能激活周期中某一特定時相所需酶的蛋白質(zhì)。Reviewed,Morgan,D.O.,1997,Ann.Rev.Cell.Dev.Biol.15,261-291；Clurman,B.E.,&Roberts,J.M.,1998,in THE GENETIC BASIS OF HUMAN CANCER,pp.173-191(ed.byVogelstein,B.,&Kinzer K.W.,McGraw Hill,NY)(hereafterVogelstein)。
細胞周期在G1期包含一個關(guān)卡。在一定的條件下，例如染色體損傷或分裂素喪失，一個正常的細胞將不跨躍關(guān)卡繼續(xù)前進。Rb和p53分別是參與與分裂素喪失和染色體損傷相關(guān)的G1期關(guān)卡的蛋白質(zhì)。這些蛋白中任意一個的失活突變體與其他突變體一致會導(dǎo)致生長轉(zhuǎn)化即變成惡性的細胞。而導(dǎo)入一個正常的p53或Rb基因則能抑制住轉(zhuǎn)化的表現(xiàn)型。相關(guān)的基因，例如p53或Rb，它們的缺失與轉(zhuǎn)化相關(guān)，一般稱為“腫瘤抑制子”基因。導(dǎo)致家族性腫瘤綜合癥的常見原因就是腫瘤抑制子基因缺失復(fù)合體的遺傳。Reviewed Fearson,E.R.,inVogelstein pp.229-236。
p53水平的升高是對染色體損傷的應(yīng)答，然而，介導(dǎo)這個應(yīng)答的機制仍是未知的。已知p53能被多種激酶磷酸化，而且這些磷酸化可以穩(wěn)定p53蛋白。Reviewed Agarwal,M.L.,et al.,Jan.2,1998,J.Biol.Chem.273,1-4。
3．發(fā)明綜述本發(fā)明的基礎(chǔ)是出人意料地發(fā)現(xiàn)hsRec是一種絲氨酸激酶，它能將控制細胞周期的幾種蛋白，特別是cyclinE和p53磷酸化。本發(fā)明許可從生理學(xué)的高度去確定細胞周期調(diào)控蛋白磷酸化位點。此外，Rec2酶活性的發(fā)現(xiàn)許可提供樣品結(jié)構(gòu)去發(fā)現(xiàn)Rec2特異的具有藥理活性的拮抗劑和激動劑類化合物。
4．附圖簡述

圖1A-1D圖1A和1B顯示hsRec2(SEQ ID NO:1)衍生氨基酸的序列。圖1C和1D顯示hsRec2 cDNA(SEQ ID NO:2)編碼鏈的核苷酸序列。圖1E和1F顯示muRec2(SEQ ID NO:3)衍生氨基酸序列，圖1G顯示muRec2cDNA(SEQ ID NO:4)編碼鏈的核苷酸序列。
圖2A-2C圖2A是hsREC2非標注的氨基酸序列。僅特別標注出核定位序列(“NLS”),A Box和B Box基元序列，DNA結(jié)合序列和絲氨酸型磷酸化位點(“P”)。
圖2B是非標注的氨基酸序列的示意圖，特別顯示出80-200區(qū)域與recA有密切關(guān)系。
圖2C和2D顯示hsREC2和Ustilago maydis REC2的序列同源性。最相似的區(qū)域有高達43％的同源性。
圖3A-3B圖3A顯示32P-ATP摻入髓鞘堿性蛋白(0.25mM)的時間作用曲線，REC2的濃度為1μl/30-40ul。圖3B顯示32P-ATP摻入肯普肽(LRRASLG,SEQ ID NO:5)在60分鐘內(nèi)對肯普肽濃度的作用曲線。
5．發(fā)明綜述在這里，基因全都大寫，例如hsREC2，而相應(yīng)的蛋白質(zhì)則首字母大寫，例如hsRec2。
hsREC2活性的測定采用產(chǎn)生于桿狀病毒的N-末端6組氨?；苌铩Ｓ脳U狀病毒產(chǎn)生的谷胱甘肽硫基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的hsREC2和用大腸桿菌中產(chǎn)生的硫氧還蛋白結(jié)合的hsREC2得到了一致的結(jié)果。這些證實的結(jié)果傾向于要排除在Ni-NTA樹脂上共純化的內(nèi)源性桿狀病毒激酶的激酶活性。為了進一步排除純化矯作物的可能性，Ni-NTA純化了的6組氨酰-hsREC2由制備型SDS-PAGE進行進一步的純化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有能被銀染的含有hsREC2的部分仍保持激酶活性。
MuRec2和hsRec2的序列在350個氨基酸中僅有56個不同。本發(fā)明可以采用muRec2或hsRec2以及其氨基酸混合體組成的蛋白質(zhì)，即蛋白質(zhì)的某些位置氨基酸是muRec2的而另一些則是hsRec2的，以下稱hs/muRec2的嵌合體實施。此外，在163位置的酪氨酸被取代的突變蛋白也適用于本發(fā)明的實施，例如Tyr-Ala。這樣，本發(fā)明可進一步用hs/muRec2a1a163嵌合體實施。一個實施方案中這個取代可以是任何脂肪族氨基酸。另一個可替換的方案中該取代可以是除了半胱氨酸和脯氨酸之外的任何氨基酸。術(shù)語“Rec2激酶”這里用于代表的種類包括hsRec2,muRec2，所有hs/muRec2的蛋白嵌合體和Tyr163被取代的衍生物。術(shù)語人工Rec2激酶指的不僅僅是哺乳動物Rec2的Rec2激酶。術(shù)語哺乳動物Rec2在這里代表的蛋白質(zhì)種類包括hsRec2和muRec2的哺乳動物同源體。
本發(fā)明能進一步可用融合蛋白實施，即包含有Rec2激酶或哺乳動物Rec2序列的蛋白質(zhì)與一個能用于純化最終融合蛋白的蛋白或多肽序列相融合所形成的融合蛋白。
自然狀態(tài)存在的hsRec2和muRec2是磷蛋白，而磷酸化對于這些蛋白質(zhì)的激酶活性來說不是必需的。本發(fā)明中術(shù)稱的Rec2激酶和哺乳動物Rec2蛋白質(zhì)既包括磷酸化也包括非磷酸化形式的蛋白質(zhì)。
5.1細胞周期調(diào)控建立含有與CMV立即早期啟動子hsRec2的片段可行連接的表達載體，并轉(zhuǎn)柒到CHO細胞中。建立酪氨酸-163突變蛋白，即在src位點一個可磷酸化的酪氨酸(SEQ ID NO.8的8-11氨基酸)被丙氨酸所取代。?？瞻邹D(zhuǎn)染(neor),hsREC2轉(zhuǎn)染和heREC2a1a163轉(zhuǎn)染的細胞經(jīng)受血清饑餓而同步化，釋放。然后在不同的時間點通過定量流式細胞術(shù)測定DNA含量.hsREC2轉(zhuǎn)染的細胞表現(xiàn)出了S期的延遲。這樣，經(jīng)過14個小時的釋放后，75％的hsREC2轉(zhuǎn)染細胞處于G1期而對照僅為36％。
hsREC2而非heREC2a1a163的過表達使細胞對UV照射敏感。CHO細胞接受UV劑量為15J/m2的輻射。然后再將細胞用定量流式細胞術(shù)分析，hsREC2細胞在照射后的24,48,72小時與對照相比較，都出現(xiàn)大量的凋亡。
5.2激酶活性
hsREC2可以在多種底物上顯示激酶活性。人工底物例如髓鞘堿性蛋白，該蛋白已知是蛋白激酶C和蛋白激酶A的底物，它能被hsREC2磷酸化?？掀针?leu-arg-arg-ala-ser-leu-gly)是一種已知的絲/蘇氨酸激酶的底物，也能被磷酸化。此外，還有下列的重組蛋白能被hsREC2磷酸化P53,cyclinBl和cyclinE。cyclinB1/cdc2和cyclinE/cdk2的異二聚體也能被hsREC2磷酸化。對這些實驗的解釋其復(fù)雜性在于cyclinE/cdk2的自身磷酸化和cyclinB1/cdc2但沒有cyclinE/cdk2能磷酸化hsREC2它本身。與cyclinB1/cdc2復(fù)合體相反，hsREC2不是一種自身磷酸化酶。
雖然heREC2a1a163在細胞中的表達對細胞周期無影響，但heREC2a1a163突變蛋白具有完全的激酶活性。
在侯選激動劑或拮抗劑存在的情況下，化合物相對于mREC2是否具有藥理活性可通過測定mREC2的激酶活性來識別，尤其是hsREC2。特別優(yōu)選的底物為cyclinE和P53。
5.3hsREC2與其它蛋白相結(jié)合在一個網(wǎng)織細胞溶胞產(chǎn)物系統(tǒng)中通過偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄翻譯進行hsREC2的S35放射標記摻入。樣品與HCT116細胞提取物相混合，在獨立的反應(yīng)中各種細胞蛋白質(zhì)的單克隆抗體被加入，得到的抗體結(jié)合物通過蛋白質(zhì)A葡聚糖分離出來，然后這些結(jié)合物通過SDS-PAGE和放射自顯影來分析。當采用抗P53，抗PCNA和抗cdc2單克隆抗體時免疫沉淀中包含hsREC2，而當采用抗cdc4或抗cdk4單克隆抗體時沒有hsREC2被沉淀下來。
5.25.4hsREC2激動劑或拮抗劑具有藥理活性hsREC2的活性指示出對它活性的調(diào)節(jié)能使細胞對于由于發(fā)生遺傳損傷，例如UV輻射之后，而進入的凋亡敏感或不敏感，以及能通過延長或縮短G1和S期來保護或去保護一個細胞免受DNA損傷。hsREC2激動劑和拮抗劑都是具有醫(yī)務(wù)人員渴望得到的活性的化合物。發(fā)現(xiàn)屬于hsREC2激動劑或拮抗劑的化合物對于藥理科學(xué)是十分重要的。
在一個實施方案中，本發(fā)明是一個能決定某一化合物是否具有這樣一種藥理活性的方法，即通過測定該化合物對hsREC2激酶活性的影響來判斷。在特定實施方案中，本發(fā)明是一種評估化合物對hsREC2和第二種激酶的相對影響的方法。例如，某一化合物是hsREC2的激動劑，但它對cyclinD/cdk4和cyclinE/cdk2沒有或很少影響，將會導(dǎo)致阻斷在G1期以及對遺傳的損傷作出走向凋亡的應(yīng)答。在具體的實施方案中，激酶的測定是用從P53,cdc2,cdk2或cyclinE組成的底物組中選擇一個底物。另一可替換的方案是可采用一個模型底物，例如髓鞘堿性蛋白或肯普肽(leu-arg-arg-ala-ser-leu-gly)。
6．實施例6.1從Autographica californica桿狀病毒感染體中生產(chǎn)重組hsREC2蛋白質(zhì)為了便于構(gòu)建hsREC2表達載體，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和KpnⅠ位點被添加到hsREC2 cDNA上。起始于71位核苷酸處的hsREC2 cDNA采用下列引物5’-GAG CTCGAG GGTACC C ATG GGT AGC AAG AAA C-3’(SEQID NO:6)擴增，它將XhoⅠ和KpnⅠ位點(下劃線)置于起始密碼子的5’端。重組分子包含hsREC2 cDNA的完整編碼序列，能被XhoⅠ或KpnⅠ切割下來，并且在SEQ ID NO:2的1270和1280堿基間有一個單一性的XbaⅠ位點。
用于HsREC2在桿狀病毒感染的Spodoptera frugiperda(Sf-9)昆蟲細胞(ATCC細胞系No.CRL1711,Rockville MD)表達的載體pBacGSTSV，是從Dr.Zailin Yu(Baculovirus Expression Laboratory,Thomas Jefferson University)處得到。載體pVLGS的構(gòu)建是通過插入一編碼Schistosoma japonicum谷胱甘肽硫基轉(zhuǎn)移酶多肽的片段以及一個來自pGEX-2T凝血酶裂解位點(由Smith&Johnson描述，GENE67:31(1988))被摻入載體pVL1393中，在此引入作為參考。一個多聚A末端信號序列插入pVLGS從而產(chǎn)生pBacGSTSV。一個包含1.2Kb hsREC2片段的質(zhì)粒用KpnⅠ切，其3’非配對末端由T4聚合酶切割，而其產(chǎn)物由XbaⅠ切割。最終片段插入一個SmaⅠ,XbaⅠ切割的pBacGSTSV載體而產(chǎn)生pGST/hsREC2。
含有從pGST/hsREC2來的插入子的重組病毒經(jīng)常規(guī)方法分離并感染細胞Sf-9,Sf-9細胞生長在SF900Ⅱ SFM(Gibco/BRL Cat#109020或TNM-FH(Gibco/BRL Cat#11605-011)加10％FBS。經(jīng)過3～5天的培養(yǎng)，收集感染細胞，用不含Ca++和Mg++的PBS洗，并在5ml加了蛋白酶抑制劑(ICN Cat#158837),1％NP-40,250mM NaCl每5×107細胞數(shù)的PBS中超聲處理。這些溶胞產(chǎn)物經(jīng)3000xg離心20分鐘。上清按每5×107細胞數(shù)加入0.5ml谷胱甘肽瓊脂糖樹脂(SigmaChem.Co.Cat#G4510)。樹脂用含50mM Tris-HCl,PH8.0,150mM NaCl和2.5mM CaCl2的緩沖液洗，用凝血酶(Sigma Chem.Co.Cat#T7513)在相同的緩沖液中23℃處理使hsREC2釋放。為了特定的實驗，凝血酶可通過Thompson和Davie在1971年Biochim Biophys Acta250:210上發(fā)表的技術(shù)去除，即采用一個氨基已酰基對氯苯甲酰胺親和柱(SigmaChem.Co.Cat#A9527)。
另一方面，hsREC2 cDNA全長被克隆到表達載體PacHisA上，在桿狀病毒系列中過表達，并利用一個六組氨酸標記來純化。為了克隆，hsREC2表達子被KpnⅠ切，3’突出末端被T4聚合酶切除，然后用XbaⅠ消化DNA。最終片段用SmaⅠ和XbaⅠ位點連接到PacHisA上。包含hsREC2重組病毒的純化和昆蟲細胞的感染是由the Kimmel Cancer Institute的桿狀病毒表達實驗室的Dr.Z.Yu完成。從2升培養(yǎng)基中獲得的昆蟲細胞球狀物重懸于60ml含10mM Tris Cl,PH 7.5,130mM NaCl,2％TX-100,2μg/ml亮抑酶肽和抑肽酶以及1μg/ml抑肽素的緩沖液中，在冰上超聲處理4次，每次5秒鐘，每次均用微探頭，并在20％的脈沖下進行(Bransonsonifier 450).碎片通過3000xg離心20分鐘除掉。澄清的上清液分倒入2個50ml培養(yǎng)管，加入1ml Ni-NTA瓊脂糖4℃條件下振蕩1小時，非結(jié)合片段通過短暫離心分離出來，樹脂用10ml100mM咪唑在振蕩器上處理10分鐘，用2000rpm離心5分鐘。用500mM咪唑第二次洗10分鐘后，將半流體物轉(zhuǎn)移到柱子上，棄去流出液。純化了his-hsRec2的用1M PH7.0的咪唑洗脫(收集洗脫物前咪唑放在柱子上10分鐘)，用50mM Tris Cl,PH 7.4,50mM NaCl,10％甘油透析過夜。簡便起見，這個蛋白被稱為是hsRec2而非his-hsRec2。
6.2細菌生產(chǎn)重組hsREC2蛋白hsREC2 cDNA編碼區(qū)通過XbaⅠ的裂解，T4聚合酶去除5’突出末端，接著用KpnⅠ的裂解而從以前采用的哺乳動物表達載體pcDNA3 G8中分離出來。最終片段被連接到一個細菌表達載體PBAD/HisC(Invitrogen.Corp.USA)的KpnⅠ和鈍化的HindⅢ位點上，帶有一個六組氨酰標記hREC2構(gòu)建的表達載體電轉(zhuǎn)入LMG194(Invitrogen.corp.USA)細菌中表達。在500ml LB氨芐青霉素培養(yǎng)基中接種一個單克隆并在37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期。培養(yǎng)物用0.02％阿拉伯糖誘導(dǎo)4小時，8000xg離心收集。沉淀物用1mg/ml溶菌酶重懸和溶解，并在5體積的50mM NaH2PO4,300mM NaCl,1％T×100,2μg/ml亮抑酶肽和抑肽酶以及1μg/ml抑肽素，1mg/ml DNA酶，10mMβME和20mM咪唑在0℃進行超聲處理。溶胞物離心10000xg30分鐘來澄清，然后加入到一個封閉的含1ml活化的Ni+NTA瓊脂糖樹脂中，4℃振蕩1小時。然后打開柱子，用20體積的含50mM NaH2PO4,300mM NaCl,1％T×100,50mM咪唑的洗脫液在4℃下靠重力洗脫。隨后將結(jié)合蛋白用含500mM咪唑的3體積的上述洗脫液洗脫，并以1ml級分收集。純化的His-HsRec2對50mM Tris,50mM NaCl,10％甘油透析過夜，儲存于-80℃。
6.3 hsREC2激酶的檢測磷酸酶濾膜測定。底物是肯普肽或髓鞘堿性蛋白，大約1μg his-hsRec2作為磷酸酶被加入。對這兩個測定，緩沖液中包含50mM Tris Cl,PH7.5,10mM MgCl2,1mM DTT。第二個底物，32p-ATP保持在50uM比活是1972cpm/pmole和2980cpm/pmole。32p-ATP在指定時間的加入啟動了在30℃發(fā)生的反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束時，取20ul點樣在磷酸纖維素圓盤上，在1％磷酸中以每圓盤10ml洗兩次，蒸餾水洗兩次。濾膜放在Wallac Scintillation計數(shù)器中計數(shù)，沒有hsRec2的底物作為對照加入并被從計數(shù)中減去以獲得零點。
在上述條件下，髓鞘堿性蛋白(0.25uM)在0到25分鐘之間被磷酸化。磷酸化的摻入與時間呈線性關(guān)系，在25分鐘時達到1.2pmole。0到0.15mM的肯普肽被磷酸化60分鐘。磷酸摻入率與底物濃度呈線性關(guān)系直至底物濃度達0.06mM，此時觀察到速率為每分鐘0.09pmoles。
2種不同的hsRec2綴合物，也顯示磷酸酶活性。通過采用對雜交瘤上清液免疫沉淀hsRec2并隨后采用下面將描述的p53作為底物來測定磷酸酶活性而獲得進一步的證據(jù)說明這種活性并不是一種污染。這些實驗證實該激酶活性能被抗hsRec2單克隆抗體沉淀。
沒有被hsRec2磷酸化的2種底物，一個是包含一個酪氨酸的酪氨酸激酶底物多肽，從圍繞著pp60src(RRLIEDAEYAARG)(SEQ ID NO.7)磷酸化位點的序列衍生。另一個是hsRec2多肽的153-172殘基(VEIAESRFPRYFNTEEKLLL)(SEQ ID NO.8)。
p53磷酸化人重組p53(0.5μg,Pharmingen,San Diego,CA)與帶有或不帶有heRec2的含50mM Tris Cl,PH7.4,10mM MgCl2和1mM DTT緩沖液在30℃中孵育。反應(yīng)通過加入32p-ATP啟初(25uM ATP,40cpm/femtomole)。在每個時間點結(jié)束時加入等體積的2×電泳緩沖液(5)，并將試管放置于冰上直至所有試管都收集起來。將樣品在100℃加熱10分鐘，用13ul走Ready Gel(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上對X光片曝光過夜。這樣就能觀察到放射標記的p53。
Cdc2-cyclinB磷酸激酶的測定純化了的人重組CyclinB/cdc2(Oncogene,Cambridge,MA)采用在p53處描述過的相同緩沖條件與hsRec2在30℃中孵育10～60分鐘。加入等體積的2×電泳緩沖液(5)，將樣品在100℃加熱10分鐘，走SDS凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜并進行膠片曝光。由于hsRec2激酶活性造成的放射性標記的cyclinB很容易在cyclinB由cdc2導(dǎo)致的“自身磷酸化”水平之上觀察到。放射性標記的cdc2僅在60分鐘的會hsRec2反應(yīng)混合物中觀察到，而在10分鐘時則沒有。
Cdk2/cyclinE磷酸酶的測定GST-cyclinE從pGEX-2TcycE(A.Giordano,ThomasJeffersonUniversity)轉(zhuǎn)化的E.Coli中分離出來，并用谷氨酰胺葡聚糖4B(Pharmacia,Pistcataway,NJ)純化。谷氨酰胺葡聚糖GST-cyclinE洗過后用50mM Tris Cl,PH7.4按1∶1懸浮液儲存。為了測定結(jié)合上cdk2的cyclinE，將純化的cdk2(由A.Koff,Sloan-Kettering,NY惠贈)與(6)中描述的cyclinE孵育，并通過事先清洗去掉未結(jié)合的cdk2然后以1∶1懸浮液儲存。激酶測定采用在p53處描述過的相同條件，對結(jié)合或未結(jié)合cdk2的固定化的GST-cyclinE進行的。在沒有cdk2時，cyclinE和hsREC2的磷酸化很容易觀察到。cdk2存在時，能見到自身磷酸化。然而，cyclinE的hsREC2磷酸化在此水平上也很明顯。
p53與hsRec2的體外結(jié)合hsRec2(5μg)和15ul瓊脂糖-GST-p53(Oncogene Sciences)加入到含以下成分10％甘油，50mM Tris Cl,PH7.4,0.1mM EDTA,1mMDTT,0.02％NP40,200mM NaCl,10μg/ml抑肽酶和亮抑酶肽以及20um PMSF的0.5ml結(jié)合緩沖液中。室溫一個小時后，p53瓊脂糖沉淀下來，并用較高濃度離子去垢劑(0.1％NP40)的上述緩沖液洗2次，然后用50mM TrisCl,PH7.4,10mM MgCl2洗一次。
體外翻譯的hsRec2與PCNA,p53和cdc2的結(jié)合首先采用1μg載體，在體外轉(zhuǎn)錄(Ambion,Austin TX)XbaⅠ線性化的PCMVhREC2，然后以含有Xef1 mRNA作為負對照的試劑盒在體外被翻譯。用35S-甲硫氨酸標志的包含有Xef1或hsREC2的翻譯產(chǎn)物的網(wǎng)織紅細胞溶胞產(chǎn)物與HCT116細胞中得到的1.2mg細胞提取物(抽提液含50mM Tris Cl,pH7.4,120mM NaCl,0.5％NP40,20uM PMSF,2μg/ml抑肽素，10μg/ml抑肽酶和亮抑酶肽，MB))孵育2小時，隨后加入抗PCNA,p53或cdc2的抗體10μg孵育過夜。第二天，加入蛋白質(zhì)A葡聚糖處理2小時，然后用500ul MB洗得到的沉淀4次。沉淀懸浮于40ul樣品緩沖液中，煮沸10分鐘，取15ul走10％凝膠電泳，然后在對X-光片曝光前轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上以取得較低的背景。
序列一覽表<110>Thomas Jefferson UniversityCornell Research FoundationKimeragen,Inc.<120>REC2激酶<130>8321-70 PC<140><141><150>09/157,603<151>1998-09-21<160>8<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>350<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Gly Ser Lys Lys Leu Lys Arg Val Gly Leu Ser Gln Glu Leu Cys1 5 10 15Asp Arg Leu Ser Arg His Gln Ile Leu Thr Cys Gln Asp Phe Leu Cys20 25 30Leu Ser Pro Leu Glu Leu Met Lys Val Thr Gly Leu Ser Tyr Arg Gly35 40 45Val His Glu Leu Leu Cys Met Val Ser Arg Ala Cys Ala Pro Lys Met50 55 60Gln Thr Ala Tyr Gly Ile Lys Ala Gln Arg Ser Ala Asp Phe Ser Pro65 70 75 80Ala Phe Leu Ser Thr Thr Leu Ser Ala Leu Asp Glu Ala Leu His Gly85 90 95Gly Val Ala Cys Gly Ser Leu Thr Glu Ile Thr Gly Pro Pro Gly Cys100 105 110Gly Lys Thr Gln Phe Cys Ile Met Met Ser Ile Leu Ala Thr Leu Pro
115 120 125Thr Asn Met Gly Gly Leu Glu Gly Ala Val Val Tyr Ile Asp Thr Glu130 135 140Ser Ala Phe Ser Ala Glu Arg Leu Val Glu Ile Ala Glu Ser Arg Phe145 150 155 160Pro Arg Tyr Phe Asn Thr Glu Glu Lys Leu Leu Leu Thr Ser Ser Lys165 170 175Val His Leu Tyr Arg Glu Leu Thr Cys Asp Glu Val Leu Gln Arg Ile180 185 190Glu Ser Leu Glu Glu Glu Ile Ile Ser Lys Gly Ile Lys Leu Val Ile195 200 205Leu Asp Ser Val Ala Ser Val Val Arg Lys Glu Phe Asp Ala Gln Leu210 215 220Gln Gly Asn Leu Lys Glu Arg Asn Lys Phe Leu Ala Arg Glu Ala Ser225 230 235 240Ser Leu Lys Tyr Leu Ala Glu Glu Phe Ser Ile Pro Val Ile Leu Thr245 250 255Asn Gln Ile Thr Thr His Leu Ser Gly Ala Leu Ala Ser Gln Ala Asp260 265 270Leu Val Ser Pro Ala Asp Asp Leu Ser Leu Ser Glu Gly Thr Ser Gly275 280 285Ser Ser Cys Val Ile Ala Ala Leu Gly Ash Thr Trp Ser His Ser Val290 295 300Asn Thr Arg Leu Ile Leu Gln Tyr Leu Asp Ser Glu Arg Arg Gln Ile305 310 315 320Leu Ile Ala Lys Ser Pro Leu Ala Pro Phe Thr Ser Phe Val Tyr Thr325 330 335Ile Lys Glu Glu Gly Leu Val Leu Gln Ala Tyr Gly Ash Ser340 345 350<210>2<211>1797<212>DNA<213>人<400>2cggacgcgtg ggcgcgggga aactgtgtaa agggtgggga aacttgaaag ttggatgctg 60cagacccggc atgggtagca agaaactaaa acgagtgggt ttatcacaag agctgtgtga 120ccgtctgagt agacatcaga tccttacctg tcaggacttt ttatgtcttt ccccactgga 180gcttatgaag gtgactggtc tgagttatcg aggtgtccat gaacttctat gtatggtcag 240cagggcctgt gccccaaaga tgcaaacggc ttatgggata aaagcacaaa ggtctgctga 300tttctcacca gcattcttat ctactaccct ttctgctttg gacgaagccc tgcatggtgg 360tgtggcttgt ggatccctca cagagattac aggtccacca ggttgtggaa aaactcagtt 420ttgtataatg atgagcattt tggctacatt acccaccaac atgggaggat tagaaggagc 480tgtggtgtac attgacacag agtctgcatt tagtgctgaa agactggttg aaatagcaga 540atcccgtttt cccagatatt ttaacactga agaaaagtta cttttgacaa gtagtaaagt 600tcatctttat cgggaactca cctgtgatga agttctacaa aggattgaat ctttggaaga 660agaaattatc tcaaaaggaa ttaaacttgt gattcttgac tctgttgctt ctgtggtcag 720aaaggagttt gatgcacaac ttcaaggcaa tctcaaagaa agaaacaagt tcttggcaag 780agaggcatcc 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ttatgcaagt gttcctattt ccccctcctc 1680ccagctcctg ggaaaccacc aatctacttt ttttctatgg ctttacctaa tctggaaatt 1740tcaaataaat gggatcaaat agtttcccaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa1797<210>3<211>350<212>PRT<213>肌肉<400>3Met Ser Ser Lys Lys Leu Arg Arg Val Gly Leu Ser Pro Glu Leu Cys1 5 10 15Asp Arg Leu Ser Arg Tyr Leu Ile Val Asn Cys Gln His Phe Leu Ser20 25 30Leu Ser Pro Leu Glu Leu Met Lys Val Thr Gly Leu Ser Tyr Arg Gly35 40 45Val His Glu Leu Leu His Thr Val Ser Lys Ala Cys Ala Pro Gln Met50 55 60Gln Thr Ala Tyr Glu Leu Lys Thr Arg Arg Ser Ala His Leu Ser Pro65 70 75 80Ala Phe Leu Ser Thr Thr Leu Cys Ala Leu Asp Glu Ala Leu His Gly85 90 95Gly Val Pro Cys Gly Ser Leu Thr Glu Ile Thr Gly Pro Pro Gly Cys100 105 110Gly Lys Thr Gln Phe Cys Ile Met Met Ser Val Leu Ala Thr Leu Pro115 120 125Thr Ser Leu Gly Gly Leu Glu Gly Ala Val Val Tyr Ile Asp Thr Glu130 135 140Ser Ala Phe Thr Ala Glu Arg Leu Val Glu Ile Ala Glu Ser Arg Phe145 150 155 160Pro Gln Tyr Phe Asn Thr Glu Glu Lys Leu Leu Leu Thr Ser Ser Arg165 170 175Val His Leu Cys Arg Glu Leu Thr Cys Glu Gly Leu Leu Gln Arg Leu180 185 190Glu Ser Leu Glu Glu Glu Ile Ile Ser Lys Gly Val Lys Leu Val Ile195 200 205Val Asp Ser Ile Ala Ser Val Val Arg Lys Glu Phe Asp Pro Lys Leu210 215 220Gln Gly Asn Ile Lys Glu Arg Asn Lys Phe Leu Gly Lys Gly Ala Ser225 230 235 240Leu Leu Lys Tyr Leu Ala Gly Glu Phe Ser Ile Pro Val Ile Leu Thr245 250 255Asn Gln Ile Thr Thr His Leu Ser Gly Ala Leu Pro Ser Gln Ala Asp260 265 270Leu Val Ser Pro Ala Asp Asp Leu Ser Leu Ser Glu Gly Thr Ser Gly275 280 285Ser Ser Cys Leu Val Ala Ala Leu Gly Asn Thr Trp Gly His Cys Val290 295 300Asn Thr Arg Leu Ile Leu Gln Tyr Leu Asp Ser Glu Arg Arg Gln Ile305 310 315 320Leu Ile Ala Lys Ser Pro Leu Ala Ala Phe Thr Ser Phe Val Tyr Thr325 330 335Ile Lys Gly Glu Gly Leu Val Leu Gln Gly His Glu Arg Pro340 345 350<210>4<211>1525<212>DNA<213>肌肉<400>4gggagccctg gaaacatgag cagcaagaaa ctaagacgag tgggtttatc tccagagctg 60tgtgaccgtt taagcagata cctgattgtt aactgtcagc actttttaag tctctcccca 120ctagaactta tgaaagtgac tggcctgagt tacagaggtg tccacgagct tcttcataca 180gtaagcaagg cctgtgcccc gcagatgcaa acggcttatg agttaaagac acgaaggtct 240gcacatctct caccggcatt cctgtctact accctgtgcg ccttggatga agcattgcac 300ggtggtgtgc cttgtggatc tctcacagag attacaggtc caccaggttg cggaaaaact 360cagttttgca taatgatgag tgtcttagct acattaccta ccagcctggg aggattagaa 420ggggctgtgg tctacatcga cacagagtct gcatttactg ctgagagact ggttgagatt 480gcggaatctc gttttccaca atattttaac actgaggaaa aattgcttct gaccagcagt 540agagttcatc tttgccgaga gctcacctgt gaggggcttc tacaaaggct tgagtctttg 600gaggaagaga tcatttcgaa aggagttaag cttgtgattg ttgactccat tgcttctgtg 660gtcagaaagg agtttgaccc gaagcttcaa ggcaacatca aagaaaggaa caagttcttg 720ggcaaaggag cgtccttact gaagtacctg gcaggggagt tttcaatccc agttatcttg 780acgaatcaaa ttacgaccca tctgagtgga gccctccctt ctcaagcaga cctggtgtct 840ccagctgatg atttgtccct gtctgaaggc acttctggat ccagctgttt ggtagctgca 900ctaggaaaca catggggtca ctgtgtgaac acccggctga ttctccagta ccttgattca 960gagagaaggc agattctcat tgccaagtct cctctggctg ccttcacctc ctttgtctac 1020accatcaagg gggaaggcct ggttcttcaa ggccacgaaa gaccataggg atactgtgac 1080ctttgtctag tgctgattgc atgtgactca tgaaatgaaa caggactgcg ctgcttggaa 1140aaaggaaacg gaagccaaca taatgaggat taattggttg gttgctgttg aggtggtaac 1200agtgatttca gacccggaag gtgaagatga agaagccttt atccagtctc tggatgcaga 1260ggctaggggc tccaccaccg tgggatgtca gcggccatcg taataatttg cacttacaca 1320agcacctttc agccatgccc ctcaaagtgg ttcagccaca ttaattaatt aaagcccaca 1380atccccctag ggagagcagg agggggacta acaagatttg taattacaga agggaaaatt 1440tccgaataaa gtattgttcc gccaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1525<210>5<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述絲/蘇氨酸激酶的底物<400>5Leu Arg Arg Ala Ser Leu Gly1 5<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>6gagctcgagg gtacccatgg gtagcaagaa ac 32<210>7<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的片段<400>7Arg Arg Leu Ile Glu Asp Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Gly1 5 10<210>8<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的片段<400>8Val Glu Ile Ala Glu Ser Arg Phe Pro Arg Tyr Phe Asn Thr Glu Glu1 5 10 15Lys Leu Leu Leu20
權(quán)利要求
1．一種磷酸化含絲氨酸底物的方法，包括將底物與有效濃度ATP和一個具有包含Rec2激酶或哺乳動物Rec2序列的序列的酶，一起孵育，以及測量底物磷酸化的數(shù)量。
2．權(quán)利要求1中的方法，其中酶的序列包括含有不同于Tyr163的序列的Rec2激酶的序列。
3．權(quán)利要求2中的方法，其中酶的序列包括含有不同于Tyr163的序列的hsRec2激酶的序列。
4．權(quán)利要求3中的方法，其中的底物從人蛋白p53,cdc2,cdk2和cyclinE組成的底物組中選擇。
5．權(quán)利要求3中的方法，其中的底物是肯普肽。
6．權(quán)利要求1中的方法，其中酶的序列包括hsRec2的序列。
7．權(quán)利要求6中的方法，其中的底物從人蛋白p53,cdc2,cdk2和cyclinE組成的底物組中選擇。
8．權(quán)利要求6中的方法，其中的底物是肯普肽。
9．權(quán)利要求1中的方法，其中酶的序列包括哺乳動物Rec2的序列。
10．權(quán)利要求9中的方法，其中的底物從人蛋白p53,cdc2,cdk2和cyclinE組成的底物組中選擇。
11．權(quán)利要求9中的方法，其中的底物是肯普肽。
12．權(quán)利要求1中的方法，進一步包含酶與酶的激動劑或拮抗劑形成混合物的步驟以及測定所述的拮抗劑或激動劑對底物磷酸化數(shù)量的影響。
13．組合物，它包含a．序列中具有包含Rec2激酶或哺乳動物Rec2序列的酶；b．酶的包含絲氨酸的底物；c．γ-磷酸標記的ATP。
14．權(quán)利要求13中的組合物，其中標記的磷酸根是32P。
15．權(quán)利要求13中的組合物，其中底物是一個細胞周期調(diào)控蛋白。
16．權(quán)利要求15中的組合物，其中底物是從人p53,cdc2,cdk2和cyclinE組成的底物組中選擇。
17．權(quán)利要求13中的組合物，其中的底物是肯普肽。
18．權(quán)利要求13中的組合物，其中酶的序列包括hsRec2或hsRec2Ala163。
19．包含其序列具有不同于Tyr163氨基酸的Rec2激酶的酶。
20．一種酶，具有的序列包含不同于Tyr163的氨基酸的哺乳動物Rec2序列。
全文摘要
本發(fā)明包括通過將底物與ATP和由hsRec2或muRec2以及其衍生物所產(chǎn)生的酶共同孵育來進行底物絲氨酸磷酸化的方法。Rec2激酶活性的天然底物是細胞周期調(diào)控蛋白,例如p53和cyclinE。Rec2的過表達已知能使細胞周期阻斷和凋亡,本發(fā)明公開這些影響是激酶介導(dǎo)的。相應(yīng)地,本發(fā)明提供了評定Rec2激動劑或拮抗劑的方法,這些激動劑或拮抗劑具有藥理活性。本發(fā)明還公開了hsRec2與至少三個細胞周期調(diào)控蛋白:p53,PCNA和cdc2之間存在特異的結(jié)合。
文檔編號G01N33/566GK1319132SQ99811166
公開日2001年10月24日 申請日期1999年9月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月21日
發(fā)明者P·A·哈夫雷, M·C·賴斯, W·K·霍洛曼, E·B·克米克 申請人:托馬斯杰弗遜大學(xué), 康乃爾研究基金會有限公司, 瓦利根美國有限公司