專利名稱：果糖胺氧化酶測定的方法和材料的制作方法
當前發(fā)明本發(fā)明涉及用于患者的果糖胺氧化酶測定的方法和材料，尤其是，但不僅僅是用于那些易患有或者已患有糖尿病的患者。
糖尿病是一種常見病，其特征是嚴重長期的血管并發(fā)癥。糖尿病患者有失明的危險上升25倍，腎衰竭的危險上升20倍，截肢和其結(jié)果導(dǎo)致壞疽的危險上升20倍，以及患冠狀動脈疾病和局部缺血的腦部損害的危險上升2-6倍。見克雷恩等人在“糖尿病護理”一文(KleinR.klein B,Davis M,DeMets D,Diabetes Care 8:311-5(1985))。幾乎一半在31歲前被診斷為糖尿病的患者，到達50歲前就去逝，大部分是由于心臟血管或腎臟的并發(fā)癥，并常常伴隨多年的跛足和殘廢疾病。見德科特等人在“糖尿病學(xué)”中的一文(Deckert T.,Poulsen J,LarsenM,Diabetologia 14:363-70(1978))。
現(xiàn)在認為血糖水平升高是糖尿病并發(fā)癥的病因，其根據(jù)是糖尿病并發(fā)癥和控制試驗(DCCT)和英國糖尿病預(yù)期研究結(jié)果(the UnitedKingdom Prospective Diabetes Study(UKPDS)。參見“糖尿病控制與并發(fā)癥實驗研究組”一文(The Diabetes Control and Complications TrialResearch Group.N.Eng.J Med.379:977-85(1993))和Lancet352:837-53(1998)。DCCT和UKPDS都證明糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展與高糖血水平和長期癥狀通過嚴格的治療可以改善。在控制當前的HbA1C水平以后，DCCT患者的微血管并發(fā)癥的發(fā)展與結(jié)構(gòu)蛋白如皮膚膠原的非酶促糖基化有關(guān)，但與高度糖基化的末端產(chǎn)品(AGE)的水平無關(guān)，如戊糖胺，carboxymethylsine和組織熒光(V Monnier-personalcommunication)。這些結(jié)果顯示組織蛋白的非酶促糖基化具有比AGE形成更重要的病理生理學(xué)意義。
糖尿病血管疾病的許多特點可以歸因于氧化應(yīng)激，定義為穩(wěn)定狀態(tài)的反應(yīng)氧和生物系統(tǒng)中氧基團水平的上升，見Baynes JW,Diabetes40:405-12(1991)。例如，超氧化物陰離子增加細胞內(nèi)的鈣離子，鈣離子在內(nèi)皮里調(diào)節(jié)硝基氧化物合成酶的活力。硝基氧化物是一種有效的血管擴張藥，這已經(jīng)在糖尿病早期的血管機能不良中發(fā)現(xiàn)，見Ido Y,Kilo C,Williamson JR,Nephrol Dial Tansplant 11 Suppl 5:72-5(1996)。在硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的從頭合成中反應(yīng)氧種類促使顯著的劑量依賴性降低，導(dǎo)致基底膜上陰離子位點的去極化和對帶正電荷蛋白如白蛋白的通透性增加，見Kashira N,Watanabe Y,Makin H,Wallner EI,& Kanwar YS.Proc Natl Acad Sci USA 89:6309-13(1992)。這種有滲漏毛細管臨床上表現(xiàn)為視網(wǎng)膜病和微球蛋白尿。反過來，微球蛋白尿被認為是IDDM中糖尿病視網(wǎng)膜病和冠狀動脈疾病和在晚期糖尿病視網(wǎng)膜病中突發(fā)死亡的危險因素，見Mogensen CE,Christensen CK,NEng J Med 311:89-93(1984)& Mogensen CE,Damsgaard EM,FrolandA.et al Clin Nephrol 38(suppl 1)；528-39(1992)。
一旦天然的抗氧化屏障被突破，這里有一種經(jīng)過銅離子催化的Haber-Weiss反應(yīng)從超氧化物產(chǎn)生的氫氧根基團的潛在性，見Halliwell B&Gutteridge JMC”生物學(xué)和藥物中的自由基團”Clarendon Press Oxford(pp.136-76 1989)。氫氧根基團是導(dǎo)致嚴重的位點特異性損害的極其活潑的反應(yīng)物。
氧基團參與了低密度脂蛋白(LDL)的氧化修飾，見Witztum JL.Br Heart J 69；S12-S18(1993)。氧化的LDL是一種動脈粥樣硬化的危險因素，與組織巨噬細胞上的清潔劑受體結(jié)合導(dǎo)致泡沫細胞的形成和膽固醇酯在內(nèi)皮脂肪層的聚集，是動脈粥樣化的斑塊形成的特點。
目前，糖尿病中氧化應(yīng)激的來源還沒有鑒定。我分離到一種新的細胞外酶，它能催化從糖基化蛋白中消除果糖胺。這個酶的存在在以前的世界文獻中沒有提到過。這個反應(yīng)是重要的，因為果糖胺是所有美拉德產(chǎn)物的前體。根據(jù)它對糖基化蛋白底物的高特異性和它用氧作為受體，這種酶可以歸類于果糖胺氧化酶1.5.3，見國際生化聯(lián)合會命名委員會推薦的酶命名法，Academic Press,London PP.19-22(1979)。果糖胺氧化酶是一種有銅離子和醌協(xié)同因子的金屬酶。反應(yīng)產(chǎn)物是游離的非糖基化的蛋白，碳酸鹽糖和超氧化物(見

圖1)。
發(fā)明概述果糖胺氧化酶的存在在以前世界范圍內(nèi)的文獻中都未提及，這是一種新酶。本發(fā)明涉及檢測果糖胺氧化酶抑制和/或拮抗患者的方法，測定或鑒定果糖胺氧化酶抑制劑的方法，篩選患者來判定患者對血管(特別微血管)損害危險的方法和鑒定那些使用果糖胺氧化酶抑制劑和/或拮抗物患者所得到的好處的方法，測定哺乳動物果糖胺氧化酶水平的方法，確定糖尿病患者或可疑患者的血漿果糖胺氧化酶水平的方法，在體外測定血清或血漿中的方法以及相關(guān)的方法和程序。
一方面，本發(fā)明包括一種測定哺乳動物患者群或?qū)⒉溉閯游锘颊哐獫{內(nèi)果糖胺氧化酶活性從而判斷患者群或患者有無血管損傷危險的方法，該方法包括測定患者群的果糖胺氧化酶和/或果糖胺氧化酶超氧化反應(yīng)產(chǎn)物和/或果糖胺氧化酶的其他任一氧自由基產(chǎn)物的水平，并根據(jù)這個水平作出判斷。
優(yōu)選的所述患者是糖尿病患者或易感者。
優(yōu)選的上述果糖胺氧化酶活性是對從每個患者采集血液進行測定的。
優(yōu)選地體外測量是超氧化反應(yīng)的產(chǎn)物或果糖胺氧化酶的任何其他氧自由基產(chǎn)物。
優(yōu)選地危險期患者群或患者，除此之外，然后對其進行治療來抑制和/或拮抗果糖胺氧化酶。
因此，在另一方面，本發(fā)明包括一種篩選哺乳動物病例(優(yōu)選地糖尿病患者或易感患者)來確定患者遭受血管(特別是微血管)損傷的危險的方法，這種方法包括確定病例全體的果糖胺氧化酶的水平和/或果糖胺氧化酶的超氧化反應(yīng)的產(chǎn)物(或果糖胺氧化酶的任何其他氧自由基)，并根據(jù)這個水平作出判斷。
優(yōu)選地上述的篩選是從每個患者采集血液。
優(yōu)選地在體外進行測定的是果糖胺氧化酶的超氧化反應(yīng)的產(chǎn)物(或果糖胺氧化酶的任何其他氧自由基)。
優(yōu)選地危險期患者，除此之外用治療來抑制和/或拮抗果糖胺氧化酶。
優(yōu)選的實施步驟基本如下所述。
另一方面，本發(fā)明包括一種鑒定那些用果糖胺氧化酶抑制劑和/或拮抗劑治療獲得益處的患者的方法，這種方法包括測定一個患者或一群患者的血液中果糖胺氧化酶或相關(guān)的果糖胺氧化酶的超氧化反應(yīng)的產(chǎn)物(或果糖胺氧化酶的任何其他氧自由基)。
優(yōu)選地危險期患者，除上述步驟之外通過治療來抑制和/或拮抗果糖胺氧化酶。
在另一方面，本發(fā)明包括一種監(jiān)測患者果糖胺氧化酶抑制劑和/或拮抗劑的方法，這種方法包括測定(直接或間接地)這個患者果糖胺氧化酶的水平。
優(yōu)選地這種測定是根據(jù)患者血液中的果糖胺氧化酶的超氧化反應(yīng)的產(chǎn)物(或果糖胺氧化酶的任何其他氧自由基)。
優(yōu)選地上述每種方法都涉及果糖胺氧化酶的特定水平和/或?qū)?yīng)這種水平的患者(看情況)的反應(yīng)產(chǎn)物，患者可能不在血管損傷的危險期，或沒有從果糖胺氧化酶抑制劑和/或拮抗劑的治療獲得好處或還不需要果糖胺氧化酶抑制劑和/或拮抗劑。
在其他方面，本發(fā)明包括一種測定和/或鑒定果糖胺氧化酶抑制劑和/或拮抗劑的方法，這種方法包括測量一種后選底物或多種后選底物對果糖胺氧化酶的一種或多種醌協(xié)同因子或銅協(xié)同因子的影響。
在另一方面，本發(fā)明包括一種鑒定為了改善哺乳動物糖尿病引起血管損傷的實驗用后選底物，這種方法包括測量這種底物對果糖胺氧化酶抑制和/或拮抗和選擇實驗的底物如(ⅰ)它對這種酶或其協(xié)同因子是特異的和(ⅱ)它對這種動物已知沒有毒性或未被禁止的劑量水平上的抑制和/或拮抗是有效的。
在其他更多方面，本發(fā)明包括通過利用它的還原特性或氧化特性或通過美學(xué)方法在體外測定哺乳動物血液中果糖胺氧化酶超氧化反應(yīng)產(chǎn)物(和/或果糖胺氧化酶的任何其他氧自由基產(chǎn)物)。
在一個優(yōu)選的實施方式中，上述的測定程序包括使{優(yōu)選地pH7～8(最優(yōu)選地pH大于7.8)}超氧化物清除無效的機制(如超氧化物歧化酶)(SOD)[例如使用氫化鉀或(更優(yōu)選地)用抗人CuZn SOD抗血清進行預(yù)處理]和隨后接觸(例如加入)一種適合的果糖胺氧化酶底物[例如糖基化的牛血清白蛋白修飾來排除銅離子螯合活性，它能是果糖胺氧化酶無效。
優(yōu)選地測定緊接著上述的優(yōu)選程序，包括的考慮修飾實例中指示劑的吸附變化(如測定)，化學(xué)發(fā)光的變化或一些其他特征變化。
在其他更多方面，本發(fā)明包括一種確定哺乳動物(人或動物)果糖胺氧化酶水平的方法，這種方法至少包括上述的程序。
在其他更多方面，本發(fā)明包括一種確定糖尿病患者或可疑糖尿病患者的血漿果糖胺氧化酶水平的方法，這種方法至少包括上述方法的步驟。
在其他更多方面，本發(fā)明包括一種患者的血清或血漿樣品，其中的超氧化物清除機制已失活和pH的范圍是7～8。
優(yōu)選地上述實例也包括或通過接觸一種適合的果糖胺氧化酶底物。
優(yōu)選地上述果糖胺氧化酶底物是糖基化的牛血清白蛋白修飾來清除銅離子螯合活性，它能使果糖胺氧化酶失活。
在其他更多方面，本發(fā)明包括為上述任何方法的目的根據(jù)本發(fā)明使用一樣品。
讀者應(yīng)當注意的是我同時申請的PCT申請(要求New Realand對NZ332084,NZ332079,NZ334471的優(yōu)先權(quán))其中公開了許多涉及果糖胺氧化酶抑制和/或拮抗來對患者(尤其不僅是糖尿病或可疑糖尿病患者)血管(特別是微血管)的損傷進行治療的步驟、方法、藥物化合物、劑量單位等。
優(yōu)選地任一種抑制劑或拮抗劑選自(ⅰ)銅離子螯合試劑(如triethylenetetramine，二氫氯化物，草霉胺，sar,diamsar，乙二胺，tetraacetic acid,δ-菲洛林和組氨酸)(ⅱ)底物類似物(如N-乙酰胱胺，casptropril,enalapril)
(ⅲ)肼化合物(如二氨基胍，肼屈嗪和甲基多巴肼)本發(fā)明包括所附的權(quán)利要求，所使用的術(shù)語“和/或”意思是“和”和“或”。同時申請的PCT國際專利說明書的全部內(nèi)容在此引證供作參考。
附圖簡述圖1顯示從果糖和蛋白到形成果糖胺和Maillard產(chǎn)物的詳細反應(yīng)機制。果糖胺氧化酶通過兩步反應(yīng)降解果糖胺，首先釋放一個α-dicarbonyl糖和接著氧化酶/蛋白復(fù)合體來釋放游離的未糖基化的蛋白。還原態(tài)的銅協(xié)同因子在體內(nèi)通過分子氧進行氧化和氧化產(chǎn)物是超氧化物。
圖2顯示果糖胺氧化酶測定和血漿果糖胺之間的關(guān)系。線性回歸公式(y=0.0349x-5.9589；i2=0.7455)。
圖3顯示果糖胺氧化酶抑制劑對人血漿里酶活性作用。只經(jīng)過實例，從這3類抑制酶活性的化合物里選擇了3個抑制劑(如卡托普利是底物類似物，Carbidopa是肼化合物，和氰化鉀是銅離子螯合劑)。
發(fā)明詳述(ⅰ)實驗原理果糖胺氧化酶催化果糖胺的降解，同時還原分子氧產(chǎn)生過氧化物反應(yīng)產(chǎn)物(圖1)。超氧化物是在水溶液里不穩(wěn)定，自發(fā)歧化成過氧化氫和氧原子。歧化反應(yīng)是強烈的pH依賴性反應(yīng)，在酸性溶液里反應(yīng)最快和在堿性溶液中降低反應(yīng)。因此，酶活力是在pH值7～8和最優(yōu)選是pH7.5時確定的，其中使用表1中列舉的一種化合物，超氧化物更加穩(wěn)定。
表1實驗化合物 實驗pH 反應(yīng)類型 參考文獻Ferncytochrome c 7.8 還原McCord J & Fridovich I.J Biol Chem244:8087-93(1969)Nitroblue tetrazollum 7.8 還原Halliwell BFEBS Lett 72:8(1976)Dichlorphenol靛酚 7.0 還原Greenstock CL & Ruddock GW.
Int J Radlat Phys Chem 8:367(1976)腎上腺素 7.8 氧化Misra HP & Fridovich IJ Biol Chem 247:3170-5(1972)羥胺 7.8 氧化Elstner EF,Heupal A.
Anal Biochem 70；616-20(1976)過氧化物酶7.8 酶 Misra HP Fridovich IAnal Biochem 79；553-60(1977)NADH…LDH 7.0 酶 Chan PC & Blelski BHJJ Biol Chem 249；1317-9(1974)NADH..GDH 7.2 酶 Chan PC & Blelski BHJJ Biol Chem 255；87-(1980)(ⅱ)因為超氧化物是一種潛在的毒性物質(zhì)，超氧化物降解酶-超氧化物歧化酶(SOD)在血漿中作用，作為對上升的超氧化物濃度的一種生理反應(yīng)。與健康的沒有糖尿病的個體比較，SOD水平在有糖尿病的患者血漿中顯著上升，尤其是在那些有微血管病如糖尿病的腎病和糖尿病的視網(wǎng)膜病。見Mizobuchi N,Nakata H,Horimi T,Takahashi I.Rinsho Byori 41；673-8(1993)。
細胞外體液如血漿中的主要SOD同工酶是細胞外SOD，它是一個含有4個同原子和4個鋅原子的4聚體糖蛋白。見KarlssonK & Marklund SL.Biochem J 242；55-9(1987)。除非它失活，否則這種SOD活性將顯著干涉根據(jù)在表1列舉的檢測系統(tǒng)中任何血漿實驗。
幾乎所有的人血漿SOD活性都對毫摩爾濃度的氫化鉀，疊氮鈉或氟化鈉的抑制敏感。選擇地血漿SOD活性可以通過用抗人CuZn SOD抗血清預(yù)處理血漿樣品來排除。見Marklund SL.
Holme E,Hellner L Clin Chim Aeta 126；41-51(1982)。(ⅲ)步驟果糖胺氧化酶活性可以用氧化還原反應(yīng)活性染料，鐵細胞色素
(ferricytochrome)C，它容易被超氧化物還原形成鐵細胞色素(ferricytochrome)C，其特征是550nM(ε250=22.1nm-1.cm-1)。試劑是50mMTES緩沖液pH7.4含有10μM細胞色素C(Sigma)，和50μM果糖胺作為糖基化的牛血清白蛋白。Cobas Bio(Roche)自動分析儀中執(zhí)行實驗的參數(shù)在表2中列出。
表2PARAMETER LISTNG1 UNITS U/L2 CALCULATION FACTOR 473.93 STANDARD 1 CONCENTRATION 04 STANDARD 2 CONCENTRATION 05 STANDARD 3 CONCENTRATION 06 LIMIT07 TEMPERATURE [DEG.C] 30.08 TYPE OF ANALYSIS 69 WAVELENGTH [NM] 55010 SAMPLE VOLUME [UL] 511 DILUENT VOLUME[UL] 4512 REAGENT VOLUME [UL] 20013 UNCUBATION TIME [SEC]30014 START REAGENT VOLUME [UL]2515 TIME OF FIRST READING [SEC] 0.516 TIME INTERVAL [SEC] 30017 NUMBER OF READINGS 218 BLANKING MODE119 PRINTOUT MODE1一個酶單位定義為在上述實驗條件下每分鐘還原溶液中1μmol的細胞色素C的酶量。計算因子是根據(jù)下面公式從對鐵細胞色素(ferricytochrome)C摩爾吸光系數(shù)來確定。
U/L(μmol.min-1.L-1)=TV×103/ε250×SV這里TV=總反應(yīng)體積SV=樣品體積(ⅳ)材料糖基化的牛血清白蛋白底物按下面方法制備(a)用氫硼化鈉還原牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)以除去蛋白氫過氧化物。BSA(60g/L)溶解于0.145M NaCl,pH用NaOH調(diào)整到9.0，加入氫硼化鈉(200mmol/L)，溶液在室溫溫和攪拌24小時。用冰乙酸排除多余的氫硼化鈉和溶液在4℃對0.145M NaCl完全透析。(b)．氫硼化還原的BSA通過將蛋白溶液與等體積的含有50mM葡萄糖和0.02％疊氮鈉的0.4M Na2PO4緩沖液pH7.4混合和在37℃溫育7天。多余的葡萄糖通過對0.145M NaCl完全透析而除去。(c)糖基化的BSA(gBSA)進行乙?；峭ㄟ^加入0.2M碘乙酸，調(diào)整pH到6.8和在室溫溫育24小時來進行的。多余的碘乙酸通過對0.145M NaCl完全透析而除去。(d)gBSA上仍然存在的銅離子結(jié)合位點通過對含有100μM硫酸銅的的0.145M NaCl透析而飽和。多余的銅離子通過對0.145MNaCl完全透析而除去。(e)gBSA底物的糖基化程度通過果糖胺實驗來確定(HoffmannLa-Roche)。(ⅴ)底物特異性對反應(yīng)氧種類試驗的特異性是在向反應(yīng)混合物加入下列沒有氧基團的清潔劑后(a)超氧化物歧化酶來選擇除去超氧化物；(b)過氧化氫酶來選擇除去過氧化氫；&(ⅲ)甘露糖醇來清除羥基基團，測定抑制鐵細胞色素(ferricytochrome)C還原的程度而進行測定的。結(jié)果在表3列出。
表3游離基團清除劑 酶活性*顯著性(U/L) (P)對比 15.34±0.16-超氧化歧化酶(20Ku/l) 9.99±0.03 ＜0.0001催化酶(1000kU/L) 12.23±0.03＜0.0001超氧化歧化酶+催化酶6.78±0.12 ＜0.0001甘露糖醇(50mmol/L) 14.96±0.190.0421*確定加入溶劑中的游離基團清除劑。結(jié)果表明試驗反應(yīng)是測量從超氧化物和過氧化氫反應(yīng)形成的超氧化物和羥基基團。(ⅴ)特異性細胞色素C是一種非特異性的還原劑和血清內(nèi)其他還原物質(zhì)或在樣品采集時加入血液樣品抗凝劑可能干擾實驗，在表4中表示。
表4添加劑*與對照相比的活性(％)對照 100肝素(1000U/L)24.4EDTA(100μM) 26.3*在溶劑加入和未加入(對照)添加劑分析人果糖胺氧化酶。(ⅵ)與果糖胺濃度的比較在非糖尿病的血清里測量果糖胺氧化酶活性，并將結(jié)果與圖2的血清果糖胺濃度相比較。(ⅶ)鑒定果糖胺氧化酶抑制劑本活性實驗的重要應(yīng)用是作為一種方法來鑒定潛在的果糖胺氧化酶拮抗劑和抑制劑。果糖胺氧化酶抑制劑可以是結(jié)合或阻斷醌協(xié)同因子的肼化合物，結(jié)合或阻斷銅協(xié)同因子的銅離子螯合劑，或與酶正常底物相似的底物類似物。毫摩爾量的侯選物質(zhì)加入反應(yīng)混合物，對人血清樣品的果糖胺氧化酶活性的降低進行了測量。carbidopa(肼化合物)，氫化鉀(銅離子螯合劑)和卡托普利(底物類似物)的抑制能力顯示于圖3。
酶抑制劑的有效性通常用速度常數(shù)(K)表示，它通過特定濃度的抑制劑在給定的時間里抑制酶部分來確定。對酶活性中心的抑制劑的特異性用引起50％酶活力喪失(IC50)的抑制劑濃度來表示。這個體外實驗的結(jié)果表示在1μM抑制劑濃度，最有效的酶抑制劑是甲基多巴肼(K=15％/分鐘)，卡托普利(K=2.6％/分鐘)次之，氫化鉀(K=1.2％/分鐘)最差。甲基多巴肼還表現(xiàn)對果糖胺氧化酶活性中心高度的特異性(IC50=0.50μM)，卡托普利(IC50=0.83μM)，氫化鉀(IC50=6.36μM)。
權(quán)利要求
1．一種測定哺乳動物群或個體患者血漿內(nèi)果糖胺氧化酶活性，判斷患者群或患者有無血管損傷危險的方法，該方法包括測定患者群的果糖胺氧化酶和/或果糖胺氧化酶超氧化反應(yīng)產(chǎn)物和/或果糖胺氧化酶的其他任一氧自由基產(chǎn)物的水平，并根據(jù)這個水平作出判斷。
2．如權(quán)利要求1的方法，其中患者是患有或者易感糖尿病的人。
3．如權(quán)利要求1或2中方法，其中所述的果糖胺氧化酶活性是對從每個患者采集到的血樣進行測定。
4．如權(quán)利要求3的方法，其中體外測量的是果糖胺氧化酶超氧化反應(yīng)產(chǎn)物或其他任一氧自由基產(chǎn)物。
5．如上述權(quán)利要求中任何一項的方法，其中，對所述處于危險期的患者群或個體患者進行治療從而抑制和/或拮抗果糖胺氧化酶。
6．一種鑒定那些用果糖胺氧化酶抑制劑和/或拮抗劑治療獲得益處的患者的方法，該方法包括直接地或者根據(jù)果糖胺氧化酶的超氧化反應(yīng)的產(chǎn)物或果糖胺氧化酶的任何其他氧自由基產(chǎn)物測定個體患者或患者群血液中果糖胺氧化酶。
7．如權(quán)利要求6的方法，其中所述處于危險期的患者群進行治療從而抑制和/或拮抗果糖胺氧化酶。
8．一種監(jiān)測患者果糖胺氧化酶抑制劑和/或拮抗劑的方法，該方法包括直接或間接地測定該患者果糖胺氧化酶的水平。
9．如權(quán)利要求8的方法，其中所述的測定是根據(jù)患者血液中的果糖胺氧化酶的超氧化反應(yīng)的產(chǎn)物或果糖胺氧化酶的任何其他氧自由基產(chǎn)物。
10．前述的權(quán)利要求中任何一項的方法，它涉及果糖胺氧化酶和/或相關(guān)反應(yīng)產(chǎn)物的特定水平的測定，并比較不處于血管損傷危險期的或沒有從果糖胺氧化酶抑制劑和/或拮抗劑的治療獲得好處的或還不需要果糖胺氧化酶抑制劑和/或拮抗劑的患者或患者群的這種水平。
11．一種測定和/或鑒定果糖胺氧化酶抑制劑的方法，該方法包括測量一種或多種候選物質(zhì)對果糖胺氧化酶的一種或多種醌協(xié)同因子或銅協(xié)同因子或至少一種果糖胺氧化酶底物類似物的影響。
12．一種鑒定用于改善哺乳動物糖尿病引發(fā)血管損傷的實驗用后選物質(zhì)的方法，這種方法包括測量這種物質(zhì)對果糖胺氧化酶的抑制和/或拮抗以及選擇篩選底物，其中(ⅰ)它對這種酶或其協(xié)同因子是特異的，和(ⅱ)在對所述哺乳動物已知沒有毒性或副作用的劑量水平上，它可以有效地實現(xiàn)所述抑制和/或拮抗。
13．哺乳動物血液中果糖胺氧化酶超氧化物反應(yīng)產(chǎn)物(和/或任何其他氧自由基團產(chǎn)物)的體外測量方法，通過利用它的還原特性或它的氧化特性或通過酶促方式來實現(xiàn)。
14．如權(quán)利要求13的測量方法，其中的步驟涉及滅活超氧化物清除機制(如超氧化物歧化酶)(SOD)和隨后接觸到適合的果糖胺氧化酶底物。
15．如權(quán)利要求14的測量方法，它是在pH7到8的條件下進行的。
16．如權(quán)利要求15的測量方法，其中所述的pH值大于7.5。
17．如權(quán)利要求16的測量方法，其中所述滅活通過用抗人CuZnSOD抗血清預(yù)先處理血漿樣品來實現(xiàn)。
18．如權(quán)利要求16中的測量方法，其中所述果糖胺氧化酶底物是進行了修飾以除去可能滅活果糖胺氧化酶的銅離子螯合活性糖基化的牛血清白蛋白。
19．如權(quán)利要求16中的測量方法，它涉及修飾樣品指示劑中的吸附變量、化學(xué)發(fā)光變量或其它一些特征變量的測量。
20．一種測定哺乳動物的果糖胺氧化酶水平的方法，它包括權(quán)利要求19中要求的測量方法。
21．一種測定糖尿病患者或可疑糖尿病患者的血漿果糖胺氧化酶水平的方法，它包括權(quán)利要求19所述的測量方法中的步驟。
22．一種體外直接和/或間接測定血清或血漿中果糖胺氧化酶的方法，它包括權(quán)利要求19所述的測量方法中的步驟。
23．如權(quán)利要求11或12的方法，它包括權(quán)利要求13到22的任何一項的方法。
24．患者的血清或血漿樣品，其中的超氧化物清除機制已經(jīng)被滅活，且其pH的范圍為7到8。
25．如權(quán)利要求24的樣品，它已經(jīng)通過接觸一種適合的果糖胺氧化酶底物進行了修飾。
26．如權(quán)利要求25的樣品，其中所述果糖胺氧化酶底物是進行了修飾以除去可能滅活果糖胺氧化酶的銅離子螯合活性的、糖基化的牛血清白蛋白。
27．對權(quán)利要求24至26所述的任何一項的樣品的應(yīng)用。
全文摘要
通過本發(fā)明的方法,根據(jù)患者或患者群血漿中果糖胺氧化酶活性,可以評估出現(xiàn)糖尿病相關(guān)血管并發(fā)癥危險,鑒定候選果糖胺氧化酶抑制和/或拮抗劑,以及測定抑制和/或拮抗劑對患者抑制/或拮抗作用。
文檔編號G01N33/15GK1320160SQ99811351
公開日2001年10月31日 申請日期1999年9月24日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月25日
發(fā)明者J·R·貝克 申請人:格利科克斯有限公司