專(zhuān)利名稱(chēng)：鑒定一種藥物多個(gè)初始靶標(biāo)的方法
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明的領(lǐng)域涉及對(duì)細(xì)胞中藥物作用的特征進(jìn)行描述的方法和系統(tǒng)。尤其，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)涉及確定一種藥物、候選藥物或其他目標(biāo)化合物是否改變細(xì)胞中的多個(gè)初始靶標(biāo)(primary target)，同時(shí)有關(guān)于應(yīng)用這些方法去發(fā)現(xiàn)藥物。
2.背景鑒定一種藥物或候選藥物多個(gè)初始靶標(biāo)是藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中非常重要的一個(gè)問(wèn)題。尤其在藥物發(fā)現(xiàn)中的一個(gè)大問(wèn)題是鑒定對(duì)于特定初始靶標(biāo)有選擇性作用的化合物。
現(xiàn)在尋找新藥主要有兩種方法占優(yōu)勢(shì)。第一種方法首先篩選對(duì)于細(xì)胞(如，誘導(dǎo)凋亡)或生物體(如，抑制血管生成)具有預(yù)期作用的化合物，這些作用通過(guò)特定的生物試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)量。具有預(yù)期作用的化合物然后可以通過(guò)修飾提高效力、穩(wěn)定性或其他特性并對(duì)修飾的化合物在試驗(yàn)中再次測(cè)試。這樣，在一種小鼠腫瘤模型中測(cè)試可以鑒定出一種起抑制血管生成作用的化合物，合成結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物并在相同的試驗(yàn)中測(cè)試，這一方法的一個(gè)主要限制是這種作用的機(jī)制，例如受這種化合物影響的分子靶標(biāo)和細(xì)胞通道，經(jīng)常是未知的并且不能通過(guò)篩選確定。另外，該添加物可能不能提供有關(guān)該藥物基于靶或通道的效果特異性的信息。不同的，第二種篩選藥物的方法涉及對(duì)已知分子靶標(biāo)使用大量的化合物測(cè)試以獲得特定的效果。該分子靶標(biāo)一般是一種分離的酶或蛋白的克隆基因序列。例如，可以進(jìn)行高通量分析試驗(yàn)大量的化合物以獲得它們改變從特定啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的水平或者結(jié)合已知蛋白的能力。
使用高通量篩選對(duì)于鑒定候選藥物是一種強(qiáng)有力的方法，然而它也有缺陷，尤其是試驗(yàn)提供很少或無(wú)法提供有關(guān)化合物在細(xì)胞或生物體水平上的效果的信息。為了把一種導(dǎo)向化合物開(kāi)發(fā)成成功的藥物，不僅需要找到能與被篩選的初始靶標(biāo)良好結(jié)合的化合物，還要保證該化合物不能同時(shí)與細(xì)胞內(nèi)的其他靶標(biāo)互相作用。必須把該藥物置于一系列細(xì)胞生物學(xué)和完整動(dòng)物研究中進(jìn)行測(cè)試以確定其在體內(nèi)的副作用毒性。實(shí)際上，分析候選藥物的特異性和毒性可以占掉藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程很大一部分(參見(jiàn)，例如，Olfiietal.，1997，“藥物開(kāi)發(fā)的分子靶標(biāo)，”in DeVita et al.，CancerPrinciples&Proctice ofOncology，5th Ed.，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，PA)。
若干基因表達(dá)試驗(yàn)現(xiàn)在已適用于定量藥物對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)物中大部分基因和蛋白的作用(參見(jiàn)，例如，Schena et al.，1995，Science270267～270；Lockhort et al.，1996，Nature Biotechnology141695～1680；Blanchard et al.，1996，Nature Biotechnology141649；Ashby et al.，1996年10月29日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利5,569,588 29，1996)。從這些基因表達(dá)試驗(yàn)得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)常很難連貫地解釋。這樣的測(cè)量技術(shù)一般會(huì)得到大量的因藥物反應(yīng)而改變表達(dá)的基因，一般50～100，也可能多至1000或少至10。在一般情況下，如果不進(jìn)一步分析就不可能僅僅從這些數(shù)據(jù)中分辨出原因和結(jié)果。許多基因中的一個(gè)或一些基因在一對(duì)相關(guān)的生物狀態(tài)下表達(dá)發(fā)生改變，這一事實(shí)無(wú)法使人們了解是什么導(dǎo)致了這一變化和這一變化所起的作用是什么。這些數(shù)據(jù)不能告訴研究者有關(guān)被影響的通道或藥物初始靶標(biāo)的信息。它們無(wú)法表明哪些效果是由于作用于某一特定初始靶標(biāo)(例如，在高通量試驗(yàn)中篩選出的靶標(biāo))而產(chǎn)生的，而哪些效果是藥物其他初始靶標(biāo)而產(chǎn)生的。
知道所有的初始靶標(biāo)對(duì)于理解藥效，副作用毒性，藥效可能的失敗，代謝反應(yīng)的激活等都是必要的。另外，鑒定一種藥物的所有初始靶標(biāo)有利于發(fā)現(xiàn)替代的初始靶標(biāo)，該靶標(biāo)可以適于產(chǎn)生最初的治療反應(yīng)。然而，沒(méi)有有效的分析方法，就需要做特別的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)以使用生物通道和機(jī)制來(lái)解釋這些基因表達(dá)結(jié)果，需要系統(tǒng)的方法來(lái)指導(dǎo)解釋這些數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)。
這樣就存在著對(duì)鑒定細(xì)胞中多個(gè)初始靶標(biāo)改善的(如，更快更便宜)的系統(tǒng)和方法的需求。這些系統(tǒng)和方法基于對(duì)這些基因表達(dá)數(shù)據(jù)的有效解釋。
這里被討論和引用的參考文獻(xiàn)不應(yīng)被理解為承認(rèn)這些參考文獻(xiàn)是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
3.發(fā)明概述本發(fā)明涉及測(cè)試和確定初始靶標(biāo)數(shù)目的方法和系統(tǒng)，藥物或其他感興趣的化合物通過(guò)這些初始靶標(biāo)作用于細(xì)胞。本發(fā)明還涉及鑒定受到一種藥物或其他感興趣的化合物每一個(gè)初始靶標(biāo)影響的蛋白和基因的方法和系統(tǒng)。另外，本發(fā)明還涉及藥物開(kāi)發(fā)的方法，該方法基于測(cè)試和確定初始靶標(biāo)數(shù)目的方法，藥物或候選藥物通過(guò)這些初始靶標(biāo)作用于細(xì)胞。
本發(fā)明方法的原理涉及分析對(duì)細(xì)胞成分對(duì)，如RNA或蛋白豐度或活性，對(duì)于變化的藥物暴露強(qiáng)度的反應(yīng)的測(cè)量。這些反應(yīng)被分析用于確定每一個(gè)單獨(dú)測(cè)量的細(xì)胞成分的藥物濃度，在該藥物濃度上該細(xì)胞成分被激活(即表達(dá)或活性的增加)或失活(即表達(dá)或活性的降低)。這樣確定的藥物濃度的分布被分析以鑒定在某一特定藥物濃度上被激活的細(xì)胞成分族或組。由于一種藥物對(duì)于不同的初始靶標(biāo)一般有不同的效力，確定這些細(xì)胞成分“表達(dá)組”是鑒定一種藥物或感興趣的化合物初始靶標(biāo)存在的關(guān)鍵因子。
本發(fā)明基于至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)一種藥物的單獨(dú)的初始靶標(biāo)參與多個(gè)二級(jí)和三級(jí)基因表達(dá)變化，它們形成連貫的“表達(dá)組”。這些連貫的“表達(dá)組”在一種藥物的特定濃度下被激活或失活。這樣，根據(jù)本發(fā)明的方法，可以通過(guò)鑒定在某特定藥物濃度下被激活(或失活)的獨(dú)立的表達(dá)組來(lái)確定該藥物的獨(dú)立的初始靶標(biāo)。該方法不需要鑒定一種藥物通路中的獨(dú)立的成分，例如，使用遺傳或藥物表現(xiàn)型。而僅僅是，相應(yīng)于一種藥物獨(dú)立初始靶標(biāo)的表達(dá)組可以通過(guò)對(duì)于不同藥物暴露強(qiáng)度下RNA或蛋白豐度或活性的簡(jiǎn)單分析而鑒定出來(lái)。
本發(fā)明通過(guò)提供鑒定一種藥物在細(xì)胞中的多個(gè)初始靶標(biāo)的方法克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。這樣，本發(fā)明的方法適用于，例如，藥物發(fā)現(xiàn)或篩選，不僅能鑒定出對(duì)于某一特定初始靶標(biāo)有很高親和性的化合物，同時(shí)能夠保證該化合物不能同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)與其他靶標(biāo)相互作用。更具體一些，本發(fā)明提供鑒定一種藥物在細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)初始靶標(biāo)的方法和系統(tǒng)，通過(guò)(i)測(cè)量細(xì)胞成分對(duì)于感興趣的藥物梯度暴露而發(fā)生的反應(yīng)；(ii)為每一個(gè)測(cè)量的細(xì)胞成分確定其對(duì)該藥物的“反應(yīng)濃度”；和(iii)從反應(yīng)藥物濃度的分布確定細(xì)胞成分的“表達(dá)組”。該藥物初始靶標(biāo)的數(shù)目就是鑒定出來(lái)的表達(dá)組的數(shù)目。
在不同的方案中，細(xì)胞成分的反應(yīng)可以通過(guò)測(cè)量基因表達(dá)(即RNA水平)、蛋白豐度、蛋白活性或這些測(cè)量的組合而得到。在不同的方案中，反應(yīng)濃度可通過(guò)以下兩種方式確定從細(xì)胞成分對(duì)藥物梯度暴露反應(yīng)的最大(或最小)斜率或者反應(yīng)是漸近線一半數(shù)值時(shí)的藥物暴露。
在第一種方案中本發(fā)明提供了鑒定一種藥物在一種細(xì)胞類(lèi)型中一個(gè)或多個(gè)初始靶標(biāo)的方法，該方法包括鑒定一個(gè)或多個(gè)表達(dá)組，其中(a)每一個(gè)表達(dá)組包含多個(gè)細(xì)胞成分，每一個(gè)細(xì)胞成分有一個(gè)與該藥物相關(guān)的反應(yīng)濃度；(b)一種細(xì)胞成分的反應(yīng)濃度是通過(guò)特定的藥物暴露水平而確定的，在該水平上細(xì)胞成分由于藥物而被激活或失活；和(c)藥物反應(yīng)是通過(guò)以下方法確定的，該方法包括測(cè)量該細(xì)胞類(lèi)型中一個(gè)細(xì)胞的多個(gè)細(xì)胞成分在多個(gè)藥物暴露水平下的反應(yīng)。每一個(gè)表達(dá)組對(duì)應(yīng)于該藥物的一個(gè)初始靶標(biāo)。在第一種方案的不同方面，一種細(xì)胞成分的反應(yīng)濃度可能是，例如，藥物暴露水平，其中該細(xì)胞成分藥物反應(yīng)的絕對(duì)斜率最大或者藥物反應(yīng)為它的漸近線值的一半。在第一種方案的不同方面，表達(dá)組從多數(shù)細(xì)胞成分反應(yīng)濃度的分布圖或直方圖進(jìn)行鑒定，其中每一個(gè)表達(dá)組對(duì)應(yīng)于直方圖中的一個(gè)眾數(shù)(mode)。直方圖中的眾數(shù)可以通過(guò)視覺(jué)檢查或?qū)ο蠼y(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行鑒定。在第一種方案的某一特定方面，該對(duì)象統(tǒng)計(jì)分析基于Fisher Distance。
本發(fā)明在第二種方案中還提供了根據(jù)本發(fā)明第一種方案所描述的方法鑒定一種細(xì)胞類(lèi)型物理環(huán)境變化中的一個(gè)或多個(gè)初始靶標(biāo)。
在另一種方案中，本發(fā)明提供了比較2種或多種藥物或藥物組合物(composition)的眾數(shù)的方法。該方案的方法涉及根據(jù)第一種方案的方法鑒定每種藥物或藥物組合物的初始靶標(biāo)并比較這樣鑒定出來(lái)的初始靶標(biāo)。在方案的一個(gè)特定方面，二種或多種藥物或藥物組合物包括同一藥物的不同組合。
在另一種方案中，本發(fā)明提供了鑒定一個(gè)或多個(gè)初始靶標(biāo)的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。本發(fā)明這一方案的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)包括(a)一個(gè)處理器；(b)一個(gè)與處理器相連的存貯器和(c)由存貯器編碼的一個(gè)或多個(gè)程序。這些程序使處理器能夠鑒定一個(gè)或多個(gè)表達(dá)組，其中(i)每個(gè)表達(dá)組包含多種細(xì)胞成分，每種細(xì)胞成分都有與該藥物相關(guān)的反應(yīng)濃度；(ii)每種細(xì)胞成分的反應(yīng)濃度確定于鑒定的藥物暴露水平，在該水平上該細(xì)胞成分被藥物激活或失活；和(iii)藥物反應(yīng)由一種方法提供，該方法包括在多種藥物暴露水平下測(cè)量該細(xì)胞類(lèi)型一個(gè)細(xì)胞的多種成分。每個(gè)由處理器鑒定出來(lái)的表達(dá)組相應(yīng)于該藥物的一個(gè)初始靶標(biāo)。在第二種方案的不同方面，反應(yīng)濃度可能在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的存貯器獲得。例如，由用戶(hù)裝入存貯器。在第二種方案的不同方面，反應(yīng)分布圖可以在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的存貯器中獲得，例如，由用戶(hù)裝入存貯器在一個(gè)特定的方案中，該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的程序進(jìn)一步使得處理器能夠由存在于存貯器中的藥物反應(yīng)確定反應(yīng)濃度。
4.附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了藥物D對(duì)生物體系使用的假設(shè)示范通道。
圖2顯示了藥物D通過(guò)作用于兩個(gè)初始靶標(biāo)P1和P2對(duì)生物體系發(fā)生作用的假設(shè)示范通道。
圖3顯示了本發(fā)明計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的示例方案。
圖4顯示了啤酒糖酵母大概6000個(gè)被測(cè)基因中的50個(gè)基因的藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)。它們對(duì)于藥物FD506有著最大的表達(dá)比例變化；實(shí)線顯示的轉(zhuǎn)錄效果是通過(guò)鈣調(diào)磷酸酶蛋白；虛線顯示的轉(zhuǎn)錄效果是通過(guò)Gcn4轉(zhuǎn)錄因子。
圖5顯示了啤酒糖酵母基因YAP6對(duì)圖4中顯示的FK506藥物的反應(yīng)的Hill函數(shù)擬合；對(duì)于Hill函數(shù)(方程2)的最小平方擬合有如下參數(shù)振幅參數(shù)a＝0.4，冪指數(shù)n＝1，和u0＝4.6(或者log10(u0)＝0.66)。
圖6顯示了反應(yīng)濃度X0的分布，它是由對(duì)圖4顯示的反應(yīng)進(jìn)行Hill函數(shù)擬合而得到的；反應(yīng)濃度的分布很明顯是雙峰的。
圖7顯示了酵母菌株R1446中ERG11基因轉(zhuǎn)錄被調(diào)控抑制的反應(yīng)數(shù)據(jù)。該菌株含有一個(gè)受脫氧土霉素調(diào)控的Tet-啟動(dòng)子構(gòu)建體；因此轉(zhuǎn)錄反應(yīng)都是通過(guò)一個(gè)單獨(dú)的初始靶標(biāo)ERG11蛋白介導(dǎo)的；ERG11轉(zhuǎn)錄本身的降低顯示于下面的曲線。
圖8顯示了反應(yīng)濃度X0的單峰分布。X0是通過(guò)對(duì)圖7中顯示的反應(yīng)進(jìn)行Hill函數(shù)擬合而得到的。
圖9顯示了酵母菌株R1918中HMG2基因轉(zhuǎn)錄被調(diào)控抑制的反應(yīng)數(shù)據(jù)，該菌株含有受脫氧土霉素調(diào)控的tet-啟動(dòng)子構(gòu)建體；轉(zhuǎn)錄反應(yīng)都是通過(guò)一個(gè)單獨(dú)的初始靶標(biāo)HMG2蛋白介導(dǎo)的。
圖10顯示了反應(yīng)濃度X0的分布，X0是通過(guò)對(duì)圖9中顯示的反應(yīng)進(jìn)行Hill函數(shù)擬合而得到的。
圖11顯示了對(duì)于圖6中顯示的直方圖Fisher Distance的計(jì)算。
圖12顯示了圖6中FK506藥物滴定實(shí)驗(yàn)直方圖最大FisherDistance FDmax的計(jì)算圖12A顯示了圖6的直方圖，豎線代表分割位置γ的值，此時(shí)Fisher Distance最大；圖12B是Fisher Distance隨γ變化的平面圖。
圖13顯示了反應(yīng)藥物濃度單峰分布的Monte Carlo實(shí)現(xiàn)的最大Fisher Distance統(tǒng)計(jì)值分布；圖13A顯示了均勻分布的Monte Carlo實(shí)現(xiàn)的最大Fisher Distance統(tǒng)計(jì)值分布；圖13B顯示了三角分布的Monte Carlo實(shí)現(xiàn)的最大Fisher Distance統(tǒng)計(jì)值分布(即，從最左側(cè)的0處陡升至右側(cè)任意大)。
圖14顯示了圖8中特定ERG11蛋白擾亂實(shí)驗(yàn)直方圖的最大Fisher Distance FDmax的計(jì)算；圖14A顯示了圖8的直方圖。垂直線表示分區(qū)位置γ的值，此時(shí)的Fisher Distance最大；圖14B是FisherDistance相對(duì)于γ的平面圖。
5.發(fā)明詳述這一部分對(duì)本發(fā)明及其在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)的描述。這些描述通過(guò)若干范例說(shuō)明的方式以提高本發(fā)明一般方法的細(xì)節(jié)和明確性。這些實(shí)例是非限制性的，對(duì)于本領(lǐng)域的研究人員很明顯的變體包含在附加的權(quán)利要求中，這些實(shí)施例之后是伴隨著一般方法的數(shù)據(jù)收集步驟的特定方案描述。
5.1簡(jiǎn)介本發(fā)明涉及在細(xì)胞中鑒定一種藥物，候選藥物或其他感興趣的化合物的一個(gè)或多個(gè)初始靶標(biāo)的方法和系統(tǒng)。尤其是，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)能夠確定細(xì)胞中受藥物影響的初始靶標(biāo)的數(shù)目。這些方法涉及分析細(xì)胞對(duì)于藥物梯度暴露反應(yīng)中生物狀態(tài)的變化值，以便確定每種細(xì)胞成分的藥物濃度，在該濃度下該細(xì)胞成分會(huì)變激活或失活。這些“反應(yīng)藥物濃度”的分布，尤其是這些分布的形式(即單峰、雙峰、三峰等)確定了細(xì)胞中受藥物影響的初始靶標(biāo)的數(shù)目。
這一部分首先描述一些初步的概念，包括藥物作用、細(xì)胞生物狀態(tài)、生物通道，根據(jù)本發(fā)明，它們?cè)诩?xì)胞中描述藥物作用。接下來(lái)，描述了本發(fā)明方法的系統(tǒng)的非限制的概要。再接下來(lái)的部分更詳細(xì)地描述本發(fā)明的方法。
雖然為了說(shuō)明的方便，本說(shuō)明經(jīng)常提到單一的細(xì)胞(例如，“RNA是從一種在單個(gè)基因被微擾的細(xì)胞中提取的”)，而本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)這樣理解更多的時(shí)候，本發(fā)明的任何特定步驟都是使用多數(shù)遺傳相似的細(xì)胞，例如，來(lái)自一種培養(yǎng)的細(xì)胞系而進(jìn)行的。這些相似的細(xì)胞在這里被稱(chēng)作一種“細(xì)胞類(lèi)型”。這些細(xì)胞要么來(lái)源于自然的單細(xì)胞生物體，或者來(lái)源于多細(xì)胞高等生物體。
具體的，5.1節(jié)描述了一些初步的概念，它們會(huì)用于本發(fā)明的進(jìn)一步描述中。5.2節(jié)描述本發(fā)明的方法。5.3節(jié)描述本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選分析方案。5.4節(jié)描述了測(cè)量細(xì)胞成分的方法。
5.1.1藥物作用和生物狀態(tài)根據(jù)本發(fā)明，藥物是任何復(fù)雜程度的化合物。它能微擾生物體系，不管是通過(guò)已知還是未知的機(jī)制，不管是否應(yīng)用于治療。這樣藥物就包括典型的研究或治療用小分子；自然生成的因子，如內(nèi)分泌，旁分泌或自分泌因子或者與所有類(lèi)型細(xì)胞受體互相作用的因子；細(xì)胞內(nèi)因子，如細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通道元素；從其它天然來(lái)源分離的因子；農(nóng)藥；除草劑；殺蟲(chóng)劑等。一種藥物的生物效果可能是由以下藥物介導(dǎo)的變化而引起的一種或多種RNA轉(zhuǎn)錄或降解的速率，一種或多種多肽的翻譯速率或程序或翻譯后加工，一種或多種蛋白降解的速率或程度，一種或多種蛋白的作用或活性的抑制或激活，等等。實(shí)際上，大多數(shù)藥物通過(guò)與蛋白的相互作用發(fā)揮它們的作用。能夠提高蛋白速率或激發(fā)其活性或水平的藥物在這里被稱(chēng)作“激活藥物”。而降低蛋白速率或抑制其活性或水平的藥物在這里被叫做“抑制藥物”。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以知道，雖然本發(fā)明在這里描述為鑒定“藥物”的初始靶標(biāo)。它同樣適用于鑒定一種特定組合物的初始靶標(biāo)，該組合物包含一種藥物，但它的初始靶標(biāo)與另一種包含同樣藥物但還含有另外不同成分的組合物的初始靶標(biāo)可能不同。
鑒定藥物在細(xì)胞內(nèi)初始靶標(biāo)的方法可用于，例如，確定治療效率(例如，如果一種或多種具體的治療細(xì)胞成分是主要藥物靶標(biāo))；確定副作用和/或毒性的可能(例如，如果存在其他主要藥物靶標(biāo))；通過(guò)測(cè)試是否存在相同的作用眾數(shù)來(lái)比較兩種或多種不同的藥物或藥物混合物的藥物作用眾數(shù)。例如，在ANDA加工期間，最后一點(diǎn)，不同的藥物可能包含，例如同一藥效基團(tuán)的不同組合物或成藥。
除了藥物，本發(fā)明同樣適用于自然環(huán)境的變化以靶向方式微擾生物體系。這些環(huán)境變化可以包括溫度的溫和變化(例如，溫度升高10℃)或者暴露于溫和劑量的輻射中。其它環(huán)境方面包括營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，如只存在特定的糖、氨基酸等。
在本發(fā)明中一種藥物(或自然環(huán)境變化)所引起的生物反應(yīng)是通過(guò)觀察細(xì)胞生物狀態(tài)的改變而測(cè)量的。該細(xì)胞可以是任何類(lèi)型的，例如，原核的、真核的、哺乳動(dòng)物的、植物的或者動(dòng)物的。這里所說(shuō)的細(xì)胞生物狀態(tài)是指細(xì)胞成分總體的狀態(tài)，它是以為了一定的目的對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，如鑒定藥物的效果。對(duì)于這些細(xì)胞成分狀態(tài)的測(cè)量和/或觀察可以是它們的豐度(即細(xì)胞中的量或濃度)，或它們的活性，或它們修飾的狀態(tài)(如磷酸化)，或其他與藥物作用鑒定相關(guān)的測(cè)量。在不同的方案中，本發(fā)明包括對(duì)不同細(xì)胞成分的總體進(jìn)行這些的測(cè)量和/或觀察。這些不同的細(xì)胞成分的總體又叫做細(xì)胞生物狀態(tài)的方面。這里所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞成份”不是指已知的亞細(xì)胞細(xì)胞器，如線粒體、溶酶體等。
本發(fā)明中測(cè)量的細(xì)胞生物狀態(tài)的一個(gè)方面是它的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)包括在一系列給定條件下組成RNA種類(lèi)的本身和豐度，尤其是mRNA。最好是細(xì)胞中所有組成RNA種類(lèi)的大部分都被測(cè)量，但至少測(cè)量足夠的部分以鑒定藥物的作用。轉(zhuǎn)錄狀態(tài)是本發(fā)明現(xiàn)在優(yōu)選測(cè)量的生物狀態(tài)方面。它很容易通過(guò)使用若干存在的基因表達(dá)技術(shù)測(cè)量cDNA豐度而得以確定。
本發(fā)明中測(cè)量的細(xì)胞生物狀態(tài)的另一方面是它的翻譯狀態(tài)。細(xì)胞的翻譯狀態(tài)包括在一系列給定條件下組成蛋白種類(lèi)的本身及其豐度。最好是細(xì)胞中所有組成蛋白種類(lèi)的大部分都被測(cè)量，但至少測(cè)量足夠的部分以鑒定藥物作用，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，轉(zhuǎn)錄狀態(tài)經(jīng)常代表著翻譯狀態(tài)。
細(xì)胞生物狀態(tài)的其他方面在本發(fā)明中也是有用的。例如，細(xì)胞的活性狀態(tài)，該術(shù)語(yǔ)在這里包括在一系列給定條件下組成蛋白種類(lèi)(可以是具有催化活性的核酸種類(lèi))的活性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，翻譯狀態(tài)經(jīng)常代表著活性狀態(tài)。
本發(fā)明還適用于細(xì)胞生物狀態(tài)的“混合”方面，即把不同細(xì)胞生物狀態(tài)的方面組合在一起。例如，在一種混合方面中，一些RNA種類(lèi)和一些蛋白種類(lèi)的豐度與一些其他蛋白的活性測(cè)量結(jié)合到一起。另外，從下文可以理解到，本發(fā)明還適用于其他可測(cè)量的細(xì)胞生物狀態(tài)方面。
在本發(fā)明的具體方案中，藥物暴露一般會(huì)改變被測(cè)量和/或觀察的細(xì)胞生物狀態(tài)某一方面的許多成分。例如，作為已知存在于細(xì)胞中的調(diào)控、體內(nèi)平衡和補(bǔ)償網(wǎng)絡(luò)和體系的結(jié)果，即使是一種“理想藥物”，即，一種只直接影響細(xì)胞中單獨(dú)成分的藥物，而對(duì)任何其他成分沒(méi)有直接影響，也會(huì)造成復(fù)雜的經(jīng)常不可預(yù)料的非直接影響。一種特異性完全抑制一種單一假設(shè)蛋白，蛋白P活性的藥物在這里被作為一個(gè)例子。雖然藥物本身只會(huì)直接改變蛋白P的活性，但是那些被蛋白P抑制或激活的另外的細(xì)胞成分，或者因補(bǔ)償?shù)鞍譖活性喪失而提高或減少的細(xì)胞成分也會(huì)受到影響。并且二階成分水平或活性的變化又會(huì)影響其他細(xì)胞成分，以此類(lèi)推。因此，該藥物對(duì)它的靶標(biāo)，蛋白P的直接作用隱藏于蛋白P下游的大量非直接影響。這些蛋白P的下游效果在這里被稱(chēng)作起源于蛋白P的生物通道。
相應(yīng)地，一種“非理想”藥物直接影響不止一種分子靶標(biāo)，可能有更復(fù)雜的下游效果。根據(jù)本發(fā)明，在一方面，對(duì)于這些效果的分析提供了有關(guān)該藥物的大量信息，例如，鑒定該藥物所影響的生物通道，可以解釋該藥物在細(xì)胞中的作用和毒性副作用。在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了進(jìn)行這一分析的方法。
在本發(fā)明中，測(cè)量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)作為優(yōu)選不僅僅是因?yàn)闇y(cè)量相對(duì)容易，還因?yàn)?，雖然藥物可能通過(guò)一種轉(zhuǎn)錄后機(jī)制發(fā)生作用(如抑制蛋白的活性或改變它的降解速率)，對(duì)細(xì)胞用藥總能通過(guò)直接或間接的影響使轉(zhuǎn)錄狀態(tài)產(chǎn)生可測(cè)量的改變。藥物暴露改變細(xì)胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的一個(gè)原因是前面提到的反饋系統(tǒng)或網(wǎng)絡(luò)，它們以一種補(bǔ)償方式對(duì)于感染、遺傳改變、環(huán)境變化(包括用藥)等作出反應(yīng)，主要是通過(guò)改變基因表達(dá)或轉(zhuǎn)錄的方式。作為內(nèi)部補(bǔ)償?shù)慕Y(jié)果，許多對(duì)于生物體系的微擾，雖然對(duì)體系的外部行為只有很微弱的影響，然而能夠?qū)τ诩?xì)胞內(nèi)的單獨(dú)元素，例如，基因表達(dá)的內(nèi)部反應(yīng)產(chǎn)生深刻的影響。
5.1.2生物通道在本發(fā)明中，對(duì)于細(xì)胞的藥物作用，不管是理想的或是非理想的藥物，不管在具體的操作中如何測(cè)量，都是由單獨(dú)的生物通道的藥物作用的組合完成的。例如，圖1顯示藥物D通過(guò)與生物通道101，102和103(通道103的細(xì)節(jié)沒(méi)有顯示)互相作用而作用于細(xì)胞。藥物D與這些通道之間的弧線代表著藥物D對(duì)這些通道可能的作用。藥物D對(duì)細(xì)胞的全部作用被認(rèn)為是藥物D對(duì)這三個(gè)通道中的一個(gè)或多個(gè)發(fā)生作用的組合。
這里所說(shuō)的生物通道一般認(rèn)為是一些相互聯(lián)系的細(xì)胞成分的總體。該總體中的每一個(gè)細(xì)胞成分都由于某些生物機(jī)制而受到該總體中其他一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞成分的影響。組成一條具體的通道的細(xì)胞成分可以從一個(gè)細(xì)胞的生物狀態(tài)和任何方面得到。例如，從轉(zhuǎn)錄狀態(tài)或者翻譯狀態(tài)，或者活性狀態(tài)，或者生物狀態(tài)的混合方面。因此，通道的細(xì)胞成分可以包含mRAN水平，蛋白豐度，蛋白活性，蛋白或核糖修飾程度(例如磷酸化或甲基化)，這些細(xì)胞成分類(lèi)型的組合，等等。總體中的每一個(gè)細(xì)胞成分通過(guò)某些生物機(jī)制至少受到該總體中其他一個(gè)細(xì)胞成分的影響，這些生物機(jī)制無(wú)需指明甚至理解。這里的


中，一種細(xì)胞成分對(duì)另一種的影響，不管是直接的還是間接的都用兩細(xì)胞成分之間的弧線表示，整個(gè)通道由連結(jié)通道中細(xì)胞成分的弧線網(wǎng)絡(luò)表示因此一個(gè)生物通道指的是從一些生物狀態(tài)方面獲得的細(xì)胞成分的總體和這些細(xì)胞成分間影響的網(wǎng)絡(luò)。
例如，在圖1中，生物通道101包括蛋白P1(例如P1的豐度或活性)和基因G1，G2和G3(例如，它們的轉(zhuǎn)錄mRNA水平)以及蛋白P1對(duì)這三個(gè)基因直接或間接的影響，用從P1到這三個(gè)基因的弧線表示。這種影響的機(jī)制可能是，例如，由于P1能夠與這些基因的啟動(dòng)子結(jié)合而提高它們的轉(zhuǎn)錄體的豐度。
這里所理解的生物通道的具體例子為本領(lǐng)域所熟知，它們依靠不同的生物機(jī)制實(shí)現(xiàn)細(xì)胞成分間的作用。生物通道包括熟知的生化合成通道，其中例如分子被打斷以提供細(xì)胞能量或者分子建成以提供能量?jī)?chǔ)備或者其中合成蛋白或核酸的前體。合成通道中的細(xì)胞成分包括酶和合成媒介物。前體分子對(duì)后繼分子的影響通過(guò)直接酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)變生物通道還包括信號(hào)和調(diào)控通道，它們中的許多例子也為人們熟知。這些通道的細(xì)胞成分一般包括，主要或媒介信號(hào)分子，和參與信號(hào)或調(diào)控級(jí)聯(lián)的蛋白，它們常用于鑒定這些通道。在信號(hào)通道中，信號(hào)分子與受體結(jié)合通常直接影響媒介信號(hào)分子的豐度并間接影響通道蛋白磷酸化(或其他修飾)的程度。這兩種影響接下來(lái)影響細(xì)胞蛋白的活性，例如通過(guò)影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，而這些細(xì)胞蛋白是由該信號(hào)啟動(dòng)的細(xì)胞過(guò)程的主要受動(dòng)器。調(diào)控通道與此類(lèi)似，例如調(diào)控細(xì)胞周期時(shí)間和發(fā)生的調(diào)控通道。這里，多個(gè)，經(jīng)常是進(jìn)行中的，細(xì)胞行為是時(shí)間上協(xié)調(diào)的，經(jīng)常帶有反饋調(diào)控，以獲得調(diào)和的結(jié)果。例如細(xì)胞分裂與染色體分離。這種協(xié)調(diào)是通道作用的結(jié)果，該通道經(jīng)常由蛋白間互相影響磷酸化(或其它修飾)的程度來(lái)介導(dǎo)。同時(shí)，面對(duì)波動(dòng)的環(huán)境，熟知的調(diào)控通道尋求維持細(xì)胞代謝的最佳水平?；谝阎獧C(jī)制的細(xì)胞通道操作的其他例子為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知。
本發(fā)明中特定興趣的通道被定義為“起始”于特定細(xì)胞成份的通道。一種起始于特定細(xì)胞成分的通道包括那些直接受到該特定細(xì)胞成分影響的第二組細(xì)胞成分，還有受到第二組細(xì)胞成分直接影響的第三組細(xì)胞成份等等，和這些組內(nèi)的細(xì)胞成分間影響的網(wǎng)絡(luò)。這些細(xì)胞成分之間的影響可以基于任何生物機(jī)制，例如，一種信號(hào)機(jī)制，或者一種調(diào)控或體內(nèi)平衡控制機(jī)制，或者一種綜合機(jī)制。在圖1中，通道101，包括一個(gè)蛋白和幾種基因，起始于蛋白P1。通道102包括2個(gè)蛋白和幾種基因，起始于蛋白P2和P3。
生物通道可以是階梯式的或是非階梯式的。一般情況下，一種階梯式生物通道沒(méi)有反饋圈。更具體一些，階梯通道中的細(xì)胞成分可以安排在標(biāo)有數(shù)字水平的階梯里以致于屬于特定數(shù)字水平的細(xì)胞成分只能受到屬于低一些數(shù)字水平的細(xì)胞成分的影響。階梯通道起始于標(biāo)有最低數(shù)字的細(xì)胞成分。在圖1中，通道101和102是階梯式的。通道101很顯然是階梯式的。在通道102中，處于最低數(shù)字水平的P2和P3共同(直接)影響處于中間數(shù)字水平的基因G。接著，基因G(可能是間接地)影響處于最高數(shù)字水平的基因G4、G5和G6。不同地，非階梯式通道有一個(gè)或多個(gè)反饋圈。生物通道中的反饋圈是通道細(xì)胞成分的一個(gè)子集。反饋圈中的每個(gè)成分影響同時(shí)受影響于反饋圈中的其他成分。例如在圖1中的通道102中，如果基因G6(可能是間接地)影響蛋白P3，則一個(gè)包含基因G和G6和蛋白P3的反饋圈就形成了。
因此綜上所述，這里所說(shuō)的生物通道包括細(xì)胞成分的總體，這些細(xì)胞成分通過(guò)任何生物機(jī)制相互作用。該機(jī)制已知或未知，如通過(guò)細(xì)胞的合成、調(diào)控、體內(nèi)平衡或控制網(wǎng)絡(luò)。一種細(xì)胞成分對(duì)另一細(xì)胞成分的影響可以通過(guò)一種細(xì)胞成分到另一種的合成轉(zhuǎn)化，兩細(xì)胞成分間直接的物理相互作用，由中間生物行為介導(dǎo)的兩細(xì)胞成分間的間接互相作用，或通過(guò)其他機(jī)制。另外，本發(fā)明中的一些特定興趣的通道可稱(chēng)作起始于特定細(xì)胞成分的通道，該特定細(xì)胞成分影響，但不受影響于通道中的其他細(xì)胞成分，并且在這些通道中，那些沒(méi)有反饋圈的被稱(chēng)為階梯式的。
本發(fā)明涉及鑒定藥物的多個(gè)初始靶標(biāo)。因此，一些類(lèi)型的通道尤其重要。藥物作用于細(xì)胞最理想的方式是直接與一種且僅一種細(xì)胞成分相互作用。然而，藥物作用于細(xì)胞一般通過(guò)直接與5到10至50或更多的細(xì)胞成分互相作用。藥物作用于細(xì)胞的其他效果來(lái)源于藥物的直接靶標(biāo)，直接或間接地影響其他的細(xì)胞成分。
例如，圖2顯示了一個(gè)示范的生物通道。它包括藥物D、作用于兩個(gè)初始靶標(biāo)P1和P2。接著，每種初始靶標(biāo)與多個(gè)其他細(xì)胞成分，如轉(zhuǎn)錄RNA水平，相互作用，用起源于P1和P2的弧線表示(單獨(dú)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄體沒(méi)有顯示)。因此，本發(fā)明中用于鑒定一種藥物多個(gè)初始靶標(biāo)的重要通道包括階梯式通道。如圖2中所示顯示的，它起始于一種藥物或感興趣的化合物或起始于作為該藥物初始靶標(biāo)的細(xì)胞成分。由于大部分的藥物靶標(biāo)是蛋白，起始于細(xì)胞蛋白的通道在呈遞藥物作用中具有特別的意義。階梯式通道在呈遞藥物作用中是有利的，因?yàn)樵诜请A梯式通道中所存在的反饋圈能夠通過(guò)在細(xì)胞成分中導(dǎo)致補(bǔ)償作用減弱藥物的影響。
5.2本發(fā)明的方法概覽本發(fā)明的系統(tǒng)和方法使用戶(hù)能夠鑒定細(xì)胞中藥物的初始靶標(biāo)。尤其，本發(fā)明的方法通過(guò)分析由于梯度水平的藥物暴露而引起的細(xì)胞生物狀態(tài)的數(shù)值變化確定藥物初始靶標(biāo)的數(shù)目。
細(xì)胞生物狀態(tài)的方面，例如轉(zhuǎn)錄狀態(tài)、翻譯狀態(tài)、或者活性狀態(tài)對(duì)于不同強(qiáng)度藥物暴露所引起的反應(yīng)可由下面5.4節(jié)的描述測(cè)量。在鑒定環(huán)境變化初始靶標(biāo)的方案中，測(cè)量是圍繞不同水平的環(huán)境變化而展開(kāi)的，例如在一段溫度范圍內(nèi)。最好的藥物暴露強(qiáng)度為從沒(méi)有藥物遞增至完全藥物作用這些測(cè)量值的總體在這里被叫做“藥物反應(yīng)”或“反應(yīng)分布圖”，它可選擇用圖表表示。然后每一個(gè)藥物反應(yīng)變化的被測(cè)細(xì)胞成分被分析以確定其特定的藥物濃度。在該濃度上該細(xì)胞成分根據(jù)一些客觀的標(biāo)準(zhǔn)被認(rèn)為激活或失活(對(duì)于那些在藥物反應(yīng)中被抑制的細(xì)胞成分)。這樣確定的每個(gè)細(xì)胞成分的特定藥物濃度在這里被叫做“反應(yīng)點(diǎn)”，或者“反應(yīng)濃度”或者“反應(yīng)藥物濃度”。
一種細(xì)胞成分的反應(yīng)濃度是根據(jù)一些客觀的標(biāo)準(zhǔn)確定的。一般情況下，一種細(xì)胞成分的藥物反應(yīng)表現(xiàn)的行為是(對(duì)于激活)斜率首先上升，達(dá)到最大值，然后下降在這樣的情況下，反應(yīng)藥物濃度最好是藥物反應(yīng)有最大斜率時(shí)的藥物濃度相應(yīng)的，在細(xì)胞成份受藥物抑制的情況下，藥物反應(yīng)一般表現(xiàn)出以下的行為斜率首先降低(即變得更負(fù))，達(dá)到最小值(即最負(fù))，然后上升，在這些情況下，反應(yīng)藥物濃度最好是藥物反應(yīng)斜率最低時(shí)的藥物濃度。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)本質(zhì)上是一樣的。尤其是，兩者的反應(yīng)濃度都是藥物反應(yīng)絕對(duì)斜率(即斜率值的絕對(duì)值)最大時(shí)的藥物濃度。
另外，反應(yīng)濃度還可以由細(xì)胞成分藥物反應(yīng)為它的漸近線值一半時(shí)的藥物濃度得到。其他確定反應(yīng)濃度的客觀標(biāo)準(zhǔn)可以被本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)識(shí)。事實(shí)上，因?yàn)楸景l(fā)明的方法僅僅涉及根據(jù)反應(yīng)濃度對(duì)于細(xì)胞成分進(jìn)行分組，所以使用的明確標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于應(yīng)用本發(fā)明并不重要。然而重要的是，對(duì)于所有的細(xì)胞成分要使用同一客觀標(biāo)準(zhǔn)確定反應(yīng)藥物濃度。
因?yàn)橐环N特定的藥物對(duì)于不同的初始靶標(biāo)經(jīng)常有著不同的效力(即每一個(gè)初始靶標(biāo)傾向于在不同的藥物濃度上被抑制)。這樣就能鑒定出不同的細(xì)胞成分組，它們分離于藥物濃度的不同反應(yīng)點(diǎn)上。這些細(xì)胞成分組在這里被稱(chēng)作“表達(dá)組”，每個(gè)表達(dá)組中的細(xì)胞成份有著相近的反應(yīng)濃度。
一個(gè)特定表達(dá)組的單獨(dú)成員(即細(xì)胞成分)相應(yīng)于藥物反應(yīng)通道中特定主要藥物靶標(biāo)下游的細(xì)胞成分。這樣，每一個(gè)表達(dá)組對(duì)應(yīng)于藥物的一個(gè)特定初始靶標(biāo)并特異地鑒定該初始靶標(biāo)。
5.3.分析方案本發(fā)明的方法的分析方案包括，第一，用連續(xù)的藥物反應(yīng)曲線代表被測(cè)的藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)的方案。第二，確定藥物反應(yīng)曲線上的“反應(yīng)點(diǎn)”或“反應(yīng)藥物濃度”。最后，在確定了多個(gè)細(xì)胞成分的反應(yīng)藥物濃度后，本發(fā)明的分析方案涉及對(duì)于反應(yīng)藥物濃度的分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。尤其是確定該分布的“形態(tài)”，最好使用某種客觀統(tǒng)計(jì)方法。
分析方法在以下的小節(jié)5.3.1至5.3.3中詳細(xì)地進(jìn)行了描述。本發(fā)明還提供了體系，它接受例如用戶(hù)輸入的藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)并執(zhí)行本發(fā)明的分析方法以確定多個(gè)主要藥物靶標(biāo)。該體系描述于下面的小節(jié)5.3.4。
5.3.1藥物反應(yīng)表示確定藥物多個(gè)初始靶標(biāo)最好開(kāi)始于測(cè)量藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)。在許多情況下，對(duì)于特定藥物或感興趣的化合物的梯度水平暴露所引起的藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)已經(jīng)測(cè)得。在另一些情況下，在進(jìn)行本發(fā)明后面的步驟以前必須先測(cè)量這些反應(yīng)數(shù)據(jù)。如上所述，這些數(shù)據(jù)是通過(guò)測(cè)量不同水平的藥物暴露(這里又叫做“藥物滴定水平”)下細(xì)胞成分特征的變化而獲得的。該藥物暴露(或“藥物滴定”)水平最好在一定區(qū)域內(nèi)有5個(gè)或更多，最好是10個(gè)或更多的暴露值，在該區(qū)域內(nèi)細(xì)胞成分的特征由天然水平快速變化至飽和暴露水平。
在下文中，變量“t”一般用來(lái)指藥物暴露(或“滴定”)水平，變量“D”一般用來(lái)指藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)。更詳細(xì)一些，第一個(gè)測(cè)量的藥物暴露水平記作“t1”，第k個(gè)細(xì)胞成分的藥物反應(yīng)是“Dk”。因此，Dk(t1)是第k個(gè)細(xì)胞成分在第一個(gè)藥物暴露水平上的藥物反應(yīng)。
在這些方法的后續(xù)步驟中，可能需要一些在藥物暴露數(shù)值上的藥物反應(yīng)數(shù)值，但這些數(shù)值可能沒(méi)有被測(cè)量。尤其是，為了精確地確定任何特定細(xì)胞成分的藥物反應(yīng)反應(yīng)點(diǎn)，最好使提供了的藥物反應(yīng)分布數(shù)據(jù)光滑或至少分段地連續(xù)。因此最好提供插入藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)以便于確定每種藥物反應(yīng)Dk的反應(yīng)藥物濃度。這一插值法最好通過(guò)曲線(spline)擬合或模型擬合來(lái)完成。
在曲線擬合中，藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)通過(guò)一個(gè)合適的曲線插值函數(shù)S與測(cè)量的數(shù)據(jù)數(shù)值的乘積求和得到，如下面的方程所示。Dk(x)=Σ1S(x-t1)Dk(t1)---(1)]]>變量“x”指藥物暴露水平的任意值，在該水平上估計(jì)藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)。一般情況下，S可以是任何平滑的或至少分段連續(xù)的有限支持值的函數(shù)，它有一個(gè)寬度相應(yīng)于反應(yīng)函數(shù)中預(yù)計(jì)的結(jié)構(gòu)。一個(gè)示范的寬度可以是一段距離，在該距離內(nèi)被插入的反應(yīng)函數(shù)從它的漸近值的10％升至90％。不同的S函數(shù)可能適合于該藥物和通道反應(yīng)數(shù)據(jù)，甚至適合于不同通道的反應(yīng)數(shù)據(jù)。示范的S函數(shù)包括線性的和Gaussaian插值法。
在模型擬合中，藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)通過(guò)使用一個(gè)單參數(shù)函數(shù)估計(jì)得到。一個(gè)適于估計(jì)轉(zhuǎn)錄狀態(tài)數(shù)據(jù)的示范模型-擬合函數(shù)是Hill函數(shù)如以下的方程2所示H(x)=a(x/x0)n1+(x/x0)n---(2)]]>方程式2中的Hill函數(shù)包括的可校正參數(shù)有振幅參數(shù)a，指數(shù)n和反應(yīng)點(diǎn)參數(shù)X0。這些可校正參數(shù)是為藥物反應(yīng)的每一個(gè)細(xì)胞成分獨(dú)立選擇的。最好的情況是，所選的可校正參數(shù)使得對(duì)于藥物反應(yīng)的每一種細(xì)胞成分來(lái)說(shuō)，H(t1)和Dk(t1)的距離的平方和最小。這一優(yōu)選的參數(shù)校正方法在本領(lǐng)域內(nèi)叫做H()到Dk()的最小平方擬合。這樣的擬合可以使用許多可獲得的數(shù)字計(jì)算方法完成(參見(jiàn)，例如，Pressetal.，1996，Numerical Recipes in C，2nd Ed.，Cambridge Univ.Press，Chs.10，14；Branch et al.，1996，Matlab OptimizationToolbox User’s Guide，Mathworks，Natick，MA)。
用Hill函數(shù)的模型擬合在圖4和5中舉例說(shuō)明。圖4顯示了一個(gè)用藥物FK506滴定的例子。這個(gè)圖表明酵母啤酒糖酵母基因組中的大概6000個(gè)基因中有50個(gè)基因的RNA表達(dá)水平對(duì)于FK506梯度水平暴露發(fā)生反應(yīng)而發(fā)生了最大的表達(dá)變化。圖5顯示了用Hill函數(shù)對(duì)這些基因表達(dá)水平中的一個(gè)所作的擬合。具體地，酵母基因YAP6用Hill函數(shù)擬合。參數(shù)為a＝0.4，n＝1和Log10(u0)＝0.66(或者u0＝4.6)，這些參數(shù)是通過(guò)前面描述的最小平方法選擇的。
由于對(duì)FK506有著最大反應(yīng)的50個(gè)基因的行為都很單調(diào)，即當(dāng)增大藥物暴露時(shí)，這些反應(yīng)中沒(méi)有一個(gè)從它的最大振幅大量下降(或者從最小振幅大量上升)。說(shuō)明Hill函數(shù)是一個(gè)合適的模型擬合函數(shù)。如果發(fā)生非-單調(diào)行為，則Hill函數(shù)就不是一個(gè)合適的模型擬合函數(shù)。其他可能的模型函數(shù)基于多項(xiàng)式擬合，例如通過(guò)不同的已知類(lèi)型的多項(xiàng)式。
5.3.2反應(yīng)藥物濃度在選擇了一種反應(yīng)數(shù)據(jù)插值法之后，鑒定主要藥物靶標(biāo)的下一步就是確定每個(gè)細(xì)胞成分藥物反應(yīng)的反應(yīng)點(diǎn)(即反應(yīng)藥物濃度)。一般情況下，反應(yīng)藥物濃度可以由插值藥物反應(yīng)的導(dǎo)數(shù)的絕對(duì)最大值得到，即表達(dá)式max(x)|dDk(x)dx|---(3)]]>在其他可選擇的方案中，反應(yīng)濃度可定義為藥物反應(yīng)(例如，轉(zhuǎn)錄水平)為其漸近值一半時(shí)的藥物濃度。當(dāng)反應(yīng)數(shù)據(jù)以Hill函數(shù)擬合時(shí)，該方法尤其適用。在這樣的方案中，反應(yīng)藥物濃度就是在反應(yīng)數(shù)據(jù)最小平方擬合中的反應(yīng)點(diǎn)參數(shù)X0的數(shù)值。其他確定反應(yīng)濃度的定義和方法也為本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知這些定義和方法屬于本發(fā)明的范疇之內(nèi)。
5.3.3統(tǒng)計(jì)分析根據(jù)本發(fā)明，單個(gè)的藥物初始靶標(biāo)參與多個(gè)二階和三階的基因表達(dá)變化。它們形成統(tǒng)一的表達(dá)組并在特定的藥物濃度“啟動(dòng)”。這樣，在本發(fā)明中通過(guò)鑒定統(tǒng)一的細(xì)胞成分組就可以同時(shí)鑒定一種藥物的多個(gè)初始靶標(biāo)。這些細(xì)胞成分組在特定的藥物濃度“啟動(dòng)”即有反應(yīng)點(diǎn)。這樣的細(xì)胞成分“表達(dá)組”可以很容易地由確定的反應(yīng)藥物濃度數(shù)值，X0的直方圖中鑒定出來(lái)。例如，圖6為當(dāng)用藥物FK506滴定啤酒糖酵母時(shí)50種最大基因反應(yīng)的反應(yīng)藥物濃度數(shù)值，X0的直方圖在許多方案中，細(xì)胞成分的表達(dá)組可以很容易地通過(guò)視覺(jué)觀察直方圖而鑒定出來(lái)。例如，圖6中所示顯示的反應(yīng)濃度直方圖明顯聚集于2個(gè)不同藥物濃度附近～0.3μg/ml和～20μg/ml。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到象圖6中所顯示的這樣的直方圖代表著一些數(shù)量的分布尤其是，象圖6中所顯示的這樣的直線圖代表了一些數(shù)量的統(tǒng)計(jì)分布，例如，多種細(xì)胞成分的反應(yīng)藥物濃度。相應(yīng)的，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易理解，為了描述和稱(chēng)呼的目的，名詞“分布”，“統(tǒng)計(jì)分布”和“直方圖”可以被替換使用。
圖6中所顯示的統(tǒng)計(jì)分布在本領(lǐng)域內(nèi)稱(chēng)作“雙峰”分布。換句話說(shuō)，圖6中反應(yīng)藥物濃度的分布有2個(gè)不同的“眾數(shù)”一個(gè)在～0.3μg/ml，另一個(gè)在～20μg/ml。這樣，每個(gè)表達(dá)組對(duì)應(yīng)于由藥物反應(yīng)確定的藥物濃度分布中(即直方圖中)的眾數(shù)。對(duì)于不同的藥物，其他類(lèi)型的分布是可能的，甚至預(yù)計(jì)的。例如，分布可能是“單峰的”，“三峰的”等(即可能分布中含1個(gè)，3個(gè)眾數(shù))。一般情況下，含有不止一個(gè)分布眾數(shù)的統(tǒng)計(jì)分布被稱(chēng)作“多峰的”。
在其他的方案中，統(tǒng)計(jì)分布的多峰性。尤其是反應(yīng)濃度的分布，僅通過(guò)對(duì)于直方圖的視覺(jué)觀察是不明顯的。在這樣的情況下，分布的形態(tài)可以通過(guò)使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的對(duì)象統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)進(jìn)行確定(參見(jiàn)，例如Phillips，T.Y.et al.，1989，Pattern Recognition 22741～746)。用于確定多峰形態(tài)的對(duì)象統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)最好不受模型的約束。因此會(huì)更加穩(wěn)定，如指數(shù)分布的形狀，它在優(yōu)選的X0數(shù)值上會(huì)發(fā)生。例如，在一個(gè)特定的方案中，雙峰形態(tài)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)基于Fisher Distance。
在確定一個(gè)分布的Fisher Distance時(shí)，分布本身在某一任意值被分開(kāi)，通過(guò)一個(gè)二進(jìn)制參數(shù)v指定這樣被分割的分布包括含有n1個(gè)元素的“左部分”和含有n2個(gè)元素的“右部分”，其中N＝n1＋n2是整個(gè)分布中元素的數(shù)目。尤其在本發(fā)明中n是包含于本分布中的細(xì)胞成分的數(shù)目。
這樣分割的分布的每一部分(即左和右部分)都會(huì)有其自身的平均值(μ1和μ2)以及二次距(σ1和σ2)這些都可由本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的表達(dá)式得以確定。根據(jù)方程4就可以由分割分布左、右部分的平均值和二次矩確定Fisher Distance FD。FD2(γ)=N[μ1(γ)-μ2(γ)]2n1σ12(γ)+n2σ22(γ)---(4)]]>為了評(píng)估宣稱(chēng)分布為雙峰形態(tài)的“置信度”，F(xiàn)isher Distance FD最好通過(guò)選擇binning參數(shù)γ進(jìn)行優(yōu)化或最大化，以使FDmax=max(γ)FD(γ)---(5)]]>
FDmax的值越大表明一個(gè)特定分布為雙峰形態(tài)的置信度越高。在另一種方案中，宣稱(chēng)一種分布為雙峰形態(tài)的置信度是通過(guò)比較FDmax的真實(shí)值和一種經(jīng)驗(yàn)確定的(例如，通過(guò)真實(shí)數(shù)據(jù)的Monte Carlo實(shí)現(xiàn))FDmax值分布而定量確定的。FDmax的真實(shí)值為了反應(yīng)濃度的特定分布而確定，而它的經(jīng)驗(yàn)分布產(chǎn)生于單峰形態(tài)的虛假說(shuō)。從大多數(shù)單峰直方圖人口分布形狀得到的直方圖實(shí)現(xiàn)與FDmax的分布非常相擬。這樣，在不同的可選方案中，單峰分布可能有多種形狀。例如，在可選方案中，單峰分布形態(tài)可能是，例如，均勻的，三角的或者Guassian，經(jīng)驗(yàn)確定的FDmax值最好用與實(shí)際反應(yīng)數(shù)據(jù)相同的元素?cái)?shù)目和二進(jìn)制分辨率進(jìn)行確定。然而，發(fā)現(xiàn)單峰分布的Monte Carlo結(jié)果對(duì)于元素的數(shù)目以及二進(jìn)制分辨率均不敏感。這樣，在其他的方案中，經(jīng)驗(yàn)FDmax分布可以用與實(shí)際反應(yīng)數(shù)據(jù)不同的元素?cái)?shù)目和/或不同的二進(jìn)制分辨進(jìn)行確定。
從這樣的單峰結(jié)果，可能給定一個(gè)可能性數(shù)值，由反應(yīng)濃度分布確定的實(shí)際FDmax是否真的來(lái)源于一個(gè)單峰分布。具體的這一可能性，P1就是在FDmax的經(jīng)驗(yàn)單峰分布中的FDmax數(shù)值的分?jǐn)?shù)，該值要比確定的FDmax大。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到這樣的分?jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)于實(shí)際確定的FDmax數(shù)值右側(cè)FDmax經(jīng)驗(yàn)單峰分布直方圖的區(qū)域。這樣，宣稱(chēng)雙峰形態(tài)的置信度是從總體中減去FDmax是源自單峰分布的可能性，即1-P。
在其他方案中，可以在反應(yīng)藥物濃度分布中測(cè)試更高水平的形態(tài)。在這些方案中，可以把直方圖的間隔分成小間隔，小間隔被懷疑含有兩個(gè)不同的眾數(shù)，然后使用以上描述的方法對(duì)每個(gè)小間隔進(jìn)行雙峰形態(tài)測(cè)試。
5.3.4.實(shí)施系統(tǒng)和方法在以上小節(jié)中描述的方法最好通過(guò)使用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)來(lái)實(shí)施。相應(yīng)的，本發(fā)明還提供了一個(gè)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)該系統(tǒng)依據(jù)以下的程序和方法實(shí)施本發(fā)明的方法。圖3顯示了一個(gè)示范的適用于實(shí)施本發(fā)明分析方法的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)301顯示為包括內(nèi)部組件，它們與外部組件相連。該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的內(nèi)部組件包括處理器元件302，它與存貯器303內(nèi)部相連。例如，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)301可以是基于Intel Pentium的200MHz或更高時(shí)鐘頻率的處理器和32M或更長(zhǎng)的主存貯器。
外部組件包括大容積累存貯器304。該大容量存貯器一塊或多塊硬盤(pán)(它們一般與處理器和存儲(chǔ)器包裝在一起)。這樣的硬盤(pán)一般為1GB或更大存貯容量。其他外部組件包括用戶(hù)界面設(shè)備305，它可以是一臺(tái)顯示器和鍵盤(pán)還有指向設(shè)備306，它可以是一支“鼠標(biāo)”或者其他的圖形輸入設(shè)備(沒(méi)有舉例)一般情況下，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)301還與網(wǎng)絡(luò)線307相連該網(wǎng)線可以是Ethernet連結(jié)，其他本地計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)系統(tǒng)或者廣域通迅網(wǎng)絡(luò)如Internet的一部分。該網(wǎng)線使計(jì)算機(jī)系統(tǒng)301與其它計(jì)算機(jī)系統(tǒng)共享數(shù)據(jù)和處理任務(wù)。該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的組件還可能包括顯示數(shù)據(jù)的方法、如顯示藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)、反應(yīng)藥物濃度和/或表達(dá)組的方法。這些方法可能包括，但不僅限于一臺(tái)顯示器或是打印機(jī)或是繪圖儀。
幾種軟件組件在該系統(tǒng)操作過(guò)程中被加載到存儲(chǔ)器中，它們?cè)诒绢I(lǐng)域內(nèi)是標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)對(duì)本發(fā)明又是特殊的。這些軟件組件共同導(dǎo)致計(jì)算機(jī)系統(tǒng)根據(jù)本發(fā)明的方法發(fā)揮作用。這些軟件組件一般存儲(chǔ)在大容量存儲(chǔ)器304中，軟件組件310代表操作系統(tǒng)，它負(fù)責(zé)管理計(jì)算機(jī)系統(tǒng)301和它的網(wǎng)絡(luò)連接。該操作系統(tǒng)可以是，例如，MicrosoftWindowsTM家族，如Windows95，Windows98或者Windows NT，一種Macintosh操作系統(tǒng)，和OS/2操作系統(tǒng)或是Unix操作系統(tǒng)軟件組件311代表公用語(yǔ)言和該系統(tǒng)方便提供的函數(shù)以輔助程序?qū)嵤┍景l(fā)明的方法。用于編寫(xiě)本發(fā)明分析方法的語(yǔ)言包括C，和C++和不是很合意的JAVA最好本發(fā)明的方法在數(shù)字軟件包中編程。該軟件包允許等式的字符輸入和運(yùn)算的高度規(guī)范，包括可用的算法，借此使用戶(hù)無(wú)需編寫(xiě)單獨(dú)的方程或算法。這樣的軟件包包括Matlab fromMathworks(Natick，MA)，Mathematica from Wolfram Research(Champaign，Illinois)或者S-Plus from Math Soft(Seattle，Washington)。
軟件組件312和313和314代表本發(fā)明的分析方法。它們用程序語(yǔ)言或字符程序包編寫(xiě)，組件312代表實(shí)施上面小節(jié)5.3.1中描述的藥物反應(yīng)表示方法的程序或子程序。組件313代表實(shí)施確定每種藥物反應(yīng)(即，每種細(xì)胞成分的藥物反應(yīng))反應(yīng)藥物濃度的方法的程序或子程序。組件314代表實(shí)施確定反應(yīng)藥物濃度分布包括小節(jié)5.3.3中描述的雙峰或多峰形態(tài)目標(biāo)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的方法的程序或子程序。
在一個(gè)示范實(shí)施中，為了使用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)實(shí)施本發(fā)明的方法，一位用戶(hù)把藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)加載到存儲(chǔ)器303中。這些數(shù)據(jù)可以由用戶(hù)從顯示器和鍵盤(pán)305中直接輸入或者從網(wǎng)絡(luò)連接307相連的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，或者在可移動(dòng)存儲(chǔ)媒介上(沒(méi)有顯示)。接下來(lái)，用戶(hù)執(zhí)行藥物反應(yīng)表示軟件312。再執(zhí)行軟件組件313，它依據(jù)小節(jié)5.3.2的方法由一個(gè)或多個(gè)藥物反應(yīng)確定反應(yīng)濃度。最后執(zhí)行組件314，它依據(jù)上面小節(jié)5.3.3中的方法確定反應(yīng)濃度的統(tǒng)計(jì)分布。
在一種可替代的實(shí)施中，為了使用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)實(shí)施本發(fā)明的方法，一位用戶(hù)把由藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)確定的多種細(xì)胞成分的反應(yīng)濃度數(shù)值加載到計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器303中。這些數(shù)據(jù)可以依據(jù)以上描述的輸入、藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)的方法進(jìn)行輸入。在這種方案中，軟件組件312和313未被使用而無(wú)需包含于計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中。另外，軟件組件314被執(zhí)行以確定被加載的反應(yīng)濃度數(shù)值的分布和形態(tài)。
用于實(shí)施本發(fā)明分析方法的其他可選系統(tǒng)和方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解并意在包含于附加的權(quán)利要求中。尤其是，附加的權(quán)利要求想要包括用于實(shí)施本發(fā)明方法的程序結(jié)構(gòu)，這些方法很容易為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
5.4測(cè)量方法藥物反應(yīng)通過(guò)測(cè)量細(xì)胞成分由于藥物暴露或通道微擾而發(fā)生的變化獲得并用于本發(fā)明。這些細(xì)胞特征可以是細(xì)胞生物狀態(tài)的任何方面。它們可以是，例如，轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，測(cè)量RNA豐度，翻譯狀態(tài)，測(cè)量蛋白豐度，活性狀態(tài)，測(cè)量蛋白活性。細(xì)胞特征還可以是混合的方面，假如測(cè)量起始一種特定生物通道的一種或多種蛋白的活性，同時(shí)測(cè)量通道中起始蛋白下游細(xì)胞成分的RNA豐度(基因表達(dá))。這一節(jié)描述了在藥物或通道反應(yīng)中測(cè)量細(xì)胞成分的示例方法，本發(fā)明適用于這些測(cè)量的其他方法。
本發(fā)明的方案優(yōu)選基于測(cè)量藥物和通道反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的方案。轉(zhuǎn)錄狀態(tài)可以通過(guò)以下方法商量在下一小節(jié)中描述的雜交核酸陳列或核酸模擬探計(jì)技術(shù)，或者在后面的小節(jié)中描述的其他基因表達(dá)技術(shù)。然而無(wú)論如何測(cè)量，結(jié)果都是包括代表RNA豐度比數(shù)值的反應(yīng)數(shù)據(jù)，它們通常反應(yīng)了DNA表達(dá)比(去除RNA降解速率的不同)這樣的測(cè)量方法描述于5.4.1小節(jié)。
在本發(fā)明的不同可選方案中，還可以測(cè)量除了轉(zhuǎn)錄狀態(tài)之外的生物狀態(tài)方面，如翻譯狀態(tài)、活性狀態(tài)、或者混和狀態(tài)。這些方案的細(xì)節(jié)描述于這一節(jié)，這樣的測(cè)量方法描述于5.4.2小節(jié)。
5.4.1測(cè)量藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)為了測(cè)量藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)，細(xì)胞暴露于藥物或感興趣的候選藥物梯度水平中。如果細(xì)胞生長(zhǎng)于體外，這些化合物通常加入它們的培養(yǎng)基。以酵母為例，如啤酒糖酯母，最好在對(duì)數(shù)期早期收集細(xì)胞，因?yàn)槟菍?duì)表達(dá)方式對(duì)于收集的時(shí)間相對(duì)不太敏感。依據(jù)藥物的特殊性質(zhì)把藥物按梯度量加入，但通常介于1ng/ml至100mg/ml之間。在一些情況下藥物會(huì)溶于一種溶劑如DMSO。
根據(jù)任何以下描述的方法測(cè)量暴露于藥物和未暴露于藥物的細(xì)胞的生物狀態(tài)。最好使用轉(zhuǎn)錄體或微陣列來(lái)尋找由于藥物暴露而導(dǎo)致表達(dá)變化的mRNA。然而，還可以測(cè)量生物狀態(tài)的其他方面以確定，例如由于藥物暴露導(dǎo)致翻譯和活性變化的蛋白。
在以下描述的雙色差異雜交中，測(cè)量藥物反應(yīng)最好帶有反向標(biāo)記。同時(shí)，使用的藥物暴露水平最好能夠在藥物反應(yīng)快速變化的區(qū)域提供足夠的分辨率，例如，通過(guò)使用大約10個(gè)水平的藥物暴露。
5.4.2轉(zhuǎn)錄狀態(tài)測(cè)量一般情況下，使用任何包含一段核苷酸序列的探針，該探針固定在一個(gè)固相支持物或表面上，就可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的測(cè)量。例如，探針可能包括DNA序列，RNA序列或者DNA和RNA序列的共聚物。該探針的多核苷酸序列還可以包含DNA和/或RNA類(lèi)似物或者其組合。例如，探針的多核苷酸序列從細(xì)胞中提取出來(lái)的基因組DNA的全長(zhǎng)或部分序列，cDNA或mRNA序列。探針的多核苷酸序列還可以是合成的核苷酸序列，如合成寡核苷酸序列。這些探針序列可以在體內(nèi)酶法合成，在體外酶法合成(例如，通過(guò)PCR)或者在體外非酶法合成。
本發(fā)明方法中所使用的探針最好固定在固相支持物或表面上，它們可以是多孔的或是無(wú)孔的。例如，本發(fā)明的探針可能是吸附于硝化纖維或尼龍膜或?yàn)V膜上的多核苷酸序列。這樣的雜交探針在本領(lǐng)域內(nèi)為人們熟知(參見(jiàn)，例如，Sambrook et al.，Eds.1989，MolecularCloningA Laboratory Manual，2nd ed.，Vols1～3，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)。另外，該固相支持物或表面可以是玻璃或塑料表面。
5.4.2.1微陣列概述在特別優(yōu)選的方案中，轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的測(cè)量是通過(guò)雜交探針的微陣列來(lái)完成的。該微陣列包括一個(gè)固相，固相表面固定著大量多核苷酸，如大量DNA或DNA模擬物或者還可以是大量的RNA。具體地，一個(gè)微陣列是一個(gè)大小小于6.25cm2的排列。微陣列可以用于，例如，分析細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，如暴露于藥物梯度水平的細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。
在優(yōu)選的方案中，一個(gè)微陣列包括一個(gè)結(jié)合(例如雜交)位點(diǎn)有序排列的表面，這些位點(diǎn)用于細(xì)胞或生物體基因組中許多基因，最好是全部或大部分基因的產(chǎn)物。微陣列可以有許多方法完成，以下描述其中的幾種無(wú)論如何制得。微陣列都有一些共同的特征排列是可重復(fù)的，允許制作給定陣列的多個(gè)拷貝而方便地相互比較。最好，該微陣列較小，一般小于5cm2。并且使用在結(jié)合(例如，核酸雜交)條件下穩(wěn)定的材料制成。最好，微陣列中的一個(gè)給定的結(jié)合位點(diǎn)或一套特異的結(jié)合位點(diǎn)特異性地結(jié)合(例如，雜交)細(xì)胞內(nèi)一個(gè)單一基因的產(chǎn)物(例如，結(jié)合一個(gè)特異的mRNA或由其而來(lái)的特異的cDNA)。然而如以上所述，一般情況下，其他相關(guān)或相似的序列會(huì)交叉雜交到給定的結(jié)合位點(diǎn)。雖然每個(gè)特定RNA或DNA可能有一個(gè)以上的物理結(jié)合位點(diǎn)，為了下文討論的清晰，假定只存在一個(gè)單一的完全互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)。
本發(fā)明的微陣列包括一種或多種測(cè)試探針，它們含有一段與被探測(cè)RNA或DNA亞序列互補(bǔ)的多核苷酸序列。每個(gè)探針最好有不同的核酸序列，它們?cè)诠滔啾砻嫔系奈恢米詈檬且阎?。在一種方案中，微陣列是一種高密度排列，密度最好大于每1cm260個(gè)不同的探針。在一種方案中，微陣列排列(即矩陣)的每個(gè)位置代表一個(gè)基因(即mRNA或由其產(chǎn)生的cDNA)編碼產(chǎn)物的單獨(dú)結(jié)合位點(diǎn)，而且存在與生物基因組中大部分或幾乎全部基因的產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)。例如，該結(jié)合位點(diǎn)可以是一個(gè)DNA或DNA類(lèi)似物，特定的RNA或特異性地與之雜交。該DNA或DNA類(lèi)似物可以是，例如，一種合成的低聚物一種全長(zhǎng)的cDNA，非合長(zhǎng)cDNA或者一種基因片段。
雖然在優(yōu)選方案中微陣列包括與靶標(biāo)生物基因組所有或幾乎所有基因產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，但這種廣泛性不一定是必需的。通常微陣列包括至少與基因組中50％基因相對(duì)應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，經(jīng)常達(dá)到大約75％，更常見(jiàn)的是至少85％，更加常見(jiàn)的是90％左右，最常見(jiàn)的是至少大概99％。優(yōu)選地，微陣列包括相應(yīng)于部分基因的結(jié)合位點(diǎn)。這些基因與感興趣的藥物或生物通道的作用有關(guān)。一個(gè)“基因”是作為一個(gè)開(kāi)放閱讀框架(ORF)被鑒定出來(lái)的，ORF最好編碼一段至少50，75，或99個(gè)氨基酸的序列，在生物體或多細(xì)胞生物體的一些細(xì)胞中一種信使RNA由ORF轉(zhuǎn)錄而來(lái)?；蚪M中基因的的數(shù)目可由該生物體所表達(dá)的mRNA的數(shù)目推斷，或者由基因組鑒定了的部分推斷。當(dāng)感興趣的生物體的基因組完成測(cè)序，就可以確定ORF的數(shù)目，通過(guò)分析DNA序列可鑒定mRNA編碼區(qū)域。例如，啤酒糖酵母的基因組已被完全測(cè)序。報(bào)道其含有大約6275個(gè)長(zhǎng)于99個(gè)氨基酸的ORF。對(duì)于ORF的分析表明其中的5885個(gè)ORF可能編碼蛋白產(chǎn)物(Goffeau et al.，1996，Science 274546～567)。不同的是，人類(lèi)的基因組估計(jì)含有大約105個(gè)基因。
5.4.2.2制備微陣列的探針如上面提到的，根據(jù)本發(fā)明與一特定的多核苷酸分子特異性雜交的“探針”通常是一段互補(bǔ)的多核苷酸序列。在一種方案中，微陣列中的探針是對(duì)應(yīng)于一種生物體基因組內(nèi)至少一部分基因的DNA或DNA“模擬物”(如，衍生物和類(lèi)似物)。在另一方案中，微陣列的探針是互補(bǔ)的RNA或RNA模擬物。
DNA模擬物是由亞基組成的多聚體，這些亞基能夠與DNA進(jìn)行特異性的，Watson-Crick式的雜交或者與RNA進(jìn)行特異性的雜交。核酸可以在堿基部分、在糖基部分或在磷酸主鏈上發(fā)生修飾。示例的DNA模擬物包括，例如，硫代磷酸。
DNA可以獲得，例如，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“PCR”)對(duì)來(lái)自基因組DNA，cDNA(例如，通過(guò)RT-PCR)或者克隆序列進(jìn)行基因片段擴(kuò)增。PCR的引物要基于產(chǎn)生特異片段(即微陣列上與其他任何片段都沒(méi)有多于連續(xù)10個(gè)堿基相同的片段)擴(kuò)增的已知基因或cDNA序列進(jìn)行優(yōu)選。本領(lǐng)域內(nèi)為人們熟知的計(jì)算機(jī)程序可用于設(shè)計(jì)帶有所需特異性和最佳擴(kuò)增屬性的引物，如Oligo Version 5.0(NationalBiosciences)一般情況下，微陣列的每個(gè)探針在20個(gè)堿基到12000個(gè)堿基之間，通常長(zhǎng)度為300堿基到2000堿基，更多情況下長(zhǎng)度為300堿基到800堿基。PCR方式在本領(lǐng)域內(nèi)為人們熟知，描述于，例如lnnis等.，編輯.，1990，PCR方法方法和應(yīng)用指南，學(xué)術(shù)出版公司，圣地亞哥，加利福尼亞。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以清楚地認(rèn)識(shí)到，自動(dòng)化控制系統(tǒng)對(duì)于分離和擴(kuò)增核酸有用。
另一種制備微陣列多核苷酸的可選方法是通過(guò)合成多核苷酸或寡核苷酸。例如，使用N-磷酸酯或亞磷酰胺反應(yīng)(Froehler等.，1986，核酸研究.145399～5407；McBrid等.，1983，Tetrahedron Lett.24246～248)。合成的序列長(zhǎng)度一般在大約15至500個(gè)堿基內(nèi)，更通常的情況是在20至50個(gè)堿基內(nèi)。在一些方案中，合成的核酸包括非天然堿基，如，但不限于肌苷。如上面提到的，核酸類(lèi)似物可以用作雜交結(jié)合位點(diǎn)。一種合適的核酸類(lèi)似物的例子是多肽核酸(參見(jiàn)，例如，Egholm等.，1993，Nature 363566～568；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,539,083)。
在可選方案中，雜交位點(diǎn)(即探針)可以從基因的質(zhì)?；蚴删w克隆，cDNA(例如，表達(dá)序列標(biāo)簽)，或由其產(chǎn)生的插入制得(Nguyen等.，1995，Genomics 29207～209)。
5.4.2.3把探針附著到固體表面探針被吸附于固體支持物或表面，它們由玻璃、塑料(例如，聚丙烯，尼龍)、聚丙烯酰胺、硝酸纖維或其它材料制成。把核酸附著到表面的一種優(yōu)選方法是通過(guò)在玻璃平板上打印，概述地描述于Schena等.，1995，科學(xué)270467～470。這一方法對(duì)于制備cDNA微陣列尤其有用(參見(jiàn)，DeRisi等.，1996，自然遺傳學(xué)14457～460；Shalon等.，1996，基因組研究.6689～645；和Schena等.，1995，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊.9310539～11286)。Blanchard說(shuō)明了使用噴墨打印機(jī)進(jìn)行寡核苷酸合成(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)09/008,120，申請(qǐng)日，1998年1月16日)。
第二種制備微陣列的優(yōu)選方法是制做高密度寡核苷酸排列。用于制備含有成千上萬(wàn)與指定序列互補(bǔ)的寡核苷酸的排列的技術(shù)已知，它們位于表面固定的位置上，使用照相平印技術(shù)進(jìn)行原位合成(參見(jiàn)，F(xiàn)oder等.，1991，科學(xué)251767～773；Pease等.，1994，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊915022～5026；Lockhart等.，1996，自然生物技術(shù)141675；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,578,832；5,556,752；和5,510,270)或者使用其他的方法進(jìn)行快速合成和指定寡核苷酸沉積(Blanchard等.，生物傳感器和生物電子儀器11687～690)。如果使用了這些方法，已知序列的寡核苷酸(例如，20-聚體)直接在表面如復(fù)合玻璃薄片上進(jìn)行合成。通常制得的排列是贅余的，每個(gè)RNA對(duì)應(yīng)幾個(gè)寡核苷酸分子寡核苷酸探針可選擇用于檢測(cè)可被剪切的mRNA。
其他制做微陣列的方法，例如，通過(guò)掩蔽(Maskos and Southern，1992，核酸研究201679～1684)，也可以被使用。原則上，任何類(lèi)型的排列，例如，在尼龍雜交膜上的點(diǎn)雜交(參見(jiàn)Sambrook等.，上文)都可以使用。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，經(jīng)常需要優(yōu)選很小的排列因?yàn)殡s交量會(huì)更小。
5.4.2.4目標(biāo)多核苷酸分子如上所述，可由本發(fā)明分析的多核苷酸分子可以是任何來(lái)源，包括天然發(fā)生的核酸分子，還有合成的核酸分子。在一種優(yōu)選的方案中，被本發(fā)明分析的多核苷酸分子含RNA，包括但絕不限于，總細(xì)胞RNA，poly(A)+信使RNA(mRNA)及其片段，或從cDNA轉(zhuǎn)錄而來(lái)的RNA。制備總RNA和poly(A)+RNA的方法在本領(lǐng)域內(nèi)熟知，概述于以上的Sambrook et al.，在一種方案中，使用硫氰酸胍裂解把RNA從不同種類(lèi)的細(xì)胞中提取出來(lái)。接著進(jìn)行CsCl離心(chirgwin等.，1979.生物化學(xué)185294～5299)Poly(A)+RNA使用寡聚dT纖維素進(jìn)行選擇、感興趣的細(xì)胞包括但決不限于，野生型細(xì)胞、藥物暴露細(xì)胞、修飾的細(xì)胞、病變細(xì)胞尤其是癌癥細(xì)胞。
在一種方案中，RNA可以用本領(lǐng)域已知的方法打成片段。例如，通過(guò)與ZnCl2共培養(yǎng)生成RNA片斷。在一種方案中，在存在標(biāo)記的dNTPs條件下，分離手mRNA可以通過(guò)全外雙鏈cDNA轉(zhuǎn)錄而轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣傻腞NA(Lockhart等.，1996，自然生物技術(shù).141675)。
在其它方案中，用于分析的多核苷酸分子可以是DNA分子，如片段基因組DNA。從mRNA反轉(zhuǎn)錄而來(lái)的cDNA第一鏈或者擴(kuò)增mRNA或cDNA的PCR產(chǎn)物。
5.4.2.5與微陣列雜交選擇核酸雜交和洗脫條件以使本發(fā)明分析的多核苷酸分子“特異性結(jié)合”或“特異性雜交”到排列的互補(bǔ)多核苷酸序列上，最好是特定的排列位點(diǎn)，其中存在被分析核酸分子的互補(bǔ)DNA。
在其上含有雙鏈探針DNA的陣列與目標(biāo)多核苷酸分子接觸之前，最好經(jīng)過(guò)變性條件處理以產(chǎn)生單鏈DNA。含有單鏈探針DNA(例如，合成寡聚脫氧核糖核酸)的陣列在與目標(biāo)多核苷酸分子接觸之前可能也要變性，例如，去除由于自身互補(bǔ)序列而產(chǎn)生的發(fā)夾或二聚物。
最佳雜交條件取決于探針的長(zhǎng)度(例如，寡聚體相對(duì)多于200堿基的多核苷酸)和種類(lèi)(例如，RNA或DNA)以及目標(biāo)核酸。特異(即嚴(yán)格)雜交條件的一般參數(shù)描述于Sambrook等.，(上文)，和Ausubel等.，1987，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，Greene Publishing andWiley-Inter science，New York.當(dāng)使用Schena等.oDNA微陣列時(shí)，典型的雜交條件是5×SSC加0.2％SDS 65℃雜交4小時(shí)，然后在25℃用高度嚴(yán)格洗脫緩沖液(0.1×SSC加0.2％SDS)洗脫(Shena等.，1996，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊.9310614)。有用的雜交條件提供于，例如，Tijessen，1993，與核酸探針的雜交，Elsevier SciencePublishers B.V.；和Kricka，1992，非同位素DNA探針技術(shù)，學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥，CA。
5.4.2.6信號(hào)檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析能夠理解當(dāng)制備了與細(xì)胞中RNA互補(bǔ)的cDNA，并在合適的雜交條件下使之與微陣列雜交。陣列中相應(yīng)于任何特定基因的位點(diǎn)上的雜交程度反映了由該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA在細(xì)胞中的廣泛程序。例如，當(dāng)與總細(xì)胞mRNA互補(bǔ)的且做了檢測(cè)標(biāo)記(例如，用熒光團(tuán))的cDNA與微陣列雜交后，陣列上相應(yīng)于一個(gè)基因的位點(diǎn)(即能夠特異性結(jié)合該基因的產(chǎn)物)，會(huì)出現(xiàn)以下兩種情況若該基因在細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有轉(zhuǎn)錄，則該位點(diǎn)上有很少或根本沒(méi)有信號(hào)(例如，熒光信號(hào))，而那些所編碼的mRNA很廣泛的基因則會(huì)有相對(duì)較強(qiáng)的信號(hào)。
在優(yōu)選方案中，從二個(gè)不同的細(xì)胞而來(lái)的cDNA雜交到微陣列的結(jié)合位點(diǎn)上。在藥物反應(yīng)的情況下，一個(gè)細(xì)胞暴露于藥物，而同類(lèi)型的另一個(gè)細(xì)胞未暴露于藥物。來(lái)源于二不同細(xì)胞的cDNA標(biāo)記不同以把它們區(qū)別開(kāi)來(lái)。例如，在一種方案中，來(lái)自藥物處理細(xì)胞的cDNA使用熒光素標(biāo)記的dNTP進(jìn)行合成，而來(lái)源于第二個(gè)未經(jīng)藥物暴露的細(xì)胞的cDNA則使用藍(lán)光鹼性蕊青細(xì)標(biāo)記的dNTP合成。把兩種cDNA混和并與微陣列雜交，在陣列的每個(gè)位點(diǎn)上來(lái)自每個(gè)cDNA組的信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度被確定，借此檢測(cè)出特定mRNA豐度的任何相對(duì)差異。
在上面所述的例子中，來(lái)自藥物處理細(xì)胞的cDNA當(dāng)熒光團(tuán)被激發(fā)時(shí)會(huì)發(fā)出綠色熒光，而來(lái)自未處理細(xì)胞的cDNA會(huì)發(fā)出紅色熒光。結(jié)果是，如果藥物處理對(duì)于細(xì)胞中特定mRNA的相對(duì)豐度沒(méi)有影響，不管是直接的還是間接的，則在兩細(xì)胞中mRNA同樣廣泛。經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄后，紅色標(biāo)記和綠色標(biāo)記的cDNA會(huì)同樣廣泛當(dāng)與微陣列雜交后，該種類(lèi)RNA結(jié)合位點(diǎn)會(huì)發(fā)射出兩種熒光團(tuán)的特征波長(zhǎng)。不同地，如果經(jīng)藥物處理的細(xì)胞所使用的藥物能夠直接或間接地增加該mRNA在細(xì)胞中的廣泛性。則綠色與紅色熒光的比例就會(huì)增大。若藥物降低該mRNA的廣泛性，則比例下降。
使用雙色熒光標(biāo)記和檢測(cè)方法確定基因表達(dá)的改變描述于，例如Shena等.，1995，科學(xué)270467～470。使用兩種不同熒光團(tuán)標(biāo)記的cDNA的優(yōu)點(diǎn)是可以對(duì)兩細(xì)胞中對(duì)應(yīng)于每個(gè)排列基因的mRNA水平進(jìn)行直接的和內(nèi)部控制的比較，由于實(shí)驗(yàn)條件(例如，雜交條件)微小差異所引起的變化不會(huì)影響后來(lái)的分析。然而，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到使用來(lái)自一個(gè)單獨(dú)細(xì)胞的cDNA，比較藥物處理或通道-微擾的細(xì)胞中和未經(jīng)處理的細(xì)胞中特定mRNA的絕對(duì)量也是可能的。
當(dāng)使用熒光標(biāo)記的探針時(shí)，每個(gè)轉(zhuǎn)錄體陣列位點(diǎn)上的熒光發(fā)射可以?xún)?yōu)選地使用掃描共焦激光顯微鏡檢測(cè)。在一種方案中，使用合適的激發(fā)線，對(duì)使用的兩種熒光團(tuán)進(jìn)行分別掃描。另外，可以使用能使樣品在兩熒光團(tuán)特異波長(zhǎng)上同時(shí)發(fā)光的激光并且來(lái)自?xún)蔁晒鈭F(tuán)的發(fā)射能同時(shí)被分析(參見(jiàn)Shalon等.，1996，基因組研究.6639～645)。在一種優(yōu)選的方案中，陣列使用一種激光熒光掃描儀進(jìn)行掃描。該掃描儀帶有一個(gè)計(jì)算機(jī)控制的X-Y層和一個(gè)顯微鏡物鏡使用多線混合氣體激光對(duì)兩熒光團(tuán)進(jìn)行順序激發(fā)，發(fā)射的光根據(jù)波長(zhǎng)分割并使用二只光電倍增管檢測(cè)。這樣的熒光激光掃描設(shè)備描述于，例如Sohena等.，1996基因組研究6639～645。另外，描述于Ferguson等.，1996，自然生物技術(shù).141681～1684的光纖束可用于同時(shí)監(jiān)測(cè)大量位點(diǎn)上的mRNA豐度水平。
信號(hào)被記錄，在優(yōu)選方案中，并用計(jì)算機(jī)分析，例如，使用一個(gè)12位模擬到數(shù)字板。在一種方案中，使用一種圖象程序(例如，HijaakGraphics Suite)對(duì)掃描的影像進(jìn)行去斑。然后再使用影像網(wǎng)絡(luò)程序進(jìn)行分析產(chǎn)生一個(gè)電子表格，該表格反應(yīng)每個(gè)位點(diǎn)上每個(gè)波長(zhǎng)上的平均雜交。如果必需的話，可對(duì)兩頻道間的“串?dāng)_”(或重疊)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確定的糾正。對(duì)于轉(zhuǎn)錄體陣列上的任何特定雜交位點(diǎn)，可以計(jì)算出兩熒光團(tuán)的發(fā)射比例。該比例與同種基因的絕對(duì)表達(dá)水平無(wú)關(guān)，但對(duì)于那些表達(dá)受到用藥、基因缺失或任何其他測(cè)試事件明顯調(diào)控的基因，這個(gè)比例是有用的。
根據(jù)本發(fā)明的方法，兩細(xì)胞或細(xì)胞系中一種mRNA的相對(duì)豐度被記為微擾并確定其量值(即在兩被測(cè)mRNA來(lái)源中豐度不同)或者沒(méi)有微擾(即相關(guān)豐度相同)。正如這里所用的，兩RNA來(lái)源間的差異至少為25％(即，RNA在一種來(lái)源中的豐度比另一來(lái)源多出25％)，更常見(jiàn)的是50X，更加常見(jiàn)的是2(即2倍豐度)，3(3倍豐度)，或者5(5倍豐度)被記錄為微擾?，F(xiàn)在的檢測(cè)方法可以可靠地檢測(cè)3倍至5倍的量級(jí)，且更加靈敏的方法即將問(wèn)世。
優(yōu)選地，除了鑒定微擾為陽(yáng)性或陰性，最好能夠確定微擾的量值。如上面所提到的，這可以通過(guò)計(jì)算用于不同標(biāo)記的熒光團(tuán)的發(fā)射比例得到或者通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員很容易理解的類(lèi)似方法。
5.4.2.7.轉(zhuǎn)錄狀態(tài)測(cè)量的其他方法細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他基因表達(dá)技術(shù)進(jìn)行測(cè)量。若干這樣的技術(shù)產(chǎn)生用于電泳分析的有限復(fù)雜性的限制性片段庫(kù)，如把雙限制性酶切與定相引物結(jié)合的方法(參見(jiàn)，例如，歐洲專(zhuān)利0534856A1，申請(qǐng)日，1992年9月24日，申請(qǐng)人為Zabeau等.，)或者選擇含有最接近一個(gè)確定mRNA端的位點(diǎn)的限制性片段的方法(參見(jiàn)，例如，Prashar等.，1996，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊93659～663)。其它的方法統(tǒng)計(jì)抽樣cDNA庫(kù)，如通過(guò)在cDNA中測(cè)定足夠堿基(例如，20～50堿基)的序列以鑒定每一個(gè)cDNA，或者通過(guò)短標(biāo)簽(例如9～10堿基)測(cè)序，短標(biāo)簽產(chǎn)生于相對(duì)于確定的mRNA端的已知位置(參見(jiàn)，例如，Velculescu，1995，科學(xué)270484～487)。
這些測(cè)量轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的方法和系統(tǒng)，雖然與微陣列相比不太合意，然而卻可以在本發(fā)明中應(yīng)用。
5.4.3.生物狀態(tài)其他方面的測(cè)量雖然監(jiān)測(cè)mRNA豐度之外的細(xì)胞成分現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了一些在監(jiān)測(cè)mRNA(即轉(zhuǎn)錄)時(shí)所沒(méi)有遇到的問(wèn)題。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易理解，使用本發(fā)明的方法適用于任何可被監(jiān)測(cè)的細(xì)胞成分。
在本發(fā)明的不同方案中，除了轉(zhuǎn)錄狀態(tài)之外的細(xì)胞狀態(tài)方面，如翻譯狀態(tài)，活性狀態(tài)或者其混和方面都可以被測(cè)量以獲取本發(fā)明的藥物反應(yīng)，這一部分描述了這些方案的細(xì)節(jié)。
5.4.3.1翻譯狀態(tài)測(cè)量翻譯狀態(tài)的測(cè)量可以按照若干方法進(jìn)行。例如，蛋白的全基因組監(jiān)測(cè)(即“蛋白組”，Gofla等.，上文)可以通過(guò)構(gòu)建一種微陣列實(shí)現(xiàn)。該微陣列上的結(jié)合位點(diǎn)包括固定的最好是單克隆的抗體。這些抗體對(duì)于由細(xì)胞基因組編碼的多數(shù)蛋白種類(lèi)具有特異性。優(yōu)選地，應(yīng)存在相對(duì)于大部分編碼蛋白的抗體，或至少存在相對(duì)于那些與藥物作用相關(guān)的蛋白的抗體。制備單克隆抗體的方法熟知(參見(jiàn)，例如，Harlowand Lane，1988，抗體實(shí)驗(yàn)指南，冷泉港，紐約)在一種優(yōu)選方案中，單克隆抗體是針對(duì)含成肽片段生成的，這些片段的設(shè)計(jì)基于細(xì)胞的基因組序列擁有這樣一個(gè)抗體陣列，細(xì)胞中的蛋白與陣列接觸，使用本領(lǐng)域已知的鑒定方法對(duì)它們的結(jié)合進(jìn)行分析。
另外，蛋白可以通過(guò)二維凝膠電泳系統(tǒng)進(jìn)行分離。二維凝膠電泳在本領(lǐng)域內(nèi)熟知，一般涉及第一個(gè)方向上的等電聚焦，接著在第二個(gè)方向上進(jìn)行SDS-PAGE電泳。參見(jiàn)，例如Hames等.，1990，蛋白質(zhì)的凝膠電泳實(shí)踐操作，IRL出版，紐約；Shevchenko等.，1996，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊931440～1445；Sagliocco等.，1996，酵母121519～1533；and Lander，1996，科學(xué)274536～539。得到的電泳圖可以通過(guò)許多技術(shù)進(jìn)行分析，包括質(zhì)譜技術(shù)，western雜交，和使用單克隆和多克隆抗體進(jìn)行免疫雜交分析，和內(nèi)部和N-末端微-測(cè)序。使用這些技術(shù)，就有可能鑒定出在給定生理?xiàng)l件下，包括暴露于藥物的細(xì)胞中(例如，酵母)或者通過(guò)特定基因缺失或過(guò)量表達(dá)的修飾的細(xì)胞中，所產(chǎn)生的所有蛋白中的大部分。
5.4.3.2.活性狀態(tài)測(cè)量只要有關(guān)鑒定藥物作用的蛋白的活性可以測(cè)量，本發(fā)明的方案就可以基于這些測(cè)量?；钚缘臏y(cè)量可以通過(guò)使用適合于被鑒定的具體活性的功能、生化或者物理方法來(lái)完成。當(dāng)活性涉及化學(xué)構(gòu)象時(shí)，細(xì)胞蛋白可與天然底物接觸，測(cè)量構(gòu)象的速率。當(dāng)活性涉及多亞基單位聯(lián)合時(shí)，例如一種激活的DNA結(jié)合化合物與DNA聯(lián)合，可以測(cè)量聯(lián)合的蛋白的量或者聯(lián)合的二階結(jié)果，如轉(zhuǎn)錄的mRNA的量。另外，當(dāng)只知道功能活性時(shí)，例如，在細(xì)胞周期調(diào)控中，可以觀察功能的表現(xiàn)。
無(wú)論怎么知道或者測(cè)量，可以使用本發(fā)明前面的方法對(duì)反應(yīng)數(shù)據(jù)中蛋白活性的變化進(jìn)行分析。
5.4.3.3.生物狀態(tài)的混合方面在可選的非限制性方案中，反應(yīng)數(shù)據(jù)可以由細(xì)胞生物狀態(tài)的混合方面形成。反應(yīng)數(shù)據(jù)可由以下變化的組合構(gòu)建而成例如，某種mRNA豐度的變化，某種蛋白豐度的變化和某種蛋白活性的變化。
6.實(shí)施例以下確定多個(gè)藥物靶標(biāo)的實(shí)施例是為了舉例說(shuō)明前面所描述的發(fā)明而不是對(duì)上述描述進(jìn)行限制。
6.1雙初始靶標(biāo)的鑒定這一實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明的方法應(yīng)用于鑒定一種特定的藥物FK506的兩個(gè)不同的初始靶標(biāo)。具體地，F(xiàn)K506已知在啤酒糖酵母中通過(guò)兩條單獨(dú)的蛋白通道發(fā)生作用；第一條是通過(guò)神經(jīng)堿蛋白，第二條是通過(guò)Gcn4轉(zhuǎn)錄因子。這樣，F(xiàn)K506在酵母中有兩個(gè)初始靶標(biāo)。
使用漸變水平的FK506滴定培養(yǎng)的啤酒糖酵母，根據(jù)以上5.4節(jié)中描述的方法測(cè)量轉(zhuǎn)錄水平。圖4繪出了50種在對(duì)FK506反應(yīng)中有著最大表達(dá)變化的基因的藥物反應(yīng)。垂直軸是表達(dá)比例的常用對(duì)數(shù)，即用藥物處理測(cè)量得到的mRNA水平與未用藥物處理測(cè)量得到的mRNA水平的比例轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的二個(gè)組可以在圖中區(qū)別開(kāi)來(lái)。一組在FK506大約0.3μg/ml時(shí)飽和，而另一組在大約20μg/ml處啟動(dòng)。
圖4中所顯示的50個(gè)藥物反應(yīng)中的每一個(gè)都用Hill函數(shù)擬合)上面的方程2)，由擬合參數(shù)X0確定它們的反應(yīng)藥物濃度。圖6顯示了反應(yīng)藥物濃度的直方圖，只要對(duì)直方圖進(jìn)行簡(jiǎn)單的視覺(jué)觀察就可以明顯看出反應(yīng)濃度的雙峰分布。具體地，反應(yīng)藥物濃度聚集在2個(gè)不同的值左右；一個(gè)在0.3μg/ml附近，另一個(gè)20μg/ml附近。
這些族對(duì)應(yīng)于細(xì)胞成分的特定“組”，它們受到FK506的不同初始靶標(biāo)的影響。具體地，那些激活(或失活)于較低藥物濃度(即反應(yīng)濃度在0.3μg/ml附近)的細(xì)胞成分是通過(guò)神經(jīng)堿蛋白激活(或失活)的。而那些激活(或失活)于較高藥物濃度(即反應(yīng)濃度在20μg/ml附近)的細(xì)胞成分則是通過(guò)Gcn4轉(zhuǎn)錄因子激活(或失活)的。這樣，圖6中顯示的每個(gè)“組”或眾數(shù)鑒定了藥物FK506的一個(gè)特定初始靶標(biāo)。
6.2.單一初始靶標(biāo)的鑒定與上面部分6.1描述的實(shí)施例相對(duì)應(yīng)，這一實(shí)施例說(shuō)明了應(yīng)用本發(fā)明的方法鑒定通過(guò)單一初始靶標(biāo)的藥物作用。具體地，構(gòu)建了兩種酵母菌株，它們含有Tet啟動(dòng)子系統(tǒng)調(diào)控下的基因(參見(jiàn)Brachmann，C.B.，et al.，1998，Yeast 14115-132；Gari，E.，et al.，1997，Yeast 13837～848；Jones，J.S.and Prakash，L.，1990，Yeast6363～366；and Wach，A.A.；et al.，1994，Yeast 101793～1808)。第一種酵母菌株，R1918包含Tet啟動(dòng)子調(diào)控下的HMG2。第二種酵母菌株R1446包含Tet啟動(dòng)子系統(tǒng)調(diào)控下的ERG11。
酵母菌株R1918的構(gòu)建酵母菌株R1918的質(zhì)粒如下構(gòu)建。為了酵母中的基因中斷，KanR顯性選擇標(biāo)記(參見(jiàn)Wach et al.，上文)從PUCKanR中擴(kuò)增出來(lái)，PUCKan包括一段來(lái)自PFA-KanMX6的1.5kb EcoRI-BamHI KanR片段克隆到PUC18的EcoRI-BamHI位點(diǎn)上。KamR-tet07啟動(dòng)子替換載體pKantet07通過(guò)用一個(gè)接頭修飾PUCKanR得以構(gòu)建。該接頭在KanR基因的鄰近處引入XhoI和BamHI位點(diǎn)，產(chǎn)生PUCKanXB。一段來(lái)自PCM159(參見(jiàn)，Gari et al.，上文)的700 bp XhoI-BamHI片段，包括ADHI終止子，tet07操縱子和來(lái)自CYC1的TATA元件，該片段克隆到PUCKanXB的XhoI-BamHI位點(diǎn)上，產(chǎn)生pKantet07。載體PURA3tTA包含一段1.9kb的XhoI-EcoRI片段，包含CMV(巨細(xì)包病毒)啟動(dòng)子和tTA-轉(zhuǎn)錄激活子(Gari et al.，上文)該片段克隆到pJJ242的SalI-EcoRI位點(diǎn)，pJJ242包含克隆于PUC18的URA3基因(Johes and Prakash，上文)。
酵母菌株R198構(gòu)建如下，hmg1KanR/HMG1雜合二倍體菌株通過(guò)用一段PCR擴(kuò)增的KanR片段轉(zhuǎn)化二倍體菌株By4743(Brachmann etal.，上文)得以構(gòu)建。該KanR片段的兩側(cè)都有556p的HMG1同源物以致通過(guò)在HMG1位點(diǎn)上的重組，整個(gè)編碼區(qū)域，包括起始和終止密碼子，都被KanR基因替換R535形成飽子，四分體分開(kāi)導(dǎo)致MAT2hmg1KanR二倍體菌株R1012的分離。
表達(dá)tTA轉(zhuǎn)錄激活子的MATa雙倍體菌株R1200的構(gòu)建如下。通過(guò)PCR介導(dǎo)的基因替換把3.2kb的URA3-CMVp-tTA構(gòu)建體(從PURA3tTA PCR擴(kuò)增)定位到二倍體菌株BY4741(Brachmann et al.，上文)的ura3-0位點(diǎn)。為了用tet07啟動(dòng)子替換內(nèi)源的HMG2啟動(dòng)子，用兩側(cè)為HMG2同源物的PCR擴(kuò)增的2.2kb KanR-tet07片段轉(zhuǎn)化R1200。該片段在HMG2啟動(dòng)子區(qū)域的同源整合導(dǎo)致了緊挨著ATG上游的352bp被KanR-tet07替換。這便產(chǎn)生了菌株R1159(MATa.URA3-CMVp-tTA，tet07-HMG2)。
R1159和R1012進(jìn)行雜交產(chǎn)生二倍體菌株R1525，它帶有基因型MAT a/α；hmg1KanR/HMG1；KanR-tet07-HMG2/HMG2；URA3-CMVp-tTA/ura3-0。形成孢子和四分體分開(kāi)導(dǎo)致一種MATa二倍體菌株R1918的分離，它帶有基因型humg1KanR；KanR-tet07-HMG2；URA3-CMVp-tTA。該菌株在不含有脫氧土霉素的平板上生長(zhǎng)得很好，在含有100μg/ml脫氧土霉素的平板上生長(zhǎng)得很差。
構(gòu)建酵母菌株R1446菌株R1158，包括在ura3-0位點(diǎn)整合的URA3-CMVp-tTA，的構(gòu)建與R1200相似。用兩側(cè)為ERG11同源物的PCR擴(kuò)增KanR-tet07片段轉(zhuǎn)化R1158以構(gòu)建菌株R1446。通過(guò)在ERG11位點(diǎn)上的整合，替換以緊挨ERG11起始密碼子上游的450bp的序列該菌株在不含脫氧土霉素的平板上生長(zhǎng)得很好，在含有1μg/ml脫氧土霉素的平板上生長(zhǎng)得很差。
轉(zhuǎn)錄狀態(tài)測(cè)量使用陣列機(jī)器人把代表來(lái)自啤酒糖酵母基因組的6065ORF的PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣到用聚賴(lài)氨酸處理的顯微鏡薄片上。打印之后，陣列被處理以把DNA共價(jià)結(jié)合到聚賴(lài)氨酸層上，中和未結(jié)合薄片表面的反應(yīng)性并使結(jié)合的DNA鏈變性。處理過(guò)的陣列用熒光標(biāo)記的cDNA雜交。這些eDNA是在被測(cè)RNA樣品反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過(guò)程中引入Cy3-或Cy5-dUTP而制得的。63℃時(shí)在22×30mm的玻璃蓋片下，22μl雜交溶液中(3×SSC，0.75μg/ml polyA DNA 0.2％SDS)熒光標(biāo)記的cDNA與陣列雜交6小時(shí)。然后用主要沖脫溶液(1.5×SSC)快速地洗脫陣列，掃描前在離心機(jī)中干燥。
結(jié)果酵母菌株R1918和R1446的藥物反應(yīng)是通過(guò)用漸變水平的脫氧土霉素滴定每個(gè)菌株的細(xì)胞培養(yǎng)物而獲得的，然后按上文的描述測(cè)量轉(zhuǎn)錄水平。在這些菌株中所用的Tet啟動(dòng)子系統(tǒng)以前有過(guò)描述(參見(jiàn)，例如，Gari et al.，1997，Yeast 13837～848)。該啟動(dòng)子受到抗生素四環(huán)素的濃度和結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物脫氧土霉素的調(diào)控。這樣，在沒(méi)有脫氧土霉素的條件下，啟動(dòng)子誘導(dǎo)高水平的表達(dá)。加入的脫氧土霉素水平的增加導(dǎo)致啟動(dòng)子活性受抑制的增加。通過(guò)加入中等水平的藥物可在穩(wěn)定狀態(tài)下獲得中等水平的基因表達(dá)。另外，能夠?qū)?dòng)子活性產(chǎn)生最大抑制的脫氧土霉素水平(10μg/ml)對(duì)于野生型酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)速率沒(méi)有明顯的影響(參見(jiàn)Gari et al.，上文)。這樣，脫氧土霉素在以上描述的酵母菌株中含有單一的初始靶標(biāo)HMG2(在酵母菌株R1918中)，和ERG11(在酵母菌株R1446中)。
圖7顯示了菌株R1446中對(duì)脫氧土霉素反應(yīng)有最大表達(dá)變化的那些基因的藥物反應(yīng)。下面的曲線顯示了ERG11轉(zhuǎn)錄自身的下降。圖7中顯示的每個(gè)藥物反應(yīng)都根據(jù)Hill函數(shù)(方程2)擬合并且從擬合參數(shù)X0確定它們的反應(yīng)藥物濃度。圖8顯示了反應(yīng)藥物濃度的最終直方圖，當(dāng)中去除了ERG11轉(zhuǎn)錄自身的反應(yīng)。正如料想的一樣，反應(yīng)藥物濃度是單峰的；圖中的兩個(gè)峰是反應(yīng)數(shù)值的統(tǒng)計(jì)被動(dòng)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著。這樣，該分布與生物知識(shí)一致這一反應(yīng)是單一蛋白抑制，即，只有一個(gè)初始靶標(biāo)。
圖9顯示了菌株R1918中對(duì)脫氧土霉素反應(yīng)有最大表達(dá)變化的那些基因的藥物反應(yīng)。圖10顯示了反應(yīng)藥物濃度的直方圖，去除了HMG2轉(zhuǎn)錄體的反應(yīng)X0的分布又一次是單峰的。對(duì)于該單一蛋白介導(dǎo)通道的激活，這一點(diǎn)正如料想的一樣。
6.3評(píng)估雙峰形態(tài)的置信度這一實(shí)施例說(shuō)明了使用描述于以上5.3.3節(jié)中本發(fā)明的統(tǒng)計(jì)方法以評(píng)估反應(yīng)藥物濃度的分布并確定分布眾數(shù)的數(shù)目。具體地，F(xiàn)isherDistance FD被最大化并用于評(píng)估描述于6.1和6.2節(jié)中的反應(yīng)藥物濃度的分布(分別圖6和8)由每個(gè)分布獲得的FDmax的值與不同形狀的單峰分布的FDmax值的分布進(jìn)行比較。后者通過(guò)對(duì)于“父本”分布(即，實(shí)際分布數(shù)據(jù))進(jìn)行Monte Carlo實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生。描述于6.1節(jié)中的直方圖(圖6)獲得的置信度＞99.9％，驗(yàn)證了該分布是真正的雙峰分布。并且因此，藥物FD506在酵母中通過(guò)二個(gè)初始靶標(biāo)作用。不同的是，圖8(6.2節(jié))中顯示的直方圖的雙峰形態(tài)置信度僅為30％。這一結(jié)果與該直方圖的視覺(jué)外觀一致，而且與生物知識(shí)一致滴定是一種單一蛋白抑制。
更加具體一些，圖11顯示了圖6中顯示的直方圖的FisherDistance FD的計(jì)算，它作為分割位置γ的一個(gè)函數(shù)。對(duì)于γ的每個(gè)選擇，計(jì)算平均數(shù)和二次矩以獲得左分區(qū)的數(shù)據(jù)(μ1和γ1)和右分區(qū)的數(shù)據(jù)(μ2和σ2)。然后根據(jù)以上5.3.3節(jié)中的方程4這些單獨(dú)的數(shù)據(jù)被用來(lái)計(jì)算FD。
圖12B為圖6中的直方圖繪出了FD相對(duì)于分割位置γ的圖。直方圖本身在圖12A中再現(xiàn)，垂直線標(biāo)記了γ的數(shù)值，此時(shí)FD有最大值。圖12B中由垂直線指示的FDmax的最大值是113.78。這一數(shù)值比由單峰分布估計(jì)的FDmax數(shù)值大得多，它本身極大地暗示了一種真正的雙峰分布。
為了給予由實(shí)際數(shù)據(jù)獲得的FDmax的數(shù)值一個(gè)量化的意義，把它與在單峰形態(tài)虛假說(shuō)下經(jīng)驗(yàn)性一產(chǎn)生的FDmax數(shù)值的分布相比較。更具體一些，使用實(shí)際數(shù)據(jù)的1000個(gè)Monte Carlo實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生單峰均勻分布、單峰三角分布(即從左到右陡升)，和單峰guasian分布的FDmax直方圖，每個(gè)實(shí)現(xiàn)中有100個(gè)直方圖元素，使用與圖6中實(shí)際數(shù)據(jù)直方圖相同的分辨率。對(duì)于單峰均勻分布這樣獲得的的FDmax數(shù)值直方圖顯示于圖13A中。對(duì)于單峰三角分布的FDmax數(shù)值直方圖顯示于圖13B中。雖然它們由形狀非常不同的分布產(chǎn)生，這兩個(gè)直方圖很相似，單峰Guassian分布(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)的結(jié)果也非常相似。另外，單峰分布的Monte Carlo結(jié)果也被發(fā)現(xiàn)對(duì)于元素?cái)?shù)目和二進(jìn)制分辨率(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)不敏感。
可能性數(shù)值P是觀察的FDmax數(shù)值真的來(lái)自單峰分布，它通過(guò)確定圖13A或13B中的FDmax數(shù)值的分?jǐn)?shù)進(jìn)行分析。即通過(guò)評(píng)估圖13A或13B中直方圖的面積相對(duì)于觀察的FDmax右側(cè)的分?jǐn)?shù)。具體地，圖13A的均勻分布用于評(píng)估P因?yàn)樗且环N有些較寬的分布，這樣能夠產(chǎn)生更加謹(jǐn)慎的可能性數(shù)值。圖12A-B中數(shù)據(jù)這樣獲得的可能性是P＜0.1％這樣數(shù)據(jù)實(shí)際上是雙峰而不是單峰的置信度被確定為1-P＞99.9％。
圖14B為圖8中的分布繪出了Fisher Distance相對(duì)于分割位置v的圖。圖8來(lái)自特異的ERG11蛋白微擾、分布本身在圖14A中再現(xiàn)，垂直線標(biāo)記了v的數(shù)值，此時(shí)FD有最大值。在這種情形下，F(xiàn)Dmax＜12，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于以上從FK506滴定雙峰分布確定的FDmax的數(shù)值。由ERG11蛋白微擾所獲得的FDmax數(shù)值與均勻單峰分布比較。該分布按上文的描述用實(shí)際數(shù)據(jù)的Monte Carlo實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生。由此確定的雙峰形態(tài)置信度僅為30％(P＝0.7)。這樣，在這一例子中，沒(méi)有雙峰形態(tài)的統(tǒng)計(jì)學(xué)證據(jù)。
最后，根據(jù)以上描述的用于FD506和ERG11特定微擾的方法還確定了圖10中分布的雙峰形態(tài)置信度。圖10來(lái)自特定HMG2蛋白微擾。該直方圖的雙峰形態(tài)置信度僅為10％，再次與這一單一蛋白微擾的預(yù)想一致。
7.引用的參考文獻(xiàn)本文所引用的參考文獻(xiàn)在此全文引入以供參考，類(lèi)似的，公開(kāi)出版物或?qū)＠驅(qū)＠暾?qǐng)也全文引入作參考。
在不偏離其精神和范圍的情況下，本發(fā)明可以做出許多修飾和變化。這里描述的特定方案僅作為實(shí)施例舉出，本發(fā)明僅受附加權(quán)利要求中術(shù)語(yǔ)的限制和使權(quán)利要求具有資格的等價(jià)物的全部范圍限制。
權(quán)利要求
1.在一種細(xì)胞類(lèi)型中鑒定一種藥物或藥物組合物的一個(gè)或多個(gè)初始靶標(biāo)的方法，該方法包括鑒定一個(gè)或多個(gè)表達(dá)組，其中(a)每個(gè)表達(dá)組包括多個(gè)細(xì)胞成分，每個(gè)細(xì)胞成分都有一個(gè)與藥物或藥物組合物相關(guān)的反應(yīng)濃度；(b)一個(gè)細(xì)胞成分的反應(yīng)濃度通過(guò)暴露于藥物或藥物組合物的特定水平確定，在該水平上，該細(xì)胞成分在藥物反應(yīng)中被藥物或藥物組合物激活或失活；和(c)藥物反應(yīng)通過(guò)一種方法提供，該方法包括在藥物或藥物組合物的多個(gè)暴露水平上測(cè)量該細(xì)胞類(lèi)型一個(gè)細(xì)胞中的多個(gè)細(xì)胞成分；其中每個(gè)表達(dá)組對(duì)應(yīng)于一個(gè)藥物或藥物組合物的初始靶標(biāo)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中一種細(xì)胞成分的反應(yīng)濃度是藥物或藥物組合物的暴露水平，在該水平上該細(xì)胞成分的藥物反應(yīng)的斜率絕對(duì)值最大。
3.權(quán)利要求1的方法，其中一種細(xì)胞成分的反應(yīng)濃度是藥物或藥物組合物的暴露水平，在該水平上該細(xì)胞成分的藥物反應(yīng)為其漸近值的一半。
4.權(quán)利要求1的方法，其中一種細(xì)胞成分的藥物反應(yīng)是用插值法求出的。
5.權(quán)利要求4的方法，其中一種細(xì)胞成分的藥物反應(yīng)通過(guò)曲線擬合用插值法求出的。
6.權(quán)利要求4的方法，其中一種細(xì)胞成分的藥物反應(yīng)通過(guò)對(duì)一個(gè)參數(shù)函數(shù)的模型擬合用插值法求出。
7.權(quán)利要求6的方法，其中參數(shù)函數(shù)是Hill函數(shù)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中一種細(xì)胞成分的反應(yīng)濃度是Hill函數(shù)的反應(yīng)點(diǎn)參數(shù)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中表達(dá)組是從多種細(xì)胞成分的反應(yīng)濃度的直方圖中鑒定出來(lái)，每個(gè)表達(dá)組對(duì)應(yīng)直方圖中的一個(gè)眾數(shù)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中直方圖中的眾數(shù)是通過(guò)對(duì)直方圖的視覺(jué)觀察鑒定出來(lái)的。
11.權(quán)利要求9的方法，其中直方圖中的眾數(shù)是通過(guò)對(duì)直方圖進(jìn)行對(duì)象統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)而鑒定出來(lái)的。
12.權(quán)利要求11的方法，其中對(duì)象統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)基于FisherDistance。
13.權(quán)利要求12的方法，其中基于Fisher Distance的對(duì)象統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)直方圖的雙峰形態(tài)。
14.權(quán)利要求13的方法，其中基于Fisher Distance的對(duì)象統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)包括確定直方圖的最大Fisher Distance，該最大值越高，則該直方圖為雙峰形態(tài)的置信度就越大。
15.權(quán)利要求14的方法，其中基于Fisher Distance的對(duì)象統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)進(jìn)一步包括確定直方圖雙峰形態(tài)的置信度，它通過(guò)一種方法確定，該方法包括比較確定的直方圖的最大Fisher Distance和單峰形態(tài)假設(shè)下的最大Fisher Distance數(shù)值的經(jīng)驗(yàn)分布。
16.權(quán)利要求15的方法，其中最大Fisher Distance數(shù)值的經(jīng)驗(yàn)分布是一種均勻分布。
17.權(quán)利要求15的方法，其中最大Fisher Distance數(shù)值的經(jīng)驗(yàn)分布是一種三角分布。
18.權(quán)利要求15的方法，其中最大Fisher Distance數(shù)值的經(jīng)驗(yàn)分布是一種Guassian分布。
19.權(quán)利要求15的方法，其中直方圖雙峰形態(tài)置信度進(jìn)一步由直方圖的確定最大Fisher Distance來(lái)自單峰分布的可能性確定。
20.權(quán)利要求19的方法，其中可能性是最大Fisher Distance數(shù)值經(jīng)驗(yàn)分布的分?jǐn)?shù)，該數(shù)值比確定的最大的Fisher Distance要大。
21.權(quán)利要求19或20的方法，其中直方圖雙峰形態(tài)的置信度是從總體中減去確定的直方圖最大Fisher Distance來(lái)自一個(gè)單峰分布的可能性。
22.權(quán)利要求12的方法，其中基于Fisher Distance的對(duì)象統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)多于雙峰形態(tài)的多峰形態(tài)水平。
23.權(quán)利要求22的方法，其中基于Fisher Distance的對(duì)象統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)包括(a)把直方圖分割成懷疑含有2個(gè)眾數(shù)的小間隔；和(b)測(cè)試直方圖小間隔的雙峰形態(tài)。
24.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞成份包括多種RNA種類(lèi)的豐度。
25.權(quán)利要求24的方法，其中通過(guò)一種方法測(cè)量一種細(xì)胞中的多種細(xì)胞成分，該方法包括使一個(gè)或多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄體陣列與如下物質(zhì)接觸(i)來(lái)自一種細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞的RNA或由其而來(lái)的cDNA，該細(xì)胞類(lèi)型暴露于藥物或藥物組合物暴露水平中，和(ii)來(lái)自一種細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞的RNA或由其而來(lái)的cDNA，該細(xì)胞類(lèi)型沒(méi)有暴露于藥物或藥物組合物暴露水平中。
26.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞成分包括多種蛋白種類(lèi)的豐度。
27.權(quán)利要求26的方法，其中多種蛋白種類(lèi)的豐度通過(guò)一種方法測(cè)量，該方法包括用來(lái)自一種細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞的蛋白接觸抗體陣列，其中抗體陣列包括一個(gè)附有抗體的表面，這些抗體能夠與多種蛋白類(lèi)結(jié)合。
28.權(quán)利要求26的方法，其中多種蛋白種類(lèi)的豐度通過(guò)一種方法測(cè)量，該方法包括對(duì)來(lái)自一種細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞的蛋白進(jìn)行二維電泳。
29.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞成分包括細(xì)胞類(lèi)型中存在的多種蛋白種類(lèi)的活性。
30.一種在一種細(xì)胞類(lèi)型中鑒定一種藥物或藥物組合物的一個(gè)或多個(gè)初始靶標(biāo)的方法，該方法包括(a)用一種方法提供藥物反應(yīng)，該方法包括在暴露于藥物或藥物組合物的多個(gè)水平下測(cè)量一種類(lèi)型細(xì)胞的多種細(xì)胞成分；(b)確定多種細(xì)胞成分中每種細(xì)胞成分的反應(yīng)濃度，它就是藥物或藥物組合物暴露水平，在該水平上，該細(xì)胞成分在藥物反應(yīng)中被激活或失活；和(c)鑒定細(xì)胞成分的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)組，每個(gè)表達(dá)組中細(xì)胞成分的反應(yīng)濃度簇集在一個(gè)特定的藥物或藥物組合物暴露水平附近；其中每個(gè)表達(dá)組對(duì)應(yīng)于藥物或藥物組合物的一個(gè)初始靶標(biāo)。
31.一種鑒定一種細(xì)胞類(lèi)型自然環(huán)境變化的一個(gè)或多個(gè)初始靶標(biāo)的方法，該方法包括鑒定一個(gè)或多個(gè)表達(dá)組，其中(a)每個(gè)表達(dá)組包括多種細(xì)胞成分，每個(gè)細(xì)胞成分都有一個(gè)與自然環(huán)境變化相關(guān)的反應(yīng)濃度；(b)每種細(xì)胞成分的反應(yīng)濃度是由自然環(huán)境變化的一個(gè)特定水平確定的，在該水平上細(xì)胞成分在反應(yīng)分布中由于自然環(huán)境的變化而被激活或失活；(c)反應(yīng)分布圖由一種方法提供，該方法包括在自然環(huán)境變化的多種水平上測(cè)量一種細(xì)胞類(lèi)型細(xì)胞的多種細(xì)胞成分；其中每個(gè)表達(dá)組對(duì)應(yīng)于自然環(huán)境變化的一個(gè)初始靶標(biāo)。
32.一種比較兩種或多種不同藥物或藥物組合物一或多個(gè)眾數(shù)的方法，該方法包括(a)根據(jù)權(quán)利要求1的方法鑒定每種藥物或藥物組合物的初始靶標(biāo)；和(b)比較鑒定出來(lái)的每種藥物或藥物組合物的初始靶標(biāo)。
33.權(quán)利要求32的方法，其中2種或多種藥物組合物被比較，該2種或多種藥物組合物包括同一藥物的不同組合。
34.一種用于在一種細(xì)胞類(lèi)型中鑒定一種藥物或藥物組合物的一個(gè)或多個(gè)初始靶標(biāo)的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，包括(a)一個(gè)處理器；(b)一個(gè)與處理器相連的存儲(chǔ)器；和(c)由存儲(chǔ)器編碼的一個(gè)或多個(gè)程序；該一個(gè)或多個(gè)程序?qū)е绿幚砥麒b定一個(gè)或多個(gè)表達(dá)組，其中(i)每個(gè)表達(dá)組包括多種細(xì)胞成分，每種細(xì)胞成分都有一個(gè)與藥物或藥物組合物相關(guān)的反應(yīng)濃度；(ii)每種細(xì)胞成分的反應(yīng)濃度是由暴露于藥物或藥物組合物的特定水平確定的，在該水平上細(xì)胞成分在藥物反應(yīng)中被藥物或藥物組合物激活或失活；和(iii)藥物反應(yīng)由一種方法提供，該方法包括在暴露于藥物或藥物組合物的不同水平上測(cè)量一種細(xì)胞類(lèi)型細(xì)胞中的多種細(xì)胞成分；其中每個(gè)表達(dá)組對(duì)應(yīng)于藥物或藥物組合物的一個(gè)初始靶標(biāo)。
35.權(quán)利要求34的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，該系統(tǒng)進(jìn)一步包含顯示反應(yīng)濃度的裝置。
36.權(quán)利要求34的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，該系統(tǒng)進(jìn)一步包含顯示表達(dá)組的裝置。
37.權(quán)利要求34的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其中反應(yīng)濃度可以在存儲(chǔ)器中獲得。
38.權(quán)利要求37的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，該系統(tǒng)進(jìn)一步包含把反應(yīng)濃度輸入存儲(chǔ)器的方法。
39.權(quán)利要求37的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其中反應(yīng)濃度由用戶(hù)加載到存儲(chǔ)器中。
40.權(quán)利要求34的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其中在存儲(chǔ)器編碼的一個(gè)或多個(gè)程序包括藥物反應(yīng)表示軟件。
41.權(quán)利要求34的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其中在存儲(chǔ)器中編碼的一種或多種程序包括軟件組件，它能從一個(gè)或多個(gè)藥物反應(yīng)確定反應(yīng)濃度。
42.權(quán)利要求34的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其中藥物反應(yīng)可在存儲(chǔ)器中獲得。
43.權(quán)利要求42的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，該系統(tǒng)進(jìn)一步包括把藥物反應(yīng)輸入存儲(chǔ)器的方法。
44.權(quán)利要求42的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其中藥物反應(yīng)由用戶(hù)加載到存儲(chǔ)器中。
45.權(quán)利要求42的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其中程序進(jìn)一步導(dǎo)致處理器確定藥物反應(yīng)的反應(yīng)濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)細(xì)胞中藥物作用的特征進(jìn)行描述的方法和系統(tǒng)。尤其是本發(fā)明提供了鑒定多個(gè)初始靶標(biāo)的方法,一種藥物、候選藥物或其它目標(biāo)化合物通過(guò)這些初始靶標(biāo)作用于細(xì)胞。這樣,本發(fā)明還有關(guān)于基于所公開(kāi)方法的藥物設(shè)計(jì)的方法,說(shuō)明方法用于鑒定一種藥物的多個(gè)初始靶標(biāo)。本發(fā)明的方法涉及:(ⅰ)測(cè)量細(xì)胞成分對(duì)于細(xì)胞梯度暴露于一種感興趣的藥物產(chǎn)生的反應(yīng)。(ⅱ)鑒定該藥物對(duì)于每種測(cè)量的細(xì)胞成分的“反應(yīng)濃度”;和(ⅲ)從反應(yīng)濃度的分布鑒定出細(xì)胞成分的“表達(dá)組”。每一個(gè)表達(dá)組對(duì)應(yīng)于該藥物的一個(gè)特定的初始靶標(biāo)。本發(fā)明還提供了計(jì)算機(jī)系統(tǒng),它能通過(guò)執(zhí)行所公開(kāi)的方法來(lái)鑒定一種藥物的多個(gè)靶標(biāo)。
文檔編號(hào)G01N37/00GK1328603SQ99813571
公開(kāi)日2001年12月26日 申請(qǐng)日期1999年9月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月23日
發(fā)明者S·H·弗里恩德, R·斯托頓 申請(qǐng)人:羅斯塔英法美蒂克斯公司