專利名稱：單克隆抗體、抗原和惡性疾病的診斷和治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單克隆抗體的新序列、與該單克隆抗體結(jié)合的抗原的肽序列，以及利用單克隆抗體和肽的診斷和治療方法。
背景技術(shù)：
公開號為No.WO95/20605，由申請人共同擁有的PCT專利申請公開了免疫刺激性單克隆抗體。該PCT申請的主題抗體針對B類淋巴母細胞而產(chǎn)生并表現(xiàn)出具有免疫刺激的效果。當(dāng)向發(fā)生腫瘤的動物體內(nèi)注射時，發(fā)現(xiàn)這些抗體也具有引發(fā)抗腫瘤的效果。
在目前的醫(yī)療程序下，對癌癥的診斷一般是一個涉及身體檢查、使用不同的成像技術(shù)、使用不同的癌癥標(biāo)示物等的多步驟程序。在癌癥的診斷技術(shù)領(lǐng)域一直有一個長期的需求，即能夠檢查出癌癥并確定被檢查的人員所患癌癥的種類。
發(fā)明的總體描述本發(fā)明的基礎(chǔ)是發(fā)現(xiàn)了針對類淋巴母細胞的單克隆抗體的序列。本發(fā)明的另一個基礎(chǔ)是發(fā)現(xiàn)了這些抗體同癌癥病人的T細胞的結(jié)合水平與同健康人的T細胞的結(jié)合水平不同(更高或更低)。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了具有可變區(qū)的單克隆抗體，其選自(a)其重鏈可變區(qū)包括

圖1所示氨基酸序列的單克隆抗體；(b)其κ輕鏈可變區(qū)包括圖2所示氨基酸序列的單克隆抗體；(c)其重鏈可變區(qū)包括圖1所示氨基酸序列且κ輕鏈可變區(qū)包括圖2所示氨基酸序列的單克隆抗體；
(d)其重鏈可變區(qū)與圖1所示氨基酸序列具有至少70％同一性的單克隆抗體；(e)其輕鏈可變區(qū)與圖2所示氨基酸序列具有至少70％同一性的單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“抗體”是指IgG、IgM、IgD、IgA和IgE類中的任何一類的單克隆抗體。該術(shù)語是指完整抗體或包括抗體的抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段，例如缺少Fc部分的抗體、單鏈抗體、基本上僅包括抗體的可變抗原結(jié)合區(qū)的節(jié)(article)片段等。
此外，本發(fā)明還涉及與抗原結(jié)合的抗體，上述單克隆抗體中任何一種特異性地與該抗原結(jié)合，即與上述抗體具有交叉反應(yīng)性的抗體。
按照本發(fā)明的一個實施方案，所述單克隆抗體是一個嵌合的人-鼠抗體，即具有人源恒定區(qū)和鼠源可變區(qū)的單克隆抗體(mAb)。出于此種目的，本發(fā)明單克隆抗體的κ輕鏈和重鏈的可變區(qū)以PCR法克隆并測定其DNA序列。按照本發(fā)明的另一個實施方案，抗體是一個完全人源化抗體，即其可變區(qū)和恒定區(qū)均取自人。
“具有至少X％同一性”術(shù)語是指當(dāng)對序列進行最佳對比時，在兩個對比序列中相同的氨基酸殘基的比例。因此，70％氨基酸序列同一性是指在兩個或多個最佳對比的多肽序列中有70％的氨基酸是相同的。優(yōu)選同一性為80％，最優(yōu)選為90％。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個方面，提供了產(chǎn)生本發(fā)明的任何單克隆抗體的鼠雜交瘤細胞系。雜交瘤可以由本領(lǐng)域中的任何已知技術(shù)制備(例如，Kohler，G.和Milstein，C.，Nature，256495-497，(1975))。雜交瘤細胞系的上清液一般通過本領(lǐng)域的任何已知的方法篩選其抗體結(jié)合活性，例如酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)或放射免疫測定法(RIA)。篩選上清液以制備單克隆抗體，該單克隆抗體同本發(fā)明的任何肽鏈(如下文說明)結(jié)合或同與之結(jié)合的細胞，例如Daudi細胞或T淋巴細胞相結(jié)合。
編碼上述單克隆抗體的重鏈或輕鏈的任何氨基酸序列的DNA序列也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。毫無疑問，本領(lǐng)域的任何熟練技術(shù)人員都清楚，由于遺傳密碼的退化性狀，多數(shù)核酸序列可編碼本發(fā)明的單克隆抗體，除了圖1或2所示的那些。
本發(fā)明還提供了例如具有所述DNA序列的質(zhì)粒的表達載體以及包含一個或多個所述表達載體的宿主細胞。
按照本發(fā)明的另外一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的單克隆抗體能夠與之結(jié)合的B細胞抗原的肽序列。針對非冗余基因庫數(shù)據(jù)庫和EST分區(qū)所實施的檢索表明該肽序列是新的。
按照本發(fā)明的這一方面，本發(fā)明提供了選自下述的肽(a)具有圖10所示的氨基酸序列的肽；(b)具有圖11所示的氨基酸序列的肽；(c)具有圖12所示的氨基酸序列的肽；(d)與上述(a)、(b)和(c)肽的氨基酸序列的任何一個具有至少85％同一性的肽；(e)包括一個或多個上述(a)-(d)肽鏈的蛋白質(zhì)或肽。
本發(fā)明的肽可以用于不同的診斷分析，例如競爭性免疫分析，該分析可以確定本發(fā)明的單克隆抗體與存在于T細胞上的其天然抗原的結(jié)合水平。此外，該肽可以用于在免疫動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體，然后該抗體可以被用于上文或下文所描述的任何一種功能。
所有上述肽的類似物也形成了本發(fā)明的另外一個方面。正如精通本領(lǐng)域的人員所理解的，可以改變本發(fā)明的肽的氨基酸序列，例如，通過一個或多個氨基酸的添加、缺失或者保守或非保守替換進行，而不會對肽抗體的結(jié)合性能產(chǎn)生實質(zhì)性的改變。
術(shù)語“保守替換”是指一種類型的氨基酸被同種類型的氨基酸所替換，其中類型由氨基酸側(cè)鏈的普通生理化學(xué)性質(zhì)和在自然界中發(fā)現(xiàn)的同源蛋白質(zhì)的高替換頻率所限定，例如通過標(biāo)準(zhǔn)Dayhoff頻率交換基質(zhì)或BLOSUM基質(zhì)確定。已表征了六種氨基酸側(cè)鏈基本類型，包括類型I(半胱氨酸)；類型II(絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸)類型III(天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸)；類型IV(組氨酸、精氨酸、賴氨酸)；類型V(異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、Met)；以及類型VI(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)。例如，以類型III中的其他氨基酸殘基如天冬酰胺、谷氨酰胺或谷氨酸替換天冬氨酸即為保守替換。術(shù)語“非保守替換”是指以一種類型中的氨基酸替換另一種類型中的氨基酸；例如，以類型III中的氨基酸殘基，如天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺替換類型II中的氨基酸殘基丙氨酸。
上文(以及下文)所使用的用于指示特定氨基酸(aa)的字母符合由IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission所推薦的單字母氨基酸符號。
落入本發(fā)明范圍的上述肽的類似物與如圖10-12所示的肽具有實質(zhì)上相同的與本發(fā)明的單克隆抗體結(jié)合的水平。結(jié)合水平可以以本領(lǐng)域的任何已知的方式確定。
本發(fā)明的肽和類似物也可以進行化學(xué)修飾，此種經(jīng)化學(xué)修飾的肽和類似物也是本發(fā)明的組成部分。術(shù)語“化學(xué)修飾”是指其中至少一個氨基酸殘基通過自然過程如加工或其他翻譯后修飾，或者通過本領(lǐng)域中已知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾的蛋白質(zhì)。在許多已知的修飾中，典型但并不排他的修飾包括乙?；?、酰化、酰胺化、ADP-核糖基化、糖基化、GPI錨形成、與液體或脂質(zhì)衍生物的共價連接、甲基化、十四烷基化、pegylation、異戊二烯基化、磷酸化、遍在蛋白化或任何類似過程。
本發(fā)明所基于的第二個發(fā)現(xiàn)是本發(fā)明的單克隆抗體與取自惡性疾病病人的T細胞的結(jié)合程度和與取自健康人體的T細胞的結(jié)合程度不同。
因此，本發(fā)明的另外一個方面提供了用于識別很可能患有惡性疾病的被檢查人員的檢查方法，包括(a)從被檢查人員獲得體液樣品；(b)將上述樣品與本發(fā)明的至少一種單克隆抗體接觸；(c)確定上述單克隆抗體與上述樣品中的T細胞的結(jié)合程度；以及(d)將(c)項中的結(jié)合程度和本發(fā)明的單克隆抗體與取自健康個體的樣品中的T細胞的結(jié)合程度進行對比；上述兩項結(jié)合程度的顯著差異表明該被檢查人員是很可能患有惡性疾病的。
根據(jù)本發(fā)明，取自被檢查個體的樣品可以是包括可檢測數(shù)量的T細胞的任何體液。典型地，體液樣品是血液樣品或淋巴液樣品。優(yōu)選在將本發(fā)明的單克隆抗體與所取得的樣品接觸前，通過一種本領(lǐng)域中已知的方法，例如Ficoll Hypaque密度離心法將樣品中的外周血單核細胞(PBMC)分離出去，分離出來的細胞然后被用于與檢測抗體的接觸。
本發(fā)明中的術(shù)語“惡性疾病”應(yīng)理解為本領(lǐng)域已知的處于任何階段的任何種類的惡性疾病。
該術(shù)語也包括處于其早期階段，尚未表現(xiàn)出臨床癥狀的惡性疾病。該術(shù)語優(yōu)選指的是實體腫瘤。
術(shù)語“健康個體”是指沒有患上惡性疾病的人，也可以指幾個個體的平均水平，或者指將取自幾個個體的體液進行混合后得到的水平。應(yīng)該注意的是，一旦建立起健康個體結(jié)合程度的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)，則沒有必要為每一次檢查重新建立該標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)，并可以連續(xù)使用已建立的數(shù)據(jù)。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)在健康個體中，大約25％的CD3+T細胞與本發(fā)明的抗體結(jié)合。
術(shù)語“很可能”系指本發(fā)明的檢查是一種能夠識別出懷疑患有惡性疾病的個體的初步篩選檢查。通過本發(fā)明的方法所檢查的個體確實患有惡性疾病的事實還需要通過本領(lǐng)域已知的其他技術(shù)在以后證實。
術(shù)語“結(jié)合程度”涉及抗體與被檢查個體的T細胞上存在的抗原的結(jié)合水平，該程度可以通過本領(lǐng)域中已知的確定抗體的結(jié)合水平的任何方法確定，例如ELISA或Western Blotting?？梢允褂萌魏螜z測系統(tǒng)確定結(jié)合程度，例如使用與一種可檢測的標(biāo)記物連接的抗小鼠免疫球蛋白或其片段。此類可檢測的標(biāo)記物的例子是放射性基團、發(fā)熒光的基團、能夠催化產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物的反應(yīng)(例如一種顏色反應(yīng))的酶、能夠通過抗生物素蛋白被檢測到的生物素基團等。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的單克隆抗體與T細胞的結(jié)合程度通過一種雙重標(biāo)記的方式測定，其中在抗T細胞抗體(例如，抗-CD3+抗體)上連接一種發(fā)熒光的標(biāo)記物，在本發(fā)明的單克隆抗體上連接另一種發(fā)熒光的標(biāo)記物。然后使用熒光素活化細胞分選儀(FACS)確定結(jié)合程度。結(jié)合程度的定量通過確定CD3+T細胞的百分比得到(由其與抗CD3+抗體的結(jié)合確定)，所述T細胞也與本發(fā)明的單克隆抗體相結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)在患有惡性疾病的個體的血液樣品中的CD3+細胞的總數(shù)與取自健康個體的血液樣品的CD3+細胞的總數(shù)類似，因此，使用患有惡性疾病的個體和健康的個體中CD3+結(jié)合性T細胞的總數(shù)對單克隆抗體和CD3+T細胞二者的結(jié)合程度進行標(biāo)準(zhǔn)化均是有效的。然而，在患有惡性疾病的個體中CD3+結(jié)合性T細胞(該T細胞也與本發(fā)明的單克隆抗體結(jié)合，以下稱“CD3+mAb細胞”)的百分比與健康個體血液中的CD3+mAb+細胞百分比有顯著差異?；加袗盒约膊〉膫€體中的CD3+mAb細胞的百分比可能顯著高于或顯著低于健康個體中的CD3+mAb+細胞百分比，這取決于惡性疾病的類型。
當(dāng)如由在此所提到的實驗方法獲得的結(jié)果連同本領(lǐng)域中任何已知的統(tǒng)計方法(例如，斯氏t檢驗)所確定的，本發(fā)明的單克隆抗體與取自被檢查個體的T細胞的結(jié)合程度和與取自健康個體的T細胞的結(jié)合程度相比在統(tǒng)計學(xué)上存在顯著程度的差異時，則認為所述單克隆抗體的結(jié)合程度之間存在“顯著差異”。
本發(fā)明不但能夠識別很可能患有任何類型的惡性疾病的個體(其中，患病個體的T細胞與本發(fā)明的單克隆抗體的結(jié)合程度與健康個體相比是不同的)，而且能夠通過確定上述結(jié)合程度比健康個體中相應(yīng)的結(jié)合程度高或低而幫助識別患有特定類型的癌癥的個體。
典型地，本發(fā)明的單克隆抗體與取自健康個體的T細胞的結(jié)合百分比在大約25％的范圍，即，表達CD3+T細胞標(biāo)記物的細胞中的25％(由抗CD3+抗體與細胞的結(jié)合確定)也與本發(fā)明的單克隆抗體結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明，已表明在取自前列腺癌癥病人的樣品中，與本發(fā)明的單克隆抗體結(jié)合的CD3+T細胞的百分比在約50％的范圍內(nèi)。
還進一步表明，當(dāng)CD3+T細胞來自取自結(jié)腸或乳腺癌病人樣品時，與本發(fā)明的單克隆抗體結(jié)合的細胞百分比分別是約7％和10％。
因此，根據(jù)本發(fā)明，使用以本發(fā)明的單克隆抗體與體液樣品中的CD3+細胞的結(jié)合程度作為基礎(chǔ)的簡單且單一的檢查即有可能確定在取自被檢查個體的體液樣品中很可能存在特定類型的癌。本發(fā)明診斷方法的簡易性，即僅需要使用一種單克隆抗體來識別患有某一類型的癌癥的個體，對于人群的大范圍篩查是非常有用的。
因此，本發(fā)明的另一個方面提供了一種識別很可能患有特定惡性疾病的被檢查個體的分析方法，包括(a)從上述個體中取得體液樣品；(b)將上述樣品與本發(fā)明的單克隆抗體接觸；(c)確定上述單克隆抗體與上述樣品中的T細胞的結(jié)合程度；和(d)將(c)項中所獲得的細胞結(jié)合程度和單克隆抗體與取自健康個體的T細胞的結(jié)合程度進行對比，在結(jié)合程度上存在顯著差異表明被檢查個體很可能患有一種惡性疾病，其中單克隆抗體與取自上述個體的T細胞的結(jié)合程度高于或低于與取自健康個體的T細胞的結(jié)合程度表明被檢查個體很可能患有一種特定類型的惡性疾病。
特別地，當(dāng)與本發(fā)明的單克隆抗體的結(jié)合程度顯著高于健康個體中的結(jié)合程度時，被檢查個體很可能患有前列腺癌。
當(dāng)結(jié)合水平顯著低于健康個體時，被檢查個體很可能患有結(jié)腸癌或乳腺癌。
根據(jù)本發(fā)明的診斷方面，包括本發(fā)明的單克隆抗體的組合物可以被用于識別很可能患有一種惡性疾病(通常意義)的個體或被用于識別該個體可能患的特定惡性疾病的診斷。因此，本發(fā)明的另一個方面提供了包括屬于至少一種上文所提到的抗體的單克隆抗體及適當(dāng)?shù)妮d體的診斷組合物。載體可以是可溶性載體，例如本領(lǐng)域中已知的任何一種生理上可以接受的緩沖液(例如，PBS)，也可以是固態(tài)的載體，例如乳膠珠。
本發(fā)明還提供了試劑盒，例如使用本發(fā)明的單克隆抗體并進行上文所公開的診斷分析的診斷分析試劑盒。在一個實施方案中，診斷試劑盒通常包括在一個或多個容器中的至少一種上述單克隆抗體，單克隆抗體的特定結(jié)合配偶體的偶聯(lián)物(例如本發(fā)明的抗原或類似物)，能夠產(chǎn)生可測信號的標(biāo)記物以及使用指南。根據(jù)推理，標(biāo)記物可以與單克隆抗體結(jié)合，或者，標(biāo)記物可以與載體分子結(jié)合，載體分子再與單克隆抗體特異性地結(jié)合。被測試樣品與診斷試劑組分的溫育時間應(yīng)足以使單克隆抗體與細胞結(jié)合。
本發(fā)明的另一個方面提供了藥物組合物，其組分包括作為活性組分的本發(fā)明的一種或多種單克隆抗體。上述單克隆抗體在制備用于治療個體的不同惡性疾病的藥物制劑中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
本發(fā)明的另一個方面涉及一種通過向需要的個體給予治療有效量的上述單克隆抗體而對惡性疾病進行治療的治療方法。治療有效量是指能夠減輕惡性疾病的癥狀、減少或完全消除癥狀的量。
包括本發(fā)明的肽的藥物組合物也構(gòu)成了本發(fā)明的一個方面。該藥物組合物可以用于，例如刺激個體的免疫功能以獲得抗體，然后該抗體與個體的T細胞結(jié)合并誘發(fā)個體的免疫應(yīng)答。本發(fā)明內(nèi)容的詳細描述下面將在隨時引用附圖的情況下描述本發(fā)明的主要方面。在下面的描述和附圖中，術(shù)語“BAT抗體”將與術(shù)語“本發(fā)明的單克隆抗體”交互使用。
對附圖的簡要說明圖1表示本發(fā)明的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的DNA和肽序列；圖2表示本發(fā)明的單克隆抗體的κ輕鏈可變區(qū)的DNA和肽序列；圖3是對本發(fā)明的抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列分析(標(biāo)為“BAT”，“BAT”限定了BAT抗體VH區(qū)的氨基酸序列，而“VMS2”限定了種系VMS2/VGK4的種系基因的氨基酸序列。當(dāng)BAT序列與種系序列相同時，種系序列以點(.)代替；當(dāng)發(fā)生錯配時，標(biāo)明不同的種系殘基。下面的表及后續(xù)頁中的序列描述了在Kabat等人的Sequences ofproteins of immunological interest(1991)所述的小鼠重鏈亞型雜集(小鼠VHMisc.)及更大的全部已知的小鼠VH序列數(shù)據(jù)庫中在特定的殘基位置觀察到的特定氨基酸的出現(xiàn)頻率)；圖4是對本發(fā)明的抗體的κ輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列分析(在圖中標(biāo)為“BAT”)?！靶∈蟆毕薅薆AT抗體Kκ區(qū)的氨基酸序列，而“種系”限定了種系H4種系基因的氨基酸序列。當(dāng)BAT序列與種系序列相同時，種系序列以點(.)代替；當(dāng)發(fā)生錯配時，標(biāo)明不同的種系殘基。下面的表及后續(xù)頁的內(nèi)容描述了在Kabat小鼠重鏈亞型VI(小鼠VκVI)及更大的全部已知的鼠Vκ序列所有小鼠Vκ數(shù)據(jù)庫中在特定的殘基位置觀察到的特定氨基酸的出現(xiàn)頻率；圖5表示本發(fā)明嵌合抗體的κ輕鏈可變區(qū)的DNA和肽序列；圖6表示本發(fā)明嵌合抗體的重鏈可變區(qū)的DNA和肽序列；圖7是對用于表達本發(fā)明嵌合抗體的κ輕鏈的pKN 110哺乳動物表達載體的示意性描述；圖8是對用于表達本發(fā)明嵌合抗體的重鏈的pG1D 110哺乳動物表達載體的示意性描述；圖9是對以ELISA分析法對鼠和本發(fā)明的γ1/κ嵌合抗體與Daudi細胞的結(jié)合特性的測定結(jié)果的一個例子的圖示；圖10表示本發(fā)明的肽1的氨基酸序列；圖11表示本發(fā)明的肽2的氨基酸序列；圖12表示本發(fā)明的肽3的氨基酸序列；圖13是對以FACS分析法確定的在取自健康個體的血液樣品中，與本發(fā)明的單克隆抗體(以“BAT”表示)結(jié)合的CD3+細胞占CD3+細胞總數(shù)的百分比的示意性描述；圖14表示以FACS分析法確定的在取自患有結(jié)腸癌的病人的血液樣品中，與本發(fā)明的單克隆抗體(以BAT表示)結(jié)合的CD3+占CD3+細胞總數(shù)的百分比；
圖15表示在取自乳腺癌的病人的血液樣品中，與本發(fā)明的單克隆抗體(以BAT表示)結(jié)合的CD3+細胞占CD3+細胞總數(shù)的百分比；圖16表示在取自前列腺癌的病人的血液樣品中，與本發(fā)明的單克隆抗體(以BAT表示)結(jié)合的CD3+細胞占CD3+細胞總數(shù)的百分比；圖17表示與乳腺癌、結(jié)腸癌或前列腺癌病人相比，在健康個體中，與本發(fā)明的單克隆抗體(以BAT表示)結(jié)合的CD3+細胞平均百分比的圖示；圖18是取自前列腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、乳腺癌病人T細胞或取自Daudi細胞的膜的肽的蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)的照片。將印跡與本發(fā)明的單克隆抗體溫育，表明取自前列腺癌病人的T細胞中的抗原數(shù)量增加，而取自乳腺癌病人的T細胞的抗原水平檢測不到。
I.單克隆抗體的測序(A)縮寫胎牛血清(FCS)；核糖核酸(RNA)；信使RNA(mRNA)；脫氧核糖核酸(DNA)；復(fù)本DNA(cDNA)；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)；分鐘(min)；秒(sec)；Tris-硼酸鹽緩沖液(TBE)。(B)原料培養(yǎng)基成分及所有其他組織培養(yǎng)材料取自Life Technologies(UK)。RNA分離試劑盒取自Sratagene(USA)，而cDNA的第一條鏈合成試劑盒從Pharmacia(UK)購買。包括AmpliTaqDNA聚合酶在內(nèi)的所有PCR反應(yīng)組分和設(shè)備均向Perkin Elmer(USA)購買。TA Cloning試劑盒獲自Invitrogen(USA)。瓊脂糖(UltraPureTM)來自Life Technologies(UK)。Thermo SequencesTM預(yù)混合循環(huán)測序試劑盒及Vistra 725 DNA測序儀均購自Amersham(UK)。所有其他分子生物學(xué)產(chǎn)品均來自New England Biolabs(USA)。(C)實驗技術(shù)PCR克隆及小鼠BAT抗體可變區(qū)基因的克隆和測序?qū)⑿∈驜AT雜交瘤細胞系和Daudi細胞系成功地轉(zhuǎn)移至MRC-CC，兩種細胞系均在懸浮液中生長，懸浮液使用RPMI(不含谷氨酰胺)并添加10％(v/v)FCS，100單位/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉和12.5單位/ml制霉菌素。
收獲BAT雜交瘤細胞系的大約108個活細胞，按照制造商的指示使用RNA分離試劑盒將總RNA從這108個細胞中分離出來。試劑盒使用如Chromczynski和Sacchi在Anal.Biochem.，162156，1987中所描述的硫氫酸胍苯酚-氯仿單步驟提取程序。仍然按照制造商的指示，利用第一條鏈cDNA合成試劑盒，使用試劑盒所提供的NotI-(dT)18引物產(chǎn)生BAT雜交瘤mRNA的單鏈DNA拷貝。在每33μl最終反應(yīng)體積中使用大約5μg總RNA。然后將最終反應(yīng)混合物在90℃加熱5分鐘，以使RNA-cDNA雙鏈體變性并使反轉(zhuǎn)錄酶失活，然后在冰上冷卻。
為PCR擴增來自雜交瘤細胞系的小鼠重鏈可變區(qū)基因(VH基因)及小鼠κ輕鏈可變區(qū)基因(Vκ基因)，使用Jones和Bendig在Bio/Technology，98，1987中所描述的方法。實質(zhì)上，使用兩組簡并引物，一組設(shè)計用于和小鼠重鏈基因的前導(dǎo)序列(即MHV1-12；表1)退火，另一組設(shè)計用于和小鼠輕鏈基因的前導(dǎo)序列(即MKV1-11；表2)退火，它們與設(shè)計用于和合適的恒定區(qū)基因的5’端退火的引物一起用于PCR克隆鼠可變區(qū)基因。
在特殊的PCR-室(PCR-room)中使用為盡可能減少交叉污染的可能而特別設(shè)計的程序，用其合適的恒定區(qū)引物準(zhǔn)備針對每種簡并引物的單獨PCR反應(yīng)。在各種情況下，使用AmplitaqDNA聚合酶擴增模板cDNA。然后將PCR反應(yīng)管放入Perkin Elmer 480 DNA循環(huán)變熱加溫器中進行每次94℃下1分鐘和72℃下1分鐘的循環(huán)加溫，循環(huán)25次(在最初以94℃解鏈1.5分鐘之后)。在最后一個循環(huán)完成時，在72℃下實施最后的延伸步驟10分鐘，然后將反應(yīng)物冷卻至4℃。除在退火(50℃)和延伸步驟(72℃)之間使用的持續(xù)的間隔時間(ramp time)為2.5分鐘之外，在每個循環(huán)步驟之間應(yīng)用30秒的間隔時間。
取自每個PCR反應(yīng)的10μl等份樣品在1％的瓊脂糖/TBE(pH8.8)膠上走柱，以確定哪個反應(yīng)產(chǎn)生了合適大小的PCR-產(chǎn)物。那些看起來確實擴增了全長可變區(qū)基因的PCR反應(yīng)被重復(fù)進行，以產(chǎn)生獨立的PCR克隆并因此減少PCR-錯誤的效果。那些適當(dāng)大小的PCR產(chǎn)物的1-6μl等分樣品被直接克隆至TA Cloning試劑盒所提供的pCRIITM載體中，并按照制造商的指示轉(zhuǎn)化至INAαF’感受態(tài)細胞中。按照Güssow和Clackson在Nucleic Acid Res.，174000，1989中的方法使用下面的表3所示的pCRII正向和pCRII反向的寡核苷酸引物對集落進行PCR篩選，從而識別含有具有適當(dāng)大小的插入子的質(zhì)粒的集落。
那些所識別的假定的陽性克隆是雙鏈質(zhì)粒DNA，使用Vistra DNA測序儀以及按照制造商的說明書的描述使用Thermo SequenaseTM預(yù)混合循環(huán)測序試劑盒對其進行了測序。實施例1BAT抗體重鏈可變區(qū)的克隆和測序如同所有人源化的項目，采用嚴格的PCT克隆和測序程序。這樣做是為了盡可能降低向來自BAT雜交瘤細胞系的鼠VH可變區(qū)基因的野生型序列引入錯誤的可能。只有在來自至少兩個不同的來自表達鼠BAT抗體的雜交瘤細胞系的VH基因克隆的所有DNA序列數(shù)據(jù)均完美地匹配時，該基因序列才被作為正確的序列接受。
對來自不同的總RNA制劑和后續(xù)第一鏈cDNA合成反應(yīng)的三種單獨的PCR產(chǎn)物，進行PCR克隆并在兩條鏈上進行完全的DNA測序。雖然測試了全部12個重鏈引物(表1)，只有MHV9引物(與MHCG3一起被設(shè)計用于小鼠γ3重鏈基因的CH1域的退火)得以PCR擴增，得到一種大約為460bp的產(chǎn)物，然后將其TA-克隆進pCRIITM克隆載體(未列數(shù)據(jù))。
對分別來自三種PCR產(chǎn)物(每種產(chǎn)物來自不同的第一鏈合成反應(yīng)和后續(xù)的PCR反應(yīng))的幾個單獨的克隆的DNA序列分析最終確定了BAT抗體重鏈可變區(qū)的序列，如圖1所示。這一序列在所研究的全部三種PCR克隆中的DNA雙鏈上得到證實。實施例2BAT抗體的κ輕鏈可變區(qū)的克隆和測序使用一系列κ輕鏈簡并引物使通過第一鏈合成反應(yīng)產(chǎn)生的單鏈cDNA模板得到PCR擴增(下文的表2)。然而，這導(dǎo)致來自不止一種簡并引物的PCR產(chǎn)物被擴增，表明不止一個可變區(qū)基因至少通過雜交瘤細胞系被轉(zhuǎn)錄。
首先，當(dāng)MKV2引物(與MKV系列引物一樣與信號肽κ輕鏈的DNA序列5’端退火)和MKC(設(shè)計用于與小鼠κ恒定區(qū)基因5’端退火)一起使用時，觀察到一種PCR產(chǎn)物。以前的內(nèi)部實驗告訴我們MKV2引物會PCT擴增一種異常的mRNA轉(zhuǎn)錄物。這種異常的假基因出現(xiàn)在衍生自原始的MOPC-21漿細胞瘤細胞系的所有標(biāo)準(zhǔn)的融合配偶體中，并被稱為MOPC-21(Deyev，S.M.等人，Genetica，8545，1991)。NO-0是一種衍生自MOPC-21系的細胞系，正是這一細胞系被作為用于產(chǎn)生BAT雜交瘤的融合配偶體。因此，當(dāng)使用MKV2引物時觀察到PCR產(chǎn)物并不希奇。分析這一產(chǎn)物，表明其是非功能性假基因(未列舉數(shù)據(jù))。
奇怪的是，以前被認為被相關(guān)的細胞系NS-1(Hamlyn，P.H.，等人，Nucl.Acis.，Res.，94485，1981)所分泌并在同時使用MKV7引物和MKC引物時正常PCR克隆的另一種假基因在目前已分析的任何PCR產(chǎn)物中均沒有觀察到。由于NS-1和NS-0細胞系具有高度的相關(guān)性，這就有一點奇怪。然而，這也表明存在于BAT雜交瘤細胞系中的κ輕鏈轉(zhuǎn)錄的混亂性。
最終成為BAT抗體的Vκ基因的另外一種PCR克隆，利用MKV5引物和MKC引物也被從BAT雜交瘤細胞系成功地PCR擴增。隨著大約450bp產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到INVαF’感受態(tài)細胞中，使用PCR篩選分析識別出推定的陽性轉(zhuǎn)化體，然后對其DNA測序。
根據(jù)對MKV5產(chǎn)物的兩個單獨的克隆(每種來自不同的第一鏈合成反應(yīng)和后續(xù)PCR反應(yīng))的序列分析，確定了BAT抗體κ輕鏈可變區(qū)基因的DNA序列(圖2)。這一序列被又一次在每個克隆中的兩條DNA鏈上證實。實施例3鼠BAT抗體可變區(qū)的序列分析將BAT Vκ和VH區(qū)的氨基酸序列與在Kabat(Supra)數(shù)據(jù)庫中所示的鼠可變區(qū)亞型的共有序列進行比較。通過這種分析，發(fā)現(xiàn)BAT VH區(qū)與小鼠κ亞型VI的共有序列最匹配。對BAT VH區(qū)與Kabat數(shù)據(jù)庫的類似比較發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出與小鼠重鏈亞型“雜集”的共有序列的最佳匹配。
將上述BAT抗體的可變區(qū)序列與鼠種系數(shù)據(jù)庫比較，發(fā)現(xiàn)與BATVH基因最近的種系基因是VMS/VGK4(圖3)，而與BAT Vκ基因最近的種系基因是H4(圖4)。正如圖3所示，發(fā)生在BAT VH基因與其最近的種系基因之間的錯配毫不奇怪地主要位于CDR2和CDR3。只有三處構(gòu)架改變，均位于FR3。關(guān)于BAT Vκ基因(圖4)，仍然毫不奇怪的是，多數(shù)錯配均位于CDR。四種位于FR的改變，除在FR3的第72位點(Kabat編號)的半胱氨酸外均為高度保守性的改變。其緊鄰著一個重要的規(guī)范殘基(第71位點)的位置表明半胱氨酸可能在抗原的結(jié)合中扮演著重要的角色。然而，只有通過模擬Fv域，這一假定才會被澄清。
盡管如此，這些分析仍然證實小鼠BAT可變區(qū)的VH和Vκ區(qū)是典型的小鼠可變區(qū)的代表。
表1用于克隆BAT重鏈可變區(qū)基因的PCR引物名稱 序列(5’→3’)MHV5a(30聚體)ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTTMHV9a(30聚體)ATGGATTGGGTGTGGACCTTGCTATTCCTGC AMHCG3b(21聚體) CAAGGGATAGACAGATGGGGCa MHV表示與小鼠重鏈可變區(qū)基因的前導(dǎo)序列雜交的引物。
b MHCG表示與小鼠恒定區(qū)基因雜交的引物。表2用于克隆BATκ輕鏈可變區(qū)基因的PCR引物名稱 序列(5’→3’)MKV2a(30聚體) ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGT TMKV5a(30聚體) ATGGATTTTCAGGTGCAGATTATCAGCTTCA TMKV6a(30聚體) ATGAGGTGCCCTGTTCAGTTCCTGGGGT TT C G C T AMKV11a(30聚體) ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCMKCb(20聚體) ACTGGATGGTGGGAAGATGGaMKV表示與小鼠κ輕鏈可變區(qū)基因的前導(dǎo)序列雜交的引物bMKC表示與小鼠κ輕鏈恒定區(qū)基因雜交的引物。表3用于PCR篩選轉(zhuǎn)化集落的引物名稱 序列(5’→3’)pCRII正向引物(18聚體)C T A G A T G C A T G C T C G A G CpCRII反向引物(21聚體)T A C C G A G C T C G G A T C C A C T A GII.本發(fā)明嵌合抗體的構(gòu)建和表達(A)縮寫使用了下列非國際標(biāo)準(zhǔn)單位的單位和其他縮寫聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)；脫氧核糖核酸(DNA)；復(fù)本DNA(cDNA)；κ輕鏈可變區(qū)(Vκ)；重鏈可變區(qū)(VH)；分鐘(min)；Tris-硼酸鹽緩沖液(TBE)；磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)；室溫(RT)；牛血清白蛋白(BSA)；鹽酸(HCl)；辣根過氧化物酶(HRP)；低脂牛奶(LFM)；小時(hr)；百分比(％)；鄰苯二胺二鹽酸(OPD)；多克隆位點(MCS)。(B)原料培養(yǎng)基成分及所有其他組織培養(yǎng)材料取自Life Technologies(UK)。包括AmpliTaqDNA聚合酶在內(nèi)的PCR反應(yīng)組分購自PerkinElmer(USA)。TA Cloning試劑盒及INVαF’感受態(tài)細胞來自Invitrogen(USA)。DH5α感受態(tài)細胞和瓊脂糖(UltraPureTM)來自Life Technologies(UK)。Thermo SequenaseTM預(yù)混合循環(huán)測序試劑盒及Vistra 725 DNA測序儀均購自Amersham(UK)。用于ABI Prism 310Genetic Analyzer的Big DyeTMTerminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit購自PE Applied Biosystems(UK)。所有其他提到的分子生物學(xué)產(chǎn)品均來自New England Biolabs(USA)或Promega(USA)。Nunc-Immuno Plate MaxiSorpTM免疫板購自Life Technologies(UK)，而Coming易清洗ELISA板購自Coming Laboratory Sciences Company(UK)。山羊抗人IgG(Fcγ片段特異性)抗體、山羊抗人κ輕鏈/HRP偶聯(lián)物以及AffinPure山羊抗人IgG(Fcγ片段特異性)/HRP偶聯(lián)物購自Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.(USA)。K-Blue TMB底物和Red Stop溶液購自Neogen Inc.(USA)。所有其他用于ELISA的產(chǎn)品均來自Sigma(UK)。Microplate Manager數(shù)據(jù)分析軟件包購自Bio-Rad(UK)。微量攪拌超濾盒和PM30過濾膜來自Amicon PLC(UK)，而Immunopure(G)IgG純化試劑盒購自Pierce PLC(UK)。(C)實驗技術(shù)Cl 嵌合γ1/κBAT抗體的構(gòu)建使用特別設(shè)計的PCR引物(表1)在5’端和3’端修飾已經(jīng)分離的小鼠κ輕鏈可變區(qū)(Vκ)基因(圖1)和重鏈可變區(qū)(VH)基因(圖2)，使得在哺乳動物細胞中BAT可變區(qū)基因表達為小鼠-人嵌合抗體的一部分。為實現(xiàn)這種分離，在一種特定的PCR-室中使用設(shè)計用于盡可能減少交叉污染可能的特定程序準(zhǔn)備每個可變區(qū)基因的PCR反應(yīng)。使用質(zhì)粒BATVH-pCR2.1和BAT Vκ-pCR2.1作為模板并使用AmpliTaqDNA聚合酶擴增這些模板。引物B8814和B8815(表4)被用于BAT VH基因的PCR修飾，而引物C0224和C0225(表4)被用于BAT Vκ基因的PCR變異。
將PCR反應(yīng)管在94℃下50秒和72℃下1分鐘30秒循環(huán)加溫，循環(huán)30次(在最初以94℃解鏈3分鐘后)。在最后一個循環(huán)完成時，在72℃下實施最后的延伸步驟10分鐘，然后將反應(yīng)物在冰上冷卻。從每個PCR反應(yīng)中取5μl等份樣品在1.2％的瓊脂糖/TBE(pH8.8)膠上走柱，以確定哪個反應(yīng)產(chǎn)生了合適大小的PCR-產(chǎn)物。
那些適當(dāng)大小的PCR產(chǎn)物的1-2μl等分樣品被直接克隆至由TACloning試劑盒所提供的pCR2.1TM載體中，并按照制造商的指示轉(zhuǎn)化至INAα F’感受態(tài)細胞中。按照Güssow和Clackson(同上)的方法使用1212和1233寡核苷酸引物(表5)對集落進行PCR篩選，從而識別含有具有適當(dāng)大小插入子的質(zhì)粒的集落。那些識別出的假定的陽性克隆是雙鏈質(zhì)粒DNA，使用Vistra DNA測序儀及ABI Prism 310Genetic Analyzer測定了其序列。按照制造商的說明書的描述使用Thermo SequenaseTM預(yù)混合循環(huán)測序試劑盒和Big DyeTMTerminatorCycle Sequencing Ready Reaction Kit和引物1212和1233(表5)。
將那些含有正確修改的BAT Vκ和VH基因(分別見圖5和圖6)的克隆作為HindIII-BamHi片段分別亞克隆至表達載體pKN110(圖7)和pGID110(圖8)中，以在哺乳動物細胞中表達嵌合輕鏈和嵌合重鏈。然后將連接的表達載體(即pKN110-BATVκ和pG1D110-BATVH)轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中。含有正確構(gòu)建的表達載體的陽性克隆最終通過限制酶切消化分析來識別。C2嵌合γ1/κBAT抗體載體DNA共轉(zhuǎn)染至COS細胞中按照Kettleborough等人的方法將哺乳動物表達載體轉(zhuǎn)染至COS細胞中。簡要地說，將DNA(10μgκ輕鏈表達載體pKN110-BATVκ和10μg重鏈表達載體pG1D110-BATVH)加入到每毫升PBS含有1×107個細胞的0.70ml等分試樣中，使用Bio-Red Cene Pulser儀在1900V，25μF電容下給予脈沖電流。在室溫下恢復(fù)10分鐘后，將經(jīng)電穿孔的細胞加入8ml含有5％FCS的DMEM中并在37℃下在5％的CO2中溫育72小時。溫育72小時后，收集培養(yǎng)基，旋轉(zhuǎn)以移去細胞碎片并使用ELISA分析嵌合BAT抗體的產(chǎn)率。C3通過ELISA對嵌合γ1/κBAT抗體定量首先以100μl含有0.4ng/μl的山羊抗人IgG(Fcγ片段特異性)抗體的等分試樣包被96孔Nunc-Immuno Plate MaxiSorpTM免疫板的每個孔，以PBS稀釋并在4℃下溫育過夜，并在使用前取出。然后在免疫板上加上100μl/孔等分的實驗樣品(即收獲的COS細胞上清液——旋轉(zhuǎn)以移去細胞碎片)以及1∶2的樣品稀釋液(在樣品酶偶聯(lián)物緩沖液，即0.1M Tris-HCl(pH7.0)、0.1M NaCl、0.02％(v/v)TWEEN-20和0.2％(w/v)BSA中稀釋)。此外，作為標(biāo)準(zhǔn)物使用的并按照1∶2連續(xù)稀釋的純化的人γ1/κ抗體(1000ng/μl)也被加入到免疫板上。免疫板在37℃下溫育1小時，然后以200μl/孔的洗滌緩沖液(PBS/0.1％(v/v)TWEEN-20)洗滌三次。向每個孔中加入100μl在樣品-酶偶聯(lián)物緩沖液中稀釋5000倍的山羊抗人κ輕鏈/辣根過氧化物酶偶聯(lián)物，然后在37℃下將免疫板溫育1小時，再按照前面的內(nèi)容洗滌。向每個孔中加入150μl K-Blue底物等分樣品，然后免疫板在室溫下在黑暗中溫育10分鐘。最后通過向每個孔中加入50μl Red Stop終止反應(yīng)。然后使用Bio-Rad 3550微量培養(yǎng)板讀數(shù)器結(jié)合Microplate Manager軟件包確定在655nm的光密度。C4嵌合BAT抗體的純化嵌合BATγ1/κ抗體從COS細胞上清液中通過兩個步驟純化。首先，按照制造商的指示使用具有PM30過濾膜的微量攪拌超濾盒，以減少未純化的粗品上清液的體積。然后仍然按照制造商的指示使用Immunopure(G)IgG純化試劑盒從濃縮的上清液中親和純化嵌合BAT抗體。C5 Daudi細胞ELISA使用由Dr.Hardy(Felsenstein Medical Research Center，RabinMedical Center，Beilinson Campus，Petach Tikva，49100，Israel)培養(yǎng)自原液的Daudi細胞實施細胞ELISA分析。根據(jù)所分析的是小鼠或小鼠-人嵌合BAT抗體對分析方法進行細微的調(diào)整。在分析小鼠BAT抗體的結(jié)合親和力時，使用山羊抗小鼠IgG(Fab特異性)/HRP偶聯(lián)物(1∶15000稀釋)作為第二抗體。相反地，當(dāng)測量嵌合BAT抗體時，使用AffiniPure山羊抗人IgG(Fcγ片段特異性)/HRP偶聯(lián)物(稀釋1000倍)。
將Daudi細胞(傳代2天后)首先以105細胞/孔涂布在96孔的Coming易清洗ELISA板中，然后在干燥的培養(yǎng)箱中在37℃下溫育過夜。第二天，向每個孔中加入200μl再水合緩沖液(含有10％FCS和0.05％疊氮化物的PBS)，然后靜置至少1小時。潷去再水合緩沖液，向培養(yǎng)板的每個孔中加入不同的1∶2連續(xù)稀釋的純化BAT抗體的50μl等分樣品。再一次在4℃下溫育培養(yǎng)板過夜，以含有5％LFM的PBS以200μl/孔洗滌兩次，使干。此后向每孔加入50μl HRP偶聯(lián)的第二抗體，實施一連串的區(qū)別性六種洗滌(即一次以含有5％LFM的PBS洗滌，三次以加入0.05％TWEEN-20的同樣的緩沖液洗滌，還有兩次以PBS/LFM緩沖液洗滌)。向每孔加入溶于0.05M檸檬酸緩沖液(pH5.0)的0.4mg/ml OPD底物和60mg/ml過氧化氫200μl，在室溫下在黑暗中溫育ELISA板直至出現(xiàn)顏色(通常約30分鐘)。最后，向每孔中加入50μl 2.5M的硫酸以終止反應(yīng)，然后使用Bio-Rad 3550微量培養(yǎng)板讀數(shù)器結(jié)合Microplate Manager軟件包確定在490nm的光密度。結(jié)果實施例4嵌合γ1/κBAT抗體的構(gòu)建如同所有項目，本實施例遵守了嚴格的PCR克隆和測序程序。這樣做是為盡可能減少在PCR修飾步驟中向小鼠可變區(qū)基因野生型序列中引入錯誤的可能性。使用引物C0224和C0225(表1)通過PCR修飾小鼠BAT Vκ基因(圖2)產(chǎn)生一條418bp的帶(未列數(shù)據(jù))。這一PCR產(chǎn)物被連接到pCR2.1質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到INVαF’感受態(tài)細胞中。類似地，使用引物B8814和B8815(表1)使小鼠BAT VH基因(圖1)PCR突變產(chǎn)生一條436bp的帶(未列數(shù)據(jù))。這一PCR產(chǎn)物也被連接到pCR2.1質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至INVαF’感受態(tài)細胞中。
然后使用PCR篩選分析(未列數(shù)據(jù))檢測推定的陽性轉(zhuǎn)化體，最后在ABI Prism 310 Genetic Analyzer上進行雙鏈DNA測序。圖3和圖4分別表示該嵌合BAT Vκ基因和BAT VH基因的DNA序列分析結(jié)果。該分析的實施既是為了確認其成功的誘變也是為了表明可能被引入基因中的任何PCR錯誤的存在。針對每種可變區(qū)基因只有一種PCR反應(yīng)實際發(fā)生并且只有來自每種PCR反應(yīng)的兩個克隆最終是完成整的DNA序列。
盡管如此，這仍足以從每種含有正確修飾的DNA序列的經(jīng)修飾的可變區(qū)基因中分離出至少一種克隆。
突變的VH和Vκ基因然后作為hindIII/BamHI片段被亞克隆至適當(dāng)?shù)谋磉_載體中以分別產(chǎn)生pKN110-BATVκ(7.88kb)和pG1D110-BATVH(7.55kb)。所構(gòu)建的表達載體的保真性然后通過限制性酶切分析被證實(未列數(shù)據(jù))。一旦共轉(zhuǎn)染至COS細胞，這些載體會允許γ1/κ型的嵌合BAT抗體的瞬間表達。
此外，作為BAT抗體人源化項目的一種特殊成分，BAT VH基因還作為HindIII/BamHI片段被亞克隆至pG3D110和pG4D1100重鏈表達載體中。除了以3γ恒定區(qū)基因(在pG3D110的情況下)的cDNA拷貝或γ3恒定區(qū)基因(在pG3D110的情況下)的cDNA或γ4恒定區(qū)基因(在pG3D110的情況下)的cDNA替換γ1人恒定區(qū)基因的cDNA拷貝外，這些載體與pG1D110是一致的。這些載體的構(gòu)建(即pG3D110-BATVκ)的目的是為了γ3/κ和γ4/κ型嵌合BAT抗體在COS細胞中表達。實施例5嵌合γ1/κBAT抗體的瞬間表達在一系列重復(fù)的瞬時表達實驗中，載體pKN110-BATVκ和pG1D110-BATVH被共轉(zhuǎn)染至COS細胞。在表達72小時后，通過γ1/κELISA在COS細胞共轉(zhuǎn)染的上清液中檢測到小鼠-人γ1/κ嵌合BAT抗體。根據(jù)這些分析，在培養(yǎng)基中所檢測到的γ1/κ嵌合BAT抗體的平均濃度的計算值為509±272ng/ml。
有趣的是，γ3/κ和γ4/κ型嵌合BAT抗體在COS細胞中表達后，看來似乎產(chǎn)生更大量的抗體。特別是，當(dāng)pG3D110-BATVH和pKN110BATVκ共轉(zhuǎn)染至COS細胞，對上清液的初步分析(使用4.3節(jié)所描述的ELISA方法并使用人IgG3/κ抗體作為標(biāo)準(zhǔn)物)測量出嵌合γ3/κBAT抗體的表達水平是6.7μg/ml。而且，當(dāng)pG4D110-BATVH和pKN110-BATVκ得以在COS細胞中表達時，使用同樣的ELISA(使用人IgG4/κ抗體作為標(biāo)準(zhǔn)物)測量出嵌合γ4/κBAT抗體的表達水平是8.2μg/ml。實施例6嵌合γ1/κBAT抗體的純化在每次共轉(zhuǎn)染中約收獲8ml，實施一系列共轉(zhuǎn)染直至收獲200mlCOS上清液。然后使這一上清液的體積通過一個具有PM30過濾膜(其截取分子量為30kDa)的微量攪拌超濾盒而濃縮至15ml。
Immunopure(G)IgG純化試劑盒的主要組成部分包括一個2ml的固定G蛋白柱。使用6ml洗脫緩沖液將抗體從柱上洗脫下來，以1ml級分為單位收集洗脫物。然后使用C3節(jié)中所描述的ELISA方法分析每一級分中的嵌合γ1/κBAT抗體的濃度。這一分析發(fā)現(xiàn)，級分3(42.05μg/ml)和級分4(20.05μg/ml)中有嵌合抗體，相當(dāng)于共回收了62.1μg的嵌合γ1/κBAT抗體。將其在-20℃下保存，直至再轉(zhuǎn)移至Curetech進行進一步分析。實施例7對結(jié)合了嵌合γ1/κBAT抗體的Daudi細胞的分析使用Daudi細胞ELISA，清晰地表明純化的嵌合γ1/κBAT抗體與Daudi細胞結(jié)合。圖9表示一個實驗的典型例子。然而，不太確定的是，按照同樣的ELISA，與類似濃度的小鼠BAT抗體的結(jié)合似乎比嵌合抗體更低。盡管如此，由于用于檢測與Daudi細胞結(jié)合的抗體的偶聯(lián)型第二抗體對于每種抗體構(gòu)建體是不同的，不能合理地對兩種類型的結(jié)合進行直接對比。表4用于對小鼠BAT抗體κ輕鏈和重鏈的可變區(qū)基因進行PCR修飾，以使得其在哺乳動物細胞中表達為嵌合γ1/κBAT抗體的一部分的引物名稱 序列(5’→3’)C0225(42聚體)C C C A A G C T T G C C G C C A C C A T GG A T T T T C A G G T G C A G A T T A T CC0224(39聚體)C G C G G A T C C A C T C A C G T T T T AT T T C C A A C T T T G T C C C C GB8815(40聚體)G G A T C C A C T C A C C T G A G G A G AC G G T G A C T G A G G T T C C T T GB8814(42聚體)A A G C T T G C C G C C A C C A T G G C TT G G G T G T G G A C C T T G C T A T T C
表5用于PCR篩選已轉(zhuǎn)化的集落以及BAT抗體經(jīng)PCR修飾的可變區(qū)基因的DNA序列的引物名稱 序列(5’→3’)Hμγl(17聚體) T T G G A G G A G G G T G C C A GHCMVi.3s(28聚體)G T C A C C G T C C T T G A C A C G C G TC T C G G G AFOR(18聚體) T G T A A A A C G A C G G C C A G TREV(18聚體) G A A A C A G C T A T G A C C A T GB6990(27聚體) C A G C A T A T G T T G A C T C T C C A CT G T C G GB6991(27聚體) G T C A A C A T A T G C T G A A G A G T TC A A G G GB8809(18聚體) T G C C A G G T C A A G T G T A A GB8810(18聚體) A A G C C A G G T T G G A T G T C CIV取自與本發(fā)明的單克隆抗體結(jié)合的Daudi B細胞類淋巴母細胞系抗原的3個肽的氨基酸序列測定包含在與本發(fā)明的單克隆抗體相結(jié)合的Daudi B類淋巴母細胞的抗原決定簇中的肽的序列。其序列分別在圖10、11和12中描述。
當(dāng)使用TBLASTN算式(第二版)，期望值(EXPECT Value)為10以及BLASUM62矩陣，將三條肽鏈作為查詢對象時，檢索非冗余基因數(shù)據(jù)庫以及EST Division，沒有發(fā)現(xiàn)吻合。
然而，由于該肽鏈?zhǔn)切‰逆湥€以更高的期望值以降低檢索條件的嚴格度對它們重新進行了檢索。篩選程序還被揭示出具有低復(fù)雜性，其可從blast報告中消除潛在的混淆匹配(例如，針對富脯氨酸區(qū)或proly-A尾部的吻合)，而保留了其blast統(tǒng)計數(shù)據(jù)反映其成對對比的特異性的區(qū)域。即使在一個非常低嚴格度的標(biāo)準(zhǔn)下，本發(fā)明的三條肽鏈仍然沒有與基因庫和EST片段發(fā)生任何吻合。
因此，根據(jù)上述結(jié)果，上述三條肽鏈應(yīng)是新肽鏈。IV使用本發(fā)明的單克隆抗體診斷個體的惡性疾病使用抗-CD3抗體以及本發(fā)明的一種單克隆抗體對取自被檢查個體的外周血淋巴細胞進行雙重標(biāo)記。確定與本發(fā)明的單克隆抗體結(jié)合的CD3+細胞的百分比。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)表明在患惡性疾病的個體中的CD3+mAb+細胞數(shù)量與取自健康個體的血液樣品中的這些細胞的百分比不同。與取自健康個體的CD3+mAb+細胞百分比相比，患惡性疾病的個體中的CD3+細胞百分比有顯著差異以及比其更高或更低的事實，能夠確定一個個體是否很可能患有惡性疾病，同時也能夠確定被檢查個體可能患有的特定種類的惡性疾病。
典型地，使用Ficoll Hypaque密度離心法從取自健康個體或癌癥患者的20ml血液中獲取外周血淋巴細胞。洗滌細胞并在含有0.5％BSA和0.05％as acid的PBS中懸浮。使用含有0.5×106個細胞的樣品進行FACS分析。首先，細胞和飽和量的本發(fā)明的單克隆抗體在0℃下溫育45分鐘，它們和與FITC偶聯(lián)的抗小鼠單克隆抗體在冰上溫育30分鐘。洗滌兩次，在1200rpm下離心，之后，細胞和與PE抗體偶聯(lián)的抗人CD3抗體在冰上溫育30分鐘。溫育后，洗滌細胞兩次，使用FACS掃描(Bectan Dickinson)分析樣品。結(jié)果在圖13至17中表示。
正如在圖13及圖17中所能看到的，取自健康個體血液樣品的CD3+BAT+細胞(與CD3+細胞總量對比)的百分比在25％的范圍內(nèi)。如在圖14所見，取自結(jié)腸癌病人的血液樣品中的CD3+BAT+細胞百分比與健康個體相比明顯偏低，在大約7％的范圍。類似地，取自乳腺癌病人的血液樣品的CD3+BAT+細胞的百分比在大約10％的范圍(圖15)。這些結(jié)果清楚地表明，可以通過CD3+BAT+細胞百分比與健康個體對比偏低的事實識別結(jié)腸癌和乳腺癌。
如在圖16中所見，取自前列腺癌病人的血液樣品的CD3+BAT+細胞百分比在大約50％的范圍內(nèi)，明顯高于取自健康個體血樣中的百分比。這些事實清楚地表明，可以通過CD3+BAT+細胞百分比與健康個體相比偏高的事實識別前列腺癌。如圖18所見，在取自前列腺癌病人T細胞中所發(fā)現(xiàn)的與本發(fā)明的單克隆抗體相結(jié)合的抗原數(shù)量非常高，而在取自乳腺癌病人的T細胞中檢測不到所述抗原。
上述結(jié)果表明本發(fā)明的單克隆抗體可以用于識別患有特定種類的惡性疾病的個體。因此，如果血液樣品取自被檢查個體并且本發(fā)明的單克隆抗體與樣品中的CD3+細胞的結(jié)合程度很高(在大約50％的范圍)，則被檢查的個體極有可能患前列腺癌。與此相反，如果樣品中CD3+細胞的百分比與健康個體相比明顯很低(在大約7％或10％的范圍)，則被檢查個體很可能患乳腺癌或結(jié)腸癌。很明顯地，如果被檢查個體是男性，那么他很可能患結(jié)腸癌。
上述實施例不應(yīng)被解釋為限制，與本發(fā)明的單克隆抗體相結(jié)合的CD3+細胞百分比和其他惡性疾病之間的其他關(guān)聯(lián)也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種具有可變區(qū)的單克隆抗體，其選自(a)重鏈可變區(qū)包括圖1的氨基酸序列的單克隆抗體；(b)κ輕鏈可變區(qū)包括圖2的氨基酸序列的單克隆抗體；(c)重鏈可變區(qū)包括圖1的氨基酸序列且κ輕鏈可變區(qū)包括圖2的氨基酸序列的單克隆抗體；(d)重鏈可變區(qū)與圖1的氨基酸序列具有至少70％同一性的單克隆抗體；(e)輕鏈可變區(qū)與圖2的氨基酸序列具有至少70％同一性的單克隆抗體。
2.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)包括圖1的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其κ輕鏈可變區(qū)包括圖2的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)包括圖1的氨基酸序列，κ輕鏈可變區(qū)包括圖2的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)與圖1的氨基酸序列具有至少70％同一性。
6.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其輕鏈可變區(qū)與圖2的氨基酸序列具有至少70％同一性。
7.一種與抗原結(jié)合的抗體，所述抗原與權(quán)利要求1-6所述的單克隆抗體中的任何一種特異性地結(jié)合。
8.權(quán)利要求1-7中任何一項的抗體，是一種嵌合人-小鼠抗體。
9.一種核酸序列，編碼權(quán)利要求1-8所述的單克隆抗體中的任何一種的氨基酸序列。
10.一種表達載體，具有權(quán)利要求9的核酸序列。
11.權(quán)利要求10的表達載體，被命名為pKN110質(zhì)粒。
12.權(quán)利要求10的表達載體，被命名為pG1D110質(zhì)粒。
13.一種細胞，其是用權(quán)利要求10-12所述的表達載體中的任何一種轉(zhuǎn)染的。
14.一種雜交瘤細胞系，其產(chǎn)生權(quán)利要求1-8的單克隆抗體中的任何一種。
15.一種肽，具有圖10所示肽的氨基酸序列。
16.一種肽，具有圖11所示肽的氨基酸序列。
17.一種肽，具有圖12所示肽的氨基酸序列。
18.一種肽，與權(quán)利要求12-14的肽中任何一種的氨基酸序列具有至少85％同一性。
19.一種蛋白質(zhì)或肽，包括權(quán)利要求12-15的肽中的一種或多種。
20.權(quán)利要求12-15的肽中任何一種的類似物，具有實質(zhì)上相同的與權(quán)利要求1的單克隆抗體中任何一種結(jié)合的水平。
21.一種用于識別很可能患有惡性疾病的被檢查個體的分析方法，包括(a)取得所述被檢查個體的體液樣品；(b)使所述樣品與權(quán)利要求1-8的單克隆抗體中的至少一種接觸；(c)確定所述單克隆抗體與所述樣品中的T細胞的結(jié)合程度；以及(d)將(c)中所述的程度和所述單克隆抗體與取自健康個體的樣品中的T細胞的結(jié)合程度進行比較，上述兩種結(jié)合程度間存在顯著差異表示所述被檢查個體是很可能患有惡性疾病的。
22.權(quán)利要求21的分析方法，其中在實施(b)步驟之前分離外周血單核細胞(PBMC)，然后將所述經(jīng)分離的PBMC在步驟(c)中與所述權(quán)利要求1-8的單克隆抗體中的至少一種接觸。
23.權(quán)利要求21或22的分析方法，其中所述的體液是血液。
24.用于識別很可能患有特定惡性疾病的被檢查個體的分析方法，包括(a)從該個體取得體液樣品；(b)將該樣品與權(quán)利要求1-8中任何一項的單克隆抗體接觸；(c)確定該單克隆抗體與所述樣品中的T細胞的結(jié)合程度；以及(d)將(c)中所述的程度和所述單克隆抗體與取自健康個體的T細胞的結(jié)合程度進行比較，結(jié)合程度間存在顯著差異表明被檢查個體是很可能患有惡性疾病的，其中與所述個體的T細胞的結(jié)合程度高于或低于所述單克隆抗體與健康個體的T細胞的結(jié)合水平，表示被檢查個體很可能患有的特定類型的惡性疾病。
25.權(quán)利要求24的分析方法，其中在實施(b)步驟之前，從所述樣品中分離出PBMC，然后將該PBMC在步驟(c)中與所述單克隆抗體接觸。
26.權(quán)利要求24或25的分析方法，其中所述單克隆抗體與取自所述被檢查個體的T細胞的結(jié)合程度高于同樣的單克隆抗體與健康個體的T細胞的結(jié)合程度。
27.權(quán)利要求26的分析方法，其中所述特定惡性疾病是前列腺癌。
28.權(quán)利要求24或25的分析方法，其中所述單克隆抗體與取自所述被檢查個體的T細胞的結(jié)合程度低于同樣的單克隆抗體與健康個體的T細胞的結(jié)合程度。
29.權(quán)利要求28的分析方法，其中所述特定惡性疾病是乳腺癌。
30.權(quán)利要求28的一種方法，其中所述特定惡性疾病是結(jié)腸癌。
31.一種藥物組合物，其中包括權(quán)利要求1-8的單克隆抗體中的一種或多種以及藥用載體。
32.一種試劑盒，包括權(quán)利要求1-8的單克隆抗體中的一種或多種、一種針對該單克隆抗體的特異性結(jié)合性配偶體的偶聯(lián)物、一種能夠產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記物以及使用指南。
33.一種藥物組合物，包括作為活性成分的權(quán)利要求1-8中任一項的單克隆抗體中的一種或多種及藥用載體。
34.權(quán)利要求33的藥物組合物，用于治療癌癥。
35.權(quán)利要求1-8的單克隆抗體中的任何一種的應(yīng)用，用于制備用來治療個體的惡性疾病的藥物組合物。
36.一種治療惡性疾病的方法，包括向需要的個體給予具有治療有效量的權(quán)利要求1-8中任何一項的單克隆抗體中的一種或多種。
37.一種藥物組合物，包括作為活性組分的權(quán)利要求15-20的肽中的一種或多種以及藥用載體。
38.一種用于對惡性疾病產(chǎn)生免疫性的疫苗制劑，包括作為活性組分的權(quán)利要求15-20的肽中的一種或多種以及免疫上可以接受的載體。
39.權(quán)利要求15-20中任何一項的肽的應(yīng)用，用于制備用來治療惡性疾病的藥物制劑。
40.一種惡性疾病的治療方法，包括向需要的個體給予治療有效量的權(quán)利要求15-20中任何一項的肽。
41.權(quán)利要求34的藥物組合物，其中所述癌癥是實體腫瘤。
42.權(quán)利要求41的藥物組合物，其中所述實體腫瘤是前列腺癌。
43.權(quán)利要求41的藥物組合物，其中所述實體腫瘤是乳腺癌。
44.權(quán)利要求42的藥物組合物，其中所述實體腫瘤是結(jié)腸癌。
45.權(quán)利要求40的方法，其中所述惡性疾病是實體腫瘤。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述實體腫瘤是前列腺癌。
47.權(quán)利要求45的方法，其中所述實體腫瘤是乳腺癌。
48.權(quán)利要求45的方法，其中所述實體腫瘤是結(jié)腸癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的針對類淋巴母細胞產(chǎn)生的單克隆抗體(mAb)的DNA和氨基酸序列以及與所述mAb結(jié)合的肽。本發(fā)明還涉及將所述抗體或肽用于檢查出很可能患有惡性疾病的個體,有時用于檢查出患有特定惡性疾病的個體的診斷方法。本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的單克隆抗體或肽的用于治療不同惡性疾病的藥物組合物,以及使用本發(fā)明的單克隆抗體或肽治療惡性疾病的方法。
文檔編號G01N33/15GK1346371SQ99816542
公開日2002年4月24日 申請日期1999年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月31日
發(fā)明者布雷塔·哈地, 亞伯拉罕·諾沃格羅斯基 申請人:莫爾研究應(yīng)用有限公司