一種測(cè)定血漿中游離化合物濃度、logD和化合物蛋白結(jié)合率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種同時(shí)測(cè)定血漿中游離化合物濃度、log D和化合物蛋白結(jié)合率的 方法。 技術(shù)背景
[0002] 隨著人類基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、組合化學(xué)、計(jì)算機(jī)等學(xué)科的迅速發(fā)展，為化合物的 篩選提供了成千上萬(wàn)的新模型、新祀點(diǎn)、新技術(shù)，推動(dòng)化合物篩選研究的高度發(fā)展?；衔?篩選是從合成或天然產(chǎn)物化合物中對(duì)可能作為的候選化合物進(jìn)行初步的藥理活性篩選過 程?；衔锖Y選中，需要對(duì)大量的候選化合物進(jìn)行理化性質(zhì)分析，如溶解度、滲透系數(shù)、化合 物蛋白結(jié)合率、log D和log P的測(cè)定。其中化合物的親脂性是化合物的一個(gè)重要的理化 性質(zhì)，它與化合物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄、毒理學(xué)特性，甚至和血腦屏障滲透性W 及化合物的清除都有重要的關(guān)系?；衔锏挠退峙湎禂?shù)通常被用作表征化合物親脂性的 參數(shù)，其定義為化合物在正辛醇和水之間的分配系數(shù)的對(duì)數(shù)，即log D。
[0003] 目前，測(cè)定化合物油水分配系數(shù)的方法很多，包括搖瓶法、色譜法、抑值度量法、固 定化人工膜和透析管法，其中，經(jīng)典方法為搖瓶法，常用方法為色譜法。搖瓶法是最簡(jiǎn)單和 常用的方法，但在測(cè)定中需消耗大量的有機(jī)試劑，不利于環(huán)保，而且該種方法費(fèi)事、費(fèi)力，要 求樣品有較高的純度和良好的穩(wěn)定性。另外，在實(shí)驗(yàn)震搖過程過程中，有機(jī)相和水相易產(chǎn)生 乳化現(xiàn)象，導(dǎo)致兩相在分離時(shí)不徹底而出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。測(cè)定油水分配系數(shù)的色譜法，包括 薄層色譜法、反相高效液相方法、親水反應(yīng)色譜法、逆流色譜法和微乳電動(dòng)色譜法。色譜法 是基于建立一系列已知油水分配系數(shù)實(shí)驗(yàn)值的化合物的色譜系統(tǒng)的關(guān)系模型。該些方法的 共同特點(diǎn)是，該些測(cè)定方法能夠準(zhǔn)確測(cè)定具有相似官能團(tuán)或者屬于同系列的化合物的油水 分配系數(shù)。然而，當(dāng)沒有結(jié)構(gòu)相同的化合物時(shí)，該方法得到的結(jié)果往往不準(zhǔn)確。
[0004] 2006年包建民教授的課題組提出了中空纖維膜液相微萃取方法測(cè)定化合物的油 水分配系數(shù)（Guo Y G,化ang J, Liu D N,化 H F. Determination of n-〇ctanol-water partition coefficients by hollow-fiber membrane solvent microextraction coupled with HPLC，Anal. Bioanal^ical Chem. 386 (7-8)，2193-2198 (2006) ?)，該方法可臥直接測(cè) 定化合物的油水分配系數(shù)。
[0005] 同時(shí)，化合物蛋白結(jié)合率的測(cè)定是化合物篩選和新藥臨床評(píng)價(jià)中非常重要的內(nèi)容 之一，它密切關(guān)系到化合物的藥理作用強(qiáng)度。如果化合物的蛋白結(jié)合率較高，在血液中的半 衰期長(zhǎng)而副作用少；如果化合物的蛋白結(jié)合率低，在血液中的半衰期短體內(nèi)消除快，作用維 持時(shí)間短。常用化合物蛋白結(jié)合率的測(cè)定方法有平衡透析法、超濾法、微透析、親和色譜法、 高效分子排阻色譜法、毛細(xì)管電泳法、光譜法、核磁共振法、質(zhì)譜法、固相微萃取法和中空纖 維膜液相微萃取法等。該些化合物蛋白結(jié)合測(cè)定方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，其中中空纖維膜液相微 萃取法是一種新型的，集采樣、萃取和濃縮于一體的樣品前處理技術(shù)，已經(jīng)初步應(yīng)用于化合 物蛋白結(jié)合的測(cè)定。
[0006] 2005 年"Tat jana Trtic ' -Petrovic 教授的課題組（Trtid-F*clrovi6 T,化nssonb J A. Determination of drug - protein binding using supported liquid membrane extraction under equilibrium conditions. J. Chromatogr. B 814 (2), 375-384(2005).) 采用中空纖維膜液相微萃取法成功測(cè)定利多卡因、羅嗽卡因、丙胺卡因、布比卡因等化合物 蛋白結(jié)合特性。該方法簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)，是測(cè)定化合物蛋白結(jié)合特性的新型技術(shù)，但是該技 術(shù)不能直接測(cè)定血漿中游離化合物濃度和蛋白結(jié)合率。2006年包建民教授的課題組（化 H, Guan J, James J. Bao. A hollow fiber solvent microextraction approach to measure 化ug - protein binding. Anal. Sci. 22 (12)，1565-1569 (2006).)用中空纖維膜液-液微萃 取法測(cè)定氨化可的松的蛋白結(jié)合率，該方法適用于給體相的體積很大而接受相體積較小， 即有機(jī)相的萃取不影響化合物蛋白結(jié)合的可逆平衡。而且該方法對(duì)高蛋白結(jié)合率化合物的 測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確，但是無(wú)法同時(shí)測(cè)定血漿中的游離化合物濃度及l(fā)og D。因此亟需一種可W 同時(shí)測(cè)定血漿中游離化合物濃度、log D和蛋白結(jié)合率，并且給體相的體積和接受相體積的 大小不影響測(cè)定結(jié)果的技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種易于操作、快速、準(zhǔn)確測(cè)定血漿中 游離化合物濃度和log D的方法。
[000引本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種測(cè)定化合物蛋白結(jié)合率的方法。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0010] 一種測(cè)定血漿中游離化合物濃度和log D的方法，包括如下步驟：
[0011] (1)用濃度為0. 02-0. 3M、pH為7. 4的磯酸緩沖溶液配制溶質(zhì)為化合物和血漿的溶 液5mL為給體相，所述給體相中化合物的濃度為0. 2-100 y g/mL、血漿體積濃度為10-50%， 將給體相放入容器中，于37°C水浴鍋中解育0. 5-2小時(shí)；
[0012] (2)將50-100 uL正辛醇注入到一端已密封的中空纖維膜內(nèi)腔中，加熱將中空纖 維膜的開口端密封；向透析袋內(nèi)加入0. 5mL抑=7. 4的濃度為0. 02-0. 3M的磯酸緩沖溶 液，將兩端封閉的中空纖維膜和透析袋放入步驟（1)獲得的溶液中，萃取75-300分鐘使平 衡；
[0013] (3)取出透析袋內(nèi)液體，用HPLC分析緩沖溶液中化合物的濃度巧]d，該濃度相當(dāng) 于平衡時(shí)血漿中游離化合物濃度；取出中空纖維膜內(nèi)液體，用HPLC分析平衡時(shí)正辛醇中化 合物濃度巧]。，計(jì)算血漿中化合物的log D ;
[0014] log D的計(jì)算方法為式I ;
[0015]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測(cè)定血漿中游離化合物濃度和logD的方法，其特征是包括如下步驟： (1) 用濃度為〇. 02-0. 3M、pH為7. 4的磷酸緩沖溶液配制溶質(zhì)為化合物和血漿的溶液 5mL為給體相，所述給體相中化合物的濃度為0. 2-100yg/mL、血漿體積濃度為10-50%， 將給體相放入容器中，于37°C水浴鍋中孵育0. 5-2小時(shí)； (2) 將50-100yL正辛醇注入到一端已密封的中空纖維膜內(nèi)腔中，加熱將中空纖維膜 的開口端密封；向透析袋內(nèi)加入〇. 5mLpH= 7. 4的濃度為0. 02-0. 3M的磷酸緩沖溶液， 將兩端封閉的中空纖維膜和透析袋放入步驟（1)獲得的溶液中，萃取75-300分鐘使平衡； (3) 取出透析袋內(nèi)液體，用HPLC分析緩沖溶液中化合物的濃度[D]d，該濃度相當(dāng)于平 衡時(shí)血漿中游離化合物濃度；取出中空纖維膜內(nèi)液體，用HPLC分析平衡時(shí)正辛醇中化合物 濃度[D]a，計(jì)算血衆(zhòng)中化合物的logD; logD的計(jì)算方法為式I:
式I。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定血漿中游離化合物濃度和logD的方法，其特征是 所述透析袋的截留分子量為7000-10000。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定血漿中游離化合物濃度和logD的方法，其特征是 所述中空纖維膜的材質(zhì)為聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯或聚碳酸纖維素。
4. 一種測(cè)定化合物蛋白結(jié)合率的方法，其特征是包括如下步驟： (1) 用濃度為〇. 02-0. 3M、pH為7. 4的磷酸緩沖溶液配制溶質(zhì)為化合物和血漿的溶液 5mL為給體相，所述給體相中化合物的濃度為0. 2-100yg/mL、血漿體積濃度為10-50%， 將給體相放入容器中，于37°C水浴鍋中孵育0. 5-2小時(shí)； (2) 將50-100yL正辛醇注入到一端已密封的中空纖維膜內(nèi)腔中，加熱將中空纖維膜 的開口端密封；向透析袋內(nèi)加入〇. 5mLpH= 7. 4的濃度為0. 02-0. 3M的磷酸緩沖溶液， 將兩端封閉的中空纖維膜和透析袋放入步驟（1)獲得的溶液中，萃取75-300分鐘使平衡； (3) 取出透析袋內(nèi)液體，用HPLC分析緩沖溶液中化合物的濃度[D]d，該濃度相當(dāng)于平 衡時(shí)血漿中游離化合物濃度；取出中空纖維膜內(nèi)液體，用HPLC分析平衡時(shí)正辛醇中化合物 濃度[D]a，計(jì)算，得到化合物蛋白結(jié)合率； 化合物蛋白結(jié)合率的計(jì)算方法為式II:
式II; 其中CPB%為化合物蛋白結(jié)合率，[V]d為平衡時(shí)給體相與透析袋內(nèi)溶液總體積；[V] 3為 平衡時(shí)中空纖維膜內(nèi)正辛醇體積；[DP]為化合物蛋白結(jié)合濃度；[VL為給體相初始體積； [D] ^為給體相中化合物初始濃度。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種測(cè)定化合物蛋白結(jié)合率的方法，其特征是所述透析袋的 截留分子量為7000-10000。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種測(cè)定化合物蛋白結(jié)合率的方法，其特征是所述中空纖維 膜的材質(zhì)為聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯或聚碳酸纖維素。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測(cè)定血漿中游離化合物濃度、log？D和化合物蛋白結(jié)合率的方法，測(cè)定血漿中游離化合物濃度和log？D的方法，步驟：(1)用磷酸緩沖溶液配制含化合物和血漿的給體相，孵育；(2)將正辛醇注入到中空纖維膜內(nèi)；向透析袋內(nèi)加入磷酸緩沖溶液，將中空纖維膜和透析袋放入步驟(1)獲得的溶液中，萃取使平衡；(3)取出透析袋內(nèi)液體，用HPLC分析緩沖溶液中化合物的濃度[D]d，該濃度相當(dāng)于平衡時(shí)血漿中游離化合物濃度；取出中空纖維膜內(nèi)液體，用HPLC分析平衡時(shí)正辛醇中化合物濃度[D]a，計(jì)算血漿中化合物的log？D；本發(fā)明分析速度快、需要的生物樣品量少，靈敏、操作簡(jiǎn)便、成本低、不需要昂貴的儀器，環(huán)保。
【IPC分類】G01N30-02, G01N30-06
【公開號(hào)】CN104569206
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510017619
【發(fā)明人】李優(yōu)鑫, 包建民, 寶貴榮
【申請(qǐng)人】天津大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年1月14日