一種檢測天然多克隆抗癌抗體的組合物、試劑盒和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及四種肽類抗原，可應(yīng)用于制備酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)抗體檢測試劑盒，用以檢測血漿中天然多克隆抗癌抗體（NPAA)濃度。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是威脅整個(gè)人類健康的最主要?dú)⑹种弧；诨姻察F霾等環(huán)境污染狀況 的持續(xù)存在，中國人群主要癌癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前我國癌癥平均每年 發(fā)病率高達(dá)3/1000以上。雖然腫瘤早期治療手段，如手術(shù)切除或放射線治療已發(fā)展的比較 成熟，能夠明顯延長病人的存活時(shí)間，但大約60%的癌癥患者在接受局部治療后仍有可能 在一年內(nèi)復(fù)發(fā)，大約90%的病人最終死于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，如何在腫瘤治療領(lǐng)域探 索一種創(chuàng)新的控制腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的免疫支持手段，是本發(fā)明技術(shù)的主要目的之一。
[0003] 近年來的研宄表明，檢測腫瘤相關(guān)抗原或抗體具有指導(dǎo)靶向治療價(jià)值。例如，臨床 上已廣泛應(yīng)用的曲妥株單抗（Trastuzumab)和貝伐株單抗（Bevacizumab)就是以人上皮細(xì) 胞生長因子二型受體（human epidermal growth factor receptor 2，HER2)和血管內(nèi)皮 細(xì)胞生長因子 A(Vascular endothelial growth factor A，VEGF_A)為標(biāo)革[1，成為臨床治 療中晚期腫瘤的重要手段。然而，由于副作用太大，這兩種單克隆抗體只能做為三線治療藥 物。因此，發(fā)展可用于防止腫瘤局部治療后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、且副作用低的新型手段是目前亟待 解決的問題。從免疫治療領(lǐng)域解決這個(gè)難題的關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)具有創(chuàng)新性的標(biāo)靶技術(shù)實(shí)施方 案，然后發(fā)展能有效防治腫瘤的新型技術(shù)。
[0004] 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子一型受體（Vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1)是一種跨膜蛋白，也是一種公認(rèn)的癌細(xì)胞表達(dá)的特異性蛋白。大量的 研宄工作發(fā)現(xiàn)，許多人類實(shí)體腫瘤可大量表達(dá)VEGFR1，如肝癌，肺癌，腎癌，腸癌及乳腺癌 等。因?yàn)閂EGFRl抗原表位多肽主要位于腫瘤細(xì)胞表面，可成為相應(yīng)抗體直接攻擊殺傷腫瘤 的靶點(diǎn)（如貝伐株單抗治療原理），也可間接地影響其功能而限制腫瘤的生長與發(fā)展。
[0005] HER2是受體型酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases)家族成員之一，也是一 種跨膜醣蛋白。目前發(fā)現(xiàn)，多種實(shí)體腫瘤可表達(dá)HER2,包括乳腺癌、膀胱癌、肺癌、胰腺癌及 頭頸部癌腫等。在現(xiàn)有技術(shù)中，曲妥株單抗對治療HER2表達(dá)陽性的乳腺癌具有顯著的療 效。
[0006] 上皮粘蛋白UMucin 1，MUCl)是一種醣化的細(xì)胞膜蛋白，多數(shù)常見上皮惡性腫瘤 細(xì)胞均大量表達(dá)MUCl，且與惡性細(xì)胞的快速增生有關(guān)。故MUCl是非常重要的腫瘤標(biāo)靶，在 發(fā)展癌癥免疫療法中具有重大意義。基于MUCl蛋白為靶標(biāo)的腫瘤疫苗技術(shù)目前已在國外 進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。可以預(yù)見，全新的化療手段未來在腫瘤治療中的地位將越來越重要。
[0007] 越來越多的臨床研宄表明，許多惡性腫瘤可能存在原發(fā)耐藥性（intrinsic resistance)，即對初始化療藥物不敏感，因而導(dǎo)致化療失敗。原發(fā)耐藥性形成的主要機(jī)理 之一，是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞表達(dá)耐藥蛋白，例如ATP結(jié)合盒（ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。這種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮 泵功能，可以將進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的化療藥物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免受藥物的殺傷。 基因表達(dá)譜篩查及大量臨床病理研宄證實(shí)，多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)ABCC3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中包括 乳腺癌、食道癌、肺癌、腎癌及頭頸部癌腫等。據(jù)此，ABCC3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以成為針對具有原發(fā) 耐藥性腫瘤的免疫治療標(biāo)靶。
[0008] 眾所周知，由于細(xì)胞在增殖和發(fā)育過程中可能發(fā)生突變，健康人的體內(nèi)每天都會 出現(xiàn)一定數(shù)量的癌細(xì)胞。但是，由于免疫監(jiān)視功能的存在，這些癌細(xì)胞可被人體中的各種抗 體和免疫細(xì)胞及時(shí)清除。本發(fā)明正是基于免疫監(jiān)視功能的原理，建立篩查存在正常人體內(nèi) 的天然抗癌抗體技術(shù)，為進(jìn)一步發(fā)展癌癥防治方法和預(yù)測腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，健康人體內(nèi)會自然形成與前述HER2、VEGFR1、MUCl和ABCC3四種 癌細(xì)胞特異性蛋白的抗原表位序列相對應(yīng)的特異性抗體，并單獨(dú)或與免疫細(xì)胞協(xié)同作用抑 殺癌細(xì)胞。本發(fā)明中將這類人體內(nèi)自然形成的、能識別其中一種或多種癌細(xì)胞特異性蛋白 的抗原表位的抗癌抗體統(tǒng)稱為"天然多克隆抗癌抗體"（natural polyclonal anti-cancer antibody, NPAA)。人血漿中NPAA可以認(rèn)為是一類天然抗腫瘤抗體，在人體內(nèi)執(zhí)行免疫監(jiān)視 和免疫清除功能，防止腫瘤的形成與發(fā)展。
[0010] 因此，本發(fā)明的主要目的是提供一組用于檢測健康人血漿中NPAA濃度的線性抗 原多肽和由此制備的試劑盒，以及使用該組抗原多肽或該試劑盒檢測人血漿中NPAA的方 法。所述抗原多肽為HER2、VEGFR1、MUC1和ABCC3四種癌細(xì)胞特異性蛋白的抗原表位。這 些抗原表位能夠與人血漿中針對HER2、VEGFRl、MUCl和ABCC3的特異性抗體結(jié)合。
[0011] 如本發(fā)明所定義的"天然多克隆抗癌抗體（NPAA) "是天然存在于健康人體內(nèi)的，能 識別一種或多種癌細(xì)胞特異性蛋白抗原表位的抗體或多克隆抗體混合物，或者說優(yōu)選能識 別HER2、VEGFRl、MUCl和ABCC3四種癌細(xì)胞特異性蛋白抗原表位的一種或多種抗體或多克 隆抗體混合物。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，所述NPAA是指能識別SEQ ID NO: 1-4中的一 個(gè)或多個(gè)表位序列的抗體或多克隆抗體混合物。
[0012] 本發(fā)明人利用免疫信息學(xué)方法和計(jì)算機(jī)軟件，在HER2、VEGFR1、MUC1和ABCC3蛋白 序列上進(jìn)行人類白細(xì)胞二類抗原（Human leukocyte antigen II，HLA-II)表位制圖，彌別 具有高度親和力的序列，進(jìn)而設(shè)計(jì)能被絕大多數(shù)人類抗原提呈細(xì)胞識別的HLA-II限制性 表位及線性抗原多肽。
[0013] 已經(jīng)公認(rèn)，抗原抗體的結(jié)合主要發(fā)生在抗原決定簇與抗體結(jié)合位點(diǎn)之間。因此，兩 者在空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)型上越接近完全互補(bǔ)，抗原抗體的結(jié)合就越穩(wěn)定，特異性就越強(qiáng)，結(jié)合效 率就越高，因此，目標(biāo)抗體（待檢測抗體）及其結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)是先決因素，抗原決定簇影響 整個(gè)蛋白抗原與抗體結(jié)合狀態(tài)和親和特性。
[0014] 本發(fā)明根據(jù)HER2、VEGFR1、MUC1和ABCC3四種蛋白的生物學(xué)特性，針對這四種蛋白 的多個(gè)表位進(jìn)行免疫信息學(xué)預(yù)測和模擬，經(jīng)分析與抗原性相關(guān)的各種參數(shù)，分別設(shè)計(jì)了四 種在空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)型上與目標(biāo)抗體完全互補(bǔ)的線性抗原多肽，其氨基酸序列見表1。
[0015] 表1.檢測人血漿中NPAA的線性抗原多肽序列
[0016]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測NPAA抗體的組合物，其包括如下4種抗原多肽： H-LCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASP-OH ； H-GEDLKLSCTVNKFLYRDVTffILLRTVNNRTMHYSI-OH ； H-VQLTLAFREGTINVDVETQFNQYKTEAASRYNLTISD-OH ； H-LLYVGQSAAAIGANVWLSAWTNDAMADSRQNNTSL-OHo
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于：所述組合物中各抗原多肽的比例為 1:1:1:1 (濃度比或體積比）。
3. 由權(quán)利要求1或2的組合物制成的試劑盒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的試劑盒，將4種抗原多肽混合液包被的馬來酰亞胺（Maleimide) 活化96孔微量檢測板干燥后，用非金屬醫(yī)用包裝材料真空密封包裝，制成試劑盒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的試劑盒，其中所述材料為玻璃或醫(yī)用塑料。
6. -種體外的、非診斷目的檢測個(gè)體血漿中的NPAA方法，其包括使用權(quán)利要求1或2 所述的組合物或權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的試劑盒對個(gè)體血漿中的NPAA進(jìn)行檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，包括將所述4種抗原多肽等比混合，然后包被馬來酰亞胺 (Maleimide)活化的96孔微量檢測板，4度過夜孵育，洗板，再進(jìn)行分步加樣分析。
8. 權(quán)利要求6所述的方法，其中所述分步加樣分析包括將待測血漿樣品雙復(fù)孔檢測， 同時(shí)設(shè)2個(gè)陰性對照孔和2個(gè)陽性對照孔；用分析液將血漿稀釋，并稀釋辣根過氧化物酶標(biāo) 記的羊抗人IgG抗體，洗板，每孔加100 y 1 3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺（TMB)及過氧化物酶 混合液，室溫避光20?30分鐘，每孔添加50 y 1終止液10%硫酸溶液，然后用酶標(biāo)儀檢測 光密度值，檢測波長為450nm，參考波長為630nm。
9. 權(quán)利要求1或2所述的組合物或權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的試劑盒在體外非診斷目 的檢測NPAA中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測天然多克隆抗癌抗體(NPAA)的組合物、由該組合物制成的試劑盒、使用該組合物或該試劑盒檢測血漿中NPAA濃度的方法、以及該組合物或該試劑盒在檢測血漿NPAA中的應(yīng)用。本發(fā)明利用與目標(biāo)NPAA完全互補(bǔ)的4種線性抗原多肽實(shí)現(xiàn)對血漿中NPAA的定性、定量檢測，可用于區(qū)分富含NPAA和不含NPAA的血漿。
【IPC分類】G01N21-31, G01N33-574
【公開號】CN104597241
【申請?zhí)枴緾N201510054670
【發(fā)明人】尉軍, 孟慶勇
【申請人】深圳市海蘭深生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年1月30日