活細(xì)胞結(jié)構(gòu)力學(xué)實(shí)時(shí)檢測熒光探針的制備及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的"熒光蛋白對"探針構(gòu)建及應(yīng)用。該探針 適用于活細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)力學(xué)變化指標(biāo)的檢測，尤其是對動(dòng)力分子誘導(dǎo)的離體和在體活細(xì)胞 及組織力學(xué)變化的實(shí)時(shí)定量或半定量測定。
【背景技術(shù)】
[0002] 肌細(xì)胞是最早發(fā)現(xiàn)與力學(xué)相關(guān)的細(xì)胞。事實(shí)上，所有細(xì)胞都能生成力和感受力，如 神經(jīng)、內(nèi)皮、骨及干細(xì)胞等。所有生命過程都涉及力學(xué)的作用和調(diào)節(jié)，如分化、反分化、分裂、 極化、運(yùn)動(dòng)、侵襲轉(zhuǎn)移和凋亡等。同時(shí)，不同組織器官的力學(xué)活動(dòng)以"穩(wěn)態(tài)"形式存在。一旦 這種力學(xué)穩(wěn)態(tài)被打破，就會(huì)導(dǎo)致組織細(xì)胞的病變，如癌細(xì)胞惡性增殖及侵襲轉(zhuǎn)移、神經(jīng)軸突 生長障礙、內(nèi)皮細(xì)胞舒張失調(diào)等。
[0003] 細(xì)胞內(nèi)力學(xué)效應(yīng)普遍依賴于動(dòng)力蛋白--驅(qū)動(dòng)蛋白（kinesin)、動(dòng)力蛋白（dynein) 和肌球蛋白（myosin)作用。動(dòng)力分子借助骨架蛋白行使力學(xué)效應(yīng)，也能通過與骨架蛋白相 互作用實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸。當(dāng)外力和內(nèi)力作用細(xì)胞時(shí)，骨架蛋白能傳遞力學(xué)變化，激活力學(xué) 感受器，將力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為化學(xué)或電信號(hào)，協(xié)調(diào)細(xì)胞力學(xué)相關(guān)活動(dòng)。細(xì)胞這種依賴于骨架結(jié) 構(gòu)的力學(xué)作用及力學(xué)信號(hào)傳遞形式被命名為細(xì)胞結(jié)構(gòu)力學(xué)。然而細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)既不能生成 力，也不能感受力學(xué)變化，僅僅是細(xì)胞傳遞力學(xué)變化必不可缺的媒介。
[0004] 已建立的生物物理微觀力學(xué)檢測技術(shù)"原子力顯微鏡、磁鉗和激光鉗"；通常采用 "微懸臂"，通過感知體外單層細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)強(qiáng)度變化，推測離體細(xì)胞力學(xué)變化，帶來了生物 物理微觀力學(xué)檢測的革命。然而，這種檢測技術(shù)，存在一定的局限性，不能滿足活細(xì)胞實(shí)時(shí) 監(jiān)測、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)力學(xué)以及團(tuán)塊細(xì)胞(胚囊）和體內(nèi)組織力學(xué)變化檢測的需要。
[0005] "熒光張力檢測探針"是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理研發(fā)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)力學(xué)檢測 技術(shù)。通過基因克隆、轉(zhuǎn)染和表達(dá)，將熒光張力探針插入細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白內(nèi)或蛋白之間，使微 絲、微管、中間纖維絲等骨架結(jié)構(gòu)傳遞的力學(xué)變化轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號(hào)，能明顯彌補(bǔ)現(xiàn)有細(xì)胞力 學(xué)檢測技術(shù)的缺陷。同時(shí)，研發(fā)的這種熒光探針能檢測力學(xué)信號(hào)與化學(xué)和電信號(hào)的相互作 用及調(diào)控機(jī)制，用于識(shí)別與細(xì)胞力學(xué)有關(guān)的藥物靶點(diǎn)，和與張力相關(guān)新藥的細(xì)胞篩選平臺(tái) 的構(gòu)建。因而，其研發(fā)及應(yīng)用可能帶來細(xì)胞結(jié)構(gòu)力學(xué)在生物物理微觀力學(xué)、疾病發(fā)病機(jī)制研 宄及臨床新藥研發(fā)的革命。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 依據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)原理，將能發(fā)生FRET的熒光蛋白對整合到細(xì)胞骨 架結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)力學(xué)變化轉(zhuǎn)換為光學(xué)信號(hào)。通過觀察熒光對角度改變導(dǎo)致的 FRET效率變化，實(shí)時(shí)推測活細(xì)胞或活體組織內(nèi)結(jié)構(gòu)力學(xué)變化。
[0007] 所謂熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)，是指兩種熒光蛋白（供體和受體）相距很近時(shí)(幾 個(gè)原子直徑范圍)，供體發(fā)射熒光與受體發(fā)色基團(tuán)的吸收光譜重疊時(shí)，用適當(dāng)頻率的光譜激 發(fā)供體產(chǎn)生振蕩偶極子，進(jìn)而與受體偶極子發(fā)生共振，最終導(dǎo)致能量從供體非放射性向受 體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。其中，能量轉(zhuǎn)移的效率取決于熒光對相距的距離遠(yuǎn)近和兩者的位置角度。 具有較高FRET效率的熒光蛋白對有：藍(lán)色（eBFP2)和綠色（eGFP)、橙色（venus)和紅色 (mcherry)、青色（eCFP)和授色（eYFP) 〇
[0008] 采用基因克隆技術(shù)，構(gòu)建中間由5-11個(gè)氨基酸短肽連接的熒光蛋白對，作為檢測 張力變化的熒光探針；并采用脯氨酸（Pro)作為熒光蛋白對形成夾角的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，形成熒光 對角度位置變化（圖1)。具體結(jié)構(gòu)為"FP/'-naa-Pro-naa- "FP2"。
[0009] 采用氨基酸鏈連接的方式，將探針嵌入兩個(gè)骨架蛋白（如肌動(dòng)蛋白β-actin、微 管蛋白α / β -tubulin、波形纖維蛋白vimentin、I/II型角蛋白（keratin)和核骨架蛋白 lamin A/C、B1和B2等)之間。其具體基因克隆模式為：真核啟動(dòng)子-骨架蛋白-Pr〇-6aa-熒 光蛋白l-naa-Pro-naa-焚光蛋白2-6aa_Pr〇-骨架蛋白。
[0010] 用質(zhì)粒（PEGFP-Cl)或病毒(慢病毒或腺病毒)作為載體，將探針及其相連骨架蛋白 基因克隆到離體細(xì)胞或體內(nèi)組織，誘導(dǎo)其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，繼而整合到細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)中，使熒光 探針懸掛在細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)外側(cè)（圖1)，以減少對正常骨架結(jié)構(gòu)功能的影響。當(dāng)外力或內(nèi)力誘 導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)改變時(shí)，能導(dǎo)致骨架蛋白力學(xué)強(qiáng)度的變化，接著運(yùn)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET) 原理，讀出其中機(jī)械張力變化。
[0011] 應(yīng)用熒光對初始角度不同調(diào)節(jié)探針靈敏度。根據(jù)FRET分光鏡規(guī)則和彈簧Hooke 定律推導(dǎo)出：熒光轉(zhuǎn)移效率（E)與熒光對距離（R)的數(shù)學(xué)關(guān)系：Ε=?Λ?+(Κ/Ι〇6)，Rtl是熒光 對的特征值；以及E與熒光對角度（θ Μ)的數(shù)學(xué)關(guān)系為：E= cos2 Θ M/ ( cos2 θ DA+l/3)。因 為cos2 θ DA在[0 °，90°]為連續(xù)減函數(shù)，cos2 θ DA范圍為[0, 1]。
[0012] 其中，0-30度，E值變化較弱；初始角度大于30度時(shí)（30-50)，E值與角度的關(guān)系呈 斜率；初始角度大于50度（50-80度)，兩者的斜率增大（圖2)。通過增加或縮短熒光對連接 的氨基酸鏈，能調(diào)節(jié)兩者間的初始角度，改善探針的檢測靈敏度。因?yàn)榧?xì)胞生物學(xué)中的力學(xué) 絕大多數(shù)是拉伸力而不是壓縮力，因此張力能誘導(dǎo)熒光供體和受體蛋白"角度"變化一般是 增大，由平行向鈍角轉(zhuǎn)換（由〇度平行向90度直角變化）；而FRET效率下調(diào)，兩者成反比關(guān) 系。即張力越強(qiáng)，兩者角度越大，F(xiàn)RET轉(zhuǎn)移越弱。
[0013] 采用供體激發(fā)熒光光譜照射，測定兩種熒光蛋白的發(fā)射光數(shù)值，再依據(jù)特定的 計(jì)算公式（如FRET/供體發(fā)射光），推測出其角度變化，從而半定量評(píng)價(jià)細(xì)胞微觀力學(xué)數(shù) 值。根據(jù)骨架蛋白與膜結(jié)合結(jié)構(gòu)的非共價(jià)連接特點(diǎn)，能推測這種熒光張力檢測探針可用于 piconewton (pN)力學(xué)檢測。
[0014] 檢測熒光共振能量轉(zhuǎn)移的儀器：能測定FRET變化的所有熒光檢測儀器（圖3)，如 多模塊熒光顯微鏡(可添加兩通道光路分離濾鏡)、激光共聚焦或FRET熒光酶標(biāo)儀（圖3)。 對于FRET效率的檢測方法有：光漂白熒光恢復(fù)、熒光壽命成像、光譜成像、熒光偏振成像等 觀察方法。先測定：標(biāo)記探針的細(xì)胞或細(xì)胞集合內(nèi)，兩種熒光的變化，再通過特定的FRET計(jì) 算公式，計(jì)算出細(xì)胞或細(xì)胞集合的張力變化。
[0015] 探針轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，采用供體和受體熒光蛋白的激發(fā)光分別鑒定兩個(gè)熒光蛋白轉(zhuǎn)入 的有效性，采用滲透壓和鈣信號(hào)刺激的動(dòng)力分子力學(xué)效應(yīng)檢測：熒光探針評(píng)價(jià)細(xì)胞力學(xué)的 可行性，采用細(xì)胞骨架蛋白解聚劑檢測熒光蛋白與骨架蛋白的結(jié)合。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)有： 1、采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理構(gòu)建的張力檢測探針，整合到細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)中，能將細(xì) 胞內(nèi)力學(xué)變化轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號(hào)，完成對活細(xì)胞，團(tuán)塊細(xì)胞(胚囊）以及體內(nèi)組織力學(xué)變化的 實(shí)時(shí)觀察，并能實(shí)現(xiàn)對活細(xì)胞或組織團(tuán)塊的連續(xù)