一種小麥種子高分子量谷蛋白亞基檢測樣品的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種小麥種子高分子量谷蛋白亞基檢測樣品的制備方法，屬于谷物化 學領域，專用于小麥谷蛋白的化學提取。
【背景技術】
[0002] 高分子量麥谷蛋白亞基（Highmolecularweightgluteninsubunit，HMW_GS)對 小麥面筋質量具有決定性作用（Gianibelli等，2001)，由Glu-Al、Glu-Bl、Glu-Dl三個位點 上的6個基因編碼，但多數(shù)品種具有3~5個HMW-GS。發(fā)掘和聚合優(yōu)質HMW-GS是國內外小 麥品質育種最重要的途徑，因此如何快速進行HMW-GS的提取和鑒定，直接影響小麥面筋品 質分子育種的成效。
[0003] 由于HMW-GS對面筋強度的影響存在加性效應和互作效應，因此在涉及2-3個 HMW-GS雜交轉育的育種方案中必須同時跟蹤多個亞基。單個基因的聚合酶鏈式反應（PCR) 或多個基因的多重PCR檢測可在小麥育種世代的苗期檢測，但存在兩個問題，一是苗期檢 測無法觀察到小麥單株的農藝性狀，對那些農藝性狀較差的單株在苗期大規(guī)模檢測勢必浪 費人力物力；多重PCR同時還存在本身反應體系不穩(wěn)定，加之顯性標記穩(wěn)定性差等因素，在 一般小麥育種單位的實用性仍不足。另外，HMW-GS的PCR檢測一般根據(jù)每個位點X型和 y型亞基兩個編碼基因緊密連鎖的特征，僅對其中的一個亞基基因進行標記檢測，對部分 HMW-GS缺失突變系無法檢測。亦有利用芯片的方法對HMW-GS進行鑒定（Jondiko等，2012)， 但設備和日常耗材昂貴。HMW-GS為顯性表達，傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)可同 時檢測所有的HMW-GS在當代小麥胚乳中的表達及組成，且可在灌漿期或成熟期進行，不僅 避開了小麥生長的農忙期，而且已對目標單株進行了優(yōu)選，仍是當前最有效實用的方法。但 是該方法檢測效率較低，主要原因是樣品提取繁瑣，在分子育種實際工作中實用性較差。因 此，建立一套高效低耗的樣品制備方法顯得尤為重要。
[0004] 目前用于SDS-PAGE檢測的小麥種子HMW-GS提取主要過程為粉碎、化學還原和烷 基化三步。育種早代樣品可通過小型磨磨制全麥粉（劉麗等，2004)、也可取單?；虬肓７N 子經錘擊或碾壓粉碎，這兩種方法都需要保證無樣品間相互污染，樣品準備過程仍較為繁 瑣?；瘜W還原劑通常選用二硫蘇糖醇、(6-巰基乙醇，濃度范圍為1 %-2% ;烷基化通常選 用4-乙烯吡啶，濃度在1%左右。化學還原劑和烷基化試劑的溶劑和緩沖液通常有50% 正丙醇、或含有正丙醇和SDS的Tris-HCl溶液（晏月明等，1998Jondiko等，2012 ;劉麗 等，2004)。已有的這些提取方法都是在1.5mL或2.OmL離心管中，利用50mg左右樣品在 100uL-300uL提取系統(tǒng)中完成，需要針對每個樣品單獨提取，在種子碾碎、離心管準備、加 液、離心和取上清液過程中花費大量的時間，較為繁瑣。每人每日正常僅可對100個左右的 樣品進行提取，工作效率低，工作強度大，難以滿足品質育種中的大規(guī)模檢測。
[0005] 本發(fā)明利用容積為200uL的普通96孔PCR擴增用微孔板和高通量組織研磨器，并 將樣品提取試劑進行復配，1組可完成2板192個樣品的提取，每人每日可完成3組6板576 個樣品的提取，操作簡單，工作強度低。相關的方法仍未見報道。參考文獻：
[0006] 1、劉麗，周陽，何中虎，閻俊，張艷，PenaR J. Glu-I和Glu-3等位變異對小麥 加工品質的影響.作物學報，2004, 30(10) :959-968
[0007]2、晏月明，劉廣田，Prodanovic S.小麥谷蛋白亞基的凝膠電泳分離及其品種鑒 定.中國糧油學報，1998, 13(6):1-5
[0008] 3、JondikoT0,AlviolaNJ，HaysDB，IbrahimA,TilleyM，AwikaJM.Effect ofhigh-moIecuIar-weightgluteninsubunitalleliccompositiononwheatflour tortillaquality.CerealChem, 2012, 89:155 - 161
[0009] 4、GianibelliMC,Larroque0R,MacRitchie F.Biochemical,genetic,molecularcharacterizationofwheatgluteninandits componentsubunits.CerealChem, 2001, 78:635 - 646.

【發(fā)明內容】

[0010] 技術問題
[0011] 鑒于小麥種子HMW-GS鑒定樣品提取效率低、工作強度大的特點，本發(fā)明旨在通過 使用體積容量為200uL的普通96孔PCR擴增用微孔板，通過樣品浸泡、復配提取試劑中的 高通量研磨，提供一種高效樣品制備方法，提高小麥種子的HMW-GS鑒定效率。
[0012] 技術方案
[0013] 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：
[0014] 一種小麥種子高分子量谷蛋白亞基檢測樣品的制備方法，其特征在于：在96孔微 孔板中一步提取。
[0015] 所述96孔微孔板為實驗室通用的容積為200uL的PCR擴增用微孔板，該微孔板配 有塑料聯(lián)排孔蓋和每孔1粒直徑2mm的鋼珠。
[0016] 其步驟包括：在小麥種子無胚端切取其體積的1/4~1/5,置于200uL的96孔PCR 微孔板中，并在每個微孔中放入1粒直徑2mm的鋼珠；隨后在微孔板中加入40uL浸泡緩沖 液靜置過夜，再加入120uL提取緩沖液，經高通量研磨器研磨后，在60°C的烘箱靜置，期間 每靜置14min，漩渦震蕩一次lmin，兩次共30min，微孔板經離心后所得上清液為小麥高分 子量谷蛋白亞基檢測所需樣本。
[0017]浸泡緩沖液：25%正丙醇 +0. 04MTris-HClPH8. 0;
[0018]提取緩沖液：25% 正丙醇+0? 04MTris-HClPH8. 0+3. 0%SDS+1. 3%DTT+2. 0% 4-VP。
[0019] 碾磨使用高通量組織碾磨儀,碾磨頻率為30次/s，碾磨時間為2min;微孔板離心 條件為 4000rpmX15min。
[0020] 有益效果
[0021] 現(xiàn)有技術中需要針對每個樣品單獨提取，在種子碾碎、離心管準備、加液、震蕩、離 心和上清液移取過程中花費大量的時間，操作繁瑣，工作強度大。每人每日正常僅可對100 個左右的樣品進行提取，工作效率低，難以滿足品質育種中的大規(guī)模檢測。
[0022] 本發(fā)明克服了小麥種子HMW-GS鑒定所需樣品制備方法中對每個樣品的單獨粉碎 或碾壓、離心管準備、加液、離心和上清液移取等的時間和人力消耗，利用體積容量為200uL 的普通96孔PCR擴增用微孔板和高通量組織研磨器，通過緩沖液浸泡樣品，并通過復配試 劑進行提取，1組可完成2板192個樣品的提取。這一方法適于小麥面筋品質育種中HMW-GS的鑒定。本發(fā)明與常規(guī)方法相比的效率優(yōu)勢如下：
[0023] 本發(fā)明：每人每日可完成3組6板576個樣品的提取。
[0024] 常規(guī)方法：每人每日僅可完成約100個樣品的提取。
[0025] 本發(fā)明所述方法和常規(guī)方法的效率估算（表1)。其中樣品數(shù)量按576個單粒估 算，所用設備中的漩渦震蕩器、離心機（I. 5mLX24孔角轉子、微孔板X2吊籃）、移液器（單 道200uL、8道IOOuL)、96孔微孔板（200uL)、震蕩器（30孔適配頭和細胞培養(yǎng)板適配頭）等 均為實驗室的通用標準。表1可以看出，本發(fā)明操作簡單，人力消耗較低，效率顯著高于常 規(guī)方法。在實際操作中，常規(guī)方法在當日僅可完成約100個樣品的全部提取過程。
[0026] 表1常規(guī)方法和本發(fā)明所述方法效率比較
【主權項】
1. 一種小麥種子高分子量谷蛋白亞基檢測樣品的制備方法，其特征在于：在96孔微孔 板中一步提取。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種小麥種子高分子量谷蛋白亞基檢測樣品的制備方法，其 特征在于：96孔微孔板為實驗室通用的容積為200 uL的PCR擴增用微孔板，該微孔板配有 塑料聯(lián)排孔蓋和每孔1粒直徑2 mm的鋼珠。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的一種小麥種子高分子量谷蛋白亞基檢測樣品的制備方 法，其步驟包括：在小麥種子無胚端切取其體積的1/4~1/5,置于200 uL的96孔PCR擴增 用微孔板中，并在每個微孔中放入1粒直徑2 mm的鋼珠；隨后在微孔板中加入40 uL浸泡 緩沖液靜置過夜，再加入120 uL提取緩沖液，經高通量研磨器研磨后，在60°C的烘箱靜置， 期間每靜置14min，漩渦震蕩一次1 min，兩次共30 min，微孔板經離心后所得上清液為小麥 高分子量谷蛋白亞基檢測所需樣本。
4. 根據(jù)權利要求3所述的一種小麥種子高分子量谷蛋白亞基檢測樣品的制備方法，其 特征在于： 浸泡緩沖液：25%正丙醇+0. 04 M Tris-HCl PH8. 0 ; 提取緩沖液：25% 正丙醇 +0? 04 M Tris-HCl PH8. 0+3. 0%SDS+1. 3%DIT+2. 0% 4-VP。
5. 根據(jù)權利要求3所述的一種小麥種子高分子量谷蛋白亞基檢測樣品的制備方法，其 特征在于：碾磨使用高通量組織碾磨儀，碾磨頻率為30次/s，碾磨時間為2 min ;微孔板離 心條件為 4000 rpmX 15 min。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種小麥種子高分子量谷蛋白亞基檢測所需樣品的制備方法，屬于生物化學領域。在小麥種子無胚端切取其體積的1/4~1/5，置于單孔容積為200uL的96孔PCR擴增用微孔板中，并在每個微孔中放入1粒直徑2mm的鋼珠。隨后在微孔板中加入40uL浸泡緩沖液靜置過夜，再加入120uL提取緩沖液，經高通量研磨器研磨后，在60℃的烘箱靜置30min，期間分2次，分別漩渦震蕩1min。微孔板經離心后所得上清液為小麥高分子量谷蛋白亞基檢測所需樣本。該提取方法通量高，適用于大規(guī)模的小麥種子高分子量谷蛋白亞基檢測中的樣品制備。
【IPC分類】G01N1-28
【公開號】CN104655464
【申請?zhí)枴緾N201510073536
【發(fā)明人】張平平, 馬鴻翔, 姚金保, 張鵬, 楊丹, 王化敦
【申請人】江蘇省農業(yè)科學院
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年2月11日