一種應(yīng)用原子力顯微鏡檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞剛度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞剛度的方法，特別是關(guān)于一種應(yīng)用原子力顯微 鏡檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞剛度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 宮頸癌是全球女性中僅次于乳腺癌的第二個(gè)最常見的惡性腫瘤。全世界每年有超 過(guò)20萬(wàn)婦女死于宮頸癌。近年來(lái)，隨著微尺度生物力學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的微區(qū)力學(xué) 性質(zhì)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及細(xì)胞侵襲力和轉(zhuǎn)移力密切相關(guān)，可能成為腫瘤早期診斷的重要 指標(biāo)。
[0003] 原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM)是一種新近發(fā)展起來(lái)的利用其非 修飾和修飾探針進(jìn)行樣品掃描，可以得到樣品表面形貌，并獲得樣品表面某一特定點(diǎn)的力 與進(jìn)針距離的關(guān)系曲線，進(jìn)而得到硬度和粘性等數(shù)據(jù)以及樣品的微區(qū)力學(xué)性質(zhì)。原子力顯 微鏡可在生理?xiàng)l件下對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察，樣本制作簡(jiǎn)單，并可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察某些 生化反應(yīng)，且無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行化學(xué)處理就可以產(chǎn)生高分辨率的圖像，可達(dá)納米水平。AFM對(duì) 細(xì)胞損傷小，通過(guò)一種類似于內(nèi)科觸診的模式，還可以對(duì)細(xì)胞骨架及其他細(xì)胞內(nèi)部微細(xì)結(jié) 構(gòu)進(jìn)行成像。相對(duì)于光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡，原子力顯微鏡具有突出的優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 如何利用原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM)檢測(cè)人正常子宮頸上皮 細(xì)胞、宮頸癌前病變（CIN)和宮頸癌的脫落細(xì)胞的剛度，建立一套系統(tǒng)的檢測(cè)方法，以便為 尋找癌變過(guò)程中微觀力學(xué)指標(biāo)的變化規(guī)律，為臨床上開展宮頸癌前病變和宮頸癌的早期診 斷提供依據(jù)和思路成為亟待解決的技術(shù)問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用原子力顯微鏡檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞剛 度的方法，該方法操作簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)傷，可以有效尋找癌變過(guò)程中微觀力學(xué)指標(biāo)的變化規(guī)律。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：一種應(yīng)用原子力顯微鏡檢測(cè)宮頸脫 落細(xì)胞剛度的方法，其包括以下步驟：1)采集宮頸上皮脫落細(xì)胞標(biāo)本；2)制備宮頸上皮脫 落細(xì)胞樣品；3)采用現(xiàn)有原子力顯微鏡成像系統(tǒng)檢測(cè)宮頸上皮脫落細(xì)胞樣品的力-距離曲 線；（1)在原子力顯微鏡成像系統(tǒng)中采用原子力顯微鏡，在原子力顯微鏡成像系統(tǒng)掃描頭 上安裝前段修飾有聚苯乙稀小球的CSGll/tipless型微懸臂，調(diào)整激光光斑位置使其位于 掃描頭毛玻璃正中央，并將偏轉(zhuǎn)以及扭轉(zhuǎn)的初始值分別設(shè)為-2V和0V，通過(guò)預(yù)置在原子力 顯微鏡成像系統(tǒng)中的Contact mode AFM Calibrated軟件對(duì)微懸臂進(jìn)行力-距離曲線采 集，從而計(jì)算出微懸臂的彈性系數(shù)和敏感度；(2)將培養(yǎng)皿固定于原子力顯微鏡成像系統(tǒng) 的樣品盤上，將探針安裝在對(duì)微弱力極敏感的微懸臂一端，微懸臂另一端固定在原子力顯 微鏡成像系統(tǒng)中的壓電陶瓷管上，探針與培養(yǎng)皿中的樣品表面輕輕接觸，測(cè)得微懸臂對(duì)應(yīng) 于掃描點(diǎn)各點(diǎn)位置的變化，獲得樣品表面的形貌信息；(3)每個(gè)患者取10個(gè)以上形態(tài)正常、 錨定良好的宮頸上皮脫落細(xì)胞樣品，在目視下選擇要采集力-距離曲線的部位，每個(gè)細(xì)胞 樣品在胞漿區(qū)取兩個(gè)點(diǎn)進(jìn)行力-距離曲線檢測(cè)；(4)選擇進(jìn)針時(shí)間，在所選進(jìn)針時(shí)間測(cè)定的 力-距離曲線代表探針在逐漸逼近樣品、接觸樣品、局部施力下壓、針尖逐漸抬起以及離開 細(xì)胞的全過(guò)程中，微懸臂的振幅改變，得到力-距離曲線，將所測(cè)定的力-距離曲線以*.ivs 格式輸出；4)根據(jù)測(cè)得的力-距離曲線對(duì)宮頸上皮脫落細(xì)胞剛度進(jìn)行檢測(cè)；（1)將*. ivs格 式力-距離曲線文件轉(zhuǎn)換為*. txt格式力-距離曲線文件，并采用Cft3bal 1計(jì)算方法，輸入 以下參數(shù)：壓入深度、微懸臂敏感度、微懸臂彈性系數(shù)和微懸臂末端小球的半徑，對(duì)*. txt 格式力-距離曲線文件進(jìn)行楊氏模量計(jì)算；（2)楊氏模量大小與細(xì)胞的剛度呈負(fù)相關(guān)，根據(jù) 步驟（1)中計(jì)算得到的楊氏模量大小得到宮頸上皮脫落細(xì)胞的剛度變化值。
[0007] 所述步驟2)中，所述宮頸上皮脫落細(xì)胞樣品制備方法如下：⑴將附著有宮頸上 皮脫落細(xì)胞標(biāo)本的宮頸刷浸入IOml PBS緩沖液中；（2)用2ml吸管將宮頸上皮脫落細(xì)胞從 宮頸刷上輕輕吹下，反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液；（3)在15ml的離心管中加入4ml密度梯度離心 液，在離心液上輕柔加入步驟（2)中的IOml細(xì)胞懸液，并進(jìn)行60g離心3分鐘；去除IOml 含有粘液和血液的上清，將剩余液體再次進(jìn)行200g離心3分鐘；(4)棄上清，加入2ml PBS 緩沖液，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液；(5)將單細(xì)胞懸液滴于0. 1 %多聚賴氨酸處理的培養(yǎng)皿底 和蓋玻片上，靜置30分鐘后待細(xì)胞基底附著后用PBS緩沖液輕輕沖洗3次，最后在培養(yǎng)皿 中加入2ml PBS緩沖液準(zhǔn)備檢測(cè)。
[0008] 所述步驟3)的步驟（1)中，所述微懸臂前端聚苯乙烯小球直徑為7 μ m。
[0009] 所述步驟4)的步驟（1)中，所述楊氏模量采用由Hertz'S模型計(jì)算：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種應(yīng)用原子力顯微鏡檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞剛度的方法，其包括以下步驟： 1) 采集宮頸上皮脫落細(xì)胞標(biāo)本； 2) 制備宮頸上皮脫落細(xì)胞樣品； 3) 采用現(xiàn)有原子力顯微鏡成像系統(tǒng)檢測(cè)宮頸上皮脫落細(xì)胞樣品的力-距離曲線； (1) 在原子力顯微鏡成像系統(tǒng)中采用原子力顯微鏡，在原子力顯微鏡成像系統(tǒng)掃描頭 上安裝前段修飾有聚苯乙稀小球的CSGll/tipless型微懸臂，調(diào)整激光光斑位置使其位于 掃描頭毛玻璃正中央，并將偏轉(zhuǎn)以及扭轉(zhuǎn)的初始值分別設(shè)為-2V和0V，通過(guò)預(yù)置在原子力 顯微鏡成像系統(tǒng)中的Contact mode AFM Calibrated軟件對(duì)微懸臂進(jìn)行力-距離曲線采集， 從而計(jì)算出微懸臂的彈性系數(shù)和敏感度； (2) 將培養(yǎng)皿固定于原子力顯微鏡成像系統(tǒng)的樣品盤上，將探針安裝在對(duì)微弱力極敏 感的微懸臂一端，微懸臂另一端固定在原子力顯微鏡成像系統(tǒng)中的壓電陶瓷管上，探針與 培養(yǎng)皿中的樣品表面輕輕接觸，測(cè)得微懸臂對(duì)應(yīng)于掃描點(diǎn)各點(diǎn)位置的變化，獲得樣品表面 的形貌信息； (3) 每個(gè)患者取10個(gè)以上形態(tài)正常、錨定良好的宮頸上皮脫落細(xì)胞樣品，在目視下選 擇要采集力-距離曲線的部位，每個(gè)細(xì)胞樣品在胞漿區(qū)取兩個(gè)點(diǎn)進(jìn)行力-距離曲線檢測(cè)； (4) 選擇進(jìn)針時(shí)間，在所選進(jìn)針時(shí)間測(cè)定的力-距離曲線代表探針在逐漸逼近樣品、接 觸樣品、局部施力下壓、針尖逐漸抬起以及離開細(xì)胞的全過(guò)程中，微懸臂的振幅改變，得到 力-距離曲線，將所測(cè)定的力-距離曲線以*· ivs格式輸出； 4) 根據(jù)測(cè)得的力-距離曲線對(duì)宮頸上皮脫落細(xì)胞剛度進(jìn)行檢測(cè)； (1) 將*· ivs格式力-距離曲線文件轉(zhuǎn)換為*· txt格式力-距離曲線文件，并采用 Cft3ball計(jì)算方法，輸入以下參數(shù)：壓入深度、微懸臂敏感度、微懸臂彈性系數(shù)和微懸臂末 端小球的半徑，對(duì)*. txt格式力-距離曲線文件進(jìn)行楊氏模量計(jì)算； (2) 楊氏模量大小與細(xì)胞的剛度呈負(fù)相關(guān)，根據(jù)步驟（1)中計(jì)算得到的楊氏模量大小 得到宮頸上皮脫落細(xì)胞的剛度變化值。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用原子力顯微鏡檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞剛度的方法，其特征 在于：所述步驟2)中，所述宮頸上皮脫落細(xì)胞樣品制備方法如下： (1) 將附著有宮頸上皮脫落細(xì)胞標(biāo)本的宮頸刷浸入IOml PBS緩沖液中； (2) 用2ml吸管將宮頸上皮脫落細(xì)胞從宮頸刷上輕輕吹下，反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液； (3) 在15ml的離心管中加入4ml密度梯度離心液，在離心液上輕柔加入步驟⑵中的 IOml細(xì)胞懸液，并進(jìn)行60g離心3分鐘；去除IOml含有粘液和血液的上清，將剩余液體再 次進(jìn)行200g離心3分鐘； (4) 棄上清，加入2ml PBS緩沖液，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液； (5) 將單細(xì)胞懸液滴于0. 1 %多聚賴氨酸處理的培養(yǎng)皿底和蓋玻片上，靜置30分鐘后 待細(xì)胞基底附著后用PBS緩沖液輕輕沖洗3次，最后在培養(yǎng)皿中加入2ml PBS緩沖液準(zhǔn)備 檢測(cè)。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用原子力顯微鏡檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞剛度的方法，其特征 在于：所述步驟3)的步驟（1)中，所述微懸臂前端聚苯乙烯小球直徑為7 μ m。
4. 如權(quán)利要求2所述的一種應(yīng)用原子力顯微鏡檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞剛度的方法，其特征 在于：所述步驟3)的步驟（1)中，所述微懸臂前端聚苯乙烯小球直徑為7 μ m。
5. 如權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述的一種應(yīng)用原子力顯微鏡檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞剛度的方 法，其特征在于：所述步驟4)的步驟（1)中，所述楊氏模量采用由Hertz's模型計(jì)算：
式中，E是所求的楊氏模量，F(xiàn)是所施加的力，R是微懸臂末端小球半徑，δ是壓入深度， υ 是 Poisson' s 比。
6. 如權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述的一種應(yīng)用原子力顯微鏡檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞剛度的方 法，其特征在于：所述步驟3)的步驟（4)中，所述進(jìn)針時(shí)間的選取范圍為0.0 ls~10s。
7. 如權(quán)利要求5所述的一種應(yīng)用原子力顯微鏡檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞剛度的方法，其特征 在于：所述步驟3)的步驟（4)中，所述進(jìn)針時(shí)間的選取范圍為0.0 ls~10s。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種應(yīng)用原子力顯微鏡檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞剛度的方法，其包括步驟：采集宮頸上皮脫落細(xì)胞標(biāo)本；制備宮頸上皮脫落細(xì)胞樣品；采用現(xiàn)有原子力顯微鏡成像系統(tǒng)檢測(cè)宮頸上皮脫落細(xì)胞樣品的力-距離曲線，將所測(cè)定的力-距離曲線輸出；根據(jù)測(cè)得的力-距離曲線對(duì)宮頸上皮脫落細(xì)胞剛度進(jìn)行檢測(cè)：采用Cft3ball計(jì)算方法，輸入以下參數(shù)：壓入深度、微懸臂敏感度、微懸臂彈性系數(shù)和微懸臂末端小球的半徑，對(duì)力-距離曲線文件進(jìn)行楊氏模量計(jì)算；楊氏模量大小與細(xì)胞的剛度呈負(fù)相關(guān)，根據(jù)計(jì)算得到的楊氏模量大小得到宮頸上皮脫落細(xì)胞的剛度變化值。本發(fā)明可以廣泛在生物醫(yī)學(xué)、納米生物和生物力學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用。
【IPC分類】G01Q60-24, G01N3-00
【公開號(hào)】CN104655879
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510097486
【發(fā)明人】耿力
【申請(qǐng)人】北京大學(xué)第三醫(yī)院
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2015年3月5日