膜蛋白cd81在子癇前期預(yù)測、分型及診療中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于婦產(chǎn)科學(xué)高危妊娠領(lǐng)域，涉及膜蛋白CD81在子癇前期預(yù)測、分型及診 療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 子癇前期（preeclampsia，PE)是妊娠期特有的并發(fā)癥，以妊娠20周后出現(xiàn)的高血 壓和蛋白尿?yàn)橹饕R床特征。能引起孕婦多器官功能損害，及胎兒宮內(nèi)缺氧、胎兒生長受 限、醫(yī)源性早產(chǎn)等，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒病死率增高的重要原因。PE的病因不明，從發(fā)病 時(shí)間與孕周的關(guān)系看，目前分為早發(fā)型和遲發(fā)型，說明其病因具有異質(zhì)性，而至今尚無更精 確的分型方法，這嚴(yán)重影響了 PE預(yù)測、預(yù)防與針對性治療方法的建立。目前PE的治療主要 是對癥處理，無效時(shí)終止妊娠，但這將增加醫(yī)源性早產(chǎn)。因此，亟待尋找有效的預(yù)測、分型及 防治方法。
[0003] ⑶81，又名抗增生抗體靶抗原-1 (TAPA-1)，是四次跨膜蛋白（TM4SF)超家族成員， 表達(dá)于哺乳動(dòng)物的多種有核細(xì)胞。CD81分子四次跨越細(xì)胞膜，形成胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi) 區(qū)，在細(xì)胞外形成大小兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)（EC1和EC2)。CD81在細(xì)胞內(nèi)和跨細(xì)胞膜區(qū)域的成分 高度保守，而其大的細(xì)胞外環(huán)區(qū)域（EC2)具有易變性。胞外的較小和較大的環(huán)狀結(jié)構(gòu)區(qū)域， 是細(xì)胞膜上CD81感知細(xì)胞外信號的關(guān)鍵部位。對CD81結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行分析，在其N末端發(fā) 現(xiàn)了一個(gè)潛在的豆蔻酯?；稽c(diǎn)，對CD81的功能調(diào)節(jié)存在重要作用。細(xì)胞膜上的CD81分 子并不孤立存在，而是與其它的TM4SF蛋白如CD9,或其它類型的跨膜蛋白分子結(jié)合，形成 不同的蛋白復(fù)合物，傳遞細(xì)胞外的信號，從而參與細(xì)胞生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)。與CD81分子結(jié) 合的蛋白質(zhì)有 CD4、CD8、CD9、CD21、CD82、HLA-DR 和整合素分子 a301、a401 和 a601 等。研宄表明CD81在機(jī)體的固有免疫及獲得性免疫的激活和丙型肝炎病毒（HCV)感染過 程均有重要作用。但尚未見CD81與PE有關(guān)的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述空白，提供膜蛋白CD81在子癇前期預(yù)測、分 型及診療中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供子癇前期預(yù)測、分型的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明的又一目的是提供一種防治子癇前期的藥物。
[0007] 本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] 膜蛋白CD81作為檢測靶標(biāo)在制備預(yù)測子癇前期的試劑盒中的應(yīng)用。
[0009] 所述的試劑盒中含有檢測膜蛋白CD81表達(dá)量的試劑；通過所述的試劑盒檢測孕 婦妊娠前或妊娠初期以及妊娠過程中膜蛋白CD81的表達(dá)量，如果妊娠過程中膜蛋白CD81 的表達(dá)顯著高于妊娠前或妊娠初期，則預(yù)測孕婦患有子癇前期。
[0010] 膜蛋白CD81作為檢測靶標(biāo)在制備子癇前期分型試劑盒中的應(yīng)用。
[0011] 膜蛋白⑶81在早發(fā)型重度PE患者（孕周〈34周）中表達(dá)顯著增高，早發(fā)型重度 PE患者病情發(fā)展迅速且容易并發(fā)胎兒窘迫及胎兒生長受限等。通過所述的檢測試劑盒檢測 膜蛋白CD81的表達(dá)量，能夠區(qū)分PE為早發(fā)型還是遲發(fā)型，同時(shí)區(qū)分輕度還是重度；為臨床 治療選擇不同方法提供依據(jù)和參考。
[0012] 膜蛋白CD81分子的拮抗物質(zhì)在制備防治子癇前期的藥物中的應(yīng)用。
[0013] 所述的膜蛋白CD81分子的拮抗物質(zhì)可以為中和抗體、siRNA及與CD81具有穩(wěn)定 結(jié)合的分子（如四次跨膜蛋白同家族成員CD9)。
[0014] 一種用于預(yù)測子癇前期的檢測試劑盒，包括用于檢測膜蛋白⑶81表達(dá)量的試劑。
[0015] 其中，所述的檢測膜蛋白⑶81表達(dá)量的試劑優(yōu)選Western blotting檢測膜蛋白 ⑶81表達(dá)量的試劑、免疫組織化學(xué)及組織免疫熒光檢測膜蛋白⑶81表達(dá)量的試劑或者酶 聯(lián)免疫檢測膜蛋白CD81表達(dá)量的試劑。
[0016] 所述的Western blotting檢測膜蛋白CD81表達(dá)量的試劑包括CD81鼠單克隆抗 體，所述單抗可按照現(xiàn)有技術(shù)公開的方法自制，也可購買商業(yè)化的產(chǎn)品，如Santa Cruz公司 生產(chǎn)的⑶81鼠單克隆抗體。
[0017] 所述的免疫組織化學(xué)及組織免疫熒光檢測膜蛋白⑶81表達(dá)量的試劑包括⑶81 兔單克隆抗體，所述單抗可按照現(xiàn)有技術(shù)公開的方法自制，也可購買商業(yè)化的產(chǎn)品，如 Epitomics公司生產(chǎn)的⑶81兔單克隆抗體。
[0018] 所述的酶聯(lián)免疫檢測膜蛋白⑶81表達(dá)量的試劑優(yōu)選使用雙抗體夾心ELISA法檢 測膜蛋白CD81的試劑。
[0019] 一種用于子癇前期分型的試劑盒，包括用于檢測膜蛋白⑶81表達(dá)量的試劑。
[0020] 其中，所述的檢測膜蛋白⑶81表達(dá)量的試劑包括Western blotting檢測膜蛋白 ⑶81表達(dá)量的試劑、免疫組織化學(xué)及組織免疫熒光檢測膜蛋白⑶81表達(dá)量的試劑或者酶 聯(lián)免疫檢測膜蛋白CD81表達(dá)量的試劑。
[0021] 一種用于防治子癇前期的藥物，包括膜蛋白CD81分子的拮抗物質(zhì)以及藥學(xué)上允 許的輔料。所述的膜蛋白CD81分子的拮抗物質(zhì)選自中和抗體、siRNA或者與CD81具有穩(wěn) 定結(jié)合的分子（如四次跨膜蛋白同家族成員CD9)。
[0022] 有益效果：
[0023] 本發(fā)明從臨床調(diào)查、體外檢測CD81分子水平及整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)探討CD81高表 達(dá)引起PE發(fā)病及其分子機(jī)制。臨床調(diào)查研宄表明，與相同孕齡的正常孕婦相比，早發(fā)型重 度PE患者的胎盤中⑶81的表達(dá)顯著升高。同時(shí)，對胎盤組織的切片進(jìn)行⑶81及CK (滋養(yǎng) 細(xì)胞的標(biāo)記分子）免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)PE患者胎盤組織的⑶81染色明顯深于正常孕婦的 胎盤切片，且CD81高表達(dá)部位主要在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞。進(jìn)一步，提取原代胎盤細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞 (cytotrophoblasts，CTBs)發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)CD81，而CD81能抑制CTBs的侵襲。最后，我們將 CD81腺病毒經(jīng)尾靜脈注射妊娠大鼠，成功誘導(dǎo)大鼠PE的高血壓表型。說明CD81可能是PE 發(fā)病的關(guān)鍵分子。基于上述研宄成果，提出膜蛋白CD81作為檢測靶標(biāo)可用于制備預(yù)測子癇 前期的試劑盒、子癇前期分型試劑盒以及膜蛋白CD81拮抗物質(zhì)可用于制備防治子癇前期 的藥物。
【附圖說明】
[0024] 圖1、組織免疫熒光檢測胎盤絨毛中⑶81的表達(dá)
[0025] 其中，亮灰色表示有⑶81表達(dá)。A, B，C圖顯示在游離絨毛的內(nèi)側(cè)為細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì) 胞，外側(cè)為合體滋養(yǎng)細(xì)胞，不同孕周的游離絨毛的外側(cè)合體滋養(yǎng)細(xì)胞未有亮灰色，而內(nèi)側(cè)細(xì) 胞滋養(yǎng)細(xì)胞上的亮灰色隨孕周的增加而變少。D，E，F(xiàn)圖顯示固定絨毛的近端及遠(yuǎn)端的滋養(yǎng) 細(xì)胞的亮灰色隨孕周的增加而減少。
[0026] 圖2、Western blotting檢測PE患者胎盤中⑶81表達(dá)
[0027] 其中，nPTL表示正常妊娠婦女組，sPE表示早發(fā)型重度PE患者組。
[0028] 圖3、免疫組化檢測PE患者胎盤組織切片中⑶81 (圖A)與CK(圖B)表達(dá)
[0029] 圖4、Western blotting檢測PE患者血清中CD81表達(dá)
[0030] 圖5、胎盤原代CTBs的提取及培養(yǎng)
[0031] 圖6、Transwell檢測CD81對CTBs侵襲能力的作用
[0032] 圖7、Western blotting檢測大鼠胎盤中⑶81表達(dá)情況
[0033] 圖8、免疫組化檢測大鼠胎盤中⑶81表達(dá)情況
[0034] 其中箭頭表示單個(gè)的大滋養(yǎng)細(xì)胞。
[0035] 圖9、免疫組化檢測子宮螺旋動(dòng)脈⑶81和CK的表達(dá)
【具體實(shí)施方式】
[0036] 實(shí)施例1 :⑶81在早發(fā)型重度PE患者胎盤及血清中表達(dá)
[0037] 1、材料，試劑，設(shè)備
[0038] 1. 1人胎盤組織及血清來源
[0039] 選擇2011年10月至2014年10月間在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院擇期剖宮產(chǎn) 分娩的單胎初產(chǎn)婦，簽署知情同意書，排除慢性高血壓、孕前糖尿病、腎病、胎膜早破、感染 性疾病以及其它妊娠合并癥和并發(fā)癥。重度PE的診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)Williams產(chǎn)科學(xué)第23版。 在孕婦剛?cè)朐撼槿§o脈血，離心后血清保留_80°C冰箱。胎盤娩出后lOmin內(nèi)采集胎盤母面 正中（避開鈣化區(qū)及出血點(diǎn)）大小約1.0復(fù)\1.0復(fù)\1.0(^的組織數(shù)塊，包括胎盤全層，從 底蛻膜板到絨毛板，不含羊膜層。用DEPC水處理過的PBS反復(fù)漂洗干凈，干紗布吸除水分， 裝入EP管后迅速經(jīng)液氮速凍后置于-80°C冰箱備用。同時(shí)記錄產(chǎn)婦年齡、身高、孕前體重、 孕齡、發(fā)病以來最高血壓及最多的蛋白尿、血谷丙轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮，以及新生兒性別、出生體 重等。選擇同期孕齡相匹配的正常妊娠婦女為對照組（表1)。
[0040]表1
[0041]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 膜蛋白CD81作為檢測靶標(biāo)在制備預(yù)測子癇前期的試劑盒中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的試劑盒中含有檢測膜蛋白CD81表達(dá) 量的試劑；通過所述的試劑盒檢測孕婦妊娠前或妊娠初期以及妊娠過程中膜蛋白CD81的 表達(dá)量，如果妊娠過程中膜蛋白CD81的表達(dá)顯著高于妊娠前或妊娠初期，則預(yù)測孕婦患有 子癇前期。
3. 膜蛋白CD81作為檢測靶標(biāo)在制備子癇前期分型試劑盒中的應(yīng)用。
4. 膜蛋白CD81分子的拮抗物質(zhì)在制備防治子癇前期的藥物中的應(yīng)用。
5. -種用于預(yù)測子癇前期的檢測試劑盒，其特征在于包括用于檢測膜蛋白CD81表達(dá) 量的試劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于預(yù)測子癇前期的檢測試劑盒，其特征在于所述的檢測膜 蛋白⑶81表達(dá)量的試劑選自Westernblot檢測膜蛋白⑶81表達(dá)量的試劑、免疫組織化學(xué) 或組織免疫熒光檢測膜蛋白CD81表達(dá)量的試劑，或者酶聯(lián)免疫檢測膜蛋白CD81表達(dá)量的 試劑。
7. -種用于子癇前期分型的試劑盒，其特征在于包括用于檢測膜蛋白CD81表達(dá)量的 試劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于子癇前期分型的試劑盒，其特征在于所述的檢測膜蛋白 ⑶81表達(dá)量的試劑包括Westernblot檢測膜蛋白⑶81表達(dá)量的試劑、免疫組織化學(xué)或組 織免疫熒光檢測膜蛋白CD81表達(dá)量的試劑，或者酶聯(lián)免疫檢測膜蛋白CD81表達(dá)量的試劑。
9. 一種用于防治子癇前期的藥物，其特征在于包括膜蛋白CD81分子的拮抗物質(zhì)以及 藥學(xué)上允許的輔料。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物，其特征在于所述的膜蛋白CD81分子的拮抗物質(zhì)選自 中和抗體、siRNA或者與CD81具有穩(wěn)定結(jié)合的分子；所述的與CD81具有穩(wěn)定結(jié)合的分子優(yōu) 選四次跨膜蛋白同家族成員CD9。
【專利摘要】本發(fā)明公開了膜蛋白CD81在子癇前期預(yù)測、分型及診療中的應(yīng)用。發(fā)明人通過臨床調(diào)查、體外分子實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CD81通過抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力導(dǎo)致子宮螺旋動(dòng)脈的重塑障礙，從而引起PE發(fā)病。故CD81可作為預(yù)測PE的標(biāo)記分子并可能成為PE分型的標(biāo)記分子，且有可能成為防治PE的靶點(diǎn)。
【IPC分類】A61K48-00, A61P15-00, G01N33-68, A61K39-39, G01N33-577
【公開號】CN104698187
【申請?zhí)枴緾N201510095649
【發(fā)明人】胡婭莉, 周艷, 刁振宇, 沈莉, 顏桂軍, 趙光峰
【申請人】南京鼓樓醫(yī)院
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月3日