抗凝血酶Ⅲ活性測(cè)定試劑盒的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種臨床檢測(cè)試劑制備方法，具體為抗凝血酶III活性測(cè)定試劑盒的 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗凝血酶111(&11衍讓1'〇1111^1111141'111)是凝血酶及因子乂11(1、乂1(1、1乂(1、父(1 等含絲氨酸的蛋白酶的抑制劑。它與凝血酶通過精氨酸-絲氨酸肽鍵相結(jié)合。形成ATIII 凝血酶復(fù)合物而使酶滅活，肝素可加速這一反應(yīng)達(dá)千倍以上。肝素與ATIII所含的賴氨酸 結(jié)合后引起ATIII構(gòu)象改變，使ATIII所含的精氨酸殘基更易與凝血酶的絲氨酸殘基結(jié) 合。一旦肝素-ATIII凝血酶復(fù)合物形成，肝素就從復(fù)合物上解離，再次與另一分子ATIII 結(jié)合而被反復(fù)利用。ATIII-凝血酶復(fù)合物則被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所消除。大量相關(guān)文獻(xiàn)已經(jīng) 證明，臨床上血漿中AT-III的活性變化與多種疾病密切相關(guān)。AT-III的增多或減少是出 血、血栓的關(guān)鍵，它在肝病、腎病、肺病、腫瘤、DIC、妊娠高血壓綜合征等疾病的診斷中具有 重要意義，對(duì)腦梗、心梗等突發(fā)疾病的協(xié)助診斷方面尤顯重要。因此，AT-III活性檢測(cè)在臨 床上具有良好的應(yīng)用前景。
[0003]ATIII發(fā)色底物法檢測(cè)原理是在待測(cè)血漿中加入過量的凝血酶，凝血酶與血漿中 ATIII形成1 : 1復(fù)合物，剩余的凝血酶作用于發(fā)色底物，裂解出顯色基團(tuán)，顯色程度與剩 余凝血酶的量呈正相關(guān)，而與血漿中ATIII活性呈負(fù)相關(guān)。在臨床研宄中應(yīng)用越來越廣泛。 目前進(jìn)口的AT-III發(fā)色底物法活性的試劑盒已有供應(yīng)，但價(jià)格昂貴。因此，研宄開發(fā)價(jià)格 合理、特異性和靈敏度較高的國(guó)內(nèi)自主品牌的AT-III活性檢測(cè)試劑盒對(duì)于提高AT-III臨 床診斷水平具有重要意義和價(jià)值。
[0004] 專利CN102690862A，公開了一種抗凝血酶III測(cè)定試劑盒（發(fā)色底物法），由于 采用了肝素衍生物和進(jìn)口的凝血酶，因此成本比較高。并且該現(xiàn)有技術(shù)在全自動(dòng)凝血儀上 進(jìn)行ATIII活性檢測(cè)時(shí)需要更改參數(shù)，更改的參數(shù)為待測(cè)血漿5y1，加入120y1稀釋液后 再取50y1血漿和60y1R1試劑，再加入60y1R2試劑，最后進(jìn)行顯色。此外在后臺(tái)參數(shù)的 設(shè)計(jì)上，需要更改參數(shù)光量設(shè)置，機(jī)器自身在檢測(cè)中設(shè)置的參數(shù)光量值為"200-400"，在檢 測(cè)的過程中需要將"200 "改為"0"。該技術(shù)由于成本比較高，因此減少了試劑的用量，體積 的縮小可能會(huì)引起最后在比色的過程中部分的數(shù)值不能顯示。因此，將參數(shù)光量值設(shè)置調(diào) 整為了 "0"。該技術(shù)成本較高，并且操作不方便，結(jié)果也容易出現(xiàn)誤差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種制備ATIII活性檢測(cè)試劑盒的方法。制備得 到的產(chǎn)品成本低，穩(wěn)定性好，可配套用于多種凝血儀使用，滿足臨床對(duì)于ATIII活性檢測(cè)的 要求。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案，
[0007] 抗凝血酶III活性測(cè)定試劑盒的制備方法，包括以下步驟：
[0008] (1)使用PH8. 4的10~50mmol/LTris-HCl溶液將凝血酶凍干粉末和肝素鈉溶 解，配制成S1試劑，S1試劑的凝血酶濃度為5~20IU/mL，肝素濃度為0. 2~10IU/mL;
[0009] (2)將發(fā)色底物S-2238 或Sar-Pro-Arg-P-nitroanilide用PHL0 的 10 ~ 50mm〇l/LTris-HCl溶解，配制成底物濃度為2~5ymol/mL的溶液，為S2試劑；
[0010] (3)分別在S1試劑和S2試劑中加入助劑進(jìn)行凍干，形成S1凍干品和S2凍干品；
[0011] S1試劑加入的助劑在S1試劑中的含量為：BSA為0. 5~5%，KC1濃度為15~ 250mmol/L、EDTA2K濃度為1~10mmol/L、抑肽酶0? 1~5IU/mL、聚乙二醇6000濃度為1~ 5mg/ml；
[0012] S2試劑加入的助劑在S2試劑中的質(zhì)量比例為：BSA為0. 5~5%、甘露醇為1~ 5% ；
[0013] (4)使用含有PH8. 4 的 10 ~50mmol/LTris-HCl、0. 1 ~0? 5mg/ml疊氮化鈉的S1 試劑復(fù)溶液復(fù)溶S1凍干品，配制成S1凍干復(fù)溶試劑；使用超純水溶解S2凍干品，配制成S2 凍干復(fù)溶試劑；
[0014] (5)采取新鮮多人份混合血漿，加入穩(wěn)定劑、防腐劑物質(zhì)進(jìn)行凍干，制備得到 ATIII校準(zhǔn)品；
[0015] 采用WH0/BS/10. 2146標(biāo)準(zhǔn)品，在全自動(dòng)凝血儀CA-1500上對(duì)ATIII校準(zhǔn)品進(jìn)行定 值，定值范圍ATIII%為90%~110%;
[0016] (6)在全自動(dòng)凝血儀CA-1500上，采用定值的ATIII校準(zhǔn)品、S1凍干復(fù)溶試劑和S2 凍干復(fù)溶試劑制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性相關(guān)系數(shù)大于〇. 99;
[0017] (7)使用待測(cè)血漿樣品在全自動(dòng)凝血儀CA-1500上進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)得到待測(cè)血漿 樣本的0D值，機(jī)器自動(dòng)計(jì)算出待測(cè)血漿樣本中ATIII的活性值，檢測(cè)程序如下：16y1待測(cè) 血漿樣品中加入175ylS1凍干復(fù)溶試劑和33ylS2凍干復(fù)溶試劑后進(jìn)行顯色反應(yīng)，整個(gè) 過程不調(diào)整儀器自身的任何參數(shù)。
[0018] 本發(fā)明提供抗凝血酶III活性測(cè)定試劑盒的制備方法，制備得到的試劑盒成本 低，線性范圍寬達(dá)到200 %~3. 1 %，穩(wěn)定性好，在全自動(dòng)凝血儀器上檢測(cè)不需要更改任何 參數(shù)，操作簡(jiǎn)單，可配套用于多種凝血儀使用，滿足臨床對(duì)于ATIII活性檢測(cè)的要求。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0020] 實(shí)施例以制備ATIII活性檢測(cè)試劑以及具體在全自動(dòng)凝血儀CA-1500上檢測(cè)為 例。
[0021] (1)使用10~50mmol/LTris-HClPH8. 4溶液將凝血酶凍干粉末和肝素鈉溶解， 將不同濃度的凝血酶和肝素鈉溶液進(jìn)行混合，配制成S1試劑，凝血酶濃度為5~20IU/mL， 肝素濃度為〇. 2~10IU/mL。
[0022] (2)將發(fā)色底物S-2238 或Sar-Pro-Arg-P-nitroanilide用PHL0 的 10 ~ 50mm〇l/LTris-HCl溶解，配制成底物濃度為2~5ymol/mL的溶液，為S2試劑。
[0023] (3)分別在S1試劑和S2試劑中加入穩(wěn)定劑和賦形劑進(jìn)行凍干，即可制備成S1 凍干品和S2凍干品。S1試劑加入的助劑在S1試劑中的含量為：0. 5%~5%BSA，20~ 50mmol/LTris-HCl，15 ~250mmol/LKC1、1 ~10mmol/LEDTA2K/L、0. 1 ~5IU/mL抑肽酶、 1~5mg/ml聚乙二醇6000 ;。S2試劑加入的助劑在S2試劑中的質(zhì)量比例為：BSA為0. 5~ 5%、甘露醇為1~5%。
[0024] (4)使用含有PH8. 4 的 10 ~50mmol/LTris-HCl、0. 1 ~0? 5mg/ml疊氮化鈉的S1 試劑復(fù)溶液復(fù)溶S1凍干品，配制成S1凍干復(fù)溶試劑；使用超純水溶解S2凍干品，配制成S2 凍干復(fù)溶試劑。
[0025] (5)在CA-1500上，使用定值好的ATIII校準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線線 性相關(guān)系數(shù)大于0. 99。
[0026] (6)使用待測(cè)血漿樣品在全自動(dòng)凝血儀CA-1500上進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)得到樣本的0D 值，機(jī)器自動(dòng)計(jì)算出待測(cè)樣本中ATIII的活性值，檢測(cè)程序如下：16wl血漿中加入175y1 S1凍干復(fù)溶試劑和33y1S2凍干復(fù)溶試劑后進(jìn)行顯色反應(yīng)，整個(gè)過程不調(diào)整儀器自身的任 何參數(shù)。
[0027]廣品性能檢驗(yàn)測(cè)試：
[0028] (1)在全自動(dòng)凝血儀器上的檢測(cè)結(jié)果
[0029] 用SysmexCA-1500全自動(dòng)血凝儀及配套抗凝血酶III檢測(cè)試劑（SIEMENS)和本 實(shí)施例制的的ATIII檢測(cè)試劑制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。
[0030] 表1ATIII標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果
[0031]
【主權(quán)項(xiàng)】
1.抗凝血酶III活性測(cè)定試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 使用PH8. 4的10~50mmol/LTris-HCl溶液將凝血酶凍干粉末和肝素鈉溶解，配 制成S1試劑，S1試劑的凝血酶濃度為5~20IU/mL，肝素濃度為0. 2~10IU/mL; (2) 將發(fā)色底物S-2238 或Sar-Pro-Arg-P-nitroanilide用PH7. 0 的 10 ~50mmol/ LTris-HCl溶解，配制成底物濃度為2~5ymol/mL的溶液，為S2試劑； (3) 分別在S1試劑和S2試劑中加入助劑進(jìn)行凍干，形成S1凍干品和S2凍干品； S1試劑加入的助劑在S1試劑中的含量為：BSA為0. 5~5 %，KC1濃度為15~250mmol/L、EDTA2K濃度為1~10mmol/L、抑狀酶0. 1~5IU/mL、聚乙二醇6000濃度為1~5mg/ml; S2試劑加入的助劑在S2試劑中的質(zhì)量比例為：BSA為0. 5~5%、甘露醇為1~5% ; ⑷使用含有PH8. 4的10~50mmol/LTris-HCl、0. 1~0? 5mg/ml疊氮化鈉的S1試劑 復(fù)溶液復(fù)溶S1凍干品，配制成S1凍干復(fù)溶試劑；使用超純水溶解S2凍干品，配制成S2凍 干復(fù)溶試劑； (5) 采取新鮮多人份混合血漿，加入穩(wěn)定劑、防腐劑物質(zhì)進(jìn)行凍干，制備得到ATIII校 準(zhǔn)品； 采用WH0/BS/10. 2146標(biāo)準(zhǔn)品，在全自動(dòng)凝血儀CA-1500上對(duì)ATIII校準(zhǔn)品進(jìn)行定值， 定值范圍ATIII%為90%~110% ; (6) 在全自動(dòng)凝血儀CA-1500上，采用定值的ATIII校準(zhǔn)品、S1凍干復(fù)溶試劑和S2凍 干復(fù)溶試劑制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性相關(guān)系數(shù)大于〇. 99 ; (7) 使用待測(cè)血漿樣品在全自動(dòng)凝血儀CA-1500上進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)得到待測(cè)血漿樣本 的0D值，機(jī)器自動(dòng)計(jì)算出待測(cè)血漿樣本中ATIII的活性值，檢測(cè)程序如下：16y1待測(cè)血漿 樣品中加入175ylS1凍干復(fù)溶試劑和33ylS2凍干復(fù)溶試劑后進(jìn)行顯色反應(yīng)，整個(gè)過程 不調(diào)整儀器自身的任何參數(shù)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種臨床檢測(cè)試劑制備方法，具體為抗凝血酶III活性測(cè)定試劑盒的制備方法，Tris-HCl溶解凝血酶凍干粉末和肝素鈉制成S1試劑，將凝血酶發(fā)色底物S-2238或Sar-Pro-Arg-P-nitroanilide用Tris-HCl溶解制成S2試劑，S1試劑和S2試劑凍干形成S1凍干品和S2凍干品；含Tris-HCl疊氮化鈉溶液復(fù)溶S1凍干品配制成S1凍干復(fù)溶試劑；超純水溶解S2凍干品制成S2凍干復(fù)溶試劑；多人份混合血漿進(jìn)行凍干，制備得到ATIII校準(zhǔn)品；對(duì)ATIII校準(zhǔn)品進(jìn)行定值，定值范圍ATIII％為90％～110％；采用定值的ATIII校準(zhǔn)品、S1凍干復(fù)溶試劑和S2凍干復(fù)溶試劑制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性相關(guān)系數(shù)大于0.99；待測(cè)血漿樣品中加入S1凍干復(fù)溶試劑和S2凍干復(fù)溶試劑后進(jìn)行顯色反應(yīng)。該方法制備得到的試劑盒成本低，線性范圍寬，穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)單。
【IPC分類】G01N33-86
【公開號(hào)】CN104714036
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510151571
【發(fā)明人】肖薇, 林方昭, 謝兆林, 楊顯福, 孫小成, 肖玲
【申請(qǐng)人】成都協(xié)和生物技術(shù)有限責(zé)任公司, 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所
【公開日】2015年6月17日
【申請(qǐng)日】2015年4月1日