一種檢測淀粉樣多肽聚集及其聚集抑制劑評估的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及淀粉樣多肽，特指一種檢測淀粉樣多肽聚集及其聚集抑制劑評估的方 法。
【背景技術】
[0002] 目前已知蛋白質(zhì)及多肽的異常集聚和40多種疾病相關，如神經(jīng)退行性疾病阿爾 茨海默氏病和帕金森綜合癥等；淀粉樣蛋白質(zhì)（多肽）的寡聚體及其集聚所形成的斑塊被認 為是這些疾病的主要病因之一；基礎醫(yī)學以淀粉樣蛋白為靶點開始進行研宄，發(fā)展藥物減 少淀粉樣多肽的產(chǎn)生和降低淀粉樣多肽的集聚及毒性；目前在科研和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中，針對疾 病的相關靶多肽和蛋白的特效藥物開發(fā)是十分重要的研宄領域，具有極其重要的研宄價值 和經(jīng)濟價值。
[0003] 醫(yī)藥學關于藥物研發(fā)的嚴肅性要求新發(fā)現(xiàn)的抑制劑在進入臨床使用前需要進行 嚴格的使用效果及安全性的評價，主要是基于生物細胞毒理性實驗和動物模型實驗，這些 評價流程非常嚴格和繁瑣復雜；阿爾茨海默氏病的藥物研宄通常需要培養(yǎng)大批量細胞供實 驗使用并建立特殊的動物模型，例如人神經(jīng)細胞瘤細胞系SK-N-SH和通過分子生物學方 式誘導產(chǎn)生淀粉樣多肽在動物腦內(nèi)來構建阿爾茨海默氏病的動物模型，而實驗結果讀取需 要使用酶聯(lián)免疫吸附測定法和蛋白質(zhì)印跡法獲得，雖然實驗結果相對可靠，但實驗周期很 長而且成本很高，很大程度上減緩了對原有的和新開發(fā)的抑制劑篩選和評價進程；由于生 物體內(nèi)影響因素很多，即使細胞和動物實驗篩選到有效果的抑制劑，也難以最終確定抑制 劑的作用機制；相比之下，將候選藥物在體外進行初步篩選和評價，可以節(jié)約大量的時間和 資源。由于淀粉樣多肽的聚集與其毒性密切相關，所以可以通過檢測淀粉樣多肽的聚集，以 及設計分子抑制淀粉樣多肽聚集來初步評價淀粉樣多肽以及其聚集抑制劑效果；目前，多 肽聚集抑制劑的體外篩選已經(jīng)取得了一些研宄進展，如2006年基于綠色熒光融合蛋白技 術，Kim等人通過熒光分析技術篩選了三嗪類衍生物化合物分子庫，發(fā)現(xiàn)了新的抑制劑分 子；2011年Mook-Jung研宄組利用金納米粒子開展了淀粉樣多肽聚集抑制劑的篩選和評價 工作，取得了一定的成果；在2013年，國內(nèi)的周飛艨課題組研宄利用二茂鐵標記的熒光淀 粉樣多肽結合高效液相色譜（HPLC)篩選淀粉樣多肽的聚集抑制劑；但目前已知在體外篩 選多肽聚集抑制劑的各種方法中，大多采取熒光探針技術，是否可以開發(fā)一種免標記方法， 測定淀粉樣多肽聚集狀態(tài)，并對其相關的聚集抑制劑進行篩選評價，是研宄者一直關注的 問題。
[0004] 石英晶體微天平（quartz crystal microbalance，QCM)是一種非常靈敏的質(zhì)量檢 測儀器，理論上可以檢測到相當于單分子層或原子層的幾分之一的質(zhì)量變化；在科學研宄 上，QCM早期主要用于檢測真空和氣態(tài)環(huán)境下的表面質(zhì)量變化，而現(xiàn)在已逐漸擴展到液態(tài)環(huán) 境下檢測，尤其是在生物學檢測領域，國內(nèi)的QCM研宄發(fā)展十分迅速；計劍、劉光明等人和 杜濱陽研宄組分別利用QCM研宄表面多層膜的組裝制備和高分子薄膜；馬宏偉研宄組應用 QCM研宄了莖環(huán)ssDNA開環(huán)和嗜酸性古生菌細胞膜耐酸的機理等；張廣照課題組利用QCM 研宄磷脂膜表面和疏水基團的相互作用和溫敏高分子刷。
[0005] 由于石英晶體微天平對于表面質(zhì)量增加非常靈敏，可以用來研宄淀粉樣多肽在表 面上的實時生長和集聚行為，無需熒光標記，這和傳統(tǒng)的方法相比具有優(yōu)勢：傳統(tǒng)方法硫磺 素染色（Thioflavin T binding，ThT)通常需要幾個小時甚至更長時間才能測定多肽的集 聚行為，QCM方法在數(shù)分鐘內(nèi)就能得到結果，同時QCM作為一種無標記方法也能避免如熒 光檢測法帶來的繁瑣操作和毒性；基于QCM可以開展較大規(guī)模的多肽相關藥物評價和篩 選，為藥物的細胞及動物實驗創(chuàng)造較好基礎，大大加快相關藥物的研發(fā)。
[0006] QCM檢測液相條件固體表面質(zhì)量的變化 石英晶體微天平（Quartz crystal microbalance，QCM)是一種利用石英晶體壓電效應 檢測表面質(zhì)量變化的儀器；當外部施加一個電場時，晶體會產(chǎn)生機械振動，當石英晶體的厚 度為電極的機械振蕩波半波長奇數(shù)倍時就會發(fā)生共振，關于真空中其共振頻率變化（Δ/η )與面均質(zhì)量變化的關系由Sauerbrey方程可以得到。
【主權項】
1. 一種檢測淀粉樣多肽聚集及其聚集抑制劑評估的方法，其特征在于具體步驟如下： 將淀粉樣多肽充分溶解分散在六氟異丙醇中得到溶液A，對溶液A進行干燥，干燥后的 淀粉樣多肽使用去離子水進行溶解，配置成濃度為250-1000yg/mL的淀粉樣多肽水溶液， 稱為溶液B; 得到QCM共振頻率基線后，取上述溶液B溶液通入石英晶體微天平傳感器中，隨著多肽 分子在芯片表面的吸附集聚，QCM頻率信號和能量耗散將發(fā)生改變，檢測到的信號作為抑制 劑組的陽性對照B; 將濃度為10-200yg/mL的聚集抑制劑的水溶液稱為溶液C，在得到QCM共振頻率基線 后，將溶液C通入QCM傳感器得到的QCM頻率和能量耗散信號作為聚集抑制劑評價的陰性 對照C使用； 在得到QCM共振頻率基線后，將待評價的淀粉樣多肽水溶液和抑制劑水溶液混合得到 混合溶液D，混合溶液D中淀粉樣多肽的濃度與前述陽性對照--溶液B的濃度一致，抑制 劑分子的濃度與陰性對照一一溶液C的濃度一致；將混合液D所得到的QCM能量頻率信號 與陽性對照B及陰性對照C進行比較，QCM頻率信號下降的數(shù)值越大，證明在表面上集聚的 多肽越多；如果：陰性對照組的頻率變化〉抑制劑組的頻率變化〉陽性對照組的頻率變化， 說明該抑制劑對于多肽集聚具有抑制效果。
2. 如權利要求1所述的一種檢測淀粉樣多肽聚集及其聚集抑制劑評估的方法，其特征 在于將淀粉樣多肽充分溶解分散在六氟異丙醇中得到溶液A指：每Iml六氟異丙醇中加入 Img淀粉樣多肽，晃動溶液A使多肽干粉能夠充分溶解分散，得到濃度為lmg/mL多肽溶液 A0
3. 如權利要求2所述的一種檢測淀粉樣多肽聚集及其聚集抑制劑評估的方法，其特征 在于：晃動溶液A以使之充分溶解的時間為24h。
4. 如權利要求1所述的一種檢測淀粉樣多肽聚集及其聚集抑制劑評估的方法，其特征 在于所述得到QCM共振頻率基線指：將去離子水通入QCM傳感器，待水進入傳感器使QCM 頻率曲線達到穩(wěn)定狀態(tài)后即為基線狀態(tài)。
5. 對如權利要求1所述方法驗證的方法，其特征在于：采用原子力顯微鏡檢測芯片表 面形貌驗證，在表面進行完QCM試驗后，將芯片干燥后，對抑制劑組和對照組芯片進行AFM 形貌觀測，驗證QCM結果；如果AFM圖中有大量多肽纖維出現(xiàn)，則證明多肽抑制效果差，反 之，如果所得AFM圖很少見到多肽的纖維，則證明多肽抑制劑作用很強。
【專利摘要】本發(fā)明涉及淀粉樣多肽，特指一種檢測淀粉樣多肽聚集及其聚集抑制劑評估的方法。該方法利用石英晶體微天平(QCM)能檢測質(zhì)量微小變化的優(yōu)勢，將淀粉樣蛋白（多肽）及其淀粉樣蛋白（多肽）與聚集抑制劑分子混合溶液在石英晶體微天平的芯片表面上孵育，經(jīng)過一定時間后，淀粉樣蛋白（多肽）將在芯片表面集聚，引發(fā)石英晶體微天平信號，由石英晶體微天平產(chǎn)生信號強弱可判斷多肽聚集抑制劑分子的抑制作用，另外結合原子力顯微鏡（AFM）表征可以對QCM結果進行確認，綜合兩種測量方法綜合評估淀粉樣多肽抑制劑效果。<b/>
【IPC分類】G01N5-00, G01N1-28, G01Q60-24
【公開號】CN104729946
【申請?zhí)枴緾N201410781868
【發(fā)明人】汪杰, 劉磊, 董明東
【申請人】江蘇大學
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2014年12月18日