一種美洲大蠊抗腫瘤活性提取物cⅱ-3的分子量檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗腫瘤有效成分的分子量檢測方法，特別涉及一種具有抗腫瘤作 用的美洲大蠊活性部位提取物的質(zhì)量控制方法。
【背景技術】
[0002] 美洲大蠊)屬昆蟲綱，蜚蠊目，蜚蠊科，大蠊屬，俗稱幢 螂。其入藥史記載早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其謂"味咸寒，治血痰癥堅，寒熱，破積聚，喉咽痹， 內(nèi)寒無子"?！侗静菥V目》中亦有記載，蜚蠊又名茶婆蟲、香娘子，為本經(jīng)中品，其主治"瘀血， 癥堅，寒熱，下氣，利血脈"，常用于治療小兒疳積、疔瘡、喉蛾，無名腫毒、膨脹、梅毒以及毒 蛇、蜈蚣咬傷等疾病。
[0003] 長期的科研探索發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊具有廣泛的藥用價值和開發(fā)前景。大量研宄證實 了美洲大蠊具有抗腫瘤、抗病毒、促進組織修復、保肝、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用。目前，以美洲大 蠊為原料藥材開發(fā)研制的藥物有"康復新液"、"心脈隆注射液"、"肝龍膠囊"等，因其療效顯 著、副作用小等優(yōu)點而廣泛應用于臨床。研宄發(fā)現(xiàn)，"康復新液"不僅對體表創(chuàng)傷的修復作用 顯著，還可以治療口腔潰瘍、胃及十二指腸潰瘍、潰瘍性結腸炎等疾病。"心脈隆注射液"可 改善微循環(huán)、興奮呼吸、利尿、增強心肌收縮力、增大體內(nèi)臟器血液循環(huán)。"肝龍膠囊"為昆蟲 類抗乙肝病毒（HBV)的國家二類中藥新藥。該藥具有疏肝理脾、活血解毒的作用，在慢性乙 型肝炎的治療方面效果顯著，具有安全、有效、副作用小、給藥方便等特點。
[0004] 本發(fā)明研宄的具有抗腫瘤活性的美洲大蠊提取物C II -3由大理學院科研團隊經(jīng) 長期不懈的努力精心研制而成，其制備方法為：將新鮮或干燥的美洲大蠊蟲體經(jīng)醇水提取、 大孔吸附樹脂柱層析、醇溶劑洗脫等工藝制得（中國專利：CN200810059054)。
[0005] 大量文獻報道了美洲大蠊提取物對腫瘤生長有顯著的抑制作用。通過對美洲大蠊 提取物C II -3進行體外篩選，證明了該提取物對3株人肺癌細胞的生長均有一定的抑制作 用[胡艷芬，呂小滿，劉光明，美洲大蠊提取物對3株人肺癌細胞的體外抑制作用，大理學院 學報，2009,8(12) :1]。何正春等人將美洲大蠊醇提物通過聚酰胺柱層析分離得到不同部 位后，采用MTT法對所得部位進行腫瘤細胞毒性測試，發(fā)現(xiàn)高活性部位的IC 5tl值接近陽性藥 的三分之一，證明美洲大蠊醇提物中存在抑制腫瘤細胞生長的物質(zhì)[何正春，王曉雨，楊雷 香，美洲大蠊提取物對3株人體生殖系統(tǒng)腫瘤細胞的細胞毒性研宄，西北藥學雜志，2009， 24(4) :271]。文獻報道美洲大蠊提取物高劑量C II -3可抑制H22荷瘤小鼠腫瘤的生長，且 能降低小鼠血清中血管生長因子（VEGF)的含量，機制可能為減少VEGF的表達，進而發(fā)揮抑 制腫瘤生長的作用[陳俊雅，耿玲，張旭強，美洲大蠊提取物C II -3對H22肝癌小鼠血管生 成作用的研宄，腫瘤學雜志，2012,8 (4) :274]。
[0006] 在中藥現(xiàn)代化發(fā)展迅猛的時代，藥物的質(zhì)量問題應倍受重視。關于美洲大蠊藥材、 提取物及其藥物制劑的質(zhì)量控制方法已有許多文獻報道。本發(fā)明建立了美洲大蠊抗腫瘤活 性提取物C II -3的分子量檢測方法，為開發(fā)研制以美洲大蠊為原料藥材的新型抗腫瘤藥物 的質(zhì)量控制提供參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術問題在于研宄美洲大蠊抗腫瘤活性提取物C II -3的分子 量及其分布，設計該活性提取物的質(zhì)量控制方法。
[0008] 有關美洲大蠊抗腫瘤活性提取物C II -3的分子量檢測方法尚未見文獻報道，本發(fā) 明通過研宄，選用不同的分離柱進行分析，嘗試了多種洗脫體系與色譜條件，最終建立了美 洲大蠊抗腫瘤活性提取物C II -3的分子量檢測方法。
[0009] 本發(fā)明采用HPSEC法，該方法包括以下步驟： (1)色譜條件與系統(tǒng)：以Superdex P印tide 10/300GL或TSK G2000PWa為色譜柱； 以水（含 0· 1%TFA)-乙腈（0-50:100-50V/V)、磷酸鹽緩沖液（pH=5~8)、Tris-HCl 緩沖液 (pH=7~9)中的一種為流動相，流速0. 5~0. 7ml/min ;檢測波長為200nm~400nm ;進樣量為 5-50μ1 ;柱溫為 20°C~30°C。
[0010] (2)標準物質(zhì)溶液的配制：稱取細胞色素 C、VB12、氧化型谷胱甘肽、還原型谷胱甘 肽、肌苷及酪氨酸適量，加水制成每1ml中各含0. lmg~2mg的溶液，分別過0. 22 μ m濾膜，作 為標準物質(zhì)溶液。
[0011] (3)標準曲線的繪制：分別吸取上述標準物質(zhì)溶液進行色譜分析，以標準物質(zhì)出 峰的保留時間R t (min)為橫坐標，其分子量的對數(shù)Log (Mr)為縱坐標，繪制標準曲線方程。
[0012] (4)供試品溶液的制備：稱取美洲大蠊抗腫瘤活性提取物C II -3干粉20mg于IOml 量瓶中，加水，搖勻，定容至刻度。用0.22 ym濾膜過濾，即得。
[0013] (5)測定方法：吸取上述供試品溶液進行色譜分析，將樣品出峰的保留時間代入 標準曲線方程，可求得各峰的相對分子質(zhì)量，通過面積歸一化法可計算出不同分子量范圍 的相對百分比。
[0014] 本發(fā)明所述的活性提取物C II -3的分子量檢測方法，優(yōu)選如下檢測方法： (1)色譜條件與系統(tǒng)：以Superdex Peptide 10/300GL為色譜柱；以乙腈：水（含 0. 1%TFA)=25:75為流動相，流速0. 5ml/min ;檢測波長為214nm ;進樣量為20 yL ;柱溫為 25。。。
[0015] (2)標準物質(zhì)溶液的配制：稱取細胞色素 C、氧化型谷胱甘肽、肌苷及酪氨酸適量， 加水制成每1ml中各含lmg、2mg、lmg、0. 5mg的單標溶液，吸取上述溶液各300 yL，混勾，過 0. 22 μ m濾膜，作為混合標準物質(zhì)溶液。
[0016] (3)標準曲線的繪制：吸取上述混合標準物質(zhì)溶液20 μ L進行色譜分析，以標準物 質(zhì)出峰的保留時間Rt (min)為橫坐標，其分子量的對數(shù)Log (Mr)為縱坐標，繪制曲線方程。
[0017] (4)供試品溶液的制備：稱取美洲大蠊抗腫瘤活性提取物C II -3干粉20mg于IOml 量瓶中，加水，搖勻，定容至刻度。用0.22 ym濾膜過濾，即得。
[0018] (5)測定方法：吸取上述供試品溶液20yL進行色譜分析，將樣品出峰的保留時間 代入標準曲線方程，可求得各峰的相對分子質(zhì)量，通過面積歸一化法可計算出不同分子量 范圍的相對百分比。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步說明。
[0020] 美洲大蠊抗腫瘤活性提取物C II -3批號：20140608、20140828、20140829、 20140830、20140905、20140906、20140907、20141008、20141009、20141010。
[0021] 以上提取物均為實驗室自制，供下列實施例使用。
[0022] (1)檢測波長的選擇 本實驗在214nm、254nm、265nm、280nm波長處觀察樣品出峰情況，結果顯不，僅有214nm 處色譜圖圖形豐富，紫外吸收值明顯。且肽鍵在214nm處有特征吸收峰，故選擇214nm為檢 測波長。
[0023] (2)流動相的選擇 方法一、磷酸緩沖鹽體系 體系a :0· 05mol · Γ1的磷酸鹽緩沖液(含有0· Imol ·廠1NaCl，ρΗ=5· 8) 體系 b :0· 05mol · Γ1 的磷酸鹽緩沖液(含有 0· Imol · L-1NaCl，ρΗ=7· 0) 體系 c :0· 05mol · Γ1 的磷酸鹽緩沖液(含有 0· Imol · L4NaCl，ρΗ=7· 8) 方法二、Tris-HCl緩沖鹽體系 體系 a :0· 05mol · T1Tris-HCl (含有 0· 3 mol · T1NaCl，ρΗ=7· 5) 體系 b :0· 05mol · T1Tris-HCl (含有 0· 3 mol · T1NaCl，ρΗ=8· 6) 方法三、有機相體系，采用等度洗脫方式 流動相為乙腈：水（含〇· 1%TFA)=25:75,流速為0· 5ml/min 三種洗脫方法中，磷酸鹽緩沖體系與Tris-HCl緩沖鹽體系洗脫樣品時，樣品出峰峰形 雜亂，且分離度差，而選擇有機相體系進行等度洗脫時，樣品分離較好，峰形清晰。因此選用 方法三作為色譜條件。
[0024] (3)線性與范圍 a)標準物質(zhì)溶液的配制：稱取細胞色素 C、VB12、氧化型谷胱甘肽、還原型谷胱甘肽、肌 苷及酪氨酸適量，加水制成每1ml中各含lmg、0. lmg、2mg、2mg、lmg、0. 5mg的單標溶液，分別 過0. 22 μ m濾膜，作為標準物質(zhì)溶液。
[0025] b)標準曲線的繪制：分別吸取上述標準物質(zhì)溶液，按已知條件進樣，進樣量 10 μ L，記錄色譜圖。結果見下表。
[0026] 表1標準物質(zhì)檢測結果
【主權項】
1. 一種美洲大蠊抗腫瘤活性提取物CII-3的分子量檢測方法，其特征在于該方法包括 下列步驟： (1)色譜條件與系統(tǒng)：以Superdex P印tide 10/300GL或TSK G2000PWXL為色譜柱， 以水（含0? 1%TFA)_乙腈（0-50:100-50V/V)、磷酸鹽緩沖液（pH=5~8)、Tris-HCl緩沖液 (pH=7~9)中的一種為流動相，流速0. 5~0. 7ml/min，檢測波長為200nm~400nm，進樣量為 5-50y 1，柱溫為20°C ~30°C ; (2) 標準物質(zhì)溶液的配制：稱取細胞色素C、VB12、氧化型谷胱甘肽、還原型谷胱甘肽、 肌苷及酪氨酸適量，加水制成每Iml中各含0.lmg~2mg的溶液，分別過0. 22ym濾膜，作為 對照品溶液； (3) 標準曲線的繪制：分別吸取上述標準物質(zhì)溶液進行色譜分析，以標準物質(zhì)出峰的 保留時間Rt(min)為橫坐標，其分子量的對數(shù)Log (Mr)為縱坐標，繪制標準曲線方程； (4) 供試品溶液的制備：稱取美洲大蠊抗腫瘤活性提取物CII-3干粉20mg于IOml量 瓶中，加水，搖勻，定容至刻度，用0.22ym濾膜過濾，即得； (5) 測定方法：吸取上述供試品溶液進行色譜分析，將樣品出峰的保留時間代入標準 曲線方程，可求得各峰的相對分子質(zhì)量，通過面積歸一化法可計算出不同分子量范圍的相 對百分比。
2. 根據(jù)權利要求1所述的活性提取物CII-3的分子量檢測方法，其特征在于色譜條件 與系統(tǒng)以SuperdexP印tide10/300GL為色譜柱，以乙腈：水（含0? 1%TFA)=25:75為流動 相，流速0. 5ml/min，檢測波長為214nm，進樣量為20yL，柱溫為25°C。
【專利摘要】本發(fā)明提供了美洲大蠊抗腫瘤活性提取物CⅡ-3的分子量檢測方法。采用高效空間排阻色譜法(HPSEC)對樣品的分子量及其分布進行測定，以Superdex Peptide 10/300GL或TSK G2000PWXL為色譜柱；以水(含0.1%TFA)-乙腈(0-50:100-50V/V)、磷酸鹽緩沖液(pH=5~8)、Tris-HCl緩沖液(pH=7~9)中的一種為流動相，流速0.5~0.7ml/min；檢測波長為200nm~400nm；進樣量為5-50μl；柱溫為20℃~30℃。根據(jù)標準物質(zhì)的線性回歸方程可計算樣品的分子量。本發(fā)明為研發(fā)以美洲大蠊為原料藥材的新型抗腫瘤藥物的安全性提供參考。
【IPC分類】G01N30-02, G01N30-06
【公開號】CN104730164
【申請?zhí)枴緾N201510123412
【發(fā)明人】肖培云, 楊永壽, 那凱歌, 劉光明, 楊敏
【申請人】大理學院
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年3月20日