一種基于氧化石墨烯和共軛聚合物復(fù)合材料的生物大分子構(gòu)象變化檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物傳感及分析領(lǐng)域，具體設(shè)及一種基于氧化石墨締和共輛聚合物復(fù) 合材料的生物大分子構(gòu)象變化檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子在生物體內(nèi)起著重要作用，每一種大分子都有著自己 特有的=維結(jié)構(gòu)，并且在執(zhí)行功能時(shí)構(gòu)象會(huì)發(fā)生特異性的變化。因此，檢測(cè)生物大分子的構(gòu) 象變化對(duì)理解其功能起著重要作用。巧調(diào)蛋白（Calmo化lin，CaM)是一種巧離子結(jié)合蛋白， 由148個(gè)氨基酸組成的單條多膚，相對(duì)分子質(zhì)量為16. 7kDa。在生物體內(nèi)，CaM參與眾多巧 離子依賴的信號(hào)傳導(dǎo)，通過(guò)與祀蛋白（蛋白激酶、離子通道等）相結(jié)合，激活祀蛋白，從而調(diào) 控生命體的代謝過(guò)程。CaM的兩個(gè)球形的末端（N-和C-末端）各含有兩個(gè)"EF-hand"，作為 巧離子結(jié)合的模體，中間由一段長(zhǎng)而富有柔性的結(jié)構(gòu)相連。與巧結(jié)合后，CaM的構(gòu)象由"閉 合狀態(tài)"轉(zhuǎn)變?yōu)?打開狀態(tài)"，中間的柔性連接變?yōu)橐欢伍L(zhǎng)而僵硬的中屯、螺旋，從而導(dǎo)致CaM 的表面暴露出更多疏水基團(tuán)W及負(fù)電荷的減少。該種活性的Ca"/CaM復(fù)合物進(jìn)而識(shí)別激活 多種祀蛋白。因此，在Ca2+介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)中，CaM的構(gòu)象變化起著重要作用。除CaM外， 生物體內(nèi)還有眾多生物大分子的構(gòu)象變化對(duì)其功能起著重要作用。盡管目前存在多種技術(shù) 檢測(cè)蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，例如：核磁共振、X-射線晶體技術(shù)、單分子光譜技術(shù)等，但是該些 方法都需要昂貴的設(shè)備、復(fù)雜操作過(guò)程W及經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)者，從而導(dǎo)致不能廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種基于氧化石墨締和共輛聚合物復(fù)合材料的生物大分子 構(gòu)象變化檢測(cè)方法。
[0004] 本發(fā)明所提供的基于氧化石墨締和共輛聚合物復(fù)合材料的生物大分子構(gòu)象變化 檢測(cè)方法，包括：基于氧化石墨締和共輛聚合物復(fù)合材料的生物大分子構(gòu)象變化輔助檢測(cè) 方法和基于氧化石墨締和共輛聚合物復(fù)合材料的生物大分子構(gòu)象變化檢測(cè)方法。
[0005] 上述基于氧化石墨締和共輛聚合物復(fù)合材料的生物大分子構(gòu)象變化輔助檢測(cè)方 法，包括下述：
[0006] a)、將標(biāo)記有巧光分子的生物大分子溶于檢測(cè)緩沖液中，得到空白溶液；向多個(gè)所 述空白溶液中的每一個(gè)空白溶液中加入該生物大分子特異性的底物，得到多個(gè)底物含量不 同的生物大分子-底物溶液，解育后，得到多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液；
[0007] b)、分別向所述空白溶液和所述多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液中的每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入相同量 的氧化石墨締，得到含氧化石墨締的空白溶液和多個(gè)含氧化石墨締的標(biāo)準(zhǔn)溶液，解育后，再 分別加入相同量的共輛聚合物，解育后，得到空白樣品和多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品；
[000引 C)、在紫外燈下分別觀察所述空白樣品和所述多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品 的顏色，得到生物大分子構(gòu)象與顏色的對(duì)應(yīng)關(guān)系；
[0009] d)、將標(biāo)記有巧光分子的構(gòu)象待測(cè)的生物大分子用所述檢測(cè)緩沖液配置成待測(cè)溶 液，所述待測(cè)溶液中的生物大分子的含量與所述a)中所述空白溶液中的生物大分子的含 量相等；向所述待測(cè)溶液中加入氧化石墨締，解育后，再加入所述共輛聚合物，解育后，得到 待測(cè)樣品，所述待測(cè)樣品中氧化石墨締的含量與所述b)中所述多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的每一個(gè) 標(biāo)準(zhǔn)樣品中的氧化石墨締的含量相等，所述待測(cè)樣品中所述共輛聚合物的含量與所述b) 中所述多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的所述共輛聚合物的含量相等；
[0010] e、在紫外燈下觀察所述待測(cè)樣品的顏色，根據(jù)步驟C)中所述生物大分子構(gòu)象與 顏色的對(duì)應(yīng)關(guān)系，輔助判斷所述待測(cè)樣品中所述生物大分子的構(gòu)象。
[00川上述方法所述a)中，所述檢測(cè)緩沖液可為肥陽(yáng)S緩沖液、Tris緩沖液、PB緩沖液 或PBS緩沖液，具體可為20mM，pH 7. 4的肥陽(yáng)S緩沖液。
[0012] 所述巧光分子為能量受體。
[0013] 所述巧光分子可為化學(xué)巧光素分子，如綠色巧光蛋白（GF巧、黃色巧光蛋白 (YFP)、青色巧光蛋白（CFP) W及它們的各種突變體，具體可為增強(qiáng)型綠色巧光蛋白 巧GF巧。
[0014] 所述空白溶液中，所述生物大分子的摩爾濃度為0. 5-5. 0 uM。
[0015] 所述生物大分子-底物溶液中，所述底物的摩爾濃度為大于0到5. OmM，具體可為： l〇-3mM、l〇-2mM、〇. lmM、〇. 3mM、0. 5mM、0. 8mM、1. OmM 或 5. OmM。
[0016] 所述解育的溫度為室溫（20-25°C )，時(shí)間為5-30min。
[0017] 所述b)中，所述含氧化石墨締的空白溶液和含氧化石墨締的標(biāo)準(zhǔn)溶液中，氧化石 墨締的質(zhì)量濃度均為5. 0-50. 0 y g/mL。
[001引所述b)中，所述共輛聚合物為式I所示的共輛聚合物：
[0019]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種生物大分子構(gòu)象變化輔助檢測(cè)方法，包括下述： a) 、將標(biāo)記有熒光分子的生物大分子溶于檢測(cè)緩沖液中，得到空白溶液；向多個(gè)所述空 白溶液中的每一個(gè)空白溶液中加入該生物大分子特異性的底物，得到多個(gè)底物含量不同的 生物大分子-底物溶液，孵育后，得到多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液； b) 、分別向所述空白溶液和所述多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液中的每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入相同量的氧 化石墨烯，得到含氧化石墨烯的空白溶液和多個(gè)含氧化石墨烯的標(biāo)準(zhǔn)溶液，孵育后，再分別 加入相同量的共軛聚合物，孵育后，得到空白樣品和多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品； c) 、在紫外燈下分別觀察所述空白樣品和所述多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的顏 色，得到生物大分子構(gòu)象與顏色的對(duì)應(yīng)關(guān)系； d) 、將標(biāo)記有熒光分子的構(gòu)象待測(cè)的生物大分子用所述檢測(cè)緩沖液配置成待測(cè)溶液， 所述待測(cè)溶液中的生物大分子的含量與所述a)中所述空白溶液中的生物大分子的含量相 等；向所述待測(cè)溶液中加入氧化石墨烯，孵育后，再加入所述共軛聚合物，孵育后，得到待測(cè) 樣品，所述待測(cè)樣品中氧化石墨烯的含量與所述b)中所述多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn) 樣品中的氧化石墨烯的含量相等，所述待測(cè)樣品中所述共軛聚合物的含量與所述b)中所 述多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的所述共軛聚合物的含量相等； e、在紫外燈下觀察所述待測(cè)樣品的顏色，根據(jù)步驟c)中所述生物大分子構(gòu)象與顏色 的對(duì)應(yīng)關(guān)系，輔助判斷所述待測(cè)樣品中所述生物大分子的構(gòu)象。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法在通過(guò)顏色變化無(wú)法判斷生物 大分子的構(gòu)象時(shí)還進(jìn)一步包括下述： f) 采集所述空白樣品的熒光發(fā)射光譜，計(jì)算所述空白樣品的熒光發(fā)射光譜上，兩個(gè)不 同的發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度比值；分別采集所述多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的熒光 發(fā)射光譜，計(jì)算每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的熒光發(fā)射光譜上，所述兩個(gè)不同的發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng) 度比值，從而得到生物大分子構(gòu)象與所述兩個(gè)不同的發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度比值的對(duì)應(yīng)關(guān) 系； g) 采集所述待測(cè)樣品的熒光光譜，計(jì)算所述待測(cè)樣品的熒光光譜上所述兩個(gè)不同的發(fā) 射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度比值，根據(jù)所述f)中的所述生物大分子構(gòu)象與所述兩個(gè)不同的發(fā)射 波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度比值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，判斷所述構(gòu)象待測(cè)的生物大分子的構(gòu)象狀態(tài)。
3. -種生物大分子構(gòu)象變化檢測(cè)方法，包括下述： 1) 將標(biāo)記有熒光分子的生物大分子溶于檢測(cè)緩沖液中，得到空白溶液；向多個(gè)所述空 白溶液中的每一個(gè)空白溶液中加入該生物大分子特異性的底物，得到多個(gè)底物含量不同的 生物大分子-底物溶液，孵育后，得到多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液； 2) 分別向所述空白溶液和所述多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液中的每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入相同量的氧 化石墨烯，得到含氧化石墨烯的空白溶液和多個(gè)含氧化石墨烯的標(biāo)準(zhǔn)溶液，孵育后，再分別 加入相同量的共軛聚合物，孵育后，得到空白樣品和多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品； 3) 采集所述空白樣品的熒光發(fā)射光譜，計(jì)算所述空白樣品的熒光發(fā)射光譜上，兩個(gè)不 同的發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度比值；分別采集所述多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的熒光 發(fā)射光譜，計(jì)算每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的熒光發(fā)射光譜上，所述兩個(gè)不同的發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng) 度比值，從而得到生物大分子構(gòu)象與所述兩個(gè)不同的發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度比值的對(duì)應(yīng)關(guān) 系； 4) 將標(biāo)記有熒光分子的構(gòu)象待測(cè)的生物大分子用所述檢測(cè)緩沖液配置成待測(cè)溶液，所 述待測(cè)溶液中的生物大分子的含量與所述1中所述空白溶液中的生物大分子的含量相等； 向所述待測(cè)溶液中加入氧化石墨烯，孵育后，再加入與所述共軛聚合物，孵育后，得到待測(cè) 樣品，所述待測(cè)樣品中氧化石墨烯的含量與所述2中所述多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣 品中的氧化石墨烯的含量相等，所述待測(cè)樣品中所述共軛聚合物的含量與所述2中所述多 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的所述共軛聚合物的含量相等； 5) 采集所述待測(cè)樣品的熒光光譜，計(jì)算所述待測(cè)樣品的熒光光譜上所述兩個(gè)不同的發(fā) 射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度比值，根據(jù)所述3中的所述生物大分子構(gòu)象與所述兩個(gè)不同的發(fā)射波 長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度比值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，判斷所述構(gòu)象待測(cè)的生物大分子的構(gòu)象狀態(tài)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述生物大分子為蛋白質(zhì)分子。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述生物大分子為鈣調(diào)蛋白；所述底 物為鈣離子。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述檢測(cè)緩沖液為HEPES緩沖液、 Tris緩沖液、PB緩沖液或PBS緩沖液； 所述熒光分子為化學(xué)熒光素分子。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述熒光分子選自下述任意一種：綠 色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、青色熒光蛋白以及它們的各種突變體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述共軛聚合物為式I所示的共軛 聚合物：
式I中，η大于8小于等于50, X = 2-12, B為鹵素。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述熒光發(fā)射光譜的條件為：激發(fā)光 波長(zhǎng)為325nm-400nm，熒光波長(zhǎng)為400nm-700nm〇
10. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述生物大分子為鈣調(diào)蛋白，所述 熒光分子為增強(qiáng)型綠色熒光蛋白，所述共軛聚合物為PFP，所述兩個(gè)不同的發(fā)射波長(zhǎng)處的熒 光強(qiáng)度比值為波長(zhǎng)510nm處的熒光強(qiáng)度與波長(zhǎng)420nm處的熒光強(qiáng)度的比值。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種基于氧化石墨烯和共軛聚合物復(fù)合材料的生物大分子構(gòu)象變化檢測(cè)方法。生物大分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變時(shí)，表面所帶的疏水基團(tuán)、電荷等性質(zhì)也發(fā)生改變，使得其與氧化石墨烯的組裝方式不同，通過(guò)共軛聚合物和生物大分子標(biāo)記的熒光分子FRET效率不同，從而判斷生物大分子所處的構(gòu)象狀態(tài)。FRET效率較低時(shí)，說(shuō)明生物大分子與石墨烯之間的結(jié)合緊密，不能有效地能量轉(zhuǎn)移，說(shuō)明生物大分子所處的構(gòu)象狀態(tài)表面帶有較多的疏水基團(tuán)以及較少的負(fù)電荷；FRET效率提高時(shí)，則相反。同時(shí)，基于底物分子特異性與生物大分子相結(jié)合，本發(fā)明還可特異性檢測(cè)誘導(dǎo)生物大分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變的底物分子。另外，在紫外燈下可以直接通過(guò)顏色變化判斷生物大分子的構(gòu)象變化。
【IPC分類】G01N21-64
【公開號(hào)】CN104749148
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510118279
【發(fā)明人】展永, 邢成芬, 袁宏博, 安海龍, 李瑞華, 牛瑞民
【申請(qǐng)人】河北工業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2015年3月18日