一種同色兜蘭菌根的染色方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及菌根染色技術(shù)領(lǐng)域，具體的是一種同色兜蘭菌根的染色方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 菌根是自然界中一種普遍存在的共生現(xiàn)象，是植物在長(zhǎng)期的生存過程中與菌根真 菌共同進(jìn)化的結(jié)果。研宄表明，菌根對(duì)多種植物的生長(zhǎng)發(fā)育有促生作用，蘭科植物也與特定 的菌根真菌結(jié)合從外界汲取養(yǎng)分。蘭科菌根真菌在宿主根部皮層細(xì)胞內(nèi)常以菌絲團(tuán)的形式 存在，且菌絲團(tuán)的壽命很短，常常會(huì)被宿主細(xì)胞降解；消解后的菌絲殘?bào)w逐漸被根部皮層細(xì) 胞溶解和吸收，最后消失。而后根部表皮細(xì)胞又會(huì)被重新侵染，形成一個(gè)反復(fù)的循環(huán)過程。 在自然條件下，蘭科菌根真菌促進(jìn)種子萌發(fā)，有助于植株吸收無(wú)機(jī)養(yǎng)分和水分。因此，蘭科 真菌對(duì)蘭科植物的生長(zhǎng)發(fā)育的作用。蘭科植物與共生真菌的關(guān)系對(duì)蘭科植物迀地共生萌發(fā) 和種群恢復(fù)具有重要意義。
[0003] 近年來(lái)，根際微生物的研宄已成為一個(gè)新的趨勢(shì)，對(duì)蘭科真菌的研宄也成為一個(gè) 熱點(diǎn)。由于蘭科植物菌根真菌的形態(tài)學(xué)特征和鑒定、共生關(guān)系的研宄均會(huì)涉及到菌根結(jié)構(gòu) 觀察與侵染率測(cè)定。隨著實(shí)驗(yàn)方法尤其是顯微技術(shù)的發(fā)展，根際菌根的染色方法也發(fā)生了 很大變化。
[0004] 同色兜蘭（Paphiopedilumconcolor)是兜蘭屬植物中的一種，是一個(gè)形態(tài)變化較 大的廣布種，與其親緣關(guān)系較密切的瀕危物種文山兜蘭、大化兜蘭、巨瓣兜蘭等種類分布地 域較為狹窄，野生種群極少。研宄同色兜蘭的菌根真菌對(duì)與其關(guān)系密切的瀕危種類有著重 要的參考意義。本發(fā)明以同色兜蘭營(yíng)養(yǎng)根為材料，摸索同色兜蘭菌根真菌的染色條件，對(duì)比 常用染色劑對(duì)同色兜蘭菌根真菌的染色效果，建立了一種同色兜蘭菌根的染色方法，為兜 蘭菌根研宄提供基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種同色兜蘭菌根的染色方法，本發(fā)明的方法對(duì)于區(qū)分蘭科 真菌與其他真菌更有效，在觀察菌絲的各種形態(tài)、入侵方式和統(tǒng)計(jì)侵染率時(shí)，可以減少誤 差。而且，在醋酸墨水染色法中使用派克黑色墨水為染色劑，可以兼顧到好的染色效果和低 毒性兩個(gè)方面。
[0006] 本發(fā)明所提供的技術(shù)方案是：
[0007] 一種同色兜蘭菌根的染色方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：
[0008] (1)材料選擇：選用健康同色兜蘭植株的營(yíng)養(yǎng)根為材料；
[0009] (2)脫色；采集同色兜蘭生長(zhǎng)良好的營(yíng)養(yǎng)根段，剪刀用75%的酒精棉表面消毒后， 截取4-5cm的根段3-4段；在自來(lái)水下沖洗干凈，切成2-3cm的小段，用濾紙吸干水，加KOH 溶液完全浸泡根系，90°C水浴處理5h后用自來(lái)水輕輕沖洗3-5次；用10%H2O2脫色5h后用 自來(lái)水沖洗3-5次；加2 %HCL溶液室溫酸化30min，去掉HCL溶液，用自來(lái)水輕輕沖洗3-5 次；
[0010] (3)染色：用加5%醋酸墨水染色；染色液室溫過夜后，將根段放在水中保存；
[0011] (4)制片：挑取脫色處理后的根段于載玻片上，再加乳酸2-3滴于根系，蓋上 24mmX50mm蓋玻片，用手指將根段稍用力壓扁；
[0012] (5)顯微鏡下觀察：使用顯微鏡觀察和拍照。
[0013] 其中，步驟（2)中所述脫色過程種KOH溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%。
[0014]其中，步驟（3)中所述5%醋酸墨水按質(zhì)量分?jǐn)?shù)由以下成分構(gòu)成：5%派克純黑書 與墨水和95%食用白醋。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0016] (1)本發(fā)明的方法對(duì)于區(qū)分蘭科真菌與其他真菌更有效，在觀察菌絲的各種形態(tài)、 入侵方式和統(tǒng)計(jì)侵染率時(shí)，可以減少誤差。
[0017] (2)本發(fā)明在醋酸墨水染色法中使用Quink黑色墨水為染色劑，可以兼顧到好的 染色效果和低毒性兩個(gè)方面。
[0018] (3)本發(fā)明方法通用性強(qiáng)。本方法也適用于其他兜蘭屬植物，如采用此方法對(duì)飄帶 兜蘭、硬葉兜蘭、文山兜蘭的菌根真菌也進(jìn)行了觀察，效果均較好。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是不同脫色條件同色兜蘭皮層染色效果（IOX);
[0020] 圖2是五種染色方法對(duì)比圖；
[0021] 主要附圖標(biāo)記說(shuō)明：
[0022] a-20%KOH處理 3h;b-20%KOH處理 5h;c-20%KOH處理 7h;d-20%KOH處理 9h; I-苯胺藍(lán)染色（IOX) ;2-酸性品紅（IOX) ;3-蘇丹紅IV(IOX) ;4-臺(tái)酚藍(lán)（IOX) ;5-l-墨水 染色（IOX) ;5-2_菌絲團(tuán)（40X) ;5-3_菌絲圈（40X) ;5-4_菌絲團(tuán)侵入方式（40X) ;5-5_根 際內(nèi)生菌（40X) ;5-6_根際內(nèi)生菌和泡囊（40X) ;5-7_根際內(nèi)生菌和泡囊（40X)。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保 護(hù)范圍并不受【具體實(shí)施方式】的限制。
[0024] 實(shí)施您U:兜蘭菌根脫色時(shí)間實(shí)驗(yàn)
[0025] 采集同色兜蘭生長(zhǎng)良好的營(yíng)養(yǎng)根段，剪刀用75%的酒精棉表面消毒后，截取 4-5cm的根段3-4段。在自來(lái)水下沖洗干凈，切成2-3cm的小段，用濾紙吸干水，加20%KOH 溶液完全浸泡根系，90°C水浴各處理3、5、7h后用自來(lái)水輕輕沖洗3次。用10%H2O2脫色 5h后用自來(lái)水沖洗3次。加2%HCl溶液室溫酸化30min，去掉HCl溶液，用自來(lái)水輕輕沖 洗3次。用加5%醋酸墨水染色（5mL派克純黑書寫墨水+95mL食用白醋）。染色液室溫過 夜后，將根段放在水中保存。
[0026] 同色兜蘭菌根不同脫色條件染色效果差異較大，3h處理的菌根皮層雜質(zhì)未消煮干 凈，造成皮層染色較深，反差不明顯；7h處理的菌根皮層雜質(zhì)少，但部分皮層細(xì)胞破裂，染 色背景雜；9h處理的菌根皮層多數(shù)已經(jīng)煮爛，皮層細(xì)胞破裂較多，細(xì)胞內(nèi)容物染色，不易進(jìn) 行壓片觀察；5h處理的菌根皮層比較干凈，雜質(zhì)少，染色效果較好（見圖1)。
[0027] 實(shí)施例2:五種染色對(duì)比試騎
[0028] 采用5種染色劑進(jìn)行染色處理：①苯胺藍(lán)染色：加苯胺藍(lán)溶液（0.Ig苯胺藍(lán) +IOOmL95%酒精）染色；②酸性品紅：加0. 05%酸性品紅（0. 15g酸性品紅+IOOmL乳酸 +IOOmL甘油+IOOmL蒸餾水）染色。③蘇丹紅IV:加蘇丹紅IV染色液（蘇丹IV染料0?lg，溶 于IOmL95%酒精中，然后加入IOmL甘油）染色；④臺(tái)酚藍(lán)：加臺(tái)酚藍(lán)溶液（0. 05g臺(tái)酚藍(lán) +乳酸、甘油、蒸餾水（1:1:DlOOmL)染色。；⑤墨水：加5%醋酸墨水染色（5mL派克純黑書 寫墨水+95mL食用白醋）。采用1. 2. 1所述方法，但20%KOH溶液完全浸泡根系，90°C水浴 5h;①-④染色后的根段保存在乳酸甘油溶液（50mL乳酸+IOOmL甘油+50mL蒸餾水）中保 存。
[0029] 表1五種常見的菌根染色方法比較
[0030]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種同色兜蘭菌根的染色方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： (1) 材料選擇：選用健康同色兜蘭植株的營(yíng)養(yǎng)根為材料； (2) 脫色；采集同色兜蘭生長(zhǎng)良好的營(yíng)養(yǎng)根段，剪刀用75%的酒精棉表面消毒后，截取 4_5cm的根段3-4段；在自來(lái)水下沖洗干凈，切成2-3cm的小段，用濾紙吸干水，加KOH溶液 完全浸泡根系，90°C水浴處理5h后用自來(lái)水輕輕沖洗3-5次；用10%H2O2脫色5h后用自來(lái) 水沖洗3-5次；加2 %HCL溶液室溫酸化30min，去掉HCL溶液，用自來(lái)水輕輕沖洗3-5次； (3) 染色：用5%醋酸墨水染色；染色液室溫過夜后，將根段放在水中保存； (4) 制片：挑取脫色處理后的根段于載玻片上，再加乳酸2-3滴于根系，蓋上 24mmX50mm蓋玻片，用手指將根段稍用力壓扁； (5) 顯微鏡下觀察：使用顯微鏡觀察和拍照。
2. 如權(quán)利要求1所述染色方法，其特征在于，步驟（2)中所述脫色過程中KOH溶液的質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為20%。
3. 如權(quán)利要求1所述染色方法，其特征在于，步驟（3)中所述5%醋酸墨水按質(zhì)量分?jǐn)?shù) 由以下成分構(gòu)成：5%派克純黑書寫墨水和95%食用白醋。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種同色兜蘭菌根的染色方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：材料選擇、脫色、染色、制片和顯微鏡下觀察。本發(fā)明的方法對(duì)于區(qū)分蘭科真菌與其他真菌更有效，在觀察菌絲的各種形態(tài)、入侵方式和統(tǒng)計(jì)侵染率時(shí)，可以減少誤差。而且，在醋酸墨水染色法中使用派克黑色墨水為染色劑，可以兼顧到好的染色效果和低毒性兩個(gè)方面。
【IPC分類】G01N1-30
【公開號(hào)】CN104764646
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510100288
【發(fā)明人】王曉國(guó), 周主貴, 李冬萍, 黃昌艷, 陳廷速, 關(guān)世凱, 羅海斌, 宋倩, 周錦業(yè), 盧家仕, 卜朝陽(yáng)
【申請(qǐng)人】廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所
【公開日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2015年3月6日