一種巴戟天耐斯糖含量測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是涉及一種巴戟天耐斯糖薄層定量檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥巴戟天為雙子葉植物茜草科巴戟天Morinda officinalis How的干燥根。巴 戟天藥食同源，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其歸為上品，也是中國(guó)著名的"四大南藥"之一。性甘、辛、 微溫，歸腎、肝經(jīng)，具有補(bǔ)腎陽(yáng)，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕的功能，用于陽(yáng)瘺遺精，宮冷不孕，月經(jīng)不調(diào)， 少腹冷痛，風(fēng)濕痹痛，筋骨瘺軟等。
[0003] 近年來(lái)對(duì)巴戟天的化學(xué)研宄表明其中含有蒽醌、環(huán)烯醚萜及其苷類(lèi)、有機(jī)酸、糖類(lèi) 等成分。其中占有絕對(duì)含量?jī)?yōu)勢(shì)的寡糖是其主要的活性成分，其它成分含量較少。研宄報(bào) 導(dǎo)巴戟天中分離的寡糖具有抗氧化、抗應(yīng)激、抗抑郁、抑制凋亡等藥理活性。因此，寡糖含量 成為藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)。由于寡糖類(lèi)成分沒(méi)有強(qiáng)紫外吸收，常規(guī)的紫外檢測(cè)器 不適合測(cè)定分析。對(duì)于寡糖類(lèi)的檢測(cè)多采用示差折光、蒸發(fā)光散射、脈沖安培、荷電氣溶膠、 質(zhì)譜等方法，除此之外，采取柱后衍生化檢測(cè)熒光的方法也可用于其測(cè)定分析。目前測(cè)定方 法多需要昂貴精密的儀器及復(fù)雜的樣品處理過(guò)程。
[0004] 薄層色譜技術(shù)以其快速、低成本、高信息量、低技術(shù)門(mén)檻在現(xiàn)代分析如醫(yī)藥、食品、 化工領(lǐng)域仍居于重要地位。本發(fā)明的目的在于提供一種基于薄層色譜的含量測(cè)定方法，新 方法利用軟件掃描薄層圖像而代替?zhèn)鹘y(tǒng)薄層掃描儀。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種利用軟件掃描薄層圖像測(cè)定巴戟天耐斯糖薄層定量檢測(cè)方法。該 方法操作簡(jiǎn)單，可以代理傳統(tǒng)薄層掃描儀。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 一種巴戟天耐斯糖薄層定量檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0008] (1)溶液制備：包括巴戟天供試品溶液和耐斯糖對(duì)照品溶液；
[0009] (2)展開(kāi)及顯色：將所得供試品溶液和對(duì)照品溶液條帶狀點(diǎn)樣至高效薄層預(yù)制板 上，以乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸為展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)并晾干，將薄層板浸入含有濃硫酸的 乙酸乙酯石油醚的混合溶液的顯色劑中數(shù)秒，取出晾干，置于薄層加熱板上至斑點(diǎn)清晰；
[0010] ⑶成像及圖像處理：將經(jīng)步驟2顯色的薄層板置于紫外燈下拍照，將照片導(dǎo)入圖 像處理軟件，軟件對(duì)樣品條帶進(jìn)行掃描，分離RGB值并進(jìn)行逐行累加，然后利用梯形積分法 對(duì)色譜峰進(jìn)行積分，根據(jù)峰面積和樣品濃度的關(guān)系進(jìn)行定量分析。
[0011] 步驟（1)中所述的供試品溶液制備方法：將巴戟天細(xì)粉用含水甲醇或水超聲提取 15-30分鐘，濾過(guò)，濾液并定容即得。所述的含水甲醇為50-80%甲醇，優(yōu)選60%甲醇。
[0012] 優(yōu)選將巴戟天藥材干燥粉碎成細(xì)粉，用水或60%甲醇超聲提取20分鐘，濾過(guò)，濾 渣用水洗滌，合并濾液定容即可。
[0013] 優(yōu)選取巴戟天藥材使用前置于60°C干燥箱內(nèi)過(guò)夜，粉碎并過(guò)20目篩，精密稱(chēng)定， 置于錐形瓶中，加水超聲80kHz提取20min，濾過(guò)，濾澄以少許水洗絳，合并濾液并定容，搖 勾，通過(guò)0. 45 μ m微孔濾膜，取續(xù)濾液制得供試品溶液20mg/ml。
[0014] 所述對(duì)照品制備：取耐斯糖對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻制得 每含I. 586mg/mL耐斯糖的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取適量加水稀釋制得系列濃度對(duì)照品溶 液。所述的系列濃度分別為I. 190、0. 893、0. 670和0. 446mg/mL
[0015] 本發(fā)明步驟（2)中所述的展開(kāi)劑乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸=8:3 : (2-2. 5): 3，優(yōu)選乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸=8:3:2. 3:3。展開(kāi)劑中水的比例對(duì)耐斯糖的Rf值影 響較大，但是過(guò)低的有機(jī)相比例會(huì)引起條帶的過(guò)度擴(kuò)散而影響分離度。
[0016] 顯色劑的均勻程度直接影響到定量結(jié)果的分析及準(zhǔn)確性，因?yàn)轱@色劑的選擇及配 比對(duì)于薄層色譜來(lái)說(shuō)是非常重要的，為了保證顯色劑的均勻與不引起斑點(diǎn)的擴(kuò)散，本發(fā)明 步驟（2)中優(yōu)選顯色劑：含有1-2. 5%濃硫酸的乙酸乙酯石油醚5-7:5-3的混合溶液，加熱 顯色5-12min。進(jìn)一步優(yōu)選顯色劑為2%濃硫酸的乙酸乙酯石油醚7:3的混合溶液，并采用 浸板的方式，加熱10分鐘顯色。顯色劑中的濃硫酸的濃度對(duì)色譜峰信號(hào)有影響，濃度為2% 時(shí)色譜峰信號(hào)較強(qiáng)，且不會(huì)引起斑點(diǎn)糊化。
[0017] 本發(fā)明所述的薄層板是預(yù)制硅膠板GF254,優(yōu)選預(yù)制SIL G-25UV254薄層板。
[0018] 本發(fā)明步驟（2)的所述的點(diǎn)樣方法，條帶狀點(diǎn)樣，條帶寬度：4mm ;條帶間距：10mm ; 距底邊距離：8mm ;點(diǎn)樣量：2 μ L0
[0019] 本發(fā)明步驟（2)優(yōu)選點(diǎn)樣后的薄層板，在展開(kāi)前需要干燥4h以上。
[0020] 本發(fā)明步驟（3)中所述的拍照是指在紫外燈下拍照參數(shù)：曝光時(shí)間2000-6000ms， 增益1. 0,累積關(guān)閉。優(yōu)選曝光5000ms。
[0021] 本發(fā)明步驟（3)中所述的薄層圖像導(dǎo)入至圖形處理軟件中對(duì)各條帶進(jìn)行數(shù)碼掃 描，分離RGB值并進(jìn)行逐行累加利用梯形積分法獲得相應(yīng)色譜峰的積分值。
[0022] 所述的圖形處理軟件是指，優(yōu)選TLC Image Processor軟件，更優(yōu)選TLC Image Processor3. 0 版軟件
[0023] 所述的RGB值是指構(gòu)成圖像像素的紅、綠、藍(lán)三原色的值，三種值相互疊加可得到 各式各樣的顏色。
[0024] 所述的梯形積分法是指：將色譜峰按照一定的步長(zhǎng)劃分為盡可能多的區(qū)間，每個(gè) 區(qū)間的面積可以近似的用梯形面積計(jì)算公式求得，色譜峰的面積等于各區(qū)間面積之和。劃 分的區(qū)間數(shù)越多，誤差越小，公式為：在區(qū)間[a，b]上，
[0025] 本發(fā)明的有益效果
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種巴戟天耐斯糖薄層定量檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 溶液制備：包括巴戟天供試品溶液和耐斯糖對(duì)照品溶液； (2) 展開(kāi)及顯色：將所得供試品溶液和對(duì)照品溶液條帶狀點(diǎn)樣至薄層預(yù)制板上，以乙 酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸為展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)并晾干，將薄層板浸入含有濃硫酸的乙酸乙 酯石油醚的混合溶液的顯色劑中數(shù)秒，取出晾干，置于薄層加熱板上至斑點(diǎn)清晰； (3) 成像及圖像處理：將經(jīng)步驟2顯色的薄層板置于紫外燈下拍照，將照片導(dǎo)入圖像處 理軟件，軟件對(duì)樣品條帶進(jìn)行掃描，分離RGB值并進(jìn)行逐行累加，然后利用梯形積分法對(duì)色 譜峰進(jìn)行積分，根據(jù)峰面積和樣品濃度的關(guān)系進(jìn)行定量分析。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟（1)中所述的供試品溶液制備方 法：將巴戟天細(xì)粉用含水甲醇或水超聲提取，濾過(guò)，濾液并定容即得。
3. 如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的供試品溶液制備方法：將巴戟天 藥材干燥粉碎成細(xì)粉，用水或60%甲醇超聲提取15-30分鐘，濾過(guò)，濾渣用水洗滌，合并濾 液定容即可。
4. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟（2)中所述的展開(kāi)劑乙酸乙酯-甲 醇-水-冰醋酸=8 :3 : (2-2. 5) :3。
5. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟（2)中所述的顯色劑：含有 1-2. 5%濃硫酸的乙酸乙酯石油醚（5-7) :(5-3)的混合溶液，加熱顯色5-12min。
6. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟（3)中所述的紫外燈下拍照參數(shù)： 曝光時(shí)間2000-6000ms，增益1. 0,累積關(guān)閉。
7. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟（3)中所述的薄層圖像導(dǎo)入至TLC ImageProcessor3.0版圖形軟件中對(duì)各條帶進(jìn)行數(shù)碼掃描，分離RGB值并進(jìn)行逐行累加 獲得相應(yīng)色譜峰的積分值。
8. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 溶液制備： 對(duì)照品溶液配制：取耐斯糖對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻制得每含 I. 586mg/mL耐斯糖的對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密吸取適量加水稀釋制得系列濃度對(duì)照品溶液； 供試品溶液的配制：巴戟天藥材使用前置于60°C干燥箱內(nèi)過(guò)夜，粉碎并過(guò)20目篩，精 密稱(chēng)定，置于錐形瓶中，加水超聲80kHz提取20min，濾過(guò)，濾澄以少許水洗絳，合并濾液并 定容，搖勾，通過(guò)0. 45ym微孔濾膜，取續(xù)濾液制得供試品溶液20mg/ml; (2) 展開(kāi)及顯色： 薄層板：預(yù)制UV254薄層板，預(yù)飽和時(shí)間：15min;展開(kāi)劑：乙酸乙醋-甲醇-水-冰醋酸 8:3:2. 3:3,v/v/v/v;展距：展至上邊緣處；顯色劑：含有1-2. 5%濃硫酸的乙酸乙酯石油醚 混合液7:3,v/v，浸染式；顯色加熱時(shí)間：5-12min; (3) 成像及圖像處理 將薄層板至于TCL觀察儀中，于366nm紫外燈下采集圖像，曝光時(shí)間5000ms，增益1. 0， 累積-關(guān)閉，將采集的像素為715X1087的BMP薄層圖像導(dǎo)入至TLCImageProcessor3.0 版圖形軟件中對(duì)各條帶進(jìn)行數(shù)碼掃描，分別累加各自的RGB值及總值，輸出包含色譜峰的 曲線(xiàn)至窗口中，然后利用梯形積分法對(duì)色譜峰進(jìn)行積分獲得峰面積。
9. 如權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 溶液制備： 對(duì)照品溶液配制：取耐斯糖對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻制得每含 I. 586mg/mL耐斯糖的對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密吸取適量加水稀釋制得系列濃度對(duì)照品溶液，濃 度分別為I. 190、0. 893、0. 670 和 0? 446mg/mL; 供試品溶液的配制：巴戟天藥材使用前置于60°C干燥箱內(nèi)過(guò)夜，粉碎并過(guò)20目篩，取 約0. 5g，精密稱(chēng)定，置于錐形瓶中，加20mL水，超聲80kHz提取20min，濾過(guò)，濾渣以少許水 洗滌，合并濾液并定容至25mL，搖勻，通過(guò)0. 45ym微孔濾膜，取續(xù)濾液制得供試品溶液； (2) 展開(kāi)及顯色： 薄層板：預(yù)制UV254薄層板，;預(yù)飽和時(shí)間：15min;展開(kāi)劑：乙酸乙醋-甲醇-水-冰醋酸 8:3:2. 3:3,v/v/v/v;展距：展至上邊緣處；顯色劑：含有2%濃硫酸的乙酸乙酯石油醚混合 液7:3,v/v，浸染式；顯色加熱時(shí)間：10min; (3) 成像及圖像處理 將薄層板至于TCL觀察儀中，于366nm紫外燈下采集圖像，曝光時(shí)間5000ms，增益1. 0， 累積-關(guān)閉，將采集的像素為715X1087的BMP薄層圖像導(dǎo)入至TLCImageProcessor3.0 版圖形軟件中對(duì)各條帶進(jìn)行數(shù)碼掃描，分別累加各自的RGB值及總值，輸出包含色譜峰的 曲線(xiàn)至窗口中，然后利用梯形積分法對(duì)色譜峰進(jìn)行積分獲得峰面積。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種利用軟件掃描薄層圖像測(cè)定巴戟天耐斯糖薄層定量檢測(cè)方法，利用梯形積分法對(duì)色譜峰進(jìn)行積分，根據(jù)峰面積和樣品濃度的關(guān)系進(jìn)行定量分析。該方法操作簡(jiǎn)單，可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)薄層掃描儀。
【IPC分類(lèi)】G01N30-94, G01N30-90
【公開(kāi)號(hào)】CN104792915
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510163742
【發(fā)明人】孫帥, 許舜軍, 楊柳, 許藝鐫, 許錚弟, 張和燦
【申請(qǐng)人】廣州浩意萬(wàn)醫(yī)藥科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年4月8日