高效液相色譜串聯(lián)質譜技術檢測血清中10種類固醇激素的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于血液檢測技術領域，具體涉及高效液相色譜串聯(lián)質譜技術檢測血清中 10種類固醇激素的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 類固醇激素是一類脂溶性小分子激素，是由膽固醇經(jīng)一系列酶催化而來。本發(fā)明 主要針對其中對人體生長發(fā)育、性成熟及新陳代謝所必須的10種類固醇激素進行分析， 包括脫氛表雄酬（dehydroepiandrosterone, DHEA)、睪酬（testosterone，T)、雙氛睪酬 (dihydrotestosterone，DHT)、雄稀二酮（androstenedione，AD)、雌酮（estrone, El)、皮 質酮（corticosterone, C0RT)、孕酮（progesterone, P4)、孕稀醇酮（pregnenolone，P5)、 17 α -輕孕酮（17 a -Hydroxyprogesterone, 17 α -〇HP4)和 17-輕孕稀醇酮（17-hydroxyl pregnenolone, 17-OHP5)〇
[0003] 其中，DHEA是一種非常重要的荷爾蒙，可使人改善記憶力，恢復性能力，降低血液 中的膽固醇，并能抵抗肥胖、心臟疾病與壓力，還能強化免疫系統(tǒng)。脫氫表雄酮過低可能引 起糖尿病、免疫力不足、癌癥、高血壓及心臟病等重大疾病。17 a -OHP4和CORT增高可能引 起先天性腎上腺皮質增生，腎上腺腺瘤或卵巢腫瘤。T可增進記憶力、增加肌肉強度、減少脂 肪、增加骨頭硬度。DHT的作用主要是維持產(chǎn)生精子作用，刺激生殖器官的發(fā)育，維持正常的 性欲，同時還能促進骨骼生長與鈣磷的沉積和紅細胞的生成。AD升高可引起痤瘡，先天性腎 上腺皮質增生，腎上腺皮質腫瘤等；AD降低可使得男性發(fā)育延遲，侏儒癥，腎上腺皮質功能 減退癥，鐮狀紅細胞性貧血。
[0004] 總之，人體類固醇激素的升高或者降低與一些臨床疾病如先天性腎上腺增生、多 囊卵巢綜合癥、腎上腺皮質功能不全等疾病息息相關，其在血清中含量的高低對于評估人 體健康是至關重要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種高效液相色譜串聯(lián)質譜技術檢測血清中 10種類固醇激素的試劑盒。
[0006] 為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下：
[0007] 高效液相色譜串聯(lián)質譜技術檢測血清中10種類固醇激素的試劑盒，
[0008] 所述的10種類固醇激素分別為：脫氫表雄酮、睪酮、雙氫睪酮、雄烯二酮、雌酮、皮 質酮、孕酮、孕烯醇酮、17 α -羥孕酮和17-羥孕烯醇酮；
[0009] 所述試劑盒包括如下試劑：
[0010] ⑴洗脫液：
[0011] 洗脫液A :0· 1 % v/v甲酸水溶液；
[0012] 洗脫液B :0· 1 % v/v甲酸甲醇溶液；
[0013] (2)標準品母液：含雄烯二酮、17α -羥孕酮、孕烯醇酮、雌酮、雙氫睪酮、脫氫表雄 酮、孕酮、睪酮、皮質酮和17-羥孕烯醇酮的甲醇溶液；
[0014] ⑶混合內(nèi)標液：含有d6-脫氫表雄酮、d3-睪酮、d8-17 α -羥孕酮、d2-雌酮和 d9-孕酮的甲基叔丁基醚溶液；
[0015] (4)稀釋液：
[0016] 稀釋液1 :空白血清基質溶液；
[0017] 稀釋液2:甲醇；
[0018] (5)萃取液：甲基叔丁基醚；
[0019] (6)質控品：含有雄烯二酮、17 α -羥孕酮、孕烯醇酮、雌酮、雙氫睪酮、脫氫表雄 酮、孕酮、睪酮、皮質酮和17-羥孕烯醇酮的空白血清基質溶液，分高中低三個濃度分別為 QC (L)、QC (M)、QC (H);
[0020] 其中，QC(L)，QC(M)，QC(H)中10種類固醇激素質控品對應濃度見表1 ;
[0021] 表1 10種類固醇激素質控品對應濃度（單位ng/mL)
[0022]
【主權項】
1. 高效液相色譜串聯(lián)質譜技術檢測血清中10種類固醇激素的試劑盒，其特征在于， 所述的10種類固醇激素分別為：脫氫表雄酮、睪酮、雙氫睪酮、雄烯二酮、雌酮、皮質 酮、孕酮、孕烯醇酮、17a-羥孕酮和17-羥孕烯醇酮； 所述試劑盒包括如下試劑： (1) 洗脫液： 洗脫液A:0. 1 %v/v甲酸水溶液； 洗脫液B:0. 1%v/v甲酸甲醇溶液； (2) 標準品母液：含雄烯二酮、17a-羥孕酮、孕烯醇酮、雌酮、雙氫睪酮、脫氫表雄酮、 孕酮、睪酮、皮質酮和17-羥孕烯醇酮的甲醇溶液； (3) 混合內(nèi)標液：含有d6-脫氫表雄酮、d3-睪酮、d8-17a-輕孕酮、d2-雌酮和d9-孕 酮的甲基叔丁基醚溶液； (4) 稀釋液： 稀釋液1 :空白血清基質溶液； 稀釋液2 :甲醇； (5) 萃取液：甲基叔丁基醚； (6) 質控品：含有雄烯二酮、17a-羥孕酮、孕烯醇酮、雌酮、雙氫睪酮、脫氫表雄酮、孕 酮、睪酮、皮質酮和17-羥孕烯醇酮的空白血清基質溶液，分高中低三個濃度分別為QC(L)、 QC(M)、QC(H); 其中，QC(L)，QC(M)，QC(H)中10種類固醇激素質控品對應濃度見表1 ; 表1 10種類固醇激素質控品對應濃度（單位ng/mL)
2. 根據(jù)權利要求1所述的高效液相色譜串聯(lián)質譜技術檢測血清中10種類固醇激素的 試劑盒，其特征在于，所述的標準品母液為含濃度為20ng/mL的雄稀二酮、20ng/mL17a -輕 孕酮、20ng/mL孕稀醇酮、20ng/mL雌酮、20ng/mL雙氫睪酮、80ng/mL的脫氫表雄酮、lOOng/ mL孕酮、100ng/mL睪酮、100ng/mL皮質酮、50ng/mL17-輕孕稀醇酮的甲醇溶液。
3. 根據(jù)權利要求1所述的高效液相色譜串聯(lián)質譜技術檢測血清中10種類固醇激素的 試劑盒，其特征在于，所述的混合內(nèi)標液為含有1. 〇mg/mLd6-脫氫表雄酮、1. 0mg/mLd3-睪 酬、l.Omg/mLd8_17a-輕孕酬、l.〇mg/mLd2_雌酬和l.Omg/mLd9_孕酬的甲基叔丁基釀 溶液。
4. 根據(jù)權利要求1所述的高效液相色譜串聯(lián)質譜技術檢測血清中10種類固醇激素的 試劑盒，其特征在于，所述的空白血清基質溶液為40mg/mL牛血清蛋白的水溶液。
5. 根據(jù)權利要求1所述的高效液相色譜串聯(lián)質譜技術檢測血清中10種類固醇激素的 試劑盒，其特征在于，所述的血清為人或動物的血清。
6. 權利要求1所述的高效液相色譜串聯(lián)質譜技術檢測血清中10種類固醇激素的試劑 盒的制備方法，其特征在于， (1) 洗脫液： 洗脫液A:配制0. 1 %v/v甲酸水溶液； 洗脫液B:配制0. 1%v/v甲酸甲醇溶液； (2) 標準品母液： 分別準確稱取脫氫表雄酮10. 〇mg、睪酮25.Omg、雙氫睪酮5. 2mg、雄稀二酮1. 5mg、雌 酮2. 5mg、皮質酮2.Omg、孕酮10mg、孕稀醇酮5.lmg、17a-輕孕酮l〇mg和17-輕孕稀醇酮 25mg，分別加入lmL、2. 5mL、5. 2mL、l. 5mL、2. 5mL、2mL、lmL、5.lmL、10mL和 2. 5mL的甲基叔丁 基醚，配制成濃度分別為10.Omg/mL的脫氫表雄酮、10.Omg/mL的睪酮、1.Omg/mL的雙氫睪 酮、1.Omg/mL的雄稀二酮、1.Omg/mL的雌酮、1.Omg/mL的皮質酮、10.Omg/mL的孕酮、1.Omg/ mL的孕稀醇酮、1.Omg/mL的17-輕孕酮和10.Omg/mL的17-輕孕稀醇酮的標準品母液； 分別從以上脫氫表雄酮、睪酮、孕酮和17-羥孕烯醇酮標準品母液中移取100 y L用甲 基叔丁基醚定容至lmL，得到這10種類固醇激素的濃度都是1. Omg/mL，然后用甲醇將這10 種類固醇激素的濃度由1. Omg/mL逐級稀釋至1. 0 y g/mL; 分別取200yL濃度為1. 0yg/mL的雄烯二酮、17a-羥孕酮、孕烯醇酮、雌酮和雙氫睪 酮，800yL濃度為1.0yg/mL的脫氫表雄酮，各l.OmL濃度為1.0yg/mL的睪酮、孕酮和皮 質酮，500yL濃度為1.0yg/mL的17-羥孕烯醇酮均加入到15mL離心管中，再加去離子水 定容到10mL，配制成混合標準液A;混合標準液A中，雄烯二酮、17a-羥孕酮、孕烯醇酮、雌 酮和雙氫睪酮的濃度為20ng/mL，脫氫表雄酮的濃度為80ng/mL，孕酮、睪酮和皮質酮的濃 度為100ng/mL，17-輕孕稀醇酮的濃度為50ng/mL; (3) 混合內(nèi)標液：配制含有1.Omg/mLd6-脫氫表雄酮、1.Omg/mLd3-睪酮、1.Omg/mL d8_17a-輕孕酮、1.Omg/mLd2_雌酮和1.Omg/mLd9_孕酮的甲基叔丁基釀溶液； (4) 稀釋液： 稀釋液1 :將4g牛血清蛋白用水定容至100mL制得； 稀釋液2 :甲醇； (5) 萃取液：甲基叔丁基醚； (6) 質控品：取步驟（2)得到的10種類固醇激素標混合標準液A各20yL、100yL、 500yL分別用空白血清基質溶液定容至1000yL得到。
7.權利要求1~5中任意一項所述的試劑盒在利用高效液相色譜串聯(lián)質譜技術檢測血 清中10種類固醇激素中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效液相色譜串聯(lián)質譜技術檢測血清中10種類固醇激素的試劑盒，包括洗脫液、標準品母液、混合內(nèi)標液、稀釋液、萃取液和質控品，所述的10種類固醇激素分別為：脫氫表雄酮、睪酮、雙氫睪酮、雄烯二酮、雌酮、皮質酮、孕酮、孕烯醇酮、17α-羥孕酮和17-羥孕烯醇酮。采用本發(fā)明試劑盒進行檢測，靈敏度高、特異性強、準確且前處理過程較簡單，10min之內(nèi)可完成多種激素的分離和檢測，精密度與加標回收率基本滿足要求。
【IPC分類】G01N30-02
【公開號】CN104807920
【申請?zhí)枴緾N201510264575
【發(fā)明人】周亞飛, 于嘉屏
【申請人】上海迪安醫(yī)學檢驗所有限公司
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年5月21日