一種人尿中檢測(cè)香草扁桃酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是一種人尿中檢測(cè)香草扁桃酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 兒茶酚胺是由腎上腺髓質(zhì)分泌的一類激素，其中包括了多巴胺、腎上腺素和去腎 上腺素。這些激素往往因?yàn)槲锢砘蚓裆系膽?yīng)激反應(yīng)，被釋放到血液循環(huán)中，提高大腦神經(jīng) 沖動(dòng)傳遞，釋放葡萄糖和脂肪酸以提供能量，支氣管擴(kuò)張和瞳孔放大。大多數(shù)兒茶酚胺會(huì) 被代謝降解成為香草扁桃酸（Vanilmandelic acid, VMA)、高香草酸（homovanillic acid, HVA)、變腎上腺素（metanephrine)和去甲腎上腺素（normetanephrine)，只有少量?jī)翰璺?胺隨尿排出體外。
[0003] VM又名3-甲氧基-4-羥基扁桃酸或4-羥基-3-甲氧基苦杏仁酸，是一種兒茶酚 胺類腎上腺素和去腎上腺素的代謝產(chǎn)物，最終隨尿排出體外。VMA在尿樣中的含量非常穩(wěn) 定，只有發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)后含量才會(huì)略有增加。但是神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastomas)，嗜鉻細(xì) 胞瘤（pheochromocytomas)和其他的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（neuroendocrine tumors)能夠大量 產(chǎn)生兒茶酚胺，引起VMA含量的劇增。由于大量?jī)翰璺影愤M(jìn)入血液循環(huán)，使血管收縮，末梢 阻力增加，心率加快，血壓出現(xiàn)陣發(fā)性急驟升高。這些病人的臨床表現(xiàn)為持續(xù)性高血壓、心 悸、惡心嘔吐、氣短、胸部壓抑、頭痛、手足發(fā)麻、大量出汗、視力模糊等，嚴(yán)重者可能出現(xiàn)腦 溢血或肺水腫等高血壓危象。尿VMA含量過(guò)高是兒茶酚胺分泌異常的一個(gè)重要標(biāo)志，是診 斷神經(jīng)母細(xì)胞瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤的首選標(biāo)志物。
[0004] 目前VMA的檢測(cè)手法主要有比色-色譜聯(lián)用技術(shù)、ELISA和HPLC法。
[0005] 市售的VM檢測(cè)ELISA試劑盒普遍應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定VM水 平。ELISA試劑盒具有靈敏、快速特點(diǎn)，但缺點(diǎn)是穩(wěn)定性不高，對(duì)操作人員的技術(shù)有較高要 求。而且該類產(chǎn)品主要為國(guó)外進(jìn)口，如Cloud-Clone Corp.(美國(guó)）、Biocompare(美國(guó)）、 RDG(美國(guó)）、Eaglebio (美國(guó)）等，價(jià)格昂貴。由于抗體等核心技術(shù)為國(guó)外壟斷，國(guó)內(nèi)尚無(wú) 自主研發(fā)產(chǎn)品,無(wú)法根本上降低試劑成本。
[0006] 比色-色譜聯(lián)用技術(shù)，目前國(guó)內(nèi)批準(zhǔn)的檢測(cè)試劑盒為西班牙Biosystems S. A.生 產(chǎn)的香草扁桃酸分析試劑盒（國(guó)食藥監(jiān)械（進(jìn)）字2010第2402315號(hào)），該方法采用陰離 子交換樹(shù)脂將尿液中的VM吸附保存在樹(shù)脂上，其他干擾物質(zhì)則不能被保留而清楚，最后 洗脫純化VMA。再在堿性條件下VM被氧化形成香草蘭素，通過(guò)紫外分光比色法進(jìn)行定量分 析。該方法效率高，檢測(cè)性好，缺點(diǎn)是該試劑盒為國(guó)外壟斷產(chǎn)品，價(jià)格昂貴。
[0007] HPLC技術(shù)檢測(cè)VMA被認(rèn)為最有前途的VMA檢測(cè)方法。其中電化學(xué)檢測(cè)法的研究相 當(dāng)成熟，此外化學(xué)后修飾法（Taran)、色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Fay ler、Lionetto)和毛細(xì)管電 泳技術(shù)檢測(cè)法也紛紛建立。這些方法優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、檢測(cè)速度快，但是需要特殊儀器，價(jià) 格昂貴，成本高，操作人員需要特別培訓(xùn)，難以廣泛應(yīng)用于臨床。HPLC聯(lián)合UV檢測(cè)法鮮有報(bào) 道，而UV檢測(cè)器成本低，一般購(gòu)置HPLC的同時(shí)都會(huì)配備UV檢測(cè)器。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種快速、高效、廉價(jià)的人尿中檢測(cè)香草 扁桃酸的方法。
[0009] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案：這種人尿中檢測(cè)香草扁桃酸的方法，其 步驟包括：
[0010] 1)取人尿液用HCl酸化，在-80°C條件下保存，尿液融化后用乙酸乙酯萃取、揮發(fā)， 醋酸再溶解，可獲得VM粗提取物；
[0011] 2)上述粗提取物經(jīng)過(guò)HPLC分離，在UV檢測(cè)器280nm波長(zhǎng)下，獲得穩(wěn)定單一的VMA 吸收峰，并通過(guò)外標(biāo)法繪制VM標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終計(jì)算出VM的含量。
[0012] 作為優(yōu)選，其中步驟1)具體如下：
[0013] a)收取新鮮尿液后，加入5M HCl酸化，放入-80°c冷柜中保存，直到開(kāi)始后續(xù)實(shí) 驗(yàn)；
[0014] b)待尿液融化后,取4ml尿液到一個(gè)預(yù)裝有2g NaCl的15ml離心管內(nèi)，上下顛倒 混合IOmin形成飽和鹽溶液；
[0015] c)加入4ml乙酸乙酯，上下顛倒混合5min ;4000g離心5min，小心吸取上層有機(jī)相 到一根新50ml圓底離心管內(nèi)；
[0016] d)重復(fù)b-c步2次，獲得上層有機(jī)相共12ml ;
[0017] e)將離心管用金屬加熱器加熱到45°C，在通風(fēng)柜內(nèi)高風(fēng)揮發(fā)，直到所有的乙酸乙 酯揮發(fā)完全，獲得黃色或黑色沉淀；
[0018] f)加入400 μ 11 %醋酸溶液，充分震蕩，4°C過(guò)夜溶解；
[0019] g) 15000g離心后，將上清液移到新1.5ml離心管內(nèi)，4°C保存不超過(guò)1周，等待 HPLC檢測(cè)。
[0020] 作為優(yōu)選，其中HPLC條件為：
[0021] 柱子：SP-C18 (4. 6mm*250mm, 5um);
[0022] 流動(dòng)相：A(水：醋酸=98 : I) :B(水：甲醇：醋酸=68 : 30 : 2)梯度洗脫；
[0023] 洗脫梯度：0-15min :100% A-20% A
[0024] 15-20min ：20% A
[0025] 20-21min ：20% A-100% A
[0026] 21-35min :100% A
[0027] 流速：0· 8ml / min ;
[0028] 檢測(cè)波長(zhǎng)：UV280nm ;
[0029] 上樣量：100 μ 1。
[0030] 作為優(yōu)選，外標(biāo)法繪制VM標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟如下：用電子分析天平稱取VMA，用1%的 醋酸配置成 Ing / μ 1、2· 5ng / μ l、5ng / μ l、10ng/y l、20ng/y lUOOng/μ 1 的濃度梯 度的VMA溶液，將這些濃度梯度的VMA溶液先后上HPLC柱檢測(cè)，并根據(jù)其檢測(cè)結(jié)果繪制標(biāo) 準(zhǔn)曲線。
[0031] 發(fā)明有益的效果是：本發(fā)明成本低，操作簡(jiǎn)便，提供了一種快速、低廉、靈敏的人尿 中檢測(cè)VMA的方法。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1是20ng / μ 1的VMA上樣后的HPLC峰圖；
[0033] 圖2是VMA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0034] 圖3是實(shí)施例1中的VM檢測(cè)圖；
[0035] 圖4是實(shí)施例2中的VM檢測(cè)圖；
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：
[0037] 參照附圖：
[0038] 本發(fā)明的這種人尿VM的檢測(cè)方法包括以下步驟：
[0039] I) VMA粗提取物的制備
[0040] a)收取新鮮尿液后，加入5Μ HCl酸化，放入-80°c冷柜中保存，直到開(kāi)始后續(xù)實(shí) 驗(yàn)；
[0041] b)待尿液融化后,取4ml尿液到一個(gè)預(yù)裝有2g NaCl的15ml離心管內(nèi)，上下顛倒 混合IOmin形成飽和鹽溶液；
[0042] c)加入4ml乙酸乙酯，上下顛倒混合5min ;4000g離心5min，小心吸取上層有機(jī)相 到一根新50ml圓底離心管內(nèi)；
[0043] d)重復(fù)b-c步2次，獲得上層有機(jī)相共12ml ;
[0044] e)將離心管用金屬加熱器加熱到45°C，在通風(fēng)柜內(nèi)高風(fēng)揮發(fā)，直到所有的乙酸乙 酯揮發(fā)完全，獲得黃色或黑色沉淀；
[0045] f)加入400 μ 11 %醋酸溶液，充分震蕩，4°C過(guò)夜溶解；
[0046] g) 15000g離心后，將上清液移到新1.5ml離心管內(nèi)，4°C保存不超過(guò)1周，等待 HPLC檢測(cè)。
[0047] 2)上述粗提取物經(jīng)過(guò)HPLC分離，在UV檢測(cè)器280nm波長(zhǎng)下，獲得穩(wěn)定單一的VMA 吸收峰，并通過(guò)外標(biāo)法繪制VM標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終計(jì)算出VM的含量。
[0048] 其中HPLC條件為：
[0049] 柱子：SP-C18 (4. 6mm*250mm, 5um);
[0050] 流動(dòng)相：A(水：醋酸=98 : I) :B(水：甲醇：醋酸=68 : 30 : 2)梯度洗脫；
[0051] 洗脫梯度：0-15min : 100% A-20% A
[0052] 15-20min ：20% A
[0053] 20-21min ：20% A-100% A
[0054] 21-35min ：100% A
[0055] 流速：0· 8ml / min ;
[0056] 檢測(cè)波長(zhǎng)：UV280nm ;
[0057] 上樣量：100 μ 1。
[0058] VM標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法：用電子分析天平稱取VM (Sigma，Η0131)，用1%的醋酸配 置成 lng/μ 1、2· 5ng/y l、5ng / μ UlOng/μ l、20ng / μ lUOOng/μ 1 的濃度梯度的 VMA 溶液，將這些濃度梯度的VMA溶液先后上HPLC柱檢測(cè)。
[0059] 20ng / μ 1的VMA上樣后的HPLC峰圖如圖1所示。VMA峰出現(xiàn)在11. 0-11. 5min。
[0060] 不同濃度VMA的檢測(cè)結(jié)果如下：
[0061]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種人尿中檢測(cè)香草扁桃酸的方法，其步驟包括： 1) 取人尿液用HCl酸化，在-80°C條件下保存，尿液融化后用乙酸乙酯萃取、揮發(fā)，醋酸 再溶解，可獲得VMA粗提取物； 2) 上述粗提取物經(jīng)過(guò)HPLC分離，在UV檢測(cè)器280nm波長(zhǎng)下，獲得穩(wěn)定單一的VMA吸收 峰，并通過(guò)外標(biāo)法繪制VM標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終計(jì)算出VM的含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人尿中檢測(cè)香草扁桃酸的方法，其特征是：步驟1)具體如 下： a) 收取新鮮尿液后，加入5M HCl酸化，放入-80°C冷柜中保存，直到開(kāi)始后續(xù)實(shí)驗(yàn)； b) 待尿液融化后,取4ml尿液到一個(gè)預(yù)裝有2g NaCl的15ml離心管內(nèi)，上下顛倒混合 IOmin形成飽和鹽溶液； c) 加入4ml乙酸乙酯，上下顛倒混合5min ;4000g離心5min，小心吸取上層有機(jī)相到一 根新50ml圓底離心管內(nèi)； d) 重復(fù)b-c步2次，獲得上層有機(jī)相共12ml ; e) 將離心管用金屬加熱器加熱到45°C，在通風(fēng)柜內(nèi)高風(fēng)揮發(fā)，直到所有的乙酸乙酯揮 發(fā)完全，獲得黃色或黑色沉淀； f) 加入4001111%醋酸溶液，充分震蕩，4°C過(guò)夜溶解； g) 15000g離心后，將上清液移到新I. 5ml離心管內(nèi)，4°C保存不超過(guò)1周，等待HPLC檢 測(cè)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人尿中檢測(cè)香草扁桃酸的方法，其特征是：HPLC條件為： 柱子：SP_C18(4. 6mm*250mm，5um); 流動(dòng)相：A(水：醋酸=98 : I) :B(水：甲醇：醋酸=68 : 30 : 2)梯度洗脫； 洗脫梯度：〇-15min :100% A-20% A 15-20min ：20% A 20- 21min ：20% A-100% A 21- 35min ：100% A 流速：〇. 8ml / min ; 檢測(cè)波長(zhǎng)：UV280nm ; 上樣量：100 yl。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人尿中檢測(cè)香草扁桃酸的方法，其特征是：外標(biāo)法繪制VM 標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟如下：用電子分析天平稱取VMA，用1%的醋酸配置成Ing / iU、2. 5ng/iil、 5ng/ia、10ng/iil、20ng / iUUOOng/iil的濃度梯度的VMA溶液，將這些濃度梯度的VMA 溶液先后上HPLC柱檢測(cè)，并根據(jù)其檢測(cè)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人尿中檢測(cè)香草扁桃酸的方法。取人尿液用HCl酸化防腐，可在-80oC條件下長(zhǎng)期保存；尿液用乙酸乙酯萃取、揮發(fā)、醋酸再溶解等工序，可獲得VMA粗提取物。該粗提物經(jīng)過(guò)HPLC分離，可在UV檢測(cè)器280nm波長(zhǎng)下，獲得穩(wěn)定單一的VMA吸收峰，并可通過(guò)外標(biāo)法繪制VMA標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終計(jì)算出VMA的含量。該方法成本低，操作簡(jiǎn)便，提供了一種快速、低廉、靈敏的人尿中檢測(cè)VMA的方法。
【IPC分類】G01N30-88, G01N30-06
【公開(kāi)號(hào)】CN104807923
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410034795
【發(fā)明人】劉軍, 陳齊, 謝丹
【申請(qǐng)人】杭州紐貝生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年7月29日
【申請(qǐng)日】2014年1月23日