一種定量檢測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中酚類化合物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種定量檢測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中酪類化合物的方法，具體設(shè)及固態(tài)發(fā)酵 產(chǎn)物的樣品前處理及定量分析酪類化合物的方法，屬于固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物分析技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 酪類化合物也稱為芳香族化合物，酪類化合物是飲料酒的香味組成部分，對于酒 的聞香、口味及穩(wěn)定性等方面均具有重要的作用。揮發(fā)性酪類化合物在白酒中的含量極少， 但呈香作用卻很強(qiáng)，在幾百萬分之一甚至千萬分之一就能使人感覺到強(qiáng)烈的香氣。有些揮 發(fā)性酪類物質(zhì)被描述為"酪味"、"動物臭味"和"馬底味"等異味，有些揮發(fā)性酪類物質(zhì)當(dāng)其 含量高于某個限值時，會使酒中產(chǎn)生腥異味，掩蓋酒的香味。因此，控制飲料酒中酪類化合 物的含量對于穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量和品質(zhì)非常重要。
[0003] 然后，對于白酒來說，白酒中的酪類物質(zhì)基本上均在固態(tài)發(fā)酵過程中產(chǎn)生，為了進(jìn) 一步探索該些酪類物質(zhì)的產(chǎn)生來源、形成機(jī)理、代謝途徑等，進(jìn)而從釀造工藝上調(diào)控?fù)]發(fā)性 酪類物質(zhì)的含量，從而達(dá)到控制終產(chǎn)品中酪類化合物含量的目的，建立"一種定量檢測固態(tài) 發(fā)酵產(chǎn)物中酪類化合物的方法"顯得尤其必要。
[0004] 近年來，國內(nèi)各白酒企業(yè)或高校科研院所對白酒中的揮發(fā)性酪類物質(zhì)的測定方法 進(jìn)行了研究分析，但目前尚沒有關(guān)于固態(tài)發(fā)酵過程產(chǎn)物，如大曲、酒酷、魯泥發(fā)酵過程等的 酪類化合物的定量分析方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供一種檢測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中10種酪類化合物的定 量分析方法。
[0006] 本發(fā)明解決技術(shù)問題，采用如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明定量檢測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中酪類化合物的方法，其特點在于按如下步驟進(jìn) 行；首先對待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行超聲萃取、離屯、取上清液置于頂空瓶中，并加入2, 6-二 甲基苯酪內(nèi)標(biāo)溶液，通過頂空固相微萃取方式吸附富集目標(biāo)物，最后通過氣相色譜-質(zhì)譜 聯(lián)用技術(shù)對待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中所含酪類化合物進(jìn)行定性（W碎片的豐度比定性）、定量 分析。其中所述酪類化合物包括苯酪、4-甲基苯酪、4-己基苯酪、愈創(chuàng)木酪、4-甲基愈創(chuàng)木 酪、4-己基愈創(chuàng)木酪、4-丙基愈創(chuàng)木酪、4-己締基愈創(chuàng)木酪、2, 4-二叔了基苯酪和2, 6-二 叔了基苯酪。具體按如下步驟進(jìn)行；
[0008] (1)超聲萃??；稱取5.0~10.Og待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物于25血棟色具塞試管中，加 入25mL體積濃度為10~15%的己醇溶液，旋緊塞子，在避光密閉條件下充分振蕩混勻后， 超聲萃取20~30min，然后采用低溫離屯、方式分離收集上清液，離屯、溫度5~10°C，離屯、轉(zhuǎn) 速 8000 ~10000巧m，離屯、10 ~15min;
[0009] 似頂空固相微萃?。喝?~10血所述上清液置于20血頂空瓶中，加入10化 的2, 6-二甲基苯酪內(nèi)標(biāo)溶液，立即密閉頂空瓶，輕輕搖勻，然后在50~55°C恒溫預(yù)熱3~ 5min后，將PA萃取頭插入所述頂空瓶中，于50~55°C恒溫萃取30~40min;
[0010] (3)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：在頂空固相微萃取結(jié)束后，將PA萃取頭插入到聯(lián)有質(zhì) 譜檢測其的氣相色譜進(jìn)樣口，230~250°C熱解析3~5min ;
[0011] 氣相色譜條件為：
[0012] 色譜柱為DB-WAX毛細(xì)管柱 60mX0. 25mmX0. 25ym;
[0013]進(jìn)樣口溫度230~250°C，質(zhì)譜檢測器溫度230°C，載氣He,流速0.8~1血/min， 不分流進(jìn)樣；
[0014]程序升溫條件為初始柱溫40°C，W4~5°C/min上升至180°C，保持2~4min，然 后W5~6°C/min升溫到230°C，保持5~15min;
[0015] 質(zhì)譜條件為：
[0016] 氣相色譜與質(zhì)譜接口溫度為230°C ;
[0017] 電離方式為電子轟擊源EI;
[0018] 監(jiān)測方式為選擇性離子掃描模式SIM，電離能量70eV;
[0019] 溶劑延遲為20~25min;
[0020] (4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0021] a、配制單標(biāo)儲備液；稱取各種酪類化合物標(biāo)準(zhǔn)品，分別用無水己醇配制成1~ 2mg/L的單標(biāo)儲備液，采用棟色儲液瓶于4°C冰箱中避光保存；
[0022]b、配制混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：吸取各酪類化合物的單標(biāo)儲備液0.5mL混合，然后采用 色譜純無水己醇定容至50mL棟色容量瓶，獲得混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4°C冰箱中避光保存；
[0023]C、配制混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液0. 05血、0. 1血、0. 2血、0. 5血、 1血至50血棟色容量瓶中，加入己醇，然后用超純水定容，配制成己醇體積濃度為10%~ 15%的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；
[0024]t對各混合標(biāo)準(zhǔn)使用液按步驟（2)、（3)進(jìn)行處理，W各酪類化合物標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo) 物特征離子峰的峰面積之比為橫坐標(biāo)，W各酪類化合物標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的濃度之比為縱坐 標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0025] (5)待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的測定；將待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物按步驟（1)進(jìn)行超聲萃取，按 步驟（2)進(jìn)行頂空固相微萃取，然后按照步驟（3)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行定性定量分析， 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中酪類化合物含量。
[0026] 所述2, 6-二甲基苯酪內(nèi)標(biāo)溶液是W內(nèi)標(biāo)物質(zhì)2, 6-二甲基苯酪溶于色譜純無水己 醇中獲得，所述2, 6-二甲基苯酪內(nèi)標(biāo)溶液的溶度為70~90mg/L。
[0027] 10種酪類化合物和內(nèi)標(biāo)物的分離質(zhì)譜圖見圖1。10種酪類化合物的定量，是W 2,6-二甲基苯酪為內(nèi)標(biāo)，在20^3/1~400 ^3/1或400 ^3/1~4000 ^3/1的檢測范圍內(nèi) 具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2均大于或等于0. 99。具體詳見表1。
[002引表1酪類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程及相關(guān)系數(shù)
[0029]
【主權(quán)項】
1. 一種定量檢測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中酚類化合物的方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行：首 先對待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行超聲萃取、離心取上清液置于頂空瓶中，并加入2, 6 -二甲基苯 酚內(nèi)標(biāo)溶液，通過頂空固相微萃取方式吸附富集目標(biāo)物，最后通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技 術(shù)對待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中所含酚類化合物進(jìn)行定性、定量分析。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述酚類化合物包括苯酚、4-甲基苯酚、 4-乙基苯酚、愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-丙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈 創(chuàng)木酚、2, 4-二叔丁基苯酚和2, 6-二叔丁基苯酚。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行： (1) 超聲萃取：稱取5. O~10.0 g待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物于25mL棕色具塞試管中，加入 25mL體積濃度為10~15%的乙醇溶液，旋緊塞子，在避光密閉條件下充分振蕩混勻后，超 聲萃取20~30min，然后采用低溫離心方式分離收集上清液，離心溫度5~KTC，離心轉(zhuǎn)速 8000 ~lOOOOrpm，離心 10 ~15min ; (2) 頂空固相微萃取：取8~IOmL所述上清液置于20mL頂空瓶中，加入IOyL的 2, 6-二甲基苯酚內(nèi)標(biāo)溶液，立即密閉頂空瓶，輕輕搖勻，然后在50~55°C恒溫預(yù)熱3~ 5min后，將PA萃取頭插入所述頂空瓶中，于50~55°C恒溫萃取30~40min ; (3) 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：在頂空固相微萃取結(jié)束后，將PA萃取頭插入到聯(lián)有質(zhì)譜檢 測儀的氣相色譜進(jìn)樣口，230~250°C熱解析3~5min ; 氣相色譜條件為： 色譜柱為DB-WAX毛細(xì)管柱60mX0. 25mmX0. 25 ym ; 進(jìn)樣口溫度230~250°C，質(zhì)譜檢測器溫度230°C，載氣He，流速0. 8~lmL/min，不分 流進(jìn)樣； 程序升溫條件為初始柱溫40°C，以4~5°C /min上升至180°C，保持2~4min，然后以 5~6°C /min升溫到230°C，保持5~15min ; 質(zhì)譜條件為： 氣相色譜與質(zhì)譜接口溫度為230°C ; 電離方式為電子轟擊源EI ; 監(jiān)測方式為選擇性離子掃描模式SIM，電離能量70eV ; 溶劑延遲為20~25min ; (4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 a、 配制單標(biāo)儲備液：稱取各種酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)品，分別用無水乙醇配制成1~2mg/L的 單標(biāo)儲備液，采用棕色儲液瓶于4°C冰箱中避光保存； b、 配制混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：吸取各酚類化合物的單標(biāo)儲備液0. 5mL混合，然后采用色譜 純無水乙醇定容至50mL棕色容量瓶，獲得混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4°C冰箱中避光保存； c、 配制混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液0. 05mL、0. lmL、0. 2mL、0. 5mL、lmL 至50mL棕色容量瓶中，加入乙醇，然后用超純水定容，配制成乙醇體積濃度為10%~15% 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液； d、 對各混合標(biāo)準(zhǔn)使用液按步驟（2)進(jìn)行頂空固相微萃取，然后按照步驟（3)進(jìn)行分析， 以各酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物特征離子峰的峰面積之比為橫坐標(biāo)，以各酚類化合物標(biāo)準(zhǔn) 品與內(nèi)標(biāo)物的濃度之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (5)待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的測定：將待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物按步驟（1)進(jìn)行超聲萃取，按步驟 (2)進(jìn)行頂空固相微萃取，然后按照步驟（3)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行定性定量分析，通過 標(biāo)準(zhǔn)曲線計算固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中酚類化合物含量。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述2, 6-二甲基苯酚內(nèi)標(biāo)溶液是以內(nèi)標(biāo) 物質(zhì)2, 6-二甲基苯酚溶于色譜純無水乙醇中獲得，所述2, 6-二甲基苯酚內(nèi)標(biāo)溶液的溶度 為 70 ~90mg/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述待測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物為大曲、酒醅或窖 泥。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種定量檢測固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中酚類化合物的方法，屬于固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物分析技術(shù)領(lǐng)域，主要適用于白酒固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物，包括大曲、酒醅、窖泥的酚類化合物的含量測定；具體涉及固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的超聲萃取、頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行定性、定量分析。本發(fā)明建立的方法能夠快速檢測并準(zhǔn)確定量固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中10種揮發(fā)性酚類化合物，各酚類化合物在所測范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系R2>0.99，檢出限均小于10ug/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10％，回收率為75％～110％；本發(fā)明的技術(shù)方案簡便快速，能實現(xiàn)對固態(tài)發(fā)酵過程產(chǎn)物中酚類化合物的有效監(jiān)控，對于提升終產(chǎn)品的品質(zhì)具有重要意義。
【IPC分類】G01N30-88
【公開號】CN104865338
【申請?zhí)枴緾N201510324311
【發(fā)明人】高江婧, 劉國英, 湯有宏, 姜利, 徐祥浩, 李安軍, 周慶伍, 梁金輝
【申請人】安徽古井貢酒股份有限公司, 安徽瑞思威爾科技有限公司
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年6月12日