一種炙甘草提取物及其指紋圖譜鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥質(zhì)量分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種炙甘草飲片提取物的制備，以 及采用高效液相色譜（HPLC)指紋圖譜方法進(jìn)行炙甘草飲片提取物質(zhì)量鑒別和控制。
【背景技術(shù)】
[0002] 炙甘草，系豆科植物甘草、脹果甘草或光果甘草的干燥根及根莖，用蜜烘制而成。 炙甘草臨床應(yīng)用多為炙甘草湯，是以炙甘草為主要原料制成的湯，能夠補(bǔ)脾和胃，益氣復(fù) 脈。用于脾胃虛弱，倦怠乏力，心動(dòng)悸，脈結(jié)代。目前炙甘草的質(zhì)量控制方法采用的是甘草 的標(biāo)準(zhǔn)，由一些簡(jiǎn)單的鑒別方法發(fā)展到采用高效液相色譜方法測(cè)定其有效成分甘草苷及甘 草酸銨的含量，但是炙甘草因品種、產(chǎn)地的不同，其有效成分的含量存在一定的差異，僅憑 甘草苷和甘草酸銨兩種成分的含量測(cè)定已明顯不能滿足于其質(zhì)量控制，故用于臨床的質(zhì)量 穩(wěn)定性也難以保證。
[0003] 中藥指紋圖譜技術(shù)是符合中醫(yī)理論及現(xiàn)狀的較好的質(zhì)量控制技術(shù)，因?yàn)樗⒉恍?要詳細(xì)了解藥物的具體活性成份信息，只需要了解個(gè)別指標(biāo)性活性組分信息，以指標(biāo)性成 份峰作為標(biāo)記，結(jié)合非指標(biāo)成份進(jìn)行比對(duì)，用來(lái)綜合評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量，既符合中醫(yī)藥理論的整 體觀點(diǎn)，也滿足了對(duì)中藥質(zhì)量的可控、保證其療效的要求。炙甘草作為一種常用藥，多見于 對(duì)其湯劑的研宄，而對(duì)炙甘草提取物質(zhì)量控制的研宄報(bào)道較少，本發(fā)明提出了一種炙甘草 提取物的指紋圖譜鑒別方法，能夠從整體把握炙甘草提取物的質(zhì)量情況，為炙甘草提取物 的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別提供了一種有效的技術(shù)手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是為提供一種炙甘草飲片提取物的制備方法，并通過HPLC指紋圖譜 的方法對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量鑒別和控制。
[0005] 制備炙甘草飲片提取物的方法，其包括以下步驟：取炙甘草飲片，加入飲片重量 6-12倍的水，一煎提取20-40分鐘，二煎加炙甘草飲片重量4-10倍的水，提取10-30分鐘， 濾液過濾、回收并濃縮，采用60°C減壓真空干燥箱蒸干，即得。
[0006] 炙甘草飲片提取物制備方法中，水的用量是飲片重量的6-12倍，優(yōu)選8倍。
[0007] 通過HPLC指紋圖譜的方法鑒別和評(píng)價(jià)炙甘草飲片提取物，該方法包括如下步驟： A、取供測(cè)試的炙甘草飲片及提取物，所述供測(cè)試的炙甘草飲片提取物按權(quán)利要求1所 述方法處理得到炙甘草飲片提取物。
[0008] B、將炙甘草提取物粉碎，過四號(hào)篩，稱取供試品粉末適量，置具塞錐形瓶中，加入 70%乙醇100ml，超聲處理30分鐘，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，得到供試品，用于高效液相 色譜分析。
[0009] C、高效液相色譜條件為：色譜柱為C18色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0. 05%磷酸，流速 為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為237nm，梯度洗脫方式如下： O到8min時(shí)，流動(dòng)相A體積比為19% ; 8到35min時(shí)，流動(dòng)相A體積比由19%上升到50% ; 35到36min時(shí)，流動(dòng)相A體積比由50%上升到100% ; 36到40min時(shí)，流動(dòng)相A體積比為100% ; 40到50min時(shí)，流動(dòng)相A體積比由100%下降到19%。
[0010] D、精密吸取步驟B的供試品溶液，注入液相色譜中，按C所述的色譜條件進(jìn)行洗 脫，得到供試品的HPLC圖譜。
[0011] 其中C18色譜柱是Agilent TC-C18 (2)色譜柱；在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Agilent TC-C18 (2)色譜柱規(guī)格為 4. 6mmX 250mm，5 μ m ;柱溫 25°C。
[0012] 其方法學(xué)驗(yàn)證如下： 1. 儀器與材料 Agilent 1260高效液相色譜儀，二元泵，紫外檢測(cè)器，真空脫氣機(jī)，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣 器，美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品，處理軟件：Agilent化學(xué)工作站。
[0013] 色譜條件：色譜柱：Agilent TC-C18 (2)色譜柱（250mmX4. 6mm)，KQ-300DB 型數(shù)控 超聲波清洗器，真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。
[0014] 炙甘草飲片，乙醇、磷酸(分析純)，乙腈(色譜純)。
[0015] 2.方法與結(jié)果 2. 1供試品溶液的制備 取炙甘草飲片，用紫砂鍋進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)煎煮，加入炙甘草飲片重量6-12倍的水，一煎提取 20-40分鐘，二煎加炙甘草飲片重量4-10倍的水，提取10-30分鐘；藥液趁熱過濾，合并兩 次煎液，濃縮，60°C真空減壓干燥箱蒸干，研細(xì)，過四號(hào)篩，即得炙甘草提取物粉末。稱取炙 甘草提取物粉末0. 2g于具塞錐形瓶中，加入70 %乙醇100ml，超聲處理30分鐘，放冷，搖 勻，溶液用0. 45 μ m濾膜濾過，取續(xù)濾液，為供試品溶液。
[0016] 2. 2方法學(xué)考察 2. 2. 1精密度試驗(yàn) 取供試品溶液，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，直接觀察各指紋圖譜的整體情況，無(wú) 明顯變化，重疊良好，共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于1. 0%，相對(duì)峰面積的RSD小于2. 0%， 表明儀器精密度良好。
[0017] 2. 2. 2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液，在上述色譜條件下，分別在〇, 2, 4, 8, 12, 24h進(jìn)樣分析，直接觀察各指 紋圖譜的整體情況，無(wú)明顯變化，重疊良好，共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于3%，相對(duì)峰面 積RSD小于3%，表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。
[0018] 2. 2. 3重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品6份，按2. 1要求分別制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，直接觀察 各指紋圖譜的整體情況，無(wú)明顯變化，重疊良好，共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于1%，相對(duì) 峰面積的RSD小于2%，表明方法重現(xiàn)性良好。
[0019] 2. 3指紋圖譜的建立 取不同基源的炙甘草提取物樣品，按2. 1要求制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn) 行分析，得到炙甘草提取物的指紋圖譜，見圖2,并采用國(guó)家藥典委員會(huì)開發(fā)的"中藥色譜指 紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版"軟件對(duì)樣品的指紋圖譜進(jìn)行了分析，以Sl為參照指紋圖 譜進(jìn)行相似度計(jì)算，炙甘草提取物相似度見表1 ;選擇一個(gè)保留時(shí)間及峰形穩(wěn)定的色譜峰 為參照物（S)，分別求出各樣品中各組分相對(duì)參照物的相對(duì)保留時(shí)間，見表2, RSD小于1%。
[0020] 表1不同基源炙甘草提取物指紋圖譜相似度表
表2不同基源炙甘草共有峰的相對(duì)保留時(shí)間
本發(fā)明建立的炙甘草提取物高效液相指紋圖譜，其供試品制備方法簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)， 色譜條件容易實(shí)現(xiàn)，控制方法完整，專屬性強(qiáng)，精密度高，能從色譜整體特征面貌上把握炙 甘草提取物的質(zhì)量情況，為炙甘草提取物的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別提供了一種有效的技術(shù)手 段。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1炙甘草提取物的HPLC指紋圖譜。
[0022] 圖2不同基源炙甘草提取物HPLC指紋圖譜比較，如圖可見，不同產(chǎn)地的炙甘草飲 片提取物所得到的指紋圖譜較穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，易于辨認(rèn)，能從色譜整體特征面貌上把握炙 甘草提取物質(zhì)量情況。 具體實(shí)施例
[0023] 1.炙甘草提取物的制備 取炙甘草飲片l〇〇g，一煎加入飲片重量8倍的水，提取30分鐘，二煎加入飲片重量6倍 的水，提取20分鐘；提取液回收并濃縮、采用60°C減壓真空干燥箱蒸干，得到炙甘草飲片提 取物。
[0024] 2.儀器與材料 Agilent 1260高效液相色譜儀，二元泵，紫外檢測(cè)器，真空脫氣機(jī)，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣 器，美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品，處理軟件：Agilent化學(xué)工作站。
[0025] 色譜條件：色譜柱：Agilent TC-C18 (2)色譜柱（250mmX4. 6mm) ;KQ-300DB 型數(shù) 控超聲波清洗器；真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；炙甘草飲片，乙醇、磷酸(分析 純)，乙腈(色譜純)。
[0026] 3.供試品溶液的制備 將炙甘草提取物研成細(xì)粉，過四號(hào)篩。稱取炙甘草提取物粉末〇. 2g于具塞錐形瓶中， 加入70 %乙醇100mL，超聲處理30分鐘，放冷，搖勻，溶液用0. 45 μ m濾膜濾過，取續(xù)濾液， 作為供試品溶液。
[0027] 4.指紋圖譜的制作 色譜柱為Agilent TC-C18 (2)柱，柱溫25°C，流速為1.0 ml/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)為237nm ; 流動(dòng)相為乙腈-〇. 05%磷酸；梯度洗脫方式如下： O到8min時(shí)，流動(dòng)相A體積比為19% ; 8到35min時(shí)，流動(dòng)相A體積比由19%上升到50% ; 35到36min時(shí)，流動(dòng)相A體積比由50%上升到100% ; 36到40min時(shí)，流動(dòng)相A體積比為100% ; 40到50min時(shí)，流動(dòng)相A體積比由100%下降到19%。
[0028] 在此條件下分析供試品溶液，得到炙甘草飲片提取物的指紋圖譜，見圖1。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 制備炙甘草飲片提取物的方法，具體包括如下步驟：取炙甘草飲片，加入炙甘草飲 片重量6-12倍的水，一煎提取20-40分鐘，二煎加炙甘草飲片重量4-10倍的水，提取10-30 分鐘，濾液過濾、回收并濃縮，采用60°C真空減壓干燥箱蒸干，即得。2. -種炙甘草飲片提取物的指紋圖譜鑒別方法，該方法包括如下步驟： A、 取供測(cè)試的炙甘草飲片提取物，研細(xì)，稱取粉末0. 2-2g，置具塞錐形瓶中，加入70% 乙醇溶解，超聲20-40分鐘，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，得到供試品； B、 高效液相色譜條件為：色譜柱為C18色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0. 05%磷酸水溶液，流速 為I.Oml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為237nm，梯度洗脫方式如下： O到8min時(shí)，流動(dòng)相A體積比為19% ; 8到35min時(shí)，流動(dòng)相A體積比由19%上升到50% ; 35到36min時(shí)，流動(dòng)相A體積比由50%上升到100% ; 36到40min時(shí)，流動(dòng)相A體積比為100% ; 40到50min時(shí)，流動(dòng)相A體積比由100%下降到19% ; C、 精密吸取步驟A的供試品溶液，注入液相色譜中，按B所述的色譜條件進(jìn)行洗脫，得 到供試品的HPLC圖譜。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其B項(xiàng)中：所述C18色譜柱：AgilentTC-C18 (2)， 4. 6mmX250mm，5ym;柱溫 25 °C。4. 如權(quán)利要求2所述指紋圖譜中，其特征在于，獲得8個(gè)共有特征峰，依次標(biāo)記，選擇相 對(duì)保留時(shí)間為測(cè)定值：0.225 (峰 1)、0.465 (峰 2)、0.483 (峰 3)、0.654 (峰 4)、0.678 (峰 5)、0.687 (峰6)、0.943 (峰7)、1(峰8)(5)。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種炙甘草提取物及其指紋圖譜鑒別方法。制備炙甘草提取物的方法包括如下：取炙甘草飲片，兩次煎煮提取，濾液過濾、濃縮、干燥，即得。采用Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent TC-C18（2）色譜柱，在檢測(cè)波長(zhǎng)為237nm的條件下進(jìn)行梯度洗脫，得到炙甘草提取物指紋圖譜。建立炙甘草提取物的特征圖譜獲得8個(gè)共有特征峰，如附圖所示：標(biāo)記8號(hào)峰為參照峰，相對(duì)保留時(shí)間作為測(cè)定值：0.225（峰1）、0.465（峰2）、0.483（峰3）、0.654（峰4）、0.678（峰5）、0.687（峰6）、0.943（峰7）、1（峰8）（S）。本發(fā)明所得的指紋圖譜較穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、易于掌握，為炙甘草提取物的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別提供了一種有效的技術(shù)手段。
【IPC分類】G01N30/06, G01N30/02
【公開號(hào)】CN104914175
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510230941
【發(fā)明人】張志強(qiáng), 付靜, 夏鑫, 高揚(yáng)
【申請(qǐng)人】北京康仁堂藥業(yè)有限公司
【公開日】2015年9月16日
【申請(qǐng)日】2015年5月8日