萊陽經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)精細化工廠)；四氯金酸(HAuCl4, Alfa Aesar，阿法埃莎公司，天津)；羅丹明B(阿拉丁)；Pdda(聚二烯丙基二甲基氯化銨，Aldrich公司)；三磷酸腺苷(ATP，Sigma 公司);ATP 適體鏈:ACC TGG GGGAGTATT GCG GAG GAA GGT，PBS 溶液為0.0IM (pH 7.4，Na2HPO4-NaH2PO4)。
[0021]實施例1:
[0022]一種采用基于靜電作用修飾的金納米籠的納米熒光探針進行細胞內(nèi)ATP的熒光成像方法，包括如下步驟:
[0023](I)取適量結腸癌細胞HCT-116，以2000?3000轉/min離心5?lOmin，移除上清液；
[0024](2)加入制備好的基于靜電作用修飾的金納米籠的ATP納米熒光探針，用移液槍均勻分散細胞和探針，置于37°C恒溫水浴箱孵育10?50min后進行激光共聚焦掃描成像實驗；
[0025](3)將細胞置于共聚焦顯微鏡的載物臺上，以543nm為激發(fā)波長，以560?640nm為接收波長范圍，得到結腸癌細胞HCT-116的熒光成像圖，如圖1所示。細胞在吞噬納米熒光探針后仍然保持良好的形態(tài)。
[0026]實施例2:
[0027]實施例1中所述的基于靜電作用修飾的金納米籠的ATP納米熒光探針的制備方法，包括如下步驟:
[0028](I)在金納米籠的懸浮液中加入200 μ L濃度為5.832mg/mL的Pdda溶液，室溫振蕩過夜；
[0029](2)離心分離后加入100 μ L1.0X 10_5mol/L羅丹明B的PBS溶液，室溫振蕩過夜；
[0030](3)向上述溶液加入1yL濃度為1.0X 10_5M的ATP適體溶液，室溫振蕩過夜，離心分離，用PBS緩沖溶液(PH = 7.4)稀釋后完成基于金納米籠的ATP納米熒光探針的制備;
[0031]所述的金納米籠按文獻方法獲得(G.D.Moon, S.ff.Choi, X.Cai, ff.Y.Li, E.C.Cho, U.Jeong, L.V.Wang andY.N.Xia.J.Am.Chem.Soc.2011，133，4762 - 4765)。
[0032]本發(fā)明將納米技術與分子生物技術相結合，通過分子識別及特異性反應，可實現(xiàn)對細胞內(nèi)ATP高靈敏、高選擇性的熒光成像。本發(fā)明熒光成像的方法是將金納米籠載體、核酸適體及表面正電荷修飾技術結合在一起，使該納米熒光探針具有可生物響應的分子門，一旦完成納米熒光探針與細胞的孵育，即可通過細胞的內(nèi)吞作用，使納米熒光探針進入細胞，則發(fā)生細胞內(nèi)靶分子ATP與修飾在金納米籠載體表面的ATP適體的特異性識別反應，導致ATP適體鏈從金納米籠表面脫離，使封堵籠孔的分子門被打開，最終導致孔內(nèi)被封堵的熒光分子被釋放出來，實現(xiàn)熒光分子在細胞內(nèi)的可控釋放。因此，利用該納米熒光探針，能夠實現(xiàn)對細胞內(nèi)ATP的高靈敏、高選擇性熒光成像檢測。
[0033]本發(fā)明的細胞內(nèi)ATP的熒光成像方法具有選擇性好、可控性強、響應時間短、易于直接觀測、便于實時監(jiān)測等優(yōu)點，本發(fā)明所采用的納米熒光探針對ATP選擇性好、細胞毒性小、細胞膜滲透能力強、胞內(nèi)釋放可控性強、在細胞內(nèi)的分散性好，作為活細胞內(nèi)ATP的熒光成像納米探針，可實現(xiàn)細胞內(nèi)ATP的熒光成像檢測的研宄和應用。該成像方法在生物醫(yī)學、生命科學等領域具有較大的應用潛力和廣闊的應用前景，可用于細胞內(nèi)ATP的特異性成像檢測，為癌癥等重大疾病的早期診斷及治療提供新的途徑和方法。
【主權項】
1.一種細胞內(nèi)活性小分子的熒光成像方法，其特征在于:采用基于靜電作用修飾的納米熒光探針。2.一種如權利要求1所述的細胞內(nèi)活性小分子的熒光成像方法，其特征在于:所采用的納米熒光探針是以金納米籠為載體。3.一種如權利要求1所述的細胞內(nèi)活性小分子的熒光成像方法，其特征在于:所采用的納米熒光探針表面通過靜電作用組裝上核酸適體。4.一種如權利要求1所述的細胞內(nèi)活性小分子的熒光成像方法，其特征在于:所采用的納米熒光探針是在納米載體表面進行正電荷修飾。5.一種如權利要求1-4所述的任一細胞內(nèi)活性小分子的熒光成像方法，其特征在于:所采用的納米熒光探針優(yōu)選地在采用Pdda-即聚二烯丙基二甲基氯化銨對納米載體表面進行正電荷修飾。6.—種如權利要求1-5所述的任一種細胞內(nèi)活性小分子的焚光成像方法，其特征在于:該成像方法可用于細胞內(nèi)ATP的熒光成像。7.—種如權利要求1-6所述的任一種細胞內(nèi)活性小分子的焚光成像方法，其特征在于:細胞內(nèi)ATP的熒光成像方法包括如下步驟: (1)取適量細胞，離心分離，移除上清液； (2)加入基于靜電作用修飾的納米熒光探針，孵育一段時間后進行激光共聚焦掃描成像實驗； 其中，所述的基于靜電作用修飾的納米熒光探針的制備方法，包括如下步驟: (1)在金納米籠的懸浮液中加入Pdda溶液，室溫振蕩過夜； (2)離心分離，加入羅丹明B溶液，室溫振蕩過夜； (3)向上述溶液中加入ATP核酸適體溶液，室溫振蕩過夜，離心分離，用PBS緩沖溶液稀釋后即制得基于靜電作用修飾的納米熒光探針。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種可用于生物醫(yī)學及生命科學領域的細胞內(nèi)ATP的熒光成像方法。本發(fā)明通過采用基于靜電作用修飾的金納米籠-核酸適體的納米熒光探針進行細胞內(nèi)ATP的熒光成像研究，該方法所采用的新型納米熒光探針設計巧妙，結構簡單，對細胞內(nèi)ATP選擇性好、細胞毒性小、細胞膜滲透能力強、胞內(nèi)釋放可控性強、在細胞內(nèi)的分散性好，利用其作為活細胞內(nèi)ATP的熒光成像納米探針，可實現(xiàn)細胞內(nèi)ATP的熒光成像檢測的研究和應用。該成像方法在生物醫(yī)學、生命科學等領域具有較大的應用潛力和廣闊的應用前景，可用于細胞內(nèi)ATP的特異性成像檢測，為癌癥等重大疾病的早期診斷及治療提供新的途徑和方法。
【IPC分類】G01N21/64
【公開號】CN104931467
【申請?zhí)枴緾N201510091962
【發(fā)明人】王衛(wèi), 陳晨, 羅細亮
【申請人】青島科技大學
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年2月28日