一種電化學(xué)檢測(cè)的細(xì)胞前處理方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種電化學(xué)檢測(cè)的細(xì)胞前處理方法。
【背景技術(shù)】
[0002]體外細(xì)胞電化學(xué)試驗(yàn)方法是近幾年發(fā)展起來的用于細(xì)胞活性檢測(cè)的試驗(yàn)方法，相較于傳統(tǒng)方法，如MTT法、流式細(xì)胞儀法等，具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏、低成本等特點(diǎn)，可以細(xì)胞活性為指標(biāo)來評(píng)價(jià)抗癌藥物敏感性、環(huán)境致癌物毒性及生物材料的生物相容性，該方法目前主要通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)電活性物質(zhì)伏安響應(yīng)的變化來反映細(xì)胞活性的變化，因此細(xì)胞內(nèi)電活性物質(zhì)的有效釋放是完成該項(xiàng)測(cè)試的關(guān)鍵性因素，而目前用來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)電活性物質(zhì)釋放的細(xì)胞前處理技術(shù)是細(xì)胞加熱裂解法和細(xì)胞原位低滲裂解法，即在進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)之前，首先把細(xì)胞放置于一定溫度的裝置中，使其加熱失活，從而釋放出細(xì)胞內(nèi)電活性物質(zhì)，該方法實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞中電活性物質(zhì)在檢測(cè)裝置中的有效釋放，可以保證細(xì)胞電化學(xué)方法檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)電活性物質(zhì)。傳統(tǒng)細(xì)胞加熱裂解法中細(xì)胞生存環(huán)境為高滲PBS溶液，如果采用低滲溶液如雙蒸水代替高滲PBS溶液，使細(xì)胞周圍環(huán)境為低滲溶液，則可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大量吸水脹大，從而加強(qiáng)細(xì)胞裂解程度，這樣就可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞原位低滲裂解。
[0003]現(xiàn)有細(xì)胞前處理技術(shù)雖然在一定程度上實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)電活性物質(zhì)的釋放，從而完成細(xì)胞的電化學(xué)檢測(cè)，以其測(cè)定結(jié)果表達(dá)細(xì)胞活性的變化，但該方法只是實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞膜表面打開通道來釋放電活性物質(zhì)，電活性物質(zhì)釋放不夠完全，從而電化學(xué)信號(hào)較弱，無法用其來真實(shí)地反映細(xì)胞活性的變化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有細(xì)胞前處理技術(shù)釋放電活性物質(zhì)不夠完全，從而無法真實(shí)地反映細(xì)胞活性變化的問題，提供一種電化學(xué)檢測(cè)的細(xì)胞前處理方法。
[0005]本發(fā)明一種電化學(xué)檢測(cè)的細(xì)胞前處理方法為細(xì)胞原位復(fù)合裂解法，具體方法為:將待檢測(cè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，置于37°C、CO2體積濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后去除培養(yǎng)基，加入低滲裂解液，調(diào)整待檢測(cè)細(xì)胞濃度為5X 14?5X 10 8Cells -mL \然后在30?70°C水浴條件下，裂解30?60min，即完成。
[0006]本發(fā)明在細(xì)胞加熱裂解法的基礎(chǔ)上復(fù)合低滲裂解法，即用低滲溶液如雙蒸水代替高滲PBS溶液，使細(xì)胞周圍環(huán)境為低滲溶液，同時(shí)輔助加熱，實(shí)現(xiàn)雙重效果疊加，導(dǎo)致細(xì)胞大量吸水脹大，從而加強(qiáng)細(xì)胞裂解程度，直至細(xì)胞膜最終破裂，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞原位復(fù)合裂解，完全釋放出細(xì)胞內(nèi)全部電活性物質(zhì)，不僅有效增強(qiáng)了電化學(xué)信號(hào)，而且真實(shí)地反映了細(xì)胞內(nèi)電活性物質(zhì)的實(shí)際含量，提高了電化學(xué)檢測(cè)信號(hào)的敏感度，使其更有利于細(xì)胞活性檢測(cè)，并且能夠真實(shí)地反映細(xì)胞活性的變化，提高了細(xì)胞電化學(xué)試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性，有望在實(shí)際樣本檢測(cè)中獲得更加廣泛的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0007]圖1為試驗(yàn)I試驗(yàn)組、對(duì)照組I和對(duì)照組2的MCF-7細(xì)胞三種裂解方式對(duì)比的電化學(xué)圖；其中a為細(xì)胞原位復(fù)合裂解，b為細(xì)胞原位加熱裂解，c為細(xì)胞原位低滲裂解；
[0008]圖2為試驗(yàn)I的試驗(yàn)組細(xì)胞裂解產(chǎn)物的顯微鏡圖；
[0009]圖3為試驗(yàn)I的對(duì)照組I細(xì)胞裂解產(chǎn)物的顯微鏡圖；
[0010]圖4為試驗(yàn)I的對(duì)照組2細(xì)胞裂解產(chǎn)物的顯微鏡圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式一種電化學(xué)檢測(cè)的細(xì)胞前處理方法為細(xì)胞原位復(fù)合裂解法，具體方法為:將待檢測(cè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，置于37°c、CO2體積濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后去除培養(yǎng)基，加入低滲裂解液，調(diào)整待檢測(cè)細(xì)胞濃度為5X104?5X 18Cells.mL \然后在30?70°C水浴條件下，裂解30?60min，即完成。
[0012]本【具體實(shí)施方式】在細(xì)胞加熱裂解法的基礎(chǔ)上復(fù)合低滲裂解法，即用低滲溶液如雙蒸水代替高滲PBS溶液，使細(xì)胞周圍環(huán)境為低滲溶液，同時(shí)輔助加熱，實(shí)現(xiàn)雙重效果疊加，導(dǎo)致細(xì)胞大量吸水脹大，從而加強(qiáng)細(xì)胞裂解程度，直至細(xì)胞膜最終破裂，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞原位復(fù)合裂解，完全釋放出細(xì)胞內(nèi)全部電活性物質(zhì)，不僅有效增強(qiáng)了電化學(xué)信號(hào)，而且真實(shí)地反映了細(xì)胞內(nèi)電活性物質(zhì)的實(shí)際含量，提高了電化學(xué)檢測(cè)信號(hào)的敏感度，使其更有利于細(xì)胞活性檢測(cè)，并且能夠真實(shí)地反映細(xì)胞活性的變化，提高了細(xì)胞電化學(xué)試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性，有望在實(shí)際樣本檢測(cè)中獲得更加廣泛的應(yīng)用。
[0013]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:所述的培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基。其他步驟和參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0014]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一或二不同的是:所述的去除培養(yǎng)基的方法為用移液槍吸去培養(yǎng)基，并用等滲PBS緩沖液沖洗三遍。其他步驟和參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一或二相同。
[0015]【具體實(shí)施方式】四:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至三之一不同的是:所述的低滲裂解液為雙蒸水。其他步驟和參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至三之一相同。
[0016]【具體實(shí)施方式】五:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至四之一不同的是:所述的在50°C水浴條件下，裂解30min。其他步驟和參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至四之一相同。
[0017]通過以下試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果:
[0018]試驗(yàn)1、本試驗(yàn)試驗(yàn)組電化學(xué)檢測(cè)的細(xì)胞前處理方法為細(xì)胞原位復(fù)合裂解法，具體方法為:將5X105cells -mL 1的MCF-7細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，置于37°C、C02體積濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后去除培養(yǎng)基，再加入雙蒸水，調(diào)整細(xì)胞濃度為5X 16Cells ^mL \然后在50°C水浴條件下，裂解30min，即完成。
[0019]對(duì)照組I細(xì)胞原位加熱裂解法的方法為:將5X 15Cells.mL 1MCFI細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，置于37°C、CO2體積濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后去除培養(yǎng)基，再加入高滲PBS，調(diào)整細(xì)胞濃度為5 X 16ceIls.mL \然后在50°C水浴條件下，裂解30min，即完成；其中高滲 PBS 為 Phosphate buffer saline (PBS電化學(xué)，pH 7.4)，其包括沈2.2mmolL 1Na2HPO4.12H20 和 199.9mmol.L 1KH2PO4)。
[0020]對(duì)照組2細(xì)胞原位低滲裂解法的方法為:將5X 15Cells.mL 1MCFI細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，置于37°C、CO2體積濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后去除培養(yǎng)基，再加入雙蒸水，調(diào)整細(xì)胞濃度為5X 16Cells.mL \然后在37°C水浴條件下，裂解30min，即完成。[0021 ] 將試驗(yàn)組、對(duì)照組I和對(duì)照組2的細(xì)胞裂解產(chǎn)物循環(huán)伏安法檢測(cè)，記錄細(xì)胞的電化學(xué)信號(hào)，試驗(yàn)組細(xì)胞原位復(fù)合裂解產(chǎn)物在0.7V和1.1V處分別出現(xiàn)兩個(gè)檢測(cè)峰，其中0.7V處檢測(cè)峰為黃嘌呤與鳥嘌呤氧化的循環(huán)伏安峰，而1.1V處為腺嘌呤和次黃嘌呤氧化的循環(huán)伏安峰，分析細(xì)胞中嘌呤堿基的含量，從而可以確定四種嘌呤堿基含量的相對(duì)水平。
[0022]本試驗(yàn)中去除培養(yǎng)基的方法為:用移液槍吸去培養(yǎng)基，并用等滲PBS緩沖液沖洗三遍；其中等滲 PBS 緩沖液為 Phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4)，其包括 136.7mmolL 1NaCU.7mmol L 1KCH 7mmol L 1Na2HPO4.12H20 和 1.5mmol.L 1KH2PO40
[0023]通過數(shù)據(jù)處理，分析比較試驗(yàn)組和對(duì)照組I和對(duì)照組2的電化學(xué)數(shù)據(jù)的差異，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組細(xì)胞原位復(fù)合裂解的電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)高于細(xì)胞原位加熱裂解和低滲裂解法，信號(hào)增強(qiáng)作用明顯，0.7V處的檢測(cè)峰面積分別比對(duì)照組I和對(duì)照組2增加了 138.79%和156.79%, 1.1V處的檢測(cè)峰面積分別比對(duì)照組I和對(duì)照組2增加了 205.80%和244.09%,從而表明該方法更適于細(xì)胞電化學(xué)檢測(cè)前處理，尤其是增加了對(duì)于腺嘌呤和次黃嘌呤檢測(cè)的敏感度；同時(shí)該裂解方式還能夠降低細(xì)胞內(nèi)嘌呤物質(zhì)的檢出下限，原單純加熱裂解檢測(cè)下限僅為IXlO5ceIls.mL \而復(fù)合裂解檢測(cè)下限達(dá)到2.5X 104cells.mL \提高電化學(xué)的靈敏性。
[0024]用顯微鏡觀察試驗(yàn)組、對(duì)照組I和對(duì)照組2的細(xì)胞裂解產(chǎn)物，結(jié)果如圖2、圖3和圖4所示，由圖2可知:細(xì)胞在原位復(fù)合裂解下，細(xì)胞吸水腫脹且細(xì)胞膜破裂，經(jīng)過吉姆薩染液染色后，可明顯觀察到細(xì)胞核完整，細(xì)胞膜破碎并散落在溶液中。由圖3可知:細(xì)胞在原位加熱裂解下，細(xì)胞處在高滲PBS(Wfc%，中失水皺縮，經(jīng)過吉姆薩染液染色后，可明顯觀察到細(xì)胞是完整且形態(tài)皺縮。由圖4可知:細(xì)胞在原位低滲裂解下，細(xì)胞吸水腫脹，可明顯觀察到細(xì)胞腫脹并部分細(xì)胞膜破裂。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種電化學(xué)檢測(cè)的細(xì)胞前處理方法，其特征在于該方法為細(xì)胞原位復(fù)合裂解法，具體方法為:將待檢測(cè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，置于37°C、CO2體積濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后去除培養(yǎng)基，再加入低滲裂解液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5X 14?5X 10 8cells -mL \然后在30?70°C水浴條件下，裂解30?60min，即完成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種電化學(xué)檢測(cè)的細(xì)胞前處理方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種電化學(xué)檢測(cè)的細(xì)胞前處理方法，其特征在于所述的去除培養(yǎng)基的方法為用移液槍吸去培養(yǎng)基，并用等滲PBS緩沖液沖洗三遍。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種電化學(xué)檢測(cè)的細(xì)胞前處理方法，其特征在于所述的低滲裂解液為雙蒸水。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種電化學(xué)檢測(cè)的細(xì)胞前處理方法，其特征在于所述的在50°C水浴條件下，裂解30min。
【專利摘要】一種電化學(xué)檢測(cè)的細(xì)胞前處理方法，它涉及一種電化學(xué)檢測(cè)的細(xì)胞前處理方法。本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有細(xì)胞前處理技術(shù)釋放電活性物質(zhì)不夠完全，從而無法真實(shí)地反映細(xì)胞活性變化的問題，本發(fā)明方法為：將待檢測(cè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、CO2體積濃度為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后去除培養(yǎng)基，再加入低滲裂解液，調(diào)整細(xì)胞濃度，然后在水浴條件下，裂解，即完成。本發(fā)明的細(xì)胞原位復(fù)合裂解，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞膜的完全破裂，電化學(xué)信號(hào)大幅度增強(qiáng)，且處理簡(jiǎn)化，不僅使電化學(xué)檢測(cè)信號(hào)加強(qiáng)，更重要的是電化學(xué)檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確地反映了細(xì)胞內(nèi)電活性物質(zhì)含量的真實(shí)情況。本發(fā)明應(yīng)用于生物分析領(lǐng)域。
【IPC分類】G01N27/26
【公開號(hào)】CN105021671
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510324323
【發(fā)明人】崔繼文, 畢勝, 野秀玉, 李錦蓮, 劉繼光, 武冬梅
【申請(qǐng)人】佳木斯大學(xué)
【公開日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年6月12日