化大豆卵磷脂 的摩爾比為3:1，膽固醇的量為占大豆卵磷脂、氫化大豆卵磷脂和膽固醇三者總摩爾數(shù)的 5%，然后將大豆卵磷脂、氫化大豆卵磷脂和膽固醇用乙醇溶解，在60°C恒溫水浴下用旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，除去乙醇，然后真空干燥過夜，再用PH為7. 4的磷酸鹽緩沖液水合1 小時(shí)，得到空白的復(fù)合磷脂脂質(zhì)體。
[0072] 3、溶液配制
[0073]I、HSPC、SPC、膽固醇、PC標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制
[0074] 精密稱取HSPC、SPC、膽固醇、PC標(biāo)準(zhǔn)品各20mg，分別加入IOmL容量瓶中，用甲醇 稀釋定容，作為對照溶液。
[0075] II、復(fù)合磷脂脂質(zhì)體溶液的配制
[0076] 稱取步驟2制備的復(fù)合磷脂脂質(zhì)體適量，用10倍量的甲醇溶解，作為實(shí)驗(yàn)溶液。
[0077] 4、檢測
[0078] 將含HSPC、SPC、膽固醇、PC標(biāo)準(zhǔn)品的對照溶液和含復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的實(shí)驗(yàn)溶液用 實(shí)施例1的檢測進(jìn)行檢測。
[0079] 5、試驗(yàn)結(jié)果
[0080]SPC、HSPC、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC-ELSD色譜圖如圖1、圖2和圖3所示，復(fù)合磷 脂脂質(zhì)體的HPLC-ELSD色譜圖如圖4所示。從圖1中可以看出，SPC標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間 為20. 4min，22. 5min，24. 3min;從圖2中可以看出，HSPC標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為32. 8min， 40. 5min;從圖3可以看出，膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為27.Omin;從圖4可以看出，HSPC在 32. 8min、40. 6min出峰，SPC在 20. 4min，22. 5min，24. 4min出峰，膽固醇在 27.Omin出峰。 由此可見，復(fù)合磷脂脂質(zhì)體中各組分SPC、HSPC、膽固醇分別與SPC標(biāo)準(zhǔn)品、HSPC標(biāo)準(zhǔn)品、膽 固醇標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間一致，同時(shí)復(fù)合磷脂脂質(zhì)體中各組分HSPC，SPC和膽固醇能同時(shí)被 檢測到，且實(shí)現(xiàn)基線分離。
[0081] 從圖2和圖4可以看出，HSPC有兩個(gè)出峰，因?yàn)镠SPC有兩種不同脂肪酸結(jié)構(gòu)，分 別是十六烷酸（棕櫚酸）和十八烷酸（硬脂酸），所以色譜行為表現(xiàn)為2個(gè)出峰。
[0082] 從圖1和圖4可以看出，SPC有三個(gè)出峰，因?yàn)镾PC并非單一的化合物，而是基架 結(jié)構(gòu)相同但脂肪酸鏈不同的一類物質(zhì)的混合物，而蒸發(fā)光散射檢測器，其特點(diǎn)之一就是進(jìn) 入散射池中的所有物質(zhì)都可被檢測。
[0083]在比較卵磷脂標(biāo)準(zhǔn)品（PC)在同色譜條件下的色譜行為發(fā)現(xiàn)（見圖5)，SPC標(biāo)準(zhǔn) 品的出峰時(shí)間為20. 479min，22. 263min，24. 410min，PC標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為20. 486min， 22. 727min，24. 435min，其出峰時(shí)間幾乎一致；也就是說，PC、SPC作為分子結(jié)構(gòu)與分子量均 非常接近的卵磷脂，其色譜行為表現(xiàn)出高度相似性；基于此，認(rèn)為SPC標(biāo)準(zhǔn)品中含有保留時(shí) 間接近的一系列混合物，故本發(fā)明利用SPC、HSPC所有峰面積之總和來計(jì)算SPC、HSPC的總 含量。
[0084] 試驗(yàn)二、本發(fā)明的利用HPLC-ELSD同時(shí)測定復(fù)合磷脂脂質(zhì)體中各組分含量的方法 的精密度測定試驗(yàn)
[0085] 1、試驗(yàn)方法
[0086] 稱取6組復(fù)合磷脂脂質(zhì)體樣品，將6組復(fù)合磷脂脂質(zhì)體樣品用甲醇分別定容于容 量瓶中，分別配制成6組復(fù)合磷脂脂質(zhì)體甲醇溶液，即為6組試驗(yàn)溶液，各組試驗(yàn)溶液中 HSPC、SPC、膽固醇含量分別為200、100、100yg?mL\ 6組試驗(yàn)溶液在同樣的條件下分別連 續(xù)用實(shí)施例1的檢測方法檢測，分別得到6組HSPC、SPC、膽固醇的峰面積。
[0087] 2、試驗(yàn)結(jié)果
[0088] 計(jì)算HSPC、SPC、膽固醇峰面積的RSD值，分別為I. 9%，2. 0%，I. 5%(n= 3)。由 此可見，本發(fā)明的檢測方法的精密度很高。
[0089] 試驗(yàn)三、本發(fā)明的利用HPLC-ELSD同時(shí)測定復(fù)合磷脂脂質(zhì)體中各組分含量的方法 的回收率測定試驗(yàn)
[0090] 1、試驗(yàn)方法
[0091] 精密稱取HSPC、SPC、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品各9份，將9份HSPC、SPC、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品分別加 甲醇稀釋定容，分別配制成9組HSPC甲醇溶液、SPC甲醇溶液、膽固醇甲醇溶液。9組HSPC 甲醇溶液、SPC甲醇溶液、膽固醇甲醇溶液均分為高、中、低3個(gè)濃度組。每個(gè)濃度組均含有 三組溶液，高濃度：HSPC、SPC、膽固醇的濃度分別200、100、100yg.mL\中濃度：HSPC、SPC、 膽固醇的濃度分別為100、50、50yg?mL\低濃度：HSPC、SPC、膽固醇的濃度分別為20、10、 10yg?mLi。將9組HSPC甲醇溶液、SPC甲醇溶液、膽固醇甲醇溶液在同樣條件下用實(shí)施 例1的檢測方法檢測，分別得到9組HSPC標(biāo)準(zhǔn)品、SPC標(biāo)準(zhǔn)品、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積。根 據(jù)9組HSPC標(biāo)準(zhǔn)品、SPC標(biāo)準(zhǔn)品、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積得到9組HSPC、SPC、膽固醇的含 量，從而計(jì)算回收率。
[0092] 2、試驗(yàn)結(jié)果
[0093] HSPC、SPC、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品的回收率分別為98. 6%，99. 3%，98. 5%。由此可見，本 發(fā)明的檢測方法回收率很高。
[0094] 試驗(yàn)四、本發(fā)明的利用HPLC-ELSD同時(shí)測定復(fù)合磷脂脂質(zhì)體中各組分含量的方法 在監(jiān)測不同復(fù)合磷脂脂質(zhì)體制備工藝中的應(yīng)用
[0095] 1、試驗(yàn)方法
[0096] 采用成膜法、超聲法和及擠出法三種工藝方法制備復(fù)合磷脂脂質(zhì)體，每種工藝設(shè) 置三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每種工藝的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組除了HSPC、SPC和膽固醇的投料比不同之外，其他工 藝條件均相同。每種工藝的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中制備好的復(fù)合磷脂脂質(zhì)體采用實(shí)施例1的方法進(jìn) 行檢測。
[0097] 2、試驗(yàn)結(jié)果
[0098] 采用成膜法的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組在成膜前后、采用超聲法的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組在超聲前后、采 用擠出法的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組在擠出前后各組分的變化如表1所示：
[0099] 表1不同工藝條件下復(fù)合磷脂脂質(zhì)體中各組分的比例
[0100]
[0101] 由表1可以看出，采用成膜法、超聲法和及擠出法制備復(fù)合磷脂脂質(zhì)體，成膜前 后、超聲前后、擠出前后，HSPC、SPC和膽固醇的比例變化不大，由此說明復(fù)合磷脂脂質(zhì)體在 蒸發(fā)成膜、探頭超聲、高壓均質(zhì)擠出等工藝條件下趨于穩(wěn)定，可用于指導(dǎo)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研 究。
[0102] 試驗(yàn)五、本發(fā)明的利用HPLC-ELSD同時(shí)測定復(fù)合磷脂脂質(zhì)體中各組分含量的方法 在不同儲藏條件監(jiān)測復(fù)合磷脂脂質(zhì)體中的應(yīng)用
[0103] 試驗(yàn)方法：
[0104] 設(shè)置三個(gè)試驗(yàn)組，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的復(fù)合磷脂脂質(zhì)體質(zhì)量相等，且均取自試驗(yàn)一制備 的復(fù)合磷脂脂質(zhì)體，將三個(gè)試驗(yàn)組的復(fù)合磷脂脂質(zhì)體分別在4°C、25°C、60°C條件下儲藏，在 儲藏過程中，各實(shí)驗(yàn)組分別取儲藏2、4、8、24小時(shí)的復(fù)合磷脂脂質(zhì)體用實(shí)施例1的方法進(jìn)行 檢測。
[0105] 試驗(yàn)結(jié)果：
[0106] 檢測的結(jié)果見表2:
[0107] 表2不同儲存溫度條件下復(fù)合磷脂脂質(zhì)體中各組分的比例
[0108]
[0109] 從表2可以看出，隨著儲藏溫度的升高，SPC的含量明顯減少，所占的百分比逐漸 減少，膽固醇和HSPC的比例變化不明顯，而4°C的條件下各組分的比例變化不明顯。隨著儲 藏溫度的升高，復(fù)合磷脂脂質(zhì)體中SPC的含量變化明顯，這可能與SPC為天然植物不飽和磷 月旨，其容易氧化有關(guān)。
[0110] 實(shí)驗(yàn)四和實(shí)驗(yàn)五表明，本發(fā)明的檢測方法可用于監(jiān)測復(fù)合磷脂脂質(zhì)體在制備、儲 藏等過程中各組分的含量變化，為復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的質(zhì)量控制提供可行性方案。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用HPLC-ELSD同時(shí)測定復(fù)合磷脂脂質(zhì)體中各組分含量的方法，其特征在于包 括如下步驟： 1) 設(shè)置檢測條件 HPLC條件： 色譜柱：C18色譜柱； 流動相：流動相A為2-6mM乙酸銨緩沖溶液，流動相B為2-6mM乙酸銨甲醇溶液； 梯度洗脫： 第一階段：采用流動相A和流動相B的混合流動相洗脫10-15分鐘，其中流動相A的體 積百分含量為10-15 %，流動相B的體積百分含量為85-90% ; 第二階段：采用流動相B洗脫35-40分鐘； 第三階段：采用流動相A和流動相B的混合流動相洗脫5-15分鐘，其中流動相A的體 積百分含量為10-15 %，流動相B的體積百分含量為85-90% ; 流速：〇? 8-1. 2mL ? min S ELSD條件： 漂移管溫度：40-50°C ;氮?dú)饬魉伲?. 7-2. ImL ? min S增益：4 ;采用分流模式； 2) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 ① 繪制大豆卵磷脂的標(biāo)準(zhǔn)曲線 I、 稱取五組大豆卵磷脂標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別定容稀釋于容量瓶中，分別配制成五組大 豆卵磷脂含量不同的大豆卵磷脂甲醇溶液，將五組大豆卵磷脂甲醇溶液用步驟1)的檢測 條件進(jìn)行檢測，得到五組大豆卵磷脂的峰面積； II、 以大豆卵磷脂的峰面積的對數(shù)為縱坐標(biāo)，以大豆卵磷脂含量的對數(shù)為橫坐標(biāo)，根據(jù) 各組檢測的數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，擬合后得到大豆卵磷脂的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到標(biāo)準(zhǔn)曲 線的函數(shù)關(guān)系式y(tǒng) = kiX+bi; ② 繪制氫化大豆卵磷脂的標(biāo)準(zhǔn)曲線 I、 稱取五組氫化大豆卵磷脂標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別定容稀釋于容量瓶中，分別配制成五 組氫化大豆卵磷脂含量不同的氫化大豆卵磷脂甲醇溶液，將五組氫化大豆卵磷脂甲醇溶液 用步驟1)的檢測條件進(jìn)行檢測，得到五組氫化大豆卵磷脂的峰面積； II、 以氫化大豆卵磷脂的峰面積的對數(shù)為縱坐標(biāo)，以氫化大豆卵磷脂含量的對數(shù)為橫 坐標(biāo)，根據(jù)各組檢測的數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，擬合后得到氫化大豆卵磷脂的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲 線得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)關(guān)系式y(tǒng) = k2x+b2; ③ 繪制膽固醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線 I、 稱取五組膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別定容稀釋于容量瓶中，分別配制成五組膽固醇 含量不同的膽固醇甲醇溶液，將五組膽固醇甲醇溶液用步驟1)的檢測條件進(jìn)行檢測，得到 五組膽固醇的峰面積； II、 以膽固醇的峰面積的對數(shù)為縱坐標(biāo)，以膽固醇含量的對數(shù)為橫坐標(biāo)，根據(jù)各組檢測 的數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，擬合后得到膽固醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)關(guān)系 式 y = k3x+b3; 3) 實(shí)際復(fù)合磷脂脂質(zhì)體樣品的測定 稱取復(fù)合磷脂脂質(zhì)體樣品，用甲醇分別定容于容量瓶中，得到復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的甲醇 溶液，將復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的甲醇溶液用步驟1)的檢測條件進(jìn)行檢測，分別得到大豆卵磷 月旨、氫化大豆卵磷脂和膽固醇的峰面積，將大豆卵磷脂、氫化大豆卵磷脂、膽固醇的峰面積 分別代入大豆卵磷脂標(biāo)準(zhǔn)曲線、氫化大豆卵磷脂標(biāo)準(zhǔn)曲線、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線中，分別得到大 豆卵磷脂、氫化大豆卵磷脂、膽固醇的含量。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用HPLC-ELSD同時(shí)測定復(fù)合磷脂脂質(zhì)體中各組分含量的方法，該方法包括如下步驟：1)設(shè)置檢測條件；2)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；3)實(shí)際復(fù)合磷脂脂質(zhì)體樣品的測定。該方法具有快速、高效、準(zhǔn)確和可靠的優(yōu)點(diǎn)，可以同時(shí)檢測復(fù)合磷脂脂質(zhì)體中大豆卵磷脂(SPC)、氫化大豆磷脂(HSPC)和膽固醇的含量，用此檢測方法可驗(yàn)證復(fù)合磷脂脂質(zhì)體在制備過程中各成分的比例是否穩(wěn)定，同時(shí)也可考察外界條件如儲檢溫度或儲藏條件下對復(fù)合磷脂脂質(zhì)體中各組分比例的影響，為復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的質(zhì)量控制提供依據(jù)。
【IPC分類】G01N30/88
【公開號】CN105067742
【申請?zhí)枴緾N201510459309
【發(fā)明人】彭佩, 陳軍, 施紅, 楊成雄, 楊洋, 顧薇
【申請人】湖北荊楚理工科技開發(fā)有限公司
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年7月29日