預染色的血 清中分離出一種特殊的HDL亞類，即pre β 1-HDL，又稱為新生的HDL。同時，本發(fā)明應用新 建立的二維非線性GGE-免疫印跡技術，發(fā)現(xiàn)這種HDL亞類和最初由Fielding實驗室定義 的pre β I-HDL具有一致的特征。和其他HDL亞類比較，pre β I-HDL具有極高的顆粒密度 (>1. 20g/ml)，且其中載脂蛋白Apo Al和膽固醇的含量比最高。體外實驗顯示，2-硝基苯甲 酸（DTNB)能夠完全抑制pre β I-HDL向大顆粒HDL衍變。pre β I-HDL在新生兒臍帶血中 含量豐富，而在急性心梗患者和CETP變異者中的含量低于健康成人，在Tangier病患者中 則無法檢測到。研究結果表明，兩維凝膠電泳-免疫印跡法不能區(qū)分prei3 I-HDL和游離的 Apo Al，因此該法檢測pre β I-HDL并不準確。只有我們建立的非線性GGE技術才能夠精準 檢測prei3 1-HDL，具有良好的應用前景。
[0063] 我國于1999年由當時華西醫(yī)科大學載脂蛋白研究室吳新偉和傅明德等采用瓊 脂糖及梯度聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳、免疫印跡試驗和斑點掃描分析，建立了血清HDL亞 類的檢測方法，圖6。這是國內較早開展檢測pre β I-HDL的研究，后來陸續(xù)有很多應用 文獻報道。該法采用2% -30 %線性GGE作為二維電泳，與Asztalos法大同小異，兩者對 prei3 I-HDL的分辨效果相似。雖然該法在定量方法上有所改進，但仍然應用的是線性GGE， 同樣存在技術缺陷，無法區(qū)分prei3 I-HDL和游離的Apo A1。遺憾的是，這個問題長期沒有 被認識到。
[0064] 圖7為線性GGE應用于二維凝膠電泳，聯(lián)合免疫印跡技術檢測pre β 1-HDL。該法 由美國波士頓Tufts大學的Asztalos發(fā)表于1993年，后來廣為所用。經Boston Heart Diagnostics公司開發(fā)用于Boston Heart HDL Map?丨的核pre β I-HDL的認識，以致成為 本行業(yè)內公認的經典。然而，2014年Miyazaki報道兩維電泳技術檢測的pre β I-HDL實 質是一種游離的Apo Al單體。顯而易見，因為無法區(qū)分游離的Apo Α1，該項技術存在致 命缺陷，長期以來對于pre β I-HDL的認識一直存在概念上的混淆，導致錯誤地認為具有保 護作用的prei3 I-HDL的含量在冠心病患者中反而顯著升高。另外，線性梯度的凝膠（如 2% -36% )在制備中需要特殊的混合裝置，穩(wěn)定性也不如非線性梯度的設置。實施電泳時 間往往要24h。定量方法應用1251，需要嚴格的放射性實驗條件。由此可見，工序復雜，操作 耗時，且無法避免放射性問題，成為該項被視為經典的方法難以克服的技術限制。
[0065] 相比之下，我們建立的非線性GGE技術（圖1-2)則能夠清晰地分離開pre β I-HDL 和游離的Apo Α1。臨床資料顯示，冠心病急性心?；颊哐錺rei31-HDL的含量顯著降 低，這使prei3 I-HDL的保護作用與其臨床相關性更容易理解。且非線性濃度梯度獨立分 層的制備過程簡單易行，不需要特殊混合裝置；實施電泳僅需< 3. 5h ;定量方法無需放射 性物質。因此，我們建立的非線性GGE具有明顯的技術優(yōu)勢，并且是目前精準檢測血清 pre β I-HDL的唯一可行的方法。
[0066] 表3.本發(fā)明建立的非線性GGE與經典線性GGE的技術比較
[0067]
[0068] 綜上所述，本發(fā)明建立了一維非線性GGE的方法（圖1)。該法采用三段濃度分別 為3. 0 %、3. 6 %和7. 0 %的聚丙烯酰胺凝膠作為電泳介質，清晰地將蘇丹黑B染色的血清分 離出一種特殊的HDL亞類，即pre β 1-HDL，又稱為新生的HDL。進而我們采用同樣的三種濃 度設置，將原來的管狀凝膠改為平板凝膠（圖2)，并將這種板膠應用到兩維凝膠電泳系統(tǒng) 中，對瓊脂糖凝膠電泳分離的HDL進行二維電泳再分離，結合免疫印跡技術，結果發(fā)現(xiàn)這種 HDL 亞類的電泳特征和最初定義的 pre β 1-HDL(CastroG. R. and Fielding C. J.，1988)完 全一致。于是我們按照慣例將這種特殊的HDL亞類命名為prei3 1-HDL。同時，我們建立的 二維非線性GGE技術能夠非常清晰地將pre β I-HDL和游離的Apo Al分離開。臨床資料顯 示，冠心病急性心梗患者血清pre β I-HDL的含量顯著降低，這使pre β I-HDL的保護作用與 其臨床相關性更容易理解。非線性濃度梯度獨立分層的制備過程簡單易行，不需要特殊混 合裝置；實施電泳僅需< 3. 5h ;定量方法無需放射性物質。因此，我們建立的非線性GGE能 夠精準檢測pre β 1-HDL，在性能上具有明顯的優(yōu)越性，并且是目前唯一可行的方法。
[0069] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為 本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1. 非線性梯度凝膠和/或蘇丹黑B染色液在精準分離和定量分析血清pre P I-HDL中 的應用，所述的非線性梯度凝膠是由三段濃度依次為3. O%、3. 6%和7. O %的聚丙烯酰胺 凝膠共同組成，所述的蘇丹黑B染色液中蘇丹黑B的濃度為0. 5-1. Ow/v%，溶劑異丙醇和乙 二醇的體積比為4:1。2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的非線性梯度凝膠分別作為一維非 線性梯度管狀凝膠體系和二維非線性梯度平板凝膠體系分離血清pre P I-HDL的電泳介 質，所述的一維非線性梯度管狀凝膠體系分離蘇丹黑B預染色的血清pre 0 1-HDL。3. -種精準分離和定量分析血清preP I-HDL的方法，其特征在于，采用非線性梯 度凝膠精準分離和定量分析血清pre P 1-HDL，其中非線性梯度凝膠是由三段濃度依次為 3. 0%、3. 6%和7. 0%的聚丙烯酰胺凝膠共同組成。4. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的非線性梯度凝膠分別作為一維非 線性梯度管狀凝膠體系和二維非線性梯度平板凝膠體系分離血清pre P I-HDL的電泳介 質。5. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，采用一維非線性梯度管狀凝膠體系分離 蘇丹黑B預染色的血清pre P 1-HDL，所述的蘇丹黑B染色液中蘇丹黑B的濃度為0. 5-1. Ow/ V %，溶劑異丙醇和乙二醇的體積比為4:1。6. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的三段濃度依次為3. 0%、3. 6%和 7. 0%的聚丙稀酰胺凝膠作為分離膠，對應的膠層高度分別為7mm、40mm和45mm，誤差范圍 為±3mm，三層分離膠的總高度為82mm，誤差范圍±5mm〇7. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的非線性梯度凝膠在一維管狀凝膠 體系中的規(guī)格為內徑6-8mm，外徑8-10mm，非線性梯度凝膠在二維平板凝膠體系中的規(guī)格 為厚度為2_3mm，寬度為60_80mm。8. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的一維非線性梯度管狀凝膠體系分 離蘇丹黑B預染色的血清pre P 1-HDL，電泳緩沖液為5mM Tris和38. 4mM甘氨酸，電泳條件 為100V，2. 5h，電泳后將迀移距離原點65-75mm處孤立的染色區(qū)帶定義為pref3 I-HDL ;所述 的二維非線性梯度平板凝膠體系分離血清pre P 1-HDL，電泳緩沖液為5mM Tris和38. 4mM 甘氨酸，電泳條件為100V，3. 5h，電泳后將pre 0泳道上迀移距離原點65_75mm處印跡區(qū)帶 定義為pre 0 I-HDL和游離的Apo Al多聚體，迀移距離原點80-90mm處印跡區(qū)帶定義為游 離的Apo Al單體。9. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的二維非線性梯度平板凝膠體系分 離血清pre P 1-HDL，電泳前在加樣區(qū)加入少量酚紅溶液作為電泳指示劑。10. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的一維非線性梯度管狀凝膠體系 分離蘇丹黑B預染色的血清pre P 1-HDL，采用光密度掃描定量，以空白凝膠掃描值為統(tǒng)一 參比，計算出pre|3 I-HDL占血脂總體的百分含量；二維非線性梯度平板凝膠體系分離血清 preP 1-HDL、游離的Apo Al單體和多聚體，采用免疫印跡、化學發(fā)光和膠片成像技術進行定 性，在同一批內比較其相對含量。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種采用非線性梯度凝膠電泳精準分離和定量分析血清preβ1-HDL的方法。本發(fā)明優(yōu)點在于：本發(fā)明的非線性濃度梯度獨立分層的制備過程簡單易行，不需要特殊混合裝置；實施電泳僅需≤3.5h；定量方法無需放射性物質。本發(fā)明建立的非線性梯度凝膠電泳能夠精準檢測preβ1-HDL，在性能上具有明顯的優(yōu)越性，并且是目前唯一可行的方法。
【IPC分類】G01N33/561
【公開號】CN105137070
【申請?zhí)枴緾N201510466708
【發(fā)明人】陳允欽, 張曉金
【申請人】復旦大學附屬中山醫(yī)院
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年8月3日