一種川穹嗪的快速檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于快速熱解-氣相色譜-質譜聯(lián)用技術（PY-GC/MS法）快速檢 測川穹嗪含量的方法。
【背景技術】
[0002] 川穹為傘形科蒿木屬植物的根莖，被中醫(yī)稱為血中之氣藥，具有活血行氣、消散淤 血、祛風止痛之功效，其主要活性成分為川穹嗪，化學學名2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪。已有的研 究證實，川穹嗪具有活血化瘀，抗血小板凝集，擴張小動脈，改善微循環(huán)，抗氧化，拮抗鈣離 子及抗纖維化等作用。川穹嗪作用機制比較復雜，目前在臨床上主要應用于治療和預防各 種血管性疾病，效果較好。
[0003] 最近的研究表明川穹嗪對神經(jīng)系統(tǒng)有較好的保護作用，例如對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的物 理擠壓損傷，有可能是通過上調(diào)損傷區(qū)域腦組織的促進神經(jīng)細胞修復的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因 子（BDNF)、堿性成纖維生長因子（bFGF)基因表達等達到修復腦損傷；川穹嗪對周圍神經(jīng)系 統(tǒng)也有較好的保護作用，其作用靶點有可能與背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體相關。此外，川穹嗪對 視網(wǎng)膜變性、癲癇、糖尿病引起的神經(jīng)系統(tǒng)病變等其他神經(jīng)褪行性疾病均有保護作用。川穹 嗪及其復方制劑非常有可能成為神經(jīng)系統(tǒng)的保護藥物，因此，針對川穹嗪的快速、高效檢測 是非常必要的。
[0004] 現(xiàn)有對川穹嗪的檢測和分析主要采用高效液相的方法。受檢測設備的限制，往往 需要對樣品進行較為復雜的樣品前處理，包括：超聲、溶解和提取、調(diào)節(jié)PH值、過濾等步驟； 隨后根據(jù)川穹嗪標準品的保留時間和峰面積，定性和定量的判斷樣品中川穹嗪的含量。該 液相分析法的主要缺點是樣品處理過程復雜、總體分析時間長。
[0005] 快速熱解-氣相色譜/質譜聯(lián)用技術（PY-GC/MS)是一種高效的檢測易揮發(fā)性成 分的技術，近年來發(fā)展迅速。低溫下的熱解過程是一種非常有效的熱分離手段，通過控制 熱解的溫度和時間可以實現(xiàn)低沸點的復雜混合物的初步的氣-液或氣-固相分離；為氣相 色譜提供一種在線的和實時的樣品前處理和初步分離能力。分析檢測過程中的熱解時間、 溫度、升溫速率、載氣流速、分流比、離子化溫度等對分析結果的影響是很大的。因此，基于 PY-GC/MS技術的特點，目前亟需提出一種針對川穹嗪的快速、微量檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種川穹嗪的快速檢測方法，并基于此，初步判斷川穹質 量的高低。
[0007] 為達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案：
[0008] 1)準確稱取川穹或川穹制品0. 01~1.0 Omg得樣品，將樣品加入熱解杯中；
[0009] 2)采用快速熱解-氣相色譜-質譜聯(lián)用儀對加入熱解杯中的樣品進行測定；
[0010] 3)經(jīng)過步驟2)后，根據(jù)測定的原始色譜數(shù)據(jù)及質譜數(shù)據(jù)，定性樣品中川穹嗪的色 譜峰，并獲得樣品中川穹嗪的相對含量。 toon] 所述樣品為塊狀或粉末狀固體。
[0012] 所述熱解的條件為：熱解溫度為150~400 °C，熱解時間為0. 1~2min。
[0013] 所述氣相色譜的工作條件為：載氣為流速0. 1~4. OmL/min的氦氣，分流比為0~ 500 :1，升溫程序為：初始溫度為40~60°C，并保持O~3min，然后以彡30°C /min升至 150°C，然后以彡10°C /min升至300°C，然后以彡30°C /min升至310°C。
[0014] 所述質譜的工作條件為：采用EI源、正離子檢測，電子能量為50~80eV，離子源 溫度為200~250°C，單四級桿溫度為130~200°C，掃描方式為全掃描方式，電子倍增器電 壓為1070~3120V，溶劑延遲為0· 1~lOmin。
[0015] 所述相對含量采用面積歸一化方法進行計算。
[0016] 所述川穹嗪的色譜峰的定性采用NIST08軟件自動匹配計算。
[0017] 本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0018] 1)總分析時間短，提高分析效率?，F(xiàn)有方法是將川穹通過超聲萃取或溶劑萃取， 調(diào)節(jié)pH值、過濾處理后，利用高效液相色譜（HPLC)或高效液相色譜-質譜聯(lián)用（HPLC-MS) 技術，或薄層層析-光譜聯(lián)用技術（TLC-SP)等檢測其有效成分；該方法的一般分析時間為 4~8小時。本發(fā)明中通過熱解方法直接對川穹或川穹制品中的川穹嗪進行分析，大大節(jié)省 了分析時間，常規(guī)分析時間為〇. 5~1小時，提高了分析效率。
[0019] 2)所需樣品量少，靈敏度好?，F(xiàn)有方法因需要先分離得到川穹嗪粗品溶液，因此需 要的樣品量較大，通常是幾克到幾十克不等；本發(fā)明方法的分析所用樣品量一般為〇. 01~ lmg，提高了分析靈敏度。
[0020] 3)本發(fā)明優(yōu)化了熱解、色譜、質譜等檢測條件，可以快速定性所需的色譜峰，實現(xiàn) 了快速和準確檢測。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0022] 實施例
[0023] -種基于PY-GC/MS檢測川穹嗪的方法，以中藥材川穹為例，但本發(fā)明的保護范圍 不局限于該實驗，具體步驟如下：
[0024] 一、樣品準備
[0025] 將取得的川穹塊（陜西瑞康生物工程有限公司，西安）準確稱取 1.0 Omg (±0. 02mg)放入50 μ L的熱解小杯中；
[0026] 二、熱解：
[0027] 熱裂解爐采用 Frontiers 的 PY2020is ;
[0028] ①熱解溫度：320 °C ;
[0029] ②熱解時間：0· 2〇min。
[0030] 三、分離、檢測
[0031] 色譜：
[0032] 氣相色譜采用安捷倫7890A :
[0033] ①分析柱是DB-5MS彈性石英毛細管柱（30m*0. 25id*0. 25 μ m);
[0034] ②載氣：高純氦氣，流速為1.0 mL/min ;
[0035] ③進樣方式為分流進樣，分流比為100 :1 ;
[0036] ④進樣口溫度為280 °C，傳輸線溫度為290 °C ;
[0037] ⑤程序升溫：初始溫度為60°C，保持lmin，然后以30°C /min升至150°C，然后以 10°C /min 升至 300°C，然后以 30°C /min 升至 310°C。
[0038] 質譜（采用安捷倫5975C):
[0039] ① EI源，正離子檢測，電子能量為70eV ;
[0040] ②離子源溫度為230°C，單四級桿溫度為150°C ;
[0041] ③掃描方式為全掃描方式；
[0042] ④電子倍增器電壓為2082V，溶劑延遲為3min。
[0043] 四、數(shù)據(jù)分析及處理
[0044] 色譜圖的保留時間和積分面積由工作站自動完成，利用NIST08譜庫定性色譜峰。 各揮發(fā)性成分的相對含量通過面積歸一化法得到。
[0045] 本樣品川穹熱解組分中可辨認的峰為35個，成分及其保留時間列于表1。保留時 間及峰面積用安捷倫Chemstation計算，相對含量用面積歸一化的方法計算。
[0046] 表1.川穹中揮發(fā)性成分的組成和含量U1= 5. 889為川穹嗪）


[0050] 五、精密度、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性實驗
[0051] 1.精密度實驗：以取自同一川穹的樣品5份，按照上述方法連續(xù)進樣5次，對相對 峰面積大于0. 5%的35個色譜峰進行分析，其相對保留時間和相對峰面積的RSD (相對標準 偏差）分別在〇~〇. 88%和1~4%之間，說明本發(fā)明方法精密度良好。
[0052] 2.重現(xiàn)性實驗：取同一批次川穹的樣品5份，按照上述方法連續(xù)進樣5次。結果 35個色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別在0~2. 7%和0. 51~3. 6%之間， 說明本發(fā)明方法重現(xiàn)性良好。
[0053] 3.穩(wěn)定性實驗：取制備好的樣品1份，分別在0、2、4、8、12、24h進樣測定，結果35 個色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2. 3%，說明本發(fā)明方法在24h內(nèi)測定 是穩(wěn)定的。
[0054] 從根本上說川穹中的主要活性成分是川穹嗪，其可作為川穹品質的主要判斷標準 之一。不同的川穹樣品因產(chǎn)地、季節(jié)、炮制方式的不同，其含水量、密度等都有細微的不同， 因此，需要的熱解、分離和分析條件均不相同，據(jù)此得出本發(fā)明中的條件范圍。
[0055] 本發(fā)明選擇PY-GC/MS技術對川穹嗪含量進行檢測，是針對實際生產(chǎn)、生活中川穹 因產(chǎn)地、季節(jié)、炮制等不同而品質不同的問題，提供一種川穹嗪的快速、微量的檢測方法，進 而初步判斷川穹的質量。本發(fā)明具有操作簡單，檢測限低，實驗重現(xiàn)性好，實驗數(shù)據(jù)直觀可 靠等特點，特別適用于微量樣品檢測（樣品量可低至10 μ g)，并可用于對不同樣品間的質 量差別進行定量的比較，應用性廣，為川穹的質量標準和現(xiàn)代化應用提供了一條可以參考 的思路和方法。
【主權項】
1. 一種川穹嗪的快速檢測方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) 準確稱取川穹或川穹制品0.0 l~1.0 Omg得樣品，將樣品加入熱解杯中； 2) 采用快速熱解-氣相色譜-質譜聯(lián)用儀對加入熱解杯中的樣品進行測定； 3) 經(jīng)過步驟2)后，根據(jù)測定的原始色譜數(shù)據(jù)及質譜數(shù)據(jù)，定性樣品中川穹嗪的色譜 峰，并獲得樣品中川穹嗪的相對含量。2. 根據(jù)權利要求1所述一種川穹嗪的快速檢測方法，其特征在于：所述樣品為塊狀或 粉末狀固體。3. 根據(jù)權利要求1所述一種川穹嗪的快速檢測方法，其特征在于：所述熱解的條件為： 熱解溫度為150~400°C，熱解時間為0. 1~2min。4. 根據(jù)權利要求1所述一種川穹嗪的快速檢測方法，其特征在于：所述氣相色譜的工 作條件為：載氣為流速〇. 1~4. OmL/min的氦氣，分流比為0~500 :1，升溫程序為：初始溫 度為40~60°C，并保持0~3min，然后以彡30°C /min升至150°C，然后以彡10°C /min升 至300°C，然后以彡30°C /min升至310°C。5. 根據(jù)權利要求1所述一種川穹嗪的快速檢測方法，其特征在于：所述質譜的工作條 件為：采用EI源、正離子檢測，電子能量為50~80eV，離子源溫度為200~250°C，單四級 桿溫度為130~200°C，掃描方式為全掃描方式，電子倍增器電壓為1070~3120V，溶劑延 遲為0? 1~lOmin。6. 根據(jù)權利要求1所述一種川穹嗪的快速檢測方法，其特征在于：所述相對含量采用 面積歸一化方法進行計算。7. 根據(jù)權利要求1所述一種川穹嗪的快速檢測方法，其特征在于：所述川穹嗪的色譜 峰的定性采用NIST08軟件自動匹配計算。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種川穹嗪的快速檢測方法：1)樣品的準備；2)PY-GC/MS檢測；3)數(shù)據(jù)分析及定性和定量分析。本發(fā)明選擇PY-GC/MS技術對川穹中川穹嗪含量進行檢測，是針對實際生產(chǎn)、生活中川穹因產(chǎn)地、季節(jié)、炮制等不同而品質不同的問題，提供一種川穹中川穹嗪快速、微量的檢測方法，進而初步判斷川穹的質量，本發(fā)明具有操作簡單，檢測限低，實驗重現(xiàn)性好，實驗數(shù)據(jù)直觀可靠等特點，特別適用于微量樣品檢測，可用于對不同產(chǎn)地、品種、批次的川穹樣品間的質量差別進行初步的比較，應用性廣，為川穹的質量標準和現(xiàn)代化應用提供了一種初步的判讀依據(jù)。
【IPC分類】G01N30/88, G01N1/44
【公開號】CN105158396
【申請?zhí)枴緾N201510598956
【發(fā)明人】陳福欣, 龔頻, 周安寧, 侯彬彬
【申請人】西安科技大學
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年9月18日