7本發(fā)明試劑盒與進(jìn)口試劑盒線性對比
[0113]
[0114] 結(jié)果表明本發(fā)明試劑盒線性良好，擬合相關(guān)系數(shù)優(yōu)于進(jìn)口試劑盒。
[0115] 四、穩(wěn)定性研究
[0116] 使用本實施例所述試劑盒，測定高、低兩個水平的游離脂肪酸樣品，每個水平樣本 重復(fù)測定10次，對2-8°C放置20個月的試劑測定結(jié)果進(jìn)行對比，驗證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，按 正規(guī)統(tǒng)計學(xué)要求，計算每個水平樣品測定結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，然后按公式：
[0117]
[0118] 變異系數(shù)（CV)=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值X 100%
[0119] 其中，X為測得的NEFA含量濃度值，f為測得的X值的平均數(shù)，n為重復(fù)測定次數(shù)；
[0120] 計算變異系數(shù)CV，結(jié)果列于下表8中；
[0121]按公式B%= (x-TK「X丨〇〇%
[0122] 其中T為初始測定值均值，I為2-8°C放置20個月的測定值均值。
[0123] 計算2_8°C放置20個月測定值與初始測定值均值的相對偏差（B% )，結(jié)果列于表 8中。
[0124] 表8本發(fā)明試劑盒2_8°C長期放置20月檢測結(jié)果
[0125]
[0126] 由表8可以看出本實施例所述試劑盒在2_8°C放置20個月，測定結(jié)果重復(fù)性CV均 小于10%，且與初始測定值的偏差均小于10%，符合《體外診斷試劑通用要求》，表明本發(fā) 明試劑盒重復(fù)性良好，具有較好的準(zhǔn)確性和良好的穩(wěn)定性。
[0127] 六、酶活性的影響
[0128] 加入2. 0 %脂酰輔酶A氧化酶穩(wěn)定劑對脂酰輔酶A氧化酶的保護(hù)作用。
[0129] 表9酶保護(hù)劑對試劑中酶活性的影響
[0130]

[0131] 本發(fā)明試劑盒對試劑中的酶有很強(qiáng)的保護(hù)作用，隨著時間的推移，對酶的保護(hù)作 用會更明顯，20個月后加酶穩(wěn)定劑的試劑與未加酶穩(wěn)定劑的試劑相比，殘存酶活率升高 49%〇
[0132] 實施例3
[0133] -、一種穩(wěn)定的酶法游離脂肪酸測定試劑盒，該試劑盒由按照下述成分和比例配 制的液體雙試劑組成，其中：
[0134]試劑1:
[0135] 滅0搏.緩沖液 100 minol/L. MgCh ? 6H20 20 mmoI/L KCL 10 mmol,,L ATP' 4.0 mmol/L 輔酶 A. 0.4 mmol/L 脂酰輔酶A合成酶 2.0 KU/L 4-氨基安替比林 0,8 g/L 穩(wěn)定劑海藻糖 3.0 g/L 無脂肪酸白蛋白 2.0 g/L 咪唑烷基脲 0.1 % 表面活性劑 2.0 g/.L BOTA 1,0 mmol/L 抗壞血酸氧化酶 2.0KU/L 亞鐵氰化鉀 0.05 mmol/L
[0136]試劑 2:
[0137] MOPS 緩沖液 100 mrnol/L
[0138] 脂酰輔酶A氧化酶 30 KU/L 黃素腺嘌呤二核苷酸鈉鹽 0.02 g/L 3-甲基-N，N-二丙磺酸鈉苯胺 3.0 mmol/L DTPA 螌介劑 1,5 mmol/L 表面活性劑 2.0 g/L 咪唑烷基脲 0.1 % 脂酰輔酶A氧化酶穩(wěn)定劑 1.0% 過氧化物酶（POD) 90Kl'/L
[0139] 所述試劑1和試劑2的容積比為4:1。
[0140] 二、本發(fā)明試劑盒與進(jìn)口試劑盒的相關(guān)性
[0141] 使用本實施例所述試劑盒，按實施例1所述方法，同時使用市售進(jìn)口試劑盒（德 賽）對40例人血清樣本中的游離脂肪酸含量進(jìn)行測定，進(jìn)口試劑盒按照其說明書進(jìn)行操 作，測定結(jié)果如下表10所示。下表中進(jìn)口試劑盒參考范圍是〇. 10-0. 60mmol/L，本發(fā)明試劑 盒的參考范圍是0. 13-0. 77mmol/L。
[0142] 表10本發(fā)明試劑盒與進(jìn)口試劑盒對NEFA的測定結(jié)果
[0143]
[0144]

[0145] 由上表統(tǒng)計結(jié)果可以看出，在這40例新鮮人血清樣本中，共出現(xiàn)28例陰性結(jié)果 和12例陽性結(jié)果，本發(fā)明試劑盒和進(jìn)口酶法試劑盒在結(jié)果判斷上是一一對應(yīng)的，按實施例 1所述方法，計算本發(fā)明試劑盒與進(jìn)口試劑盒測定結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r = 0. 9992,二者相關(guān)性 良好，臨床意義顯著。
[0146] 以上的試驗是采用日立公司制造的7080型號全自動生化分析儀進(jìn)行的，但本發(fā) 明試劑盒的應(yīng)用不限于上述儀器，還適用于其他全自動或半自動生化分析儀，并且本領(lǐng)域 技術(shù)人員可以根據(jù)情況對測定參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整。
[0147] 三、線性評估
[0148] 取某一高值樣本，分別用本發(fā)明試劑盒和進(jìn)口試劑盒（德賽）測定高值樣本的5 次倍比稀釋后的線性，以此從實際樣本中評估各試劑盒的線性，結(jié)果列于表11中。
[0149] 表11本發(fā)明試劑盒與進(jìn)口試劑盒線性對比
[0150]
[0151]
[0152] 結(jié)果表明本發(fā)!明試劑盒線性良好，擬合相美系數(shù)優(yōu)于進(jìn)m式劑盒。
[0153] 四、穩(wěn)定性研究
[0154] 使用本實施例所述試劑盒，測定高、低兩個水平的游離脂肪酸樣本，每個水平重復(fù) 測定10次，對2-8°C放置20個月的試劑測定結(jié)果進(jìn)行對比，驗證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，按正規(guī) 統(tǒng)計學(xué)要求，計算每個水平樣本測定結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，然后按公式：
[0155]
[0156] 變異系數(shù)（CV)=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值X 100%
[0157] 其中，X為測得的NEFA含量濃度值，X為測得的X值的平均數(shù)，n為重復(fù)測定次數(shù)；
[0158] 計算變異系數(shù)CV，結(jié)果列于下表12中；
[0159]按公式B% = (x -T)/T X 1娜％
[0160] 其中T為初始測定值均值，I為2-8°C放置20個月的測定值均值。
[0161] 計算2_8°C放置20個月測定值與初始測定值均值的相對偏差（B% )，結(jié)果列于表 12中。
[0162] 表12本發(fā)明試劑盒2-8 °C長期放置20個月
[0163]
[0164] 由以上結(jié)果可以看出本實施例所述試劑盒在2_8°C放置20個月，測定結(jié)果重復(fù)性 CV均小于10%，且與初始測定值的偏差均小于10%，符合《體外診斷試劑通用要求》，表明 本發(fā)明酶法游離脂肪酸檢測試劑盒具有較高的準(zhǔn)確性和良好的穩(wěn)定性。
[0165] 五、酶活性的影響
[0166] 加入1 %脂酰輔酶A氧化酶穩(wěn)定劑對脂酰輔酶A氧化酶的保護(hù)作用。
[0167] 表13酶保護(hù)劑對試劑中酶活性的影響 [01681
[0169]-本發(fā)明試劑盒對試劑中的酶有很強(qiáng)的保護(hù)作用，隨著時間的推移，對酶的保護(hù)作 用會更明顯，20個月后加酶穩(wěn)定劑的試劑與未加酶穩(wěn)定劑的試劑相比，殘存酶活率升高 51%〇
【主權(quán)項】
1. 一種穩(wěn)定的游離脂肪酸測定試劑盒，其特征在于：包括試劑1和試劑2兩種分別放 置的液體試劑，其各組分及濃度范圍為： 試劑1: 緩沖液 20~200mmol/L MgCl2?6H20 1-100mmol/L KCL 5~50mmol/L ATP 2~20mmol/L 輔酶A 0. 1~2. 0mmol/L 脂酰輔酶A合成酶 0. 4~5KU/L 4_氨基安替比林 0. 2~2g/L 穩(wěn)定劑 1~10g/L 防腐劑 0? 05~0. 5 % 表面活性劑 0. 5~5g/L EGTA 0. 5~3 mmol/L 抗壞血酸氧化酶 0. 5~10KU/L 亞鐵氰化鉀 0. 01~0.1 mmol/L 試劑2: 緩沖液 20~200mmol/L 脂酰輔酶A氧化酶 10~100KU/L 黃素腺嘌呤二核苷酸鈉鹽 0.01-0.05g/L 色原 1~10mmol/L DTPA螯合劑 0? 5~3mmol/L 表面活性劑 0. 5~5g/L 防腐劑 0? 05~0. 5 % 酶保護(hù)劑 0. 5~2 % 過氧化物酶（POD) 50-150KU/L 所述試劑1和試劑2的容積比為4:1 ; 所述緩沖液選自2-嗎啉代乙磺酸（MES)、3-嗎啉代丙磺酸（M0PS)、N-[三（羥甲基）甲 基]-2-氨基甲磺酸（TES)、3-[4-(2-羥甲基）-1-哌嗪]丙磺酸（（H)EPPS)中的一種，優(yōu)選 MOPS緩沖液，pH優(yōu)選范圍為6. 0~8. 5 ; 所述穩(wěn)定劑選自海藻糖、蔗糖、P-環(huán)糊精、甘露醇中一種或多種的組合，同時添加無脂 肪酸白蛋白； 所述防腐劑為咪唑烷基脲； 所述表面活性劑選自Brij35、Brij98、Tween20 ; 所述酶保護(hù)劑為乙酰輔酶A氧化酶穩(wěn)定劑； 所述色原為胺類新色原3-甲基-N，N-二丙磺酸鈉苯胺。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述白蛋白為利用基因工程學(xué)上方法 制造的無脂肪酸白蛋白，純度大于98%，脂肪酸含量低于0. 002% (w/w)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于：所述脂酰輔酶A合成酶和脂酰輔
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定的酶法游離脂肪酸的試劑盒，該試劑盒由分別放置的試劑1和試劑2兩種獨(dú)立液體試劑組成，具有良好的穩(wěn)定性和抗干擾性。酶法測定游離脂肪酸，方法簡便、易于操作。本發(fā)明試劑中選用了新型色原，配方中同時加入了抗壞血酸氧化酶、亞鐵氰化鉀等抗擾劑，使試劑具有靈敏度高、抗干擾性強(qiáng)的特點(diǎn)；同時采用液體穩(wěn)定技術(shù)，加入了一系列特殊的穩(wěn)定劑、螯合劑和酶保護(hù)劑，使試劑具有優(yōu)良的穩(wěn)定性，可廣泛應(yīng)用于絕大多數(shù)半/全自動生化分析儀，監(jiān)測人體脂肪代謝情況和血脂水平等，便于臨床推廣。
【IPC分類】G01N21/31, G01N33/50
【公開號】CN105203472
【申請?zhí)枴緾N201510378206
【發(fā)明人】李雪, 袁恩武, 江崇才, 張成順, 蘇巖, 李江
【申請人】北京萬泰德瑞診斷技術(shù)有限公司
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年6月30日