一種苦參堿的快速檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于快速熱解-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術（PY-GC/MS法）快速檢 測苦參堿含量的方法。
【背景技術】
[0002] 苦參堿是豆科植物苦參、苦豆子、廣豆根等中草藥的活性成分，這一類生物堿還包 括氧化苦參堿、槐果堿、槐定堿、槐醇堿、槐胺堿、氧化槐果堿等，其結(jié)構(gòu)均屬四環(huán)的喹諾里 西啶生物堿。大量研究表明，它們在腫瘤防治方面具有較好的應用前景，如復方苦參注射液 (巖舒）、氧化苦參堿（博爾泰力）、苦參堿注射液（斯巴德康）、康艾注射液等均已在臨床 應用，特別是用于腫瘤的治療?，F(xiàn)代藥理學研究表明，苦參堿和氧化苦參堿能抑制腫瘤細胞 增殖、誘導周期阻滯、促進細胞凋亡、誘導腫瘤細胞分化、抗腫瘤新生血管形成以及抑制腫 瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等。同時，苦參堿也能逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥性，并能增強臨床上常用抗腫瘤化 療藥物的抗腫瘤活性。
[0003] 此外，最近的研究表明苦參堿在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、消化道系統(tǒng)疾病 中均有較好的預防和治療作用。如，可增加小鼠腦中的抑制性遞質(zhì)的氨基丁酸和甘氨酸而 呈現(xiàn)鎮(zhèn)靜作用，也可明顯抑制小鼠扭體痛反應，延長熱刺激所致小鼠出現(xiàn)痛反應的潛伏期， 從而具有鎮(zhèn)痛作用。周斌等人發(fā)現(xiàn)，苦參堿一方面能顯著降低大鼠實驗性高脂血癥的血清 甘油三酯，降低血液黏度，改善血液流變學各項指標；另一方面，其能抑制纖維蛋白、纖維蛋 白原降解產(chǎn)物的作用，表現(xiàn)在能顯著抑制大鼠主動脈內(nèi)皮細胞釋放乳酸脫氫酶及平滑肌細 胞的增殖，減少小鼠腹腔巨噬細胞分泌白細胞介素。因此苦參堿在防治動脈粥樣硬化方面 亦具有一定的意義。因此，快速、高效檢測中藥或其復方制劑中的苦參堿對中藥的質(zhì)量控制 和進一步的現(xiàn)代化應用是非常重要的?，F(xiàn)有對苦參堿的分析檢測主要采用高效液相色譜 或高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法。受分析方法的要求限制，往往需要對樣品進行較為復雜 的前處理，通過萃取等方法將苦參堿從中藥材或其復方制劑中分離，隨后采用HPLC/UPLC/ SFCLC等液相色譜方法分析；如果需要使用HPLC-MS分析方法，還需要對樣品進行除鹽的處 理。該類分析方法的樣品處理過程復雜、總體分析時間長。
[0004] 快速熱解-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術（PY-GC/MS)是一種高效的檢測易揮發(fā)性成 分的技術，近年來發(fā)展迅速。低溫下的熱解過程是一種非常有效的熱分離手段，通過控制 熱解的溫度和時間可以實現(xiàn)低沸點的復雜混合物的初步的氣-液或氣-固相分離；為氣相 色譜提供一種在線的和實時的樣品前處理和初步分離能力。分析檢測過程中的熱解時間、 溫度、升溫速率、載氣流速、分流比、離子化溫度等對分析結(jié)果的影響是很大的。因此，基于 PY-GC/MS技術的特點，目前亟需提出一種針對苦參堿的快速、微量檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種苦參堿的快速檢測方法，并基于此，初步判斷苦參等 中藥材及其制劑質(zhì)量的高低。
[0006] 為達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案：
[0007] 1)準確稱取苦參或其復方制劑0. 02~5.OOmg得樣品，將樣品加入熱解杯中；
[0008] 2)采用快速熱解-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對加入熱解杯中的樣品進行測定；
[0009] 3)經(jīng)過步驟2)后，根據(jù)測定的原始色譜數(shù)據(jù)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，定性樣品中苦參堿的色 譜峰，并獲得樣品中苦參堿的相對含量。
[0010] 所述樣品為塊狀或粉末狀固體。
[0011] 所述熱解的條件為：熱解溫度為180~450°C，熱解時間為0. 1~lmin。
[0012] 所述氣相色譜的工作條件為：載氣為流速0. 1~4. OmL/min的氦氣，分流比為0~ 500 :1，升溫程序為：初始溫度為40~70°C，并保持0~3min，然后以彡20°C /min升至 300 °C〇
[0013] 所述質(zhì)譜的工作條件為：采用EI源、正離子檢測，電子能量為50~85eV，離子源 溫度為215~245°C，單四級桿溫度為145~185°C，掃描方式為全掃描方式，電子倍增器電 壓為1075~2980V，溶劑延遲為0~6min。
[0014] 所述相對含量采用面積歸一化方法進行計算。
[0015] 所述苦參堿的色譜峰的定性采用NIST08軟件自動匹配計算。
[0016] 本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0017] 1)快速分離?，F(xiàn)有方法是將苦參或其制劑通過萃取方法初步分離得到苦參堿溶 液，過濾處理后，利用液相色譜分析，或薄層層析_光譜聯(lián)用技術（TLC-SP)等檢測其有效成 分；該方法的一般分析時間為4~24小時。本發(fā)明中通過熱分離方法直接對苦參或其制劑 的低沸點物質(zhì)進行初步分離，隨后采用氣相色譜進一步分離苦參堿，大大節(jié)省了分析時間， 常規(guī)分析時間為〇. 1~〇. 3小時，提高了分析效率。
[0018] 2)靈敏度好，所需樣品量少。HPLC檢測方法受到儀器的限制，一般需要先分離得 到粗品溶液，因此需要的樣品量較大，通常是幾克到幾十克不等；本發(fā)明方法的分析所用樣 品量一般為〇. 02~lmg，提高了分析靈敏度。
[0019] 3)本發(fā)明優(yōu)化了熱解、色譜、質(zhì)譜等檢測條件，可以快速定性所需的色譜峰，實現(xiàn) 了快速和準確檢測。
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0021] 本發(fā)明針對苦參堿的物化特點，采用快速熱解-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術（PY-GC/ MS)，充分將熱分離和色譜分離相結(jié)合，實現(xiàn)苦參堿的快速分離，隨后采用質(zhì)譜定性和定量 檢測，達到快速、微量檢測的目的。
[0022] 實施例
[0023] -種基于PY-GC/MS檢測苦參堿的方法，以中藥材苦參為例，但本發(fā)明的保護范圍 不局限于該實施例，具體步驟如下：
[0024] -、樣品準備
[0025] 將取得的苦參（陜西天之潤生物科技有限公司，西安）準確稱取 1. 00mg(±0. 02mg)放入50 y L的熱解小杯中；
[0026] 二、熱解：
[0027] 熱裂解爐采用 Frontiers 的 PY2020is ;
[0028] ①熱解溫度：260°C ;
[0029] ②熱解時間：0? 3〇min。
[0030] 三、分離、檢測
[0031] 色譜：
[0032] 氣相色譜采用安捷倫7890A :
[0033] ①分析柱是HP-5MS彈性石英毛細管柱（30m*0. 25id*0. 25 y m);
[0034] ②載氣：高純氦氣，流速為1. OmL/min ;
[0035] ③進樣方式為分流進樣，分流比為80 :1 ;
[0036] ④進樣口溫度為280 °C，傳輸線溫度為290 °C ;
[0037] ⑤程序升溫：初始溫度為60°C，保持2min，然后以20°C /min升至300°C。
[0038] 質(zhì)譜（采用安捷倫5975C):
[0039] ①EI源，正離子檢測，電子能量為70eV ;
[0040] ②離子源溫度為230°C，單四級桿溫度為150°C ;
[0041] ③掃描方式為全掃描方式；
[0042] ④電子倍增器電壓為2440V，溶劑延遲為3. 5min。
[0043] 四、數(shù)據(jù)分析及處理
[0044] 色譜圖的保留時間和積分面積由工作站自動完成，利用NIST08譜庫定性色譜峰。 各揮發(fā)性成分的相對含量通過面積歸一化法得到。
[0045] 本樣品苦參熱解組分中可辨認的峰為27個，成分及其保留時間列于表1。保留時 間及峰面積用安捷倫Chemstation計算，相對含量用面積歸一化的方法計算。
[0046] 表1?苦參中揮發(fā)性成分的組成和含量（tr= 15. 144 :苦參堿）
[0047]
[0048]
[0049] 五、精密度、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性實驗
[0050] 1.精密度實驗：以取自同一苦參的樣品5份，按照上述方法連續(xù)進樣5次，對相對 峰面積大于0. 5%的27個色譜峰進行分析，其相對保留時間和相對峰面積的RSD (相對標準 偏差）分別在3. 15~4. 55%和2. 23~4. 73%之間，說明本發(fā)明方法精密度良好。
[0051] 2.重現(xiàn)性實驗：取同一批次苦參的樣品5份，按照上述方法連續(xù)進樣5次。結(jié)果 27個色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別在2. 16~4. 5%和2. 38~4. 09%之 間，說明本發(fā)明方法重現(xiàn)性良好。
[0052] 3.穩(wěn)定性實驗：取制備好的樣品1份，分別在0、2、4、8、12、24h進樣測定，結(jié)果27 個色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于4. 87%，說明本發(fā)明方法在24h內(nèi)測 定是穩(wěn)定的。
[0053] 中藥材因產(chǎn)地、季節(jié)、炮制方式的不同，其含水量、密度等都有細微的不同，繼而其 復方制劑中的含量也有所不同。因此，需要的熱解、分離和分析條件均不相同，據(jù)此得出本 發(fā)明中的條件范圍。
[0054] 本發(fā)明具有操作簡單，檢測限低，實驗重現(xiàn)性好，實驗數(shù)據(jù)直觀可靠等特點，特別 適用于微量樣品檢測（樣品量可低至20 y g)，可用于對不同樣品間的質(zhì)量差別進行定量的 比較，應用性廣，為該類中藥材的質(zhì)量標準和現(xiàn)代化應用提供了一條參考的思路和方法。
【主權(quán)項】
1. 一種苦參堿的快速檢測方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) 準確稱取苦參或其復方制劑0. 02~5.OOmg得樣品，將樣品加入熱解杯中； 2) 采用快速熱解-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對加入熱解杯中的樣品進行測定； 3) 經(jīng)過步驟2)后，根據(jù)測定的原始色譜數(shù)據(jù)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，定性樣品中苦參堿的色譜 峰，并獲得樣品中苦參堿的相對含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種苦參堿的快速檢測方法，其特征在于：所述樣品為塊狀或 粉末狀固體。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種苦參堿的快速檢測方法，其特征在于：所述熱解的條件為： 熱解溫度為180~450°C，熱解時間為0. 1~lmin。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種苦參堿的快速檢測方法，其特征在于：所述氣相色譜的工 作條件為：載氣為流速〇. 1~4.OmL/min的氦氣，分流比為0~500 :1，升溫程序為：初始溫 度為40~70°C，并保持0~3min，然后以彡20°C/min升至300°C。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種苦參堿的快速檢測方法，其特征在于：所述質(zhì)譜的工作條 件為：采用EI源、正離子檢測，電子能量為50~85eV，離子源溫度為215~245°C，單四級 桿溫度為145~185°C，掃描方式為全掃描方式，電子倍增器電壓為1075~2980V，溶劑延 遲為0~6min。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種苦參堿的快速檢測方法，其特征在于：所述相對含量采用 面積歸一化方法進行計算。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種苦參堿的快速檢測方法，其特征在于：所述苦參堿的色譜 峰的定性采用NIST08軟件自動匹配計算。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種苦參堿的快速檢測方法：1)樣品的準備；2)PY-GC/MS檢測；3)數(shù)據(jù)分析及定性和定量分析。本發(fā)明選擇PY-GC/MS技術對苦參堿含量進行檢測，是針對苦參等以苦參堿為主要活性成分的中藥材，因產(chǎn)地、季節(jié)、炮制等不同而品質(zhì)不同的問題，提供一種苦參堿快速、微量的檢測方法，進而初步判斷此類中藥材的質(zhì)量，本發(fā)明具有操作簡單，檢測限低，實驗重現(xiàn)性好，實驗數(shù)據(jù)直觀可靠等特點，特別適用于微量樣品檢測，可用于對不同產(chǎn)地、品種、批次的苦參等樣品間的質(zhì)量差別進行初步的比較，應用性廣。
【IPC分類】G01N30/02
【公開號】CN105203662
【申請?zhí)枴緾N201510600822
【發(fā)明人】龔頻
【申請人】陜西科技大學
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年9月18日