一種基于點(diǎn)擊化學(xué)的電化學(xué)dna生物傳感器及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種生物傳感器及其制備方法，具體涉及一種基于點(diǎn)擊化學(xué)的電化學(xué)DNA生物傳感器及其制備方法，應(yīng)用于核酸檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]脫氧核糖核酸(DNA)是遺傳信息的攜帶者，DNA分子中堿基序列的改變與許多人類疾病有關(guān)。因此，對(duì)特定DNA序列進(jìn)行分析和檢測(cè)在遺傳疾病的早期診斷和治療方面具有十分重大的意義和應(yīng)用前景。傳統(tǒng)的DNA檢測(cè)方法主要包括熒光測(cè)定法和紫外分光光度法等光學(xué)方法，但都具有靈敏度低、選擇性差、設(shè)備復(fù)雜或檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)；相比之下，電化學(xué)方法用于DNA檢測(cè)時(shí)具有靈敏度高、選擇性好、檢測(cè)成本低、檢測(cè)時(shí)間短和設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)良特性，因而在近年來獲得了相當(dāng)廣泛的應(yīng)用。
[0003]分子信標(biāo)技術(shù)以其操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、可對(duì)核酸進(jìn)行實(shí)時(shí)定量測(cè)定，甚至可以用于活體分析等特點(diǎn)不僅在生物學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用，而且在疾病基因檢測(cè)與診斷等生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和臨床研究中也將充當(dāng)重要的角色。文獻(xiàn)(10.1073/pnas.1633515100)報(bào)導(dǎo)了一種基于分子信標(biāo)的電化學(xué)DNA生物傳感器，該傳感器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，實(shí)用性強(qiáng)，然而這是一種信號(hào)減弱型生物傳感器，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。此外，文獻(xiàn)(10.1021/ja800554t)報(bào)導(dǎo)了一種信號(hào)增強(qiáng)型生物傳感器，該傳感器靈敏度高，選擇性好，然而制備過程相當(dāng)復(fù)雜，成本高昂，實(shí)用性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種基于點(diǎn)擊化學(xué)的電化學(xué)DNA生物傳感器及其制備方法。本發(fā)明的傳感器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、制備工藝簡(jiǎn)便、靈敏度高、選擇性好、抗干擾能力強(qiáng)、重復(fù)性好，為醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域中特異性DNA提供了一種快速、低成本的檢測(cè)方法。
[0005]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案為:一種基于點(diǎn)擊化學(xué)的電化學(xué)DNA生物傳感器及其制備方法，包括以下步驟:
[0006]步驟一、將含目標(biāo)DNA的溶液滴加到巰基化發(fā)夾DNA探針修飾的金電極表面，雜交反應(yīng)結(jié)束后，將電極表面清洗干凈；
[0007]步驟二、將步驟一所得電極表面浸泡在含電化學(xué)活性標(biāo)記物的標(biāo)記溶液中，反應(yīng)一段時(shí)間后，即得電化學(xué)DNA生物傳感器。
[0008]步驟一中，巰基化發(fā)夾DNA探針的末端修飾有參與點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的官能團(tuán)。
[0009]步驟一中，雜交反應(yīng)時(shí)間為0.25?5h，雜交反應(yīng)溫度為20?50°C。
[0010]步驟一中，所述的巰基化發(fā)夾DNA探針修飾的金電極是將潔凈的金電極浸泡在含有巰基化發(fā)夾DNA探針的溶液中進(jìn)行修飾，再用巰基己醇對(duì)電極表面殘余的位點(diǎn)進(jìn)行封閉后得到。
[0011]進(jìn)一步的，含有巰基化發(fā)夾DNA探針的溶液中，巰基化發(fā)夾DNA探針的濃度為0.01?10 μΜ，修飾溫度為20?50 °C，修飾時(shí)間為0.25?24h，巰基己醇濃度為0.1?1mM0
[0012]步驟二中，電化學(xué)活性標(biāo)記物含有與修飾在巰基化發(fā)夾DNA探針的末端的官能團(tuán)發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)所需的官能團(tuán)，反應(yīng)時(shí)間為0.25?24h。
[0013]所述的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)為環(huán)加成反應(yīng)、親核開環(huán)反應(yīng)、非醇醛的羰基化學(xué)以及碳碳多鍵的加成反應(yīng)。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0015]①本發(fā)明通過采用一段與目標(biāo)DNA互補(bǔ)的巰基化發(fā)夾DNA作為捕獲探針，提高了DNA電化學(xué)生物傳感器的選擇性及其在復(fù)雜臨床樣品中的實(shí)用性；
[0016]②通過點(diǎn)擊化學(xué)將電化學(xué)活性標(biāo)記物連到電極表面，具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速率快、連接效率高、可控性強(qiáng)、選擇性好、抗干擾能力強(qiáng)以及對(duì)空氣和水不敏感等優(yōu)良特性，同時(shí)也可以顯著縮短檢測(cè)時(shí)間、降低檢測(cè)成本；
[0017]③本發(fā)明的電化學(xué)DNA生物傳感器，體系簡(jiǎn)單，成本低廉，不易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，實(shí)用性強(qiáng)。
【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明一種基于點(diǎn)擊化學(xué)的電化學(xué)DNA生物傳感器的制備過程示意圖。
[0019]圖2是本發(fā)明電化學(xué)DNA生物傳感器對(duì)不同濃度目標(biāo)DNA的差分脈沖伏安響應(yīng)曲線㈧及其響應(yīng)峰電流的校準(zhǔn)曲線(B)。
[0020]圖3是本發(fā)明電化學(xué)DNA生物傳感器對(duì)不同DNA的電化學(xué)響應(yīng)。
[0021]圖4是本發(fā)明電化學(xué)DNA生物傳感器在血清樣品中的電化學(xué)響應(yīng)。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，以下實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，以便于更好地理解本發(fā)明，因而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。
[0023]實(shí)施例1:如附圖1中所示步驟，制備本發(fā)明電化學(xué)DNA生物傳感器。
[0024](I)電極表面的預(yù)處理及捕獲探針的固定化
[0025]將金電極表面依次用0.3和0.05 μ m的拋光粉打磨至鏡面，清洗干凈后，在水虎魚酸(98% H2S04/H202，3:1，v/v)中浸泡處理lOmin，清洗后，在0.5M的稀硫酸中用循環(huán)伏安法對(duì)電極表面進(jìn)行電化學(xué)處理，清洗干凈后即得潔凈的金電極；將已經(jīng)潔凈處理過的金電極在含有I μΜ末端標(biāo)記有疊氮基團(tuán)的巰基化發(fā)夾DNA探針(序列:5’-SH-(CH2)6_CCA CGCTTG TGG GTC AAC CCC CGT GG_N3_3’ )的溶液中在37°C下浸泡1.5h，再用2mM巰基己醇對(duì)電極表面殘余的位點(diǎn)進(jìn)行封閉，即得到發(fā)夾DNA探針修飾的金電極。
[0026](2)雜交
[0027]將含目標(biāo)DNA (序列:5’ -GGG GTT GAC CCA CAA G-3’ )的溶液滴加到修飾后所得的電極表面，在37°C下雜交反應(yīng)1.5h，將電極表面清洗干凈。
[0028](3)標(biāo)記電化學(xué)活性物質(zhì)
[0029]將雜交后所得電極表面浸泡在含1.4mg/mL乙炔基二茂鐵、0.1mM硫酸銅和0.2mM抗壞血酸的標(biāo)記溶液中，在室溫下反應(yīng)1.5h，即得電化學(xué)DNA生物傳感器。
[0030](4)電化學(xué)檢測(cè)
[0031]用差分脈沖伏安法對(duì)連接在電極表面的二茂鐵進(jìn)行檢測(cè)。
[0032]實(shí)施例2:本發(fā)明電化學(xué)DNA生物傳感器對(duì)不同濃度目標(biāo)DNA的電化學(xué)響應(yīng)特性。
[0033]采用本發(fā)明所述方法，以末端標(biāo)記有疊氮基團(tuán)的巰基化發(fā)夾DNA(序列:5’ -SH-(CH2)6-CCA CGC TTG TGG GTC AAC CCC CGT GG_N3_3’ )作為捕獲探針，與不同濃度的目標(biāo)DNA(序列:5’ -GGG GTT GAC CCA CAA G-3’)進(jìn)行雜交反應(yīng)。所有操作步驟及條件均如同上述實(shí)施例1，其中，通過改變目標(biāo)DNA的濃度(1，5，10，50，100，500和100pM)，檢測(cè)本發(fā)明電化學(xué)DNA生物傳感器的電化學(xué)響應(yīng)特性。其檢測(cè)結(jié)果如附圖2所示，從圖中可以看出，氧化電流隨著目標(biāo)DNA濃度的增長(zhǎng)而線性增長(zhǎng)，其線性范圍為I?100pM (R2 =0.9995)，檢測(cè)下限為 0.296pMo
[0034]實(shí)施例3:本發(fā)明電化學(xué)DNA生物傳感器對(duì)不同DNA的電化學(xué)響應(yīng)。
[0035]采用本發(fā)明所述方法，以末端標(biāo)記有疊氮基團(tuán)的巰基化發(fā)夾DNA(序列:5’ -SH-(CH2)6-CCA CGC TTG TGG GTC AAC CCC CGT GG_N3_3’ )作為捕獲探針，與相同濃度的目標(biāo) DNA (序列:5 ’ -GGG GTT GAC CCA CAA G-3 ’)、單堿基錯(cuò)配 DNA (序列:5' -GGG GTCGAC CCA CAA G-3')、三堿基錯(cuò)配 DNA (序列:5' -GGG GTC GTC GCA CAA G-3')和對(duì)照DNA(序列:5' -TTC AGC TCT ATC AAT C-3')進(jìn)行雜交反應(yīng)。所有操作步驟及條件均如同上述實(shí)施例1，其中，所有DNA的濃度均為50pM，檢測(cè)本發(fā)明電化學(xué)DNA生物傳感器對(duì)不同DNA的電化學(xué)響應(yīng)。其檢測(cè)結(jié)果如附圖3所示，從圖中可以看出，單堿基錯(cuò)配DNA、三堿基錯(cuò)配DNA和對(duì)照DNA的響應(yīng)信號(hào)分別為目標(biāo)DNA響應(yīng)信號(hào)的28.9%，12.4%和7.6%，說明本發(fā)明電化學(xué)DNA生物傳感器對(duì)于不同DNA具有很好的選擇性。
[0036]實(shí)施例4:本發(fā)明電化學(xué)DNA生物傳感器在血清樣品中的電化學(xué)響應(yīng)。
[0037]采用本發(fā)明所述方法，以末端標(biāo)記有疊氮基團(tuán)的巰基化發(fā)夾DNA(序列:5’ -SH-(CH2)6-CCA CGC TTG TGG GTC AAC CCC CGT GG_N3_3’ )作為捕獲探針，與不同樣品中的目標(biāo)DNA(序列:5’ -GGG GTT GAC CCA CAA G-3’ )進(jìn)行雜交反應(yīng)。所有操作步驟及條件均如同上述實(shí)施例1，其中，樣品分別為TE緩沖液、1%的血清樣品、5%的血清樣品，目標(biāo)DNA的濃度為50pM，檢測(cè)本發(fā)明電化學(xué)DNA生物傳感器在血清樣品中的電化學(xué)響應(yīng)。其檢測(cè)結(jié)果如附圖4所示，從圖中可以看出，1%的血清樣品和5%的血清樣品中的響應(yīng)信號(hào)分別為TE緩沖液中響應(yīng)信號(hào)的93.5%和88.6%，說明本發(fā)明在臨床實(shí)驗(yàn)分析中具有很好的實(shí)用性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于點(diǎn)擊化學(xué)的電化學(xué)DNA生物傳感器及其制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一、將含目標(biāo)DNA的溶液滴加到巰基化發(fā)夾DNA探針修飾的金電極表面，雜交反應(yīng)結(jié)束后，將電極表面清洗干凈； 步驟二、將步驟一所得電極表面浸泡在含電化學(xué)活性標(biāo)記物的標(biāo)記溶液中反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后即得電化學(xué)DNA生物傳感器。2.如權(quán)利要求1所述的基于點(diǎn)擊化學(xué)的電化學(xué)DNA生物傳感器及其制備方法，其特征在于，步驟一中，所述的巰基化發(fā)夾DNA探針修飾的金電極是將潔凈的金電極浸泡在含有巰基化發(fā)夾DNA探針的溶液中進(jìn)行修飾，再用巰基己醇對(duì)電極表面殘余的位點(diǎn)進(jìn)行封閉后得到。3.如權(quán)利要求2所述的基于點(diǎn)擊化學(xué)的電化學(xué)DNA生物傳感器及其制備方法，其特征在于，含有巰基化發(fā)夾DNA探針的溶液中，巰基化發(fā)夾DNA探針的濃度為0.01?10 μ Μ ;修飾溫度為20?50°C ;修飾時(shí)間為0.25?24h ;巰基己醇濃度為0.1?10mM。4.如權(quán)利要求1所述的基于點(diǎn)擊化學(xué)的電化學(xué)DNA生物傳感器及其制備方法，其特征在于，巰基化發(fā)夾DNA探針的末端修飾有參與點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的官能團(tuán)。5.如權(quán)利要求1所述的基于點(diǎn)擊化學(xué)的電化學(xué)DNA生物傳感器及其制備方法，其特征在于，步驟一中，雜交反應(yīng)時(shí)間為0.25?5h，雜交反應(yīng)溫度為20?50°C。6.如權(quán)利要求1所述的基于點(diǎn)擊化學(xué)的電化學(xué)DNA生物傳感器及其制備方法，其特征在于，步驟二中，電化學(xué)活性標(biāo)記物含有與修飾在巰基化發(fā)夾DNA探針的末端的官能團(tuán)發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)所需的官能團(tuán)，反應(yīng)時(shí)間為0.25?24h。7.如權(quán)利要求4或6所述的基于點(diǎn)擊化學(xué)的電化學(xué)DNA生物傳感器及其制備方法，其特征在于，點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)為環(huán)加成反應(yīng)、親核開環(huán)反應(yīng)、非醇醛的羰基化學(xué)以及碳碳多鍵的加成反應(yīng)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于點(diǎn)擊化學(xué)的電化學(xué)DNA生物傳感器及其制備方法，其包括金電極、與目標(biāo)DNA互補(bǔ)的發(fā)夾DNA以及電化學(xué)活性標(biāo)記物，將一段與目標(biāo)DNA互補(bǔ)的巰基化發(fā)夾DNA固定在金電極表面作為捕獲探針，與目標(biāo)DNA雜交后，發(fā)夾環(huán)打開，在點(diǎn)擊化學(xué)的作用下將電化學(xué)活性標(biāo)記物連到電極表面，用電化學(xué)方法對(duì)連接在電極表面的標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的高靈敏度、高選擇性響應(yīng)和檢測(cè)。該傳感器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、制備工藝簡(jiǎn)便、靈敏度高、選擇性好、抗干擾能力強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域中特異性DNA序列的快速、低成本檢測(cè)。
【IPC分類】G01N27/327
【公開號(hào)】CN105259235
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510781238
【發(fā)明人】孔金明, 胡瓊, 梅亞琦, 何玟輝, 張學(xué)記
【申請(qǐng)人】南京理工大學(xué)
【公開日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年11月13日